CN111316913B - 一种诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物的繁殖技术领域，具体涉及一种诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法。本申请的诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法，通过以辽东楤木根茎为材料，通过适宜浓度的甲基磺酸乙酯浸泡一定时间，再结合植物组织培养技术，通过采用根茎切片组织芽体(茎叶体)诱导、芽体(茎叶体)生根复壮生长等方法，获得各单株独立性强、单株遗传信息纯度高、单株来源清晰等特征的新型的辽东楤木人工栽培品种，该品种遗传稳定，可作为品系栽培和构建辽东楤木突变体库。

Description

一种诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法

技术领域

本发明属于植物新品种技术领域，具体涉及一种诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法。

背景技术

辽东楤木[ralia elata（Miq）Seem.]为五加科楤木属多年生落叶灌木或小乔木，别名：刺龙芽、刺老芽、刺嫩芽、龙芽楤木、鹊不踏等。高1.5-6米，树皮灰色；小枝灰棕色，疏生多数细刺；刺长1-3毫米，基部膨大；嫩枝上常有长达1.5厘米的细长直刺。辽东楤木生长于海拔约1000米的森林中，喜冷凉、湿润的气候，为阴性树种，多生长在阴坡，主要分布在坡的中上部，一般分布在林下、林缘、林间空地和林间采伐作业道两侧，近水湿地林缘没有分布。在坡度较大的北坡可以生长在全光下，要求郁闭度在0.3-0.6。多生长在针阔混交林、阔叶杂木林内。刺嫩芽喜土质疏松，不耐粘重土壤，喜湿怕涝，不耐郁闭度大于0.6的林地，喜肥耐瘠薄。主要分布于中国黑龙江北部、东北部、南部，吉林中部以东和辽宁东北部，朝鲜、俄罗斯和日本也有分布。辽东楤木是一种食用、药用、工业加工、观赏价值很高的经济植物，春季采摘的嫩芽是名贵的山野菜，商品名刺嫩芽，食用方法多样，可以生食、炒食、酱食、做汤、做馅或加工成不同风味的小咸菜，被誉为“山野菜之王”，在日本，刺嫩芽被称为“天下第一”的山珍。根皮及根茎主要含齐墩果酸-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（oleanolicacid-28-O-β-D-glucopyranoside），蔗糖（sucrose），胡萝卜苷（daucosterol），齐墩果酸（oleanolicacid），楤木皂苷（araloside）A、C、G，楤木皂苷A甲酯（araloside Amethylester）等成分，东北产辽东楤木根皮中总皂甙含量是人参根中的三倍左右，含有大量的齐墩果酸，齐墩果酸有抗炎、镇静、利尿、强心、免疫和防癌等作用。龙芽槐木的根皮及树皮入药，对浮肿、便秘、糖尿病、胃痉挛等症有效，对治疗黄疸性肝炎与迁延型慢性肝炎也有较好的疗效，在制药方面的开发日益受到重视，已经开发了多个医药品种，如齐墩果酸制剂、肝喜乐片剂及胶囊、总皂苷片、町剂等。

以往辽东楤木的食用材料完全来源于野生资源，导致野生资源已近枯竭。目前，东北部分地区已对辽东楤木进行人工驯化和栽培生产，暂未实现大面积人工栽培，仍在小范围摸索性栽培。在栽培过程中产量较低，亩产不足200斤，易出现嫩芽萌发晚、芽小、易老化、刺硬度大、植株退化严重、产量逐年降低等问题，且发现幼苗易患立枯病和叶枯病，地下根茎时有蝼蛄和蚯蚓为害，夏秋季地上部分发生红蜘蛛、蚜虫等虫害问题。

在现有技术中，对辽东楤木的研究大多集中于人工繁育、驯化和栽培生产技术及病虫害防治等方面，未发现进行品种改良和新品种（系）培育的相关报道。因此急需培育出抗性强、性状优而稳定的新品种，并应用于人工规模化栽培生产。

发明内容

为了解决上述辽东楤木野生资源枯竭，人工栽培产量较低，易出现嫩芽萌发晚、芽小、易老化、刺硬度大、植株退化严重、虫害等问题，本发明提供一种诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法，包括以下步骤：

（1）材料选择与预处理：选取10月中下旬直径为0.3cm的野生辽东楤木根茎，用无菌水和软毛刷将根茎表面的少量泥土洗净，切割成1.0cm茎段；接着用75%乙醇涮洗15s后移至饱和次氯酸钠溶液浸泡10min，无菌水冲洗15次，并用无菌滤纸吸干表面水分；接着在超净工作台内，将茎段用无菌手术刀和镊子切割成0.2cm的根茎切片组织，将根茎切片组织分批放入不同浓度的EMS溶液中，浸泡30-120min；最后用无菌水冲根茎切片组织10次以备接种；

（2）根茎切片组织芽体的诱导培养：将步骤（1）中经过EMS浸泡后的根茎切片组织转接到根茎切片组织芽体诱导培养基中，并置于光照周期5h·d^-1、光照强度600lx和温度26±2℃条件下培养65天，根茎切片组织茎皮上产生独立、可分离的芽体，并继续培养15天，芽体长至0.5cm；

（3）芽体生根复壮生长培养：将步骤（2）中芽体长至0.5cm后，将芽体剥离转接到芽体生根复壮生长培养基中进行生根复壮生长培养，同时置于光照周期12h·d^-1、光照强度1000lx和温度28±2℃条件下培养40天，芽体生根完全发育生长为含有根和茎叶的小植株；

（4）移栽和定植及品系确定：当步骤（3）中小植株在培养瓶中长至2.0cm时，从瓶中取出经驯化炼苗后栽植于营养钵中，待长至30cm时，定植栽培到田间，观察其生长情况，并进行分类及注标签；接着将差异植株进行组培快繁，组培快繁后栽培于不同适宜地域；最后进行筛选确定遗传稳定的优良性状突变体作为品系，并进行编号。

进一步的，步骤（1）中EMS以浓度为0.1mol·L^-1、pH=7的磷酸盐缓冲液作为溶剂配制成体积百分比浓度为0.3-1.7%的EMS溶液。

进一步的，不同浓度的EMS溶液分别为体积百分比0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、0.16%、1.1%、1.3%、1.5%、1.7%的EMS溶液。

进一步的，不同浓度的EMS溶液分别对应的浸泡时间为30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min。

进一步的，培养基包括基本培养基，所述基本培养基的成份包括下列物质：马铃薯上清液48g·L^-1；大量元素：100.0mg·L^-1NH₄NO₃，168.5mg·L^-1KNO₃，36mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，42.3mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，15.6mg·L^-1KH₂PO₄；铁盐：14.6mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，6.25mg·L^{- 1}Na₂·EDTA·2H₂O。

进一步的，步骤（2）中培养基为基本培养基附加2.8mg·L^-1TDZ、0.12mg·L^-1ABT和0.50mg·L^-1赤霉素，以及7.5g·L^-1琼脂粉，60g·L^-1蔗糖。

进一步的，步骤（2）中培养基的pH值为5.6。

进一步的，步骤（3）中培养基为基本培养基附加0.02mg·L^-1ABT，以及7.0g·L^-1琼脂粉，5g·L^-1蔗糖。

进一步的，步骤（3）中培养基的pH值为5.8。

进一步的，突变体分类根据突变体长势、茎、株型形态特征中的一种或多种进行差别分类；所述品系确定根据突变体长势、形态特性、芽萌发力和大小、产量、稳定性抗性、种子苗遗传情况中的一种或多种因素进行筛选。

本发明提供一种诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法，具有以下有益效果：

（1）甲基磺酸乙酯（EMS）的特性是作用于诱发点，使诱发点突变，不会导致染色体畸形，显性突变高，无需进一步遗传转化，可直接获得遗传稳定突变体，栽培多态性极小，可直接选择优良性状突变体作为品系栽培和品种审定，显著缩短了育种周期；

（2）本方法简捷多效、诱导后代突变率高、变异范围广、突变体遗传稳定性好、突变具有多样性等优点；

（3）本方法以辽东楤木根茎切片组织为材料，应用甲基磺酸乙酯与植物组织培养技术相结合的方法，经过根茎切片组织芽体（茎叶体）诱导、芽体（茎叶体）生根复壮生长等途径获得遗传稳定突变体，该突变体具有各单株独立性强、单株遗传信息纯度高、单株来源清晰等特点，并可进一步应用于辽东楤木突变体库的构建和和品种培育。

附图说明

图1为辽东楤木根茎切片组织诱导的芽体结构图；

图2中 a. 优良性状品系（品系代码：2014-011）春季芽萌发状态图；

b.优良性状品系春季采收的嫩芽（食用）图；

c.野生辽东楤木和新品系茎芽对比图，其中1为新品系茎芽图，2为野生辽东楤木茎芽图；

d.野生辽东楤木和新品系冬季树干对比图，其中1为新品系树干图，2为野生辽东楤木树干图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

如图1和2所示，一种诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法，包括以下步骤：

1材料与方法

1.1材料选取与预处理

10月中下旬，选取野生辽东楤木直径为0.3cm左右的根茎，用无菌水和软毛刷将根茎表面的少量泥土洗净，切割成1.0cm茎段后用75%乙醇（体积百分比浓度）涮洗15s后移至饱和次氯酸钠溶液浸泡10min，无菌水冲洗15次，无菌滤纸吸干表面水分备用。

1.2 方法

1.2.1甲基磺酸乙酯（EMS）溶液配制

EMS以浓度为0.1mol·L^-1、pH=7的磷酸盐缓冲液作为溶剂配制成体积百分比浓度为0.3-1.7%的EMS溶液；

即以pH 7.0的0.1mol·L^-1的磷酸盐缓冲液作为溶剂，将甲基磺酸乙酯（EMS）配制成体积百分比浓度（v·v^-1）溶液，浓度分别为0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、0.16%、1.1%、1.3%、1.5%、1.7%，以及磷酸盐缓冲液作为对照液（CK），该浓度范围依据根茎成活率经预实验获得，使用前需过滤灭菌消毒。

1.2.2培养基配制

基本培养基成份和用量为：马铃薯上清液48g·L^-1；大量元素：100.0mg·L^{- 1}NH₄NO₃，168.5mg·L^-1KNO₃，36mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，42.3mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，15.6mg·L^{- 1}KH₂PO₄；铁盐：14.6mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，6.25mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O。

根茎切片组织芽体（茎叶体）诱导培养基及培养条件：基本培养基中附加2.8mg·L^-1噻苯隆（TDZ）、0.12mg·L^-1ABT和0.50mg·L^-1赤霉素，7.5g·L^-1琼脂粉，添加60g·L^-1蔗糖，并调节培养基pH值至5.6；根茎切片组织接种后培养瓶置于光照周期5h·d^-1、光照强度600lx和温度26±2℃条件下培养。

芽体（茎叶体）生根复壮生长培养基及培养条件：基本培养基中附加0.02mg·L^{- 1}ABT，7.0g·L^-1琼脂粉，添加5g·L^-1蔗糖，并调节培养基pH值为5.8。胚状体接种后培养瓶置于光照周期12h·d^-1、光照强度1000lx和温度28±2℃条件下培养。

1.2.3操作方法

（1）材料处理：在超净工作台内，将1.1中经消毒灭菌后的茎段用无菌手术刀和镊子切割成0.2cm的根茎切片组织，分批次放入过滤灭菌消毒的体积百分比浓度为0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%、1.3%、1.5%、1.7%甲基磺酸乙酯（EMS）以及作为对照液的磷酸盐缓冲液（CK，为0%）中浸泡，浸泡时间为30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min以及对照液（CK，为120min）（浸泡时间依据根茎切片组织死亡率经预实验获得），浸泡后用无菌水冲洗根茎切片组织10次，以备接种；

（2）根茎切片组织芽体（茎叶体）诱导培养：将上述经过EMS浸泡后的根茎切片组织转接到根茎切片组织芽体（茎叶体）诱导培养基（培养基成分见1.2.2）中，并光照周期5h·d^-1、光照强度600lx和温度26±2℃条件下培养65天，根茎切片组织茎皮上产生独立、可分离的芽体，并继续培养15天，芽体长至0.5cm（如图1所示）；

（3）芽体（茎叶体）生根复壮生长培养：当上述芽体长至0.5cm后，将芽体剥离转接到芽体生根复壮生长培养基（培养基成分见1.2.2）中进行生根复壮生长培养，同时置于光照周期12h·d^-1、光照强度1000lx和温度28±2℃条件下培养40天，芽体生根完全发育生长为含有根和茎叶的小植株；

（4）移栽和定植及品系确定：当小植株在培养瓶中长到2.0cm左右时，从瓶中取出经驯化炼苗后栽植到营养钵中，待长至30cm时，定植栽培到田间，观察其生长情况。根据其长势、茎、株型等形态特征差别进行分类上标签，并将差异植株进行组培快繁后不同适宜地域栽培，根据长势、形态特性、芽萌发力和大小、产量及稳定性抗性、种子苗遗传情况等因素筛选确定遗传稳定的优良性状突变体作为品系，并进行编号（品系代码）。

为了减少实验次数以及确保甲基磺酸乙酯体积比浓度与浸泡时间两因素匹配的合理性，通过均匀设计法设计试验，选用U₈(8²)均匀表，每个处理接种30个根茎切片组织，重复3次，筛选并确定影响辽东楤木根茎切片组织分化突变体的EMS体积比浓度和浸泡时间最佳配比。突变率=突变体数/由芽体形成的小植株并栽培成活植株总数×100%。

2 结果与分析

2.1 EMS体积比浓度和浸泡时间对辽东楤木根茎切片组织再分化突变体的影响

表1影响辽东楤木根茎切片组织分化突变体因素筛选的U₈(8²)试验设计与结果

试验所得数据（表1）经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为Y=-1.15＋1.11X₁＋0.0166X₂，显著性水平α=0.05，复相关系数R=0.9702，剩余标准差S=0.171，检验值F_t=40.02﹥临界值F_(0.05,2,5)=5.786，回归方程具有显著性，甲基磺酸乙酯体积比浓度和浸泡时间对辽东楤木根茎切片组织突变的影响均显著，具有一定规律性突变。通过计算甲基磺酸乙酯体积比浓度和浸泡时间对突变的贡献值和贡献率可知，U₁=1.90，U₁/U=81.0%；U₂=1.07，U₂/U=45.5%，说明甲基磺酸乙酯对辽东楤木根茎切片组织突变的贡献大于浸泡时间。由回归方程可知EMS体积比浓度和浸泡时间均与突变率呈正相关，又因在预实验时以1.7%的EMS浸泡100min，根茎切片组织成活率不足8%，尽管EMS体积比浓度和浸泡时间均与突变率呈正相关，EMS体积比浓度和浸泡时间的增加导致根茎切片组织成活率降低也没有实验意义。

因此，根据试验结果和回归分析，为确保根茎切片组织成活率和较高的突变率，选择EMS体积比浓度1.60%和浸泡时间为90min进行了验证试验，结果发现，接种后根茎切片组织成活率达80%以上，经8年栽培观察，突变率达2.46%，在栽培的122个单株中又获得3个遗传稳定的突变体。

经过甲基磺酸乙酯浸泡后的根茎切片组织转接到根茎切片组织芽体（茎叶体）诱导培养基中通过65天左右的培养，根茎切片组织茎皮上产生独立、可分离的芽体（茎叶体），继续培养15天，芽体长至0.5cm后，将芽体（茎叶体）剥离转接到芽体（茎叶体）生根复壮生长培养基中进行生根复壮生长培养，培养40天左右，芽体（茎叶体）生根完全发育生长为含有根和茎叶的小植株，小植株高度达1.0cm左右。通过以上系列试验可知，利用辽东楤木根茎切片组织通过甲基磺酸乙酯浸泡与植物组织培养技术相结合的方法可获得较高的突变率，且突变体性状遗传稳定，可作为品系进行栽培和构建辽东楤木突变体库。

迄今，所有单株经过3个适宜区域栽培10年，获得14个遗传稳定单株，其中1个为无刺、萌发力强、芽大、产量高而稳定且抗性强的优良性状品系。以下为优良性状突变体品系的特性简介（品系图片详见图2）。

无刺、萌发力强、芽大、产量高而稳定且抗性强的优良性状品系（品系代码：2014-011）：2014年，从EMS诱导野生辽东楤木根茎切片组织产生的突变体中选出的单株，该品系树干、茎枝、叶柄均无刺，株型大。嫩芽红紫色，嫩芽大且萌发力强，叶伸展后其表面和背面局部呈不规则性红紫色。丰产、稳定性好，抗性强，采收期长，品质优良，耐储运，产量高于野生种20-25%以上。适合吉林省东南部地区栽培。

本发明以辽东楤木种根茎切片组织为材料，通过适宜浓度的甲基磺酸乙酯浸泡一定时间，再结合植物组织培养技术，通过采用根茎切片组织芽体（茎叶体）诱导、芽体（茎叶体）生根复壮生长等途径获得遗传稳定突变体，该突变体具有各单株独立性强、单株遗传信息纯度高、单株来源清晰等特征的新型的辽东楤木人工栽培品种，该品种遗传稳定，可作为品系栽培和构建辽东楤木突变体库。

上述仅为本发明的优选具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (6)

1.诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)材料选择与预处理：选取10月中下旬直径为0.3cm的野生辽东楤木根茎，用无菌水和软毛刷将根茎表面的少量泥土洗净，切割成1.0cm茎段；接着用75%乙醇涮洗15s后移至饱和次氯酸钠溶液浸泡10min，无菌水冲洗15次，并用无菌滤纸吸干表面水分；接着在超净工作台内，将茎段用无菌手术刀和镊子切割成0.2cm的根茎切片组织，将根茎切片组织分批放入不同浓度的EMS溶液中，浸泡30-120min，EMS以浓度为0.1mol·L^-1、pH＝7的磷酸盐缓冲液作为溶剂配制成体积百分比浓度为0.3-1.7%的EMS溶液；最后用无菌水冲根茎切片组织10次以备接种；

(2)根茎切片组织芽体的诱导培养：将步骤(1)中经过EMS浸泡后的根茎切片组织转接到根茎切片组织芽体诱导培养基中，并置于光照周期5h·d^-1、光照强度600lx和温度26±2℃条件下培养65天，根茎切片组织茎皮上产生独立、可分离的芽体，并继续培养15天，芽体长至0.5cm；所述根茎切片组织芽体诱导培养基为基本培养基附加2.8mg·L^-1 TDZ、0.12mg·L^-1ABT和0.50mg·L^-1赤霉素，以及7.5g·L^-1琼脂粉，60g·L^-1蔗糖；

(3)芽体生根复壮生长培养：步骤(2)中芽体长至0.5cm后，将芽体剥离转接到芽体生根复壮生长培养基中进行生根复壮生长培养，同时置于光照周期12h·d^-1、光照强度1000lx和温度28±2℃条件下培养40天，芽体生根完全发育生长为含有根和茎叶的小植株；所述芽体生根复壮生长培养基为基本培养基附加0.02mg·L^-1 ABT，以及7.0g·L^-1琼脂粉，5g·L^-1蔗糖；

(4)移栽和定植及品系确定：当步骤(3)中小植株在培养瓶中长至2.0cm时，从瓶中取出经驯化炼苗后栽植于营养钵中，待长至30cm时，定植栽培到田间，观察其生长情况，并进行分类及注标签；接着将差异植株进行组培快繁，组培快繁后栽培于不同适宜地域；最后进行筛选确定遗传稳定的优良性状突变体作为品系，并进行编号；

所述基本培养基由下列物质组成：马铃薯上清液48g·L^-1；大量元素：100.0mg·L^{- 1}NH₄NO₃，168.5 mg·L^-1KNO₃，36mg·L^-1CaCl₂·2H₂O，42.3mg·L^-1MgSO₄·7H₂O，15.6mg·L^-1 KH₂PO₄；铁盐：14.6mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，6.25mg·L^-1Na₂·EDTA·2H₂O。

2.根据权利要求1所述的诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法，其特征在于：所述不同浓度的EMS溶液分别为体积百分比0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、0.16%、1.1%、1.3%、1.5%、1.7%的EMS溶液。

3.根据权利要求2所述的诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法，其特征在于：所述不同浓度的EMS溶液分别对应的浸泡时间为30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min、100min。

4.根据权利要求1所述的诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法，其特征在于：所述根茎切片组织芽体诱导培养基的pH值为5.6。

5.根据权利要求1所述的诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法，其特征在于：所述芽体生根复壮生长培养基的pH值为5.8。

6.根据权利要求1所述的诱导辽东楤木根茎切片组织突变的新品种培育方法，其特征在于：突变体分类根据突变体长势、茎、株型形态特征中的一种或多种进行差别分类；品系确定根据突变体长势、形态特性、芽萌发力和大小、产量、稳定性抗性、种子苗遗传情况中的一种或多种因素进行筛选。

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