CN114467750B - 一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法 - Google Patents

一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法，本发明以大盘山国家级自然保护区大盘山榧的未成熟种子为起始材料，经表面消毒后，剥取其幼胚及胚乳，胚乳看护培养2周后，剥除胚乳，将胚单独培养，进而获得大盘山榧无菌幼苗。本发明的优点是：利用大盘山榧未成熟种子，一方面，前期充分利用胚乳的营养成分优势促进胚的生长发育，另一方面，后期为了降低胚乳褐化对胚发育的影响，及时对幼胚进行单独培养，可在45天内获得大量大盘山榧无菌幼苗，改善大盘山榧由于群体数量少而在自然条件下极度濒危的现状。该方法可操作性强，简单高效，污染率低，对世界濒危植物保护及幼苗的快速培育具有重要意义。

Description

一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法
技术领域
本发明涉及一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法，从而快速、高效的获得大盘山榧幼苗，达到扩大濒危物种种群数量、保护濒危物种的目的。
背景技术
大盘山榧(Torreya dapanshanica)，系红豆杉科(Taxaceae)榧属(Torreya)常绿乔木，树高5米至8米，树干直径达25cm。未成熟种子具青绿色肉质假种皮，长3.5至4厘米，宽2至2.5厘米。种子(不含假种皮)宽卵形球状或球状，种皮为坚硬木质。种子9月至11月成熟。自九龙山榧(Torreya jiulongshanensis)定名后，在浙江省磐安县大盘山国家级自然保护区又发现了一个罕见的榧树群，与九龙山榧相似，但通过叶片和种子的精确比较，发现这个榧树群是一个独特的新种，并正式定名为大盘山榧。由于这一新种仅见于浙江中部磐安县的大盘山国家级自然保护区，且目前仅有6株成熟植株和2株幼苗，因此，大盘山榧被《国际自然保护联盟濒危物种红色名录》(IUCN red list)列为“极危(Critically endangered)”植物。
保护极度濒危植物的首要任务就是繁育更多的后代苗木，避免其“瞬间消失”。大盘山榧作为新发现的“极危”植物，其致濒机制尚未解析，故对其进行保苗护苗尤为重要。因此，迫切需要建立一种简单、快速的培育大盘山榧幼苗的方法。对未成熟种子进行培养不但为胚生长发育提供营养成分和生长环境，而且可以提高种子萌发率以及快速获得有性后代的无菌试管苗，为珍稀濒危植物多样性的保护以及“千年种子库”的建立奠定了基础。然而，在大盘山榧未成熟种子培养的过程中，单独的幼胚在人工培养基上很难萌发，而自身胚乳含多酚类活性物质，极易在共同培养的过程中褐化，最终影响胚的正常发育，因此，亟需建立一套完整大盘山榧未成熟种子培养方法来快速获得大盘山榧幼苗，防止濒危植物大盘山榧在自然条件下因繁殖困难而灭绝。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法，包括如下步骤：
(1)采集大盘山榧未成熟种子。
(2)去除大盘山榧未成熟种子包裹在外的青绿色假种皮，对未成熟种子进行表面灭菌，用解剖刀将种皮剥离，将包含胚的胚乳切至(1.0±0.3)cm×(0.4±0.2)cm×(0.4±0.2)cm长方体并接种到培养基上，将其水平放置，胚乳看护暗培养2周。
(3)暗培养后，去除胚乳，将胚取出接种至含有植物生长调节剂的培养基上，弱光条件下培养，直至胚萌发。
(4)胚萌发后，将胚接种至培养基上，在正常光照条件下竖直培养，待胚根长度>1cm时，转移至试管中继续培养并保存。
进一步地，在所述步骤(2)中，所述表面灭菌的程序为：将未成熟种子用体积分数为70％-75％乙醇水溶液浸泡并震荡30s，无菌水冲洗3次，每次1min。再用质量分数为0.1％的氯化汞的水溶液浸泡并振荡10min后，用无菌水冲洗5次，每次1min。最后用无菌滤纸吸干表面多余的水分。
进一步地，在所述步骤(2)、(4)中，所述培养基以SH(Schenk&Hildebrandt)为基本培养基，另外添加500mg/L活性炭、蔗糖、琼脂，培养基的pH为5.8。
进一步地，在所述步骤(2)中，所述胚乳看护暗培养的条件为：20±3℃，培养时间为2周。
进一步地，在所述步骤(3)中，所述将胚取出的过程为：在体视显微镜下，左手持无菌镊固定包含胚的胚乳，右手持无菌解剖刀，沿珠孔所在平面垂直向下呈片状切割；接近珠孔处时，用无菌尖头镊将胚取出。
进一步地，在所述步骤(3)中，所述含有植物生长调节剂的培养基以SH(Schenk&Hildebrandt)为基本培养基，另外添加植物生长调节剂、活性炭、蔗糖、琼脂，培养基的pH为5.8。
进一步地，在所述步骤(3)中，所述的植物生长调节剂，为生长素类植物生长调节剂。
进一步地，在所述步骤(3)中，所述的生长素类植物生长调节剂，为0.2mg/L3-吲哚丁酸(3-Indolebutyric acid,IBA)。
进一步地，在所述步骤(3)中，所述弱光培养条件为：温度为20±3℃、光照强度为30μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d，培养时间为15天。
进一步地，在所述步骤(4)中，所述胚萌发形态特征为胚根伸长且子叶展开。
本发明的优点是：利用大盘山榧未成熟种子，一方面，前期充分利用胚乳的营养成分优势促进胚的生长发育，另一方面，后期为了降低胚乳褐化对胚发育的影响，及时对幼胚进行单独培养，可在45天内获得大量大盘山榧无菌幼苗，改善大盘山榧由于群体数量少而在自然条件下极度濒危的现状。该方法可操作性强，简单高效，污染率低，对世界濒危植物保护及幼苗的快速培育具有重要意义。
附图说明
图1是大盘山榧野生植株上的未成熟种子图，图中方格为比例尺，一格为1cm；
图2是胚乳看护培养后的大盘山榧胚图；
图3是大盘山榧胚培养后萌发图；
图4是萌发幼苗生长图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
材料：本实例以大盘山榧未成熟种子为培养的起始材料。
步骤(1)：取材
7月下旬至8月下旬于浙江省磐安县大盘山国家级自然保护区收集大盘山榧未成熟种子(图1)。未成熟种子呈绿色，卵球形。可放于密封袋中，4℃低温中贮藏备用。
步骤(2)：种子表面灭菌
用75％乙醇擦拭种子表面，用镊子去除包裹在外的青绿色假种皮。在超净工作台上，用70％乙醇水溶液浸泡并震荡30s，无菌水冲洗3次，每次1min。再用质量分数为0.1％的氯化汞水溶液浸泡并振荡10min后，用无菌水冲洗5次，每次1min。最后用无菌滤纸吸干表面多余的水分。
步骤(3)：胚乳看护暗培养
在超净工作台中，用解剖刀将种皮轻轻剥离，将包含胚的胚乳切至(1.0±0.1)cm×(0.5±0.1)cm×(0.5±0.1)cm的长方体，并接种到培养基上，将其水平放置。培养基以SH(Schenk&Hildebrandt)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、活性炭等，浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L，培养基的pH为5.8。暗培养温度为20±3℃，培养时间为2周。
步骤(4)：去除胚乳，胚萌发
胚乳看护暗培养后(图2)，胚乳由乳白色转变为淡黄色，充分利用胚乳的营养成分优势促进胚的生长发育；然后在超净工作台中的体视显微镜下，左手持无菌镊固定包含胚的胚乳，右手持无菌解剖刀，沿珠孔所在平面垂直向下呈片状切割；接近珠孔处时，用无菌尖头镊小心将胚取出，接种在培养基上弱光培养2周。培养基以SH(Schenk&Hildebrandt)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、活性炭、3-吲哚丁酸(3-Indolebutyric acid,IBA)等，浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L、0.2mg/L，培养基的pH为5.8，直至胚根伸长、子叶展开。弱光培养条件为：温度为20±3℃、光照强度为30μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d。
步骤(5)：自养期培养
胚培养后，萌发率可达80％以上(图3)。然后转移到培养基正常光竖直培养，待胚根长度>1cm时，转至直径为2.5cm的试管中继续培养，培养基体积为试管体积的2/3，并采用双层一次性无菌透气封口膜。培养基以SH(Schenk&Hildebrandt)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、活性炭等，浓度分别为20g/L、8g/L、500mg/L，培养基的pH为5.8。培养条件为温度20±3℃、光照强度80μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d。培养8周的幼苗如图4所示。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法把所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采集大盘山榧未成熟种子；
(2)去除大盘山榧未成熟种子包裹在外的青绿色假种皮，对未成熟种子进行表面灭菌，用解剖刀将种皮剥离，将包含胚的胚乳切至(1.0±0.3)cm×(0.4±0.2)cm×(0.4±0.2)cm的长方体并接种到培养基上，将其水平放置，胚乳看护暗培养直至胚乳由乳白色转变为淡黄色；步骤(2)采用的培养基以SH为基本培养基，另外添加500mg/L活性炭、20g/L蔗糖、8g/L琼脂，培养基的pH为5.8；
(3)暗培养后，去除胚乳，将胚取出接种至培养基上，弱光条件下培养，直至胚萌发；步骤(3)采用的培养基以SH为基本培养基，另外添加0.2mg/L3-吲哚丁酸、500mg/L活性炭、20g/L蔗糖、8g/L琼脂，培养基的pH为5.8；
(4)胚萌发后，将胚接种至培养基上，在正常光照条件下竖直培养，待胚根长度>1cm时，转移至试管中继续培养并保存；步骤(4)采用的培养基以SH为基本培养基，另外添加500mg/L活性炭、20g/L蔗糖、8g/L琼脂，培养基的pH为5.8。
2.根据权利要求1所述的一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，所述表面灭菌的程序为：将未成熟种子用体积分数为70％-75％乙醇水溶液浸泡并震荡30s，无菌水冲洗3次，每次1min；再用质量分数为0.1％的氯化汞水溶液浸泡并振荡10min后，用无菌水冲洗5次，每次1min；最后用无菌滤纸吸干表面多余的水分。
3.根据权利要求1所述的一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，所述胚乳看护暗培养的条件为：20±3℃，培养时间为2周。
4.根据权利要求1所述的一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，所述将胚取出的过程为：在体视显微镜下，左手持无菌镊固定包含胚的胚乳，右手持无菌解剖刀，沿珠孔所在平面垂直向下呈片状切割；接近珠孔处时，用无菌尖头镊将胚取出。
5.根据权利要求1所述的一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，所述弱光培养条件为：温度为20±3℃、光照强度为30μmol·m-2·s-1、光照时间为12h/d，培养时间为15天。
6.根据权利要求1所述的一种大盘山榧未成熟种子看护培养方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，所述胚萌发形态特征为胚根伸长且子叶展开。
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