CN115125261B - 百山祖冷杉蔗糖合成酶基因和产品及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种百山祖冷杉蔗糖合成酶基因和产品及用途。本发明首次从百山祖冷杉中克隆得到百山祖冷杉蔗糖合成酶基因，并确定其核苷酸序列(SEQ ID NO.1)以及氨基酸序列(SEQ ID NO.2)，填补了现有技术中对百山祖冷杉蔗糖合成酶及其生物合成基因未知的空白，为百山祖冷杉的相关研究提供了理论和基础支持。此外，发明人通过将百山祖冷杉蔗糖合成酶基因重组得到重组载体和工程菌，并且成功纯化得到百山祖冷杉蔗糖合成酶基因，在体外酶活实验中该酶可将蔗糖和尿苷二磷酸催化合成尿苷二磷酸葡萄糖及其逆向反应，是一种双向反应酶，在生物合成及其代谢途径中具有重要意义。

Description

百山祖冷杉蔗糖合成酶基因和产品及用途

技术领域

本发明涉及植物分子生物学领域，具体而言，涉及一种百山祖冷杉蔗糖合成酶基因和产品及用途。

背景技术

百山祖冷杉(Abies beshanzuensis M.H.Wu)起源古老，是第四纪冰川时期的孑遗植物，素有“植物活化石”之称，耐阴、喜冷湿，分布于百山祖主峰海拔1740-1750m处，是低纬度地区的冷杉属等高寒植物在第四纪冰川末期从低海拔向高海拔山体退缩的佐证。百山祖冷杉是国家一级重点保护野生植物，目前，野生成年百山祖冷杉全世界仅存3株，处于极度濒危状态。百山祖冷杉对于其所在植物区系的发生和演变具有很高的科研和保护价值。

百山祖冷杉属于菌根共生型植物，脱离共生关系难以利用根系吸收利用营养物质，糖是菌根共生型植物营养吸收限制的重要因素之一。糖类是植物重要的结构组成、能源物质和调节根系功能的信号分子，在植物体内运输过程对根系形态建成至关重要。蔗糖是碳水化合物从光合作用来源组织转运到库组织的主要形式，不仅作为植物代谢的能量来源和结构物质，同时还作为信号分子调节相关基因，参与植物体内众多生理生化代谢过程。然而，目前关于百山祖冷杉中蔗糖类合成酶的生物合成基因尚未被分离和鉴定。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种百山祖冷杉蔗糖合成酶基因，以填补现有技术对百山祖冷杉中蔗糖类合成酶及其生物合成基因未知的空白。

本发明第二目的在于提供百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的扩增引物对，可以快速、准确得到百山祖冷杉蔗糖合成酶基因。

本发明的第三目的在于提供百山祖冷杉蔗糖合成酶及其在生产蔗糖和/或尿苷二磷酸葡萄糖中的应用，填补现有技术中缺少百山祖冷杉蔗糖合成酶的空白，同时提供该合成酶的工业应用。

本发明的第四目的在于提供一种蔗糖、尿苷二磷酸和/或尿苷二磷酸葡萄糖的生产方法，填补现有技术中缺少可以利用生物技术工业化生产蔗糖、尿苷二磷酸和/或尿苷二磷酸葡萄糖方法的空白。

本发明的第五目的在于提供含有百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的重组载体和工程菌及其应用，为百山祖冷杉蔗糖合成酶的获取和利用提供更简便的生物模块。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种百山祖冷杉蔗糖合成酶基因，百山祖冷杉蔗糖合成酶基因核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的扩增引物对，所述扩增引物对如下：

正向引物为：5’-ATGGTTGCTGCAACGCTGACC-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为：5’-CTAGTCTGTACTCTTCTCTTCAAT-3’(SEQ ID NO.4)。

一种百山祖冷杉蔗糖合成酶，百山祖冷杉蔗糖合成酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

百山祖冷杉蔗糖合成酶在生产蔗糖、尿苷二磷酸和/或尿苷二磷酸葡萄糖中的应用。

一种蔗糖和/或尿苷二磷酸葡萄糖的生产方法，利用上述百山祖冷杉蔗糖合成酶双向催化蔗糖和尿苷二磷酸，得到蔗糖、尿苷二磷酸和/或尿苷二磷酸葡萄糖。

一种含有百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的重组载体，所述重组载体包括百山祖冷杉蔗糖合成酶基因和载体；

百山祖冷杉蔗糖合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述载体包括表达载体或克隆载体；

优选地，表达载体包括pET-32a；

优选地，克隆载体包括pClone007。

一种含有百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的工程菌，所述工程菌包括百山祖冷杉蔗糖合成酶基因和宿主细胞，百山祖冷杉蔗糖合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述宿主细胞包括大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21。

含有百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的重组载体，或工程菌，在生产蔗糖、尿苷二磷酸和/或尿苷二磷酸葡萄糖中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明首次从百山祖冷杉中克隆得到百山祖冷杉蔗糖合成酶基因，并确定其核苷酸序列以及氨基酸序列，填补了现有技术中对百山祖冷杉中蔗糖类合成酶及其生物合成基因未知的空白，为百山祖冷杉的相关研究提供了理论和基础支持。此外，通过将百山祖冷杉蔗糖合成酶基因重组得到重组载体和工程菌，并且成功纯化得到百山祖冷杉蔗糖合成酶，是一种双向反应酶，在体外酶活实验中该酶可将蔗糖和尿苷二磷酸催化合成或尿苷二磷酸葡萄糖及其逆向反应，将在生物合成及其代谢途径中具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中的百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的PCR片段；

图2为实施例3中的SDS-PAGE分析百山祖冷杉蔗糖合成酶上清纯化结果，其中，泳道1：诱导后；泳道2：P破菌沉淀；泳道3：Pre上柱流出液；泳道4：Aft流出蛋白；泳道5：5％洗杂蛋白；泳道6：30％洗脱蛋白；泳道7：100％洗脱蛋白；泳道8：marker(kDd)；

图3为实施例3中的western-blot检测百山祖冷杉蔗糖合成酶纯化结果；

图4为实施例4中的UPLC-Triple-TOF-MS检测尿苷二磷酸葡萄糖图谱(a,对照组——未加入百山祖冷杉蔗糖合成酶；b,实验组——加入百山祖冷杉蔗糖合成酶)；

图5为实施例4中的UPLC-Triple-TOF-MS检测尿苷二磷酸葡萄糖二级离子特征峰；

图6为实施例4中的UPLC-Triple-TOF-MS检测尿苷二磷酸图谱(a,对照组——未加入百山祖冷杉蔗糖合成酶；b,实验组——加入百山祖冷杉蔗糖合成酶)；

图7为实施例4中的UPLC-Triple-TOF-MS检测尿苷二磷酸二级离子特征峰；

图8为实施例4中的UPLC-Triple-TOF-MS检测蔗糖图谱(a,对照组——未加入百山祖冷杉蔗糖合成酶；b,实验组——加入百山祖冷杉蔗糖合成酶)。

图9为实施例4中的UPLC-Triple-TOF-MS检测蔗糖二级离子特征峰。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

本发明首次从百山祖冷杉中克隆得到百山祖冷杉蔗糖合成酶基因(下述可称为“SUS”)，并确定其核苷酸序列以及氨基酸序列，填补了现有技术中对百山祖冷杉中萜烯类合成酶及其生物合成基因未知的空白，为百山祖冷杉的相关研究提供了理论和基础支持。

百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的扩增引物对，扩增引物对如下：

正向引物为：5’-ATGGTTGCTGCAACGCTGACC-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为：5’-CTAGTCTGTACTCTTCTCTTCAAT-3’(SEQ ID NO.4)。

本发明提供的扩增引物对可以快速准确地从百山祖冷杉基因组中扩增得到百山祖冷杉蔗糖合成酶基因，特异性好，效率高。

百山祖冷杉蔗糖合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

百山祖冷杉蔗糖合成酶可以用于生产蔗糖、尿苷二磷酸(UDP)和/或尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)。具体地，本发明中百山祖冷杉蔗糖合成酶可以以尿苷二磷酸和蔗糖为底物，催化合成尿苷二磷酸葡萄糖，也可以以尿苷二磷酸葡萄糖为底物催化合成蔗糖和/或尿苷二磷酸，蔗糖、尿苷二磷酸和/或尿苷二磷酸葡萄糖中的任意一种都对植物生物合成及其多种代谢途径中具有重要意义。

一种蔗糖、尿苷二磷酸和/或尿苷二磷酸葡萄糖生产方法，利用本发明的百山祖冷杉蔗糖合成酶催化蔗糖和尿苷二磷酸，得到尿苷二磷酸葡萄糖，或逆向催化合成蔗糖和/或尿苷二磷酸。

在优选地实施方式中，具体的，该生产方法中各原料的用量比例可以参照如下进行：HEPES，50mM；醋酸醋酸钠，50mM；Tris HCl，50mM；Mes/NaOH，50mM；UDP，4mM；蔗糖，200mM，加入100ng纯化后的百山祖冷杉蔗糖合成酶置于30℃反应25min。

一种含有百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的重组载体，包括百山祖冷杉蔗糖合成酶基因和载体，其中，百山祖冷杉蔗糖合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明提供的重组载体可以包括表达载体或克隆载体，将百山祖冷杉蔗糖合成酶基因重组于表达载体或克隆载体中，构建生物模块，可以实现百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的简便快速利用，快速大量得到目标基因或目标蛋白。在本发明中，表达载体优选为pET-32a；克隆载体优选为pClone007。

一种含有百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的工程菌，工程菌包括百山祖冷杉蔗糖合成酶基因和宿主细胞，百山祖冷杉蔗糖合成酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

将百山祖冷杉蔗糖合成酶基因设置于宿主细胞中，可以快速大量得到目标基因和目标蛋白酶，工程菌构成的生物模块避免了目标基因使用时需要从百山祖冷杉基因组中PCR扩增的繁琐操作。宿主细胞优选为大肠杆菌DH5α或大肠杆菌BL21。

本发明提供一种百山祖冷杉蔗糖合成酶的生产方法，培养本发明提供的工程菌，获得培养物，再从培养物中分离得到百山祖冷杉蔗糖合成酶。

上述重组载体或工程菌在生产蔗糖、尿苷二磷酸和/或尿苷二磷酸葡萄糖中的应用。本发明提供的重组载体和工程菌可以直接进行培养、扩增和表达得到百山祖冷杉蔗糖合成酶，得到的大量活性百山祖冷杉蔗糖合成酶可以用于生产蔗糖、尿苷二磷酸和/或尿苷二磷酸葡萄糖。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。除另有说明外，实施例中涉及的物质含量均为质量分数。

实施例1

克隆百山祖冷杉蔗糖合成酶基因，构建克隆载体及转化原核细胞。

提取百山祖冷杉试管苗根部组织的RNA，采用逆转录酶M-MLV，逆转录反应合成cDNA。以该cDNA为模板，扩增引物如下：

正向引物为：5’-ATGGTTGCTGCAACGCTGACC-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为：5’-CTAGTCTGTACTCTTCTCTTCAAT-3’(SEQ ID NO.4)；

利用Vazyme公司Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，进行PCR扩增。

PCR条件为：98℃，2min；98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min；35个循环；72℃延伸5min。

PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示，其中，图1的M为DNAmarkerDL5000，目标基因百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的片段大小约为2463bp，符合预期。

采用琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒的方法回收目标基因片段，将目标片段进行TA克隆，连接到pClone007载体上，然后将其转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株中。

转化条件为：在50μL感受态细胞中加入5μL连接产物，轻轻混匀，冰上静置25min，42℃水域热激45s，迅速冰浴，静置2min，加入500μL不含抗生素的LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏1h，将菌液3000rpm离心1min，弃400μL上清液，悬浮菌液，涂布于含有抗生素(Amp)的固体LB平板，37℃倒置培养12-16h。

采用菌落PCR进行阳性克隆筛选，筛选方法为：从转化平板上随机挑取单菌落，置于1.5mL离心管中的液体培养基中培养。将每管进行编号，各管取lμL用作模板进行PCR检测，剩余培养物保存于4℃，检测为阳性的菌落于平板或甘油管保存备用。

经测序，成功克隆得到百山祖冷杉蔗糖合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其含有2463个碱基，共编码820个氨基酸。同时得到将百山祖冷杉蔗糖合成酶基因插入到pClone007克隆载体的重组载体以及将重组载体成功转化至原核细胞大肠杆菌DH5α中的阳性工程菌。

实施例2

蔗糖合成酶基因构建表达载体及转化原核细胞。

将实施例1中克隆好的目标片段通过同源重组的方式转化到pET32a线性化载体上。反应条件为：将反应体系混合后置于37℃孵育30min，然后于20℃1h，将5μL反应液加到50μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞中，混匀冰浴静置30min，轻轻取出，42℃，热激60s，立即冰浴2min，加入500μL LB培养基37℃培养1h；去100μL菌液涂布于含有Amp抗性的LB平板上，过夜培养。

挑取抗生素(Amp)筛选得到的阳性菌落，提取质粒得到原核表达载体。将原核表达载体转入到大肠杆菌BL21菌株中，37℃，200rpm，待培养至OD₆₀₀为0.6，向试管培养液中加入终浓度0.l mM IPTG，之后分别置于15℃和37℃诱导表达,得到大量表达百山祖冷杉蔗糖合成酶的菌液。

实施例3

百山祖冷杉蔗糖合成酶的原核表达、蛋白纯化、蛋白质检。

挑选实施例2中含重组质粒的单菌落至3mL LB液体培养基(氨苄抗性)中，37℃培养过夜后-20℃保种。

挑选含重组质粒的单菌落至3mL LB液体培养基(氨苄抗性)中，37℃震荡培养至OD₆₀₀约0.6，取部分菌液作为对照组，余下菌液加入IPTG诱导剂(终浓度1mM)，37℃震荡培养3h；分别取两组菌液0.15mL，12000×g离心2min，菌体沉淀以40μL 1×loading buffer重悬裂解，SDS-PAGE检测。结果如图2所示，目标蛋白90kd，标签17kd，融合蛋白约107kd。其中，泳道1：诱导后；泳道2：P破菌沉淀；泳道3：Pre上柱流出液；泳道4：Aft流出蛋白；泳道5：5％洗杂蛋白；泳道6：30％洗脱蛋白；泳道7：100％洗脱蛋白；泳道8：marker(kDd)。

取保存于-20℃的菌种100μL接种于100mL LB液体培养基(氨苄抗性)中震荡培养过夜；取100mL菌液接种于2000mL LB液体培养基中，37℃扩大培养至OD₆₀₀约0.6，降低培养温度到30℃；加入IPTG诱导剂至终浓度0.5mM，30℃继续震荡培养3h；8000rpm离心3min收集菌体，重悬于50mL预冷NTA-0缓冲液中，冰浴30min。

超声破碎菌体，参数设置为功率200W、工作3s、暂停4s、99个循环；16000rpm 4℃离心50min，收集上清以及沉淀；取少量上清及沉淀进行SDS-PAGE检测，剩余上清及沉淀至于4℃备用。

上清蛋白溶液用0.22μm过滤器过滤备用；准备Ni-NTA柱；以1mL/min的流速上样上清蛋白溶液；以NTA-0缓冲液(pH8.0)洗柱至流出液不含蛋白(G250检测液不变色)；分别以20mM、60mM、200mM和500mM咪唑洗脱，分段收集洗脱液至G250检测液不变色；以3倍柱体积去离子水洗涤柱料，以20％乙醇封柱；对收集的洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测，对百山祖冷杉蔗糖合成酶进行Western检测。结果如图3所示，目标蛋白90kd，标签17kd，融合蛋白约107kd。

实施例4

百山祖冷杉蔗糖合成酶的生化功能

以蔗糖和尿苷二磷酸(UDP)为底物，酶促反应体系为：HEPES，50mM；醋酸醋酸钠，50mM；Tris HCl，50mM；Mes/NaOH，50mM；UDP，4mM；蔗糖，200mM，加入100ng纯化后的百山祖冷杉蔗糖合成酶置于30℃反应25min收集产物；

以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)为底物，酶促反应体系为：HEPES，50mM；醋酸醋酸钠，50mM；Tris HCl，50mM；Mes/NaOH，50mM；UDP，4mM；蔗糖，200mM，置于30℃反应25min收集产物作为对照；

超高效液相色谱串联三重四级杆飞行时间质谱法(UPLC-Triple-TOF-MS)对产物进行检测。

利用Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8μm 3.0×50mm色谱柱(Waters,Elstree,UK)在Waters UPLC(Waters Corp.,Milford,MA,USA)上进行糖类化合物的分离、鉴定，紫外可见检测器(UV)检测。对于所有分析，自动进样10μL提取物(上清液)，柱温保持在30℃，UV检测器设置为254nm。流速为0.4mL/min的流动相由0.5％甲酸水溶液(洗脱液A)和含0.5％甲酸的乙腈(洗脱液B)组成。体积比梯度程序如下：2％ B，0min；2-5％ B 0-0.5min；5-8％B，0.5-4min；8-20％ B，4-7min；20-35％ B，7-10min；35-70％ B，10-13min；70-95％B，13-16min；95-2％ B，16-17min；2-2％ B，17-20min。

质谱分析在配备ESI(电喷雾电离源)系统的AB Triple TOF 5600+系统(ABSCIEX，Framingham，USA)上进行。实验在负电离模式下进行，源电压为-4.5kV，源温度设置为550℃。气体1(空气)和气体2(空气)的压力设置为50psi，而帘式气体(N₂)的压力设置为35psi。最大允许误差设置为±5ppm。将去簇电位(DP)设置为100V，将碰撞能量(CE)设置为10V。对于MS/MS采集模式，参数几乎相同，只是碰撞能量(CE)设置为50±20eV，离子释放延迟(IRD)设置为67，离子释放宽度(IRW)设置为25。IDA-基于自动MS2在一个全扫描周期(1s)中对8个最强的代谢物离子进行。母离子和子离子的m/z扫描范围分别设置为100-1,500Da和501,500Da。利用自动校准交付系统自动执行精确的质量校准。

尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)检测结果如图4、图5所示。

尿苷二磷酸(UDP)检测结果如图6、图7所示。

蔗糖检测结果如图8、图9所示。

表明本发明百山祖冷杉蔗糖合成酶能双向催化蔗糖和尿苷二磷酸/尿苷二磷酸葡萄糖反应。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (2)

1.包含百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的重组载体/工程菌在生产蔗糖、尿苷二磷酸和/或尿苷二磷酸葡萄糖中的应用，其特征在于，所述包含百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的重组载体/工程菌通过如下方法构建获得：

提取百山祖冷杉试管苗根部组织的RNA，采用逆转录酶M-MLV，逆转录反应合成cDNA；

以该cDNA为模板，扩增引物如下：

正向引物为：5’-ATGGTTGCTGCAACGCTGACC-3’；

反向引物为：5’-CTAGTCTGTACTCTTCTCTTCAAT-3’；

利用Vazyme公司Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，进行PCR扩增；

PCR条件为：98℃，2min；98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min；35个循环；72℃延伸5min；

采用琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒的方法回收目标基因片段，将目标片段进行TA克隆，连接到pClone007载体上，然后将其转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株中，采用菌落PCR进行阳性克隆筛选，得到将百山祖冷杉蔗糖合成酶基因插入到pClone007克隆载体的重组载体以及将重组载体成功转化至原核细胞大肠杆菌DH5α中的阳性工程菌。

2.一种蔗糖和/或尿苷二磷酸葡萄糖的生产方法，其特征在于，利用百山祖冷杉蔗糖合成酶催化蔗糖和尿苷二磷酸，得到尿苷二磷酸葡萄糖，或催化尿苷二磷酸葡萄糖得到尿苷二磷酸和/或蔗糖，所述百山祖冷杉蔗糖合成酶由包含百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的重组载体/工程菌表达获得；

所述包含百山祖冷杉蔗糖合成酶基因的重组载体/工程菌通过如下方法构建获得：

提取百山祖冷杉试管苗根部组织的RNA，采用逆转录酶M-MLV，逆转录反应合成cDNA；

以该cDNA为模板，扩增引物如下：

正向引物为：5’-ATGGTTGCTGCAACGCTGACC-3’；

反向引物为：5’-CTAGTCTGTACTCTTCTCTTCAAT-3’；

利用Vazyme公司Phanta Max Super-Fidelity DNA聚合酶，进行PCR扩增；

PCR条件为：98℃，2min；98℃，10sec；55℃，15sec；72℃，2min；35个循环；72℃延伸5min；

采用琼脂糖凝胶电泳胶回收试剂盒的方法回收目标基因片段，将目标片段进行TA克隆，连接到pClone007载体上，然后将其转化到大肠杆菌DH5α克隆菌株中，采用菌落PCR进行阳性克隆筛选，得到将百山祖冷杉蔗糖合成酶基因插入到pClone007克隆载体的重组载体以及将重组载体成功转化至原核细胞大肠杆菌DH5α中的阳性工程菌。