CN111670703A - 一种百山祖冷杉高效嫁接的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种百山祖冷杉高效嫁接的方法，旨在解决百山祖冷杉对低海拔地区气候条件适应性差的问题。本发明以百山祖冷杉试管苗为接穗，选取适应中低海拔地区生长的冷杉属其他物种试管苗为砧木，在保留砧木顶端分生组织的基础上，利用植物生长调节剂处理砧木与接穗接触表面后，嫁接百山祖冷杉的接穗，经过嫁接部位愈合、炼苗、移栽驯化等阶段获得百山祖冷杉嫁接苗。本发明利用百山祖冷杉和同属其他物种的无菌试管苗，短时间内获得较多的试管嫁接苗，且嫁接部位愈合速度快，成活率高，能够改善百山祖冷杉在自然条件下分布范围狭窄的问题。该方法快速高效，对改良百山祖冷杉，提高百山祖冷杉环境适应性，扩大百山祖冷杉适生海拔范围具有重要意义。

Description

一种百山祖冷杉高效嫁接的方法
技术领域
本发明涉及一种百山祖冷杉高效嫁接的新方法，从而达到提高濒危物种对低海拔地区气候适应性的目的。
背景技术
百山祖冷杉(Abies Beshanzuensis M.H.Wu)是中国植物学者吴鸣翔于1976年发表的松科冷杉属新种，是我国特有的古老孑遗植物。自然条件下，百山祖冷杉群体数量极少，1987年，被国际自然保护联盟物种生存委员会列为全球最濒危的12种植物之一。
第三世纪百山祖冷杉曾在苏、浙、皖、闽等省广泛分布，然而，在经历了第四冰川时期和间冰期后，百山祖冷杉的生境发生了剧变，严重影响了百山祖冷杉的生长繁育，导致群体数量骤减，呈孤岛状分布。目前百山祖冷杉的野生植株仅存在于浙江省南部庆元县百山祖的高海拔地区(海拔1750m)，在中低海拔地区未见自然分布，由此可见百山祖冷杉对不同气候条件，尤其对不同海拔的自然条件适应性有限。同时，百山祖冷杉存在群体数量极少、种子败育率高和自然更新困难的问题，导致百山祖冷杉处于极度濒危的状态。因此需要探索一种快速改善百山祖冷杉适应性的新方法，以达到更新复壮百山祖冷杉的目的。
试管嫁接，是指对生长在试管内或培养皿中的植物幼苗进行嫁接而获得新植株的一种技术。和一般方法相比，试管嫁接技术具有许多独特的优点，可显著提高砧木与接穗之间的亲和力，同时减少了季节、温度、湿度、土壤等外部环境的限制。通过选取对不同海拔气候适应能力更强的同属近缘物种为砧木，保留砧木顶端分生组织的试管嫁接方法，有效地提高了百山祖冷杉嫁接的成活率，同时缩短了嫁接部位愈合的时间。因此，利用试管嫁接技术改良百山祖冷杉，可以获得海拔适应范围更广的百山祖冷杉植株，有效地促进了百山祖冷杉的更新复壮，为扩大百山祖冷杉种群数量提供坚实的基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种百山祖冷杉高效嫁接的新方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种百山祖冷杉高效嫁接的方法，包括如下步骤：
(1)采摘百山祖冷杉与日本冷杉的球果，剥取其未成熟胚及胚乳进行培养，获得无菌的试管苗；
(2)在超净工作台上，依次将步骤1得到的试管苗置于体视显微镜下，利用无菌手术刀和镊子对其进行切割。然后，将其放置于含有湿润滤纸的培养皿中备用；其中，日本冷杉的试管苗作为砧木，切割时保留顶端分生组织；百山祖冷杉的试管苗作为接穗。
(3)在无菌条件下，将准备好的砧木和接穗放入含有植物生长调节剂水溶液中进行浸泡，然后将砧木和接穗放置于体视显微镜下进行试管嫁接，并用硅胶嫁接管固定嫁接部位；
(4)嫁接完成后，将嫁接试管苗接种至培养基上进行弱光培养，砧木和接穗愈合后，将其移至正常光照条件下培养；
(5)嫁接苗培养30d后，将嫁接试管苗进行高光强炼苗，并打开瓶口，使其逐渐适应外界环境。3d后，洗去植株根部附着的培养基，将植株移栽至人工配制的混合培养基质中，浇水至基质湿润，于人工气候箱中培养。
进一步地，在所述步骤(1)中，所述百山祖冷杉和日本冷杉的球果采摘时间为8月中旬。
进一步地，在所述步骤(1)中，所述用于嫁接的无菌试管苗苗龄是10～15d。
进一步地，在所述步骤(2)中，所述砧木日本冷杉的切割方法为：在超净工作台上，将日本冷杉的无菌试管苗置于体视显微镜下，利用无菌手术刀将试管苗的顶端分生组织沿中心轴纵切0.5～0.7cm。
进一步地，在所述步骤(2)中，所述接穗百山祖冷杉的切割方法为：左手持镊子固定百山祖冷杉无菌试管苗，右手持手术刀，在试管苗胚根上方0.5cm处切长0.5cm的“V”字型切口，保留切口以上的部分，将其放置于含有湿润滤纸的培养皿中备用。
进一步地，在所述步骤(3)中，所述植物生长调节剂水溶液的配方是：细胞分裂素6-BA的浓度为2mg·L-1，生长素NAA的浓度为1mg·L-1。
进一步地，在所述步骤(3)中，所述试管嫁接的方法为：首先，将硅胶嫁接管从砧木日本冷杉根端套入至切口的下方。双手持镊子，在体视显微镜下，将接穗插入砧木的切口中，然后迅速将砧木上预留的硅胶管上滑至嫁接部位。
进一步地，在所述步骤(3)中，所述硅胶嫁接管制备方法为：将直径0.1cm的厚壁硅胶管横切成长度为0.7cm的小段后，进行单侧纵切并利用高压蒸汽灭菌法灭菌备用。
进一步地，在所述步骤(4)中，所述培养基以DCR(Gupta and Durzan medium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、酶水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、酶水解酪蛋白的浓度分别为20g·L-1、8g·L-1、500mg·L-1，培养基的pH为5.8。
进一步地，在所述步骤(4)中，所述弱光光照条件和正常光照条件的光强分别为20±5μmol·m-2·s-1和80±5μmol·m-2·s-1。
进一步地，在所述步骤(5)中，所述高光强炼苗的培养条件为：光照强度为120±5μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1，温度为20±2℃。
进一步地，在所述步骤(5)中，所述人工配制的混合培养基质配方：将泥炭土、赤玉土和松鳞按照体积比3:1:1进行混合。
本发明的优点是：本发明所采用的接穗和砧木为百山祖冷杉和同属适应性强的近缘物种的无菌苗，植株活力高，嫁接后易存活，嫁接部位愈合速度快且嫁接不受环境条件限制，能够在短时间内获得较多的百山祖冷杉嫁接苗。该方法快速高效，污染率低，对改良百山祖冷杉，提高百山祖冷杉环境适应性，扩大百山祖冷杉适生海拔范围具有重要意义。
附图说明
图1是百山祖冷杉与日本冷杉试管嫁接。
图中，A为百山祖冷杉试管苗，B为日本冷杉试管苗，C为百山祖冷杉与日本冷杉试管嫁接苗，D为实施例嫁接部位示意图，E为对比例嫁接部位示意图，①为百山祖冷杉与日本冷杉试管嫁接苗的嫁接部位，②为接穗百山祖冷杉，③为硅胶管，④为砧木日本冷杉。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例
材料：本实例以百山祖冷杉和日本冷杉的未成熟球果为材料。
步骤(1)：试管苗培养
采摘8月中旬的百山祖冷杉和日本冷杉球果，用镊子剥取种子并置于流水下冲洗3h后，在超净工作台对种子进行表面灭菌处理。处理方式为：用75％乙醇处理1min，无菌水冲洗3次，每次1min。再用0.1wt％氯化汞处理8min，无菌水冲洗3次，每次1min，用无菌滤纸吸干表面水分。
然后左手用无菌镊子固定种子，右手用无菌解剖刀在种皮边缘纵切，用镊子将种皮从胚乳上分离。将胚乳水平接种到培养基上。培养基以DCR(Gupta and Durzan medium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、酶水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、酶水解酪蛋白的浓度分别为20g·L-1、8g·L-1、500mg·L-1，培养基的pH为5.8。
接种后的成熟胚及其胚乳先于20±2℃黑暗条件下培养3d，再弱光光照条件下培养至种子萌发，所述弱光光照条件为：光照强度为20±5μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1。
步骤(2)：萌发后培养
将萌发后的幼苗从胚乳中分离并接种至培养基上进行培养，培养基以DCR为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、酶水解酪蛋白等，浓度分别为20g·L-1、8g·L-1、500mg·L-1，培养基的pH为5.8。培养条件为温度20±2℃、光照强度为80±5μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1。
步骤(3)：试管嫁接
幼苗萌发10～15d后，选择胚轴直径相似的百山祖冷杉与日本冷杉的试管苗进行嫁接(图1)。首先准备砧木材料，在超净工作台上，将日本冷杉的无菌试管苗置于体视显微镜下，利用无菌手术刀将试管苗的顶端分生组织沿中心轴纵切0.5～0.7cm。然后，将其放置于含有湿润滤纸的培养皿中备用。然后准备接穗材料，左手持镊子固定百山祖冷杉无菌试管苗，右手持手术刀，在试管苗胚根上方0.5cm处切长0.5cm的“V”字型切口，保留切口以上的部分，将其放置于含有湿润滤纸的培养皿中备用。
依次将准备好的砧木和接穗放入已过滤灭菌的植物生长调节剂的水溶液(细胞分裂素6-BA的浓度为2mg·L-1，生长素NAA的浓度为1mg·L-1)中进行浸泡1min，然后将砧木和接穗放置于体视显微镜下，硅胶嫁接管从砧木日本冷杉根端套入至切口的下方(硅胶嫁接管制备方法为：将直径0.1cm的厚壁硅胶管横切成长度为0.7cm的小段后，进行单侧纵切并利用高压蒸汽灭菌法灭菌备用)。双手持镊子，在体视显微镜下，将接穗插入砧木的切口中，然后迅速将砧木上预留的硅胶管上滑至嫁接部位。
步骤(4)：嫁接后管理
用镊子夹紧嫁接部位，然后将嫁接后的试管苗接种至培养基(同步骤1)中，于光照强度为20±5μmol·m-2·s-1弱光条件下进行培养，7d后砧木和接穗愈合后，将其移至光照强度为80±5μmol·m-2·s-1的正常光照条件下进行培养。培养条件为温度20±2℃、光照时间为12h·d-1。每日观察嫁接苗生长情况。若两周后接穗保持绿色并持续生长，说明嫁接成功，本方法的嫁接成活率在95％以上。
步骤(5)：嫁接苗移栽驯化
嫁接30d后，将嫁接试管苗进行高光强炼苗(光照强度为120±5μmol·m-2·s-1)，使植株生长粗壮，并打开瓶口，降低湿度，使其逐渐适应外界环境。3d后，洗去植株根部附着的培养基，将植株移栽至人工配制的混合培养基质(泥炭土、赤玉土和松鳞按照体积比3:1:1进行混合)中，于人工气候箱中培养。
对比例
材料：同样以百山祖冷杉和日本冷杉的未成熟球果为材料。
步骤(1)：试管苗培养
采摘8月中旬的百山祖冷杉和日本冷杉球果，用镊子剥取种子并置于流水下冲洗3h后，在超净工作台对种子进行表面灭菌处理。处理方式为：用75％乙醇处理1min，无菌水冲洗3次，每次1min。再用0.1wt％氯化汞处理8min，无菌水冲洗3次，每次1min，用无菌滤纸吸干表面水分。
然后左手用无菌镊子固定种子，右手用无菌解剖刀在种皮边缘纵切，用镊子将种皮从胚乳上分离。将胚乳水平接种到培养基上。培养基以DCR(Gupta and Durzan medium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、酶水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、酶水解酪蛋白的浓度分别为20g·L-1、8g·L-1、500mg·L-1，培养基的pH为5.8。
接种后的成熟胚及其胚乳先于20±2℃黑暗条件下培养3d，再弱光光照条件下培养至种子萌发，所述弱光光照条件为：光照强度为20±5μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1。
步骤(2)：萌发后培养
将萌发后的幼苗从胚乳中分离并接种至培养基上进行培养，培养基以DCR为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、酶水解酪蛋白等，浓度分别为20g·L-1、8g·L-1、500mg·L-1，培养基的pH为5.8。培养条件为温度20±2℃、光照强度为80±5μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1。
步骤(3)：试管嫁接
幼苗萌发10～15d后，选择胚轴直径相似的百山祖冷杉与日本冷杉的试管苗进行嫁接(图1)。首先准备砧木材料，在超净工作台上，将日本冷杉的无菌试管苗置于体视显微镜下，利用无菌手术刀在试管苗子叶下0.2～0.5cm处横切去除顶端分生组织和子叶，并将试管苗下端胚轴沿中心轴纵切0.5～0.7cm。然后，将其放置于含有湿润滤纸的培养皿中备用。然后准备接穗材料，左手持镊子固定百山祖冷杉无菌试管苗，右手持手术刀，在试管苗胚根上方0.5cm处切长0.5cm的“V”字型切口，保留切口以上的部分，将其放置于含有湿润滤纸的培养皿中备用。
依次将准备好的砧木和接穗放入已过滤灭菌的植物生长调节剂的水溶液(细胞分裂素6-BA的浓度为2mg·L-1，生长素NAA的浓度为1mg·L-1)中进行浸泡1min，然后将砧木和接穗放置于体视显微镜下，硅胶嫁接管从砧木日本冷杉根端套入至切口的下方(硅胶嫁接管制备方法为：将直径0.1cm的厚壁硅胶管横切成长度为0.7cm的小段后，进行单侧纵切并利用高压蒸汽灭菌法灭菌备用)。双手持镊子，在体视显微镜下，将接穗插入砧木的切口中，然后迅速将砧木上预留的硅胶管上滑至嫁接部位。
步骤(4)：嫁接后管理
用镊子夹紧嫁接部位，然后将嫁接后的试管苗接种至培养基中，于光照强度为20±5μmol·m-2·s-1弱光条件下进行培养，7d后砧木和接穗愈合后，将其移至光照强度为80±5μmol·m-2·s-1的正常光照条件下进行培养。培养条件为温度20±2℃、光照时间为12h·d-1。每日观察嫁接苗生长情况。然而该方法未获得成活嫁接苗。

Claims (10)

1.一种百山祖冷杉高效嫁接的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采摘百山祖冷杉与日本冷杉的球果，分别剥取其未成熟胚及胚乳进行培养，获得无菌的试管苗；
(2)在超净工作台上，依次将步骤1得到的试管苗置于体视显微镜下，利用无菌手术刀和镊子对其进行切割。然后放置于含有湿润滤纸的培养皿中备用；其中，日本冷杉的试管苗作为砧木，切割时保留顶端分生组织；百山祖冷杉的试管苗作为接穗。
(3)在无菌条件下，将准备好的砧木和接穗放入含有植物生长调节剂水溶液中进行浸泡，然后将砧木和接穗放置于体视显微镜下进行试管嫁接，并用硅胶嫁接管固定嫁接部位；
(4)嫁接完成后，将嫁接试管苗接种至培养基上进行弱光培养，砧木和接穗愈合后，将其移至正常光照条件下培养；
(5)嫁接苗培养30d后，将嫁接试管苗进行高光强炼苗，并打开瓶口，使其逐渐适应外界环境。3d后，洗去植株根部附着的培养基，将植株移栽至人工配制的混合培养基质中，浇水至基质湿润，于人工气候箱中培养。
2.根据权利要求1所述的一种百山祖冷杉高效嫁接的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述百山祖冷杉和日本冷杉的球果采摘时间为8月中旬。
3.根据权利要求1所述的一种百山祖冷杉高效嫁接的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，无菌试管苗苗龄是10～15d。
4.根据权利要求1所述的一种百山祖冷杉高效嫁接的方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，作为砧木的日本冷杉试管苗的切割方法为：在超净工作台上，将日本冷杉的无菌试管苗置于体视显微镜下，利用无菌手术刀将试管苗的顶端分生组织沿中心轴纵切0.5～0.7cm。
5.根据权利要求1所述的一种百山祖冷杉高效嫁接的方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，作为接穗的百山祖冷杉试管苗的切割方法为：左手持镊子固定百山祖冷杉无菌试管苗，右手持手术刀，在试管苗胚根上方0.5cm处切长0.5cm的“V”字型切口，保留切口以上的部分，将其放置于含有湿润滤纸的培养皿中备用。
6.根据权利要求1所述的一种百山祖冷杉高效嫁接的方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，所述含有植物生长调节剂水溶液的配方是：细胞分裂素6-BA的浓度为2mg·L-1，生长素NAA的浓度为1mg·L-1。
7.根据权利要求1所述的一种百山祖冷杉高效嫁接的方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，所述试管嫁接的方法为：首先，将硅胶嫁接管从砧木日本冷杉根端套入至切口的下方。双手持镊子，在体视显微镜下，将接穗插入砧木的切口中，然后将砧木上预留的硅胶管上滑至嫁接部位。
8.根据权利要求1所述的一种百山祖冷杉高效嫁接的方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，所述培养基以DCR(Gupta and Durzan medium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、酶水解酪蛋白等，蔗糖、琼脂、酶水解酪蛋白的浓度分别为20g·L-1、8g·L-1、500mg·L-1，培养基的pH为5.8。
9.根据权利要求1所述的一种百山祖冷杉高效嫁接的方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，所述弱光光照条件和正常光照条件的光强分别为20±5μmol·m-2·s-1和80±5μmol·m-2·s-1。
10.根据权利要求1所述的一种百山祖冷杉高效嫁接的方法，其特征在于：在所述步骤(5)中，所述高光强炼苗的培养条件为：光照强度为120±5μmol·m-2·s-1、光照时间为12h·d-1，温度为20±2℃；所述人工配制的混合培养基质配方：将泥炭土、赤玉土和松鳞按照体积比3:1:1进行混合。
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