CN114375154A - 与大豆中疾病抗性相关联的遗传基因座 - Google Patents

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CN114375154A CN202080055304.1A CN202080055304A CN114375154A CN 114375154 A CN114375154 A CN 114375154A CN 202080055304 A CN202080055304 A CN 202080055304A CN 114375154 A CN114375154 A CN 114375154A
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刘清利
R·A·迪耶特里克
T·J·小柯利
J·D·希普斯金
B·W·布莱廷格
J·L·道森
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Syngenta Crop Protection AG Switzerland
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Abstract

本发明涉及使用衍生自澎湖大豆例如PI339656或其子代的标志、基因和染色体区间来鉴定、选择和/或产生疾病抗性大豆植物或种质的方法和组合物。还提供了通过本发明的任何方法鉴定、选择和/或产生的大豆植物或种质。还提供了疾病抗性大豆种子、植物和种质。

Description

与大豆中疾病抗性相关联的遗传基因座
技术领域
本发明涉及用于鉴定、选择和产生增强的疾病和/或病原体抗性大豆植物的组合物和方法。
关于序列表的电子提交的声明
提供ASCII文本格式的序列表作为纸质副本的替代，该序列表是根据37C.F.R.§1.821提交的，名称为“81923-WO-REG-ORG-NAT-1_SeqList_ST25”，于2019年7月31日生成并经由EFS-Web提交。这个序列表特此通过引用以其披露内容并入本说明书中。
背景技术
已知植物病原体对重要作物造成相当大的损害，这导致显著的农业损失，伴随着对依赖植物材料的食物供应和其他工业的广泛的后果。同样，长期以来存在降低农业病原体对作物产生的发病率和/或影响的需要。
若干种病原体与对大豆的损害相关联，该损害在美国和全世界范围内单独地和共同地有可能造成重大的产量损失。示例性病原体包括但不限于真菌(例如，疫霉属和亚洲大豆锈病豆薯层锈菌)、线虫(例如，根结线虫属，特别是爪哇根结线虫)和大豆茎溃疡病。鉴于这些病原体存在对全球食物供应的显著威胁以及与处理大豆作物以预防损失相关联的时间和花费，需要用于产生病原体抗性大豆栽培品种的新方法。所需要的是可以引入商业大豆植物以控制大豆病原体的新颖的抗性基因(本文中，“R基因”)。
发明内容
本概述列出了本披露主题的若干实施例，并且在许多情况下列出了这些实施例的变化。
因此，本披露主题的一个目的是提供用于将病原体抗性传递到非抗性大豆种质或植物品系的方法，该目的通过本披露主题全部或部分地实现。
序列表的简要说明
SEQ ID NO:1是衍生自澎湖大豆(Glycine clandestina)品系登录PI339656的染色体区间，其在本文中称为“支架14851”。支架14851已以支架14851定位到澎湖大豆14号染色体上大约3.18到3.50MB的区间。可以将该染色体区间或其部分引入(即通过使用胚拯救和/或标志辅助育种(MAB)或转基因地使基因渗入)到大豆品系中以产生对各种疾病(例如亚洲大豆锈病(ASR))具有抗性的大豆品系。在一些实施例中，预期来自该区间的基因编码一种或多种多肽，其可以在植物中转基因表达或被遗传修饰(即通过TALEN或CRISPR编辑的基因)以赋予疾病抗性(例如亚洲大豆锈病(ASR)抗性)。表1表示SEQ ID NO:1中与ASR抗性相关联的单核苷酸多态性(SNP)。确定了表1中鉴定的SNP的所有等位基因与抗性或易感性显著相关(p<0.05)。
表1：在SEQ ID NO:1中与针对ASR的增加的抗性相关联的SNP位置
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本领域众所周知，给定与给定性状(例如ASR抗性)相关联的序列和SNP等位基因，本领域普通技术人员可以开发寡核苷酸引物并使用所述引物来鉴定携带SEQ ID NO:1中描述的任一染色体区间的植物。
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测定(例如，通常为两步等位基因鉴别测定或类似测定)、KASPTM测定(通常是下文定义的一步等位基因鉴别测定或类似测定)、或两者均可用于测定如本文披露的SNP。在示例性两步测定中，使用正向引物、反向引物和两种测定探针(或杂交寡核苷酸)。将正向和反向引物用于扩增包含与ASR抗性基因座相关联的SNP的遗传基因座。然后使用测定引物(在一些实施例中，这些测定引物被用例如荧光团差异标记以允许在单个反应中区分两种测定探针)来测定存在于SNP位置的特定核苷酸，这些测定引物在每对中针对存在于SNP位置的核苷酸而彼此不同(尽管注意到在任何给定的对中，探针在它们的5'或3'末端可以不同而不影响它们区分存在于相应SNP位置的核苷酸的能力)。在一些实施例中，设计测定引物和反应条件使得测定引物将仅与100％完全匹配的序列的反向互补物杂交，从而允许基于杂交的检测来鉴定存在的哪种或哪些等位基因。
提供了用于鉴定、选择和产生具有增强的疾病抗性的大豆属植物(包括野生大豆属和大豆品系)的组合物和方法。还提供了疾病抗性大豆植物和种质。
在一些实施例中，提供了鉴定疾病抗性大豆植物或种质的方法。此类方法可以包括在大豆植物或种质中检测与增强的疾病抗性(特别是ASR抗性)相关联的遗传基因座或分子标志(例如SNP或数量性状基因座(QTL))。在一些实施例中，遗传基因座或分子标志与包含SEQ ID NO:1的核苷酸序列或其部分的染色体区间的存在相关联。
在一些实施例中，提供了产生疾病抗性大豆植物的方法。此类方法可以包括在大豆种质中检测与增强的病原体(例如ASR)抗性相关联的遗传基因座和/或遗传标志的存在，以及从所述大豆种质中产生子代植物。
在一些实施例中，提供了选择疾病抗性大豆植物或种质的方法。此类方法可以包括使第一大豆植物或种质与第二大豆植物或种质杂交，其中该第一大豆植物或种质包含衍生自包含与增强的疾病抗性和/或耐受性相关联的SEQ ID NO:1中任一个或其部分的大豆澎湖大豆登录PI339656或其子代的遗传基因座，并选择具有遗传基因座的子代植物或种质。在进一步的实施例中，第一大豆植物或种质包含衍生自大豆澎湖大豆登录PI591576的遗传基因座。
在一些实施例中，提供了将与增强的病原体抗性相关联的、衍生自大豆登录号PI339656、PI591576或其子代的遗传基因座基因渗入到大豆植物或种质的方法。此类方法可以包括将第一大豆植物或种质(该大豆植物或种质包含与增强的病原体抗性相关联的、衍生自大豆登录号PI339656、PI591576或其子代的染色体区间)与第二大豆植物或种质(该大豆植物或种质用缺乏所述基因座)杂交，并任选地将包含所述遗传等位基因的子代植物与第二大豆植物或种质重复回交以产生具有增强的病原体抗性的大豆植物(例如大豆)或种质，该大豆植物或种质包含与增强的病原体抗性相关联的、衍生自大豆登录号PI339656、PI591576或其子代的染色体区间。包含与增强的病原体抗性相关联的染色体区间的子代可以通过在其基因组中检测与衍生自大豆登录号PI339656、PI591576或其子代的所述染色体区间相关联的标志的存在来鉴定其中所述染色体区间包含SEQ ID NO:1或其部分。来自PI339656、PI591576或其子代的R-基因可以通过使用本领域技术人员已知的胚拯救方法(例如如美国专利7,842,850中披露的，其通过引用并入本文)和通过如本文工作实例中描述的方法基因渗入到大豆品系中。
在一些实施例中，提供了大豆物种的植物、子代植物或植物部分，其中该植物的基因组的一部分通过使用化学诱导的染色体加倍从野生大豆属物种获得，并且其中所述部分赋予该植物与不包含该部分的对照植物相比增加的ASR抗性。
在一些实施例中，提供了大豆物种的植物、子代植物或植物部分，其中该植物的基因组包含染色体区间，与不包含该区间的对照植物相比，该染色体区间赋予对ASR增加的抗性的，其中所述染色体区间从野生大豆属物种引入该植物，并且其中具有所述染色体区间的所述植物是通过化学诱导的染色体加倍获得的。
还提供了通过本发明的方法鉴定、产生或选择的大豆植物和/或种质，以及衍生自通过这些方法鉴定、产生或选择的大豆植物或种质的任何子代或种子。在一个实施例中，与SEQ ID NO:1中描述的染色体区间的存在相关联的分子标志可用于鉴定或选择对ASR具有抗性的植物品系。此外，所述分子标志可位于所述染色体区间的20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM内。在另一个实施例中，所述分子标志可以位于如表1中描述的与ASR相关联的任何SNP标志的20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM内。
还提供了非天然存在的大豆种子、植物和/或种质，该大豆种子、植物和/或种质包含与增强的病原体(例如ASR、胞囊线虫、疫霉菌、茎褐腐病等)抗性相关联的、衍生自大豆植物登录号PI339656、PI591576或其子代的一个或多个遗传基因座。
与增强的病原体抗性相关联的标志可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与增强的病原体抗性相关联的单个等位基因或衍生自PI339656、PI591576或其子代的一个或多个遗传基因座处的等位基因的组合。在一个实施例中，标志在如SEQ ID NO:1描述的染色体区间内。
上述的以及本发明的其他目的和方面将在以下阐述的附图和说明中进行详细解释。
附图说明
图1显示了野生大豆属品系对一组16种锈病分离株的锈病抗性筛选。
图2说明了用于测量植物表型的锈病评定量表。
图3显示了支架14851和支架9588上与ASR抗性相关联的澎湖大豆(PI339656)SNP的描绘。
图4是支架14851内与ASR相关联的标志的映射区间。
图5是澎湖大豆(PI339656)的标志关联图，其中条带指示与ASR抗性相关联的对应的染色体的区域/区间。
具体实施方式
当前披露的主题至少部分涉及衍生自澎湖大豆登录品系PI339656、PI591576或其子代的与增强的病原体抗性(例如亚洲大豆锈病或大豆胞囊线虫)相关联的基因组区域(即染色体区间)的鉴定。同样，来自PI339656、PI591576或其子代的所述染色体区间可以经由体细胞胚拯救(参见例如美国专利公开2007/0261139和本文中的实例)或通过使用已经基因渗入到其基因组来自PI339656、PI591576或其子代的遗传区域的大豆供体品系而渗入大豆品系中，其中该区域包含SEQ ID NO:1或其部分，其中所述遗传区域的存在与针对例如ASR、SCN、茎终止(Stem termination)、茎溃疡、细菌性脓疱、根结线虫、褐茎腐病、蛙眼叶斑病(frogeye leaf spot)或疫霉菌的增加大豆疾病抗性相关联。在另一个实施例中，衍生自PI339656、PI591576或其子代的染色体区间被引入不包含所述染色体区间的大豆品系，其中所述引入在大豆品系或其子代中赋予了对疾病(例如ASR)增加的抗性，其中该所述染色体区间衍生自澎湖大豆的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19号染色体或20号染色体，并且另外，其中所述染色体区间包含与增加的疾病抗性的性状相关联的至少一个等位基因，其中所述等位基因分别是如下等位基因中任一个，这些等位基因分别选自如表1中描述的任一个。
下面列出的所有参考文献、以及在即时披露中引用的所有参考文献，包括但不限于所有专利、专利申请及其出版物、科学杂志上的文章以及数据库条目(例如，
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数据库条目及所有在其中可获得的注释)，将其全部内容通过引用并入本文，其并入程度是它们补充、解释、提供一种针对(或传授)本文采用的方法、技术和/或组合物的背景。
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本披露主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。
尽管认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，但是提出以下定义是为了使本披露主题容易理解。
如本文使用的，术语“一种/一个(a/an)”或“该(the)”可以是指一种/一个或多于一种/一个。例如，“一种/一个”标志可以指一种/一个标志或多种/个标志。
如本文使用的，术语“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关联的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(“或”)解释时组合的缺少。
如本文使用的，术语“约”当关于可测量的值(如质量、剂量、时间、温度等的量)使用时意指涵盖指定量的多达20％、10％、5％、1％、0.5％或甚至0.1％的变化。
术语“基本上由……组成”(以及其语法上的变体)当应用于本发明的多核苷酸序列时，意指由所列举的序列(例如，SEQ ID NO:1)以及该列举的序列的5’和/或3’端上的全部十个或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)的另外的核苷酸两者组成的一个多核苷酸序列，这样使得该多核苷酸序列的功能未实质上发生改变。该总共十个或更少的另外的核苷酸包括全部数量的两个端上加在一起的另外的核苷酸。术语“实质上发生改变”，当应用于本发明的多核苷酸时，是指与由所列举的序列组成的多核苷酸序列的表达水平相比，表达多核苷酸序列的能力增加或减少至少约50％或更多。
如本文所用，术语“野生大豆属”是指澎湖大豆植物。
如本文使用的，术语“等位基因”是指在特定基因座处出现的两个或更多个不同核苷酸或核苷酸序列中的一个。
当标志与性状连锁并且当标志的存在指示了所希望的性状或性状形式是否会和/或会以什么程度发生在包含标志的植物/种质中时，则该标志与该性状“相关联”。类似地，当标志与等位基因连锁并且当标志的存在指明了等位基因是否存在于包含标志的植物/种质中时，则该标志与该等位基因“相关”。例如，“与增强的病原体抗性相关联的标志”是指其存在或不存在可用于预测植物是否和/或在何种程度上显示病原体抗性表型的标志。
如本文使用的，术语“回交”和“回交的”是指一种方法，凭借该方法将子代植物反复与其亲本之一回交。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待基因渗入的所期望的等位基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座被基因渗入其中的亲本植物。例如，参见Ragot,M.等人，Marker-assisted Backcrossing:A Practical Example,in Techniques et Utilisations desMarqueurs Moleculaires Les Colloques[标志辅助回交：实践范例，分子标志技术和应用专题讨论会]第72卷，第45-56页(1995)；以及Openshaw等人，Marker-assisted Selectionin Backcross Breeding,in Proceedings of the Symposium“Analysis of MolecularMarker Data,”[回交育种中的标志辅助选择，专题讨论会会议记录“分子标志数据分析”]，第41-43页(1994)。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指第二次使用轮回亲本，“BC2”是指第三次使用轮回亲本，以此类推。
厘摩(“cM”)是重组频率的度量单位。一个cM等于有1％的机会，一个遗传基因座处的标志会由于单代中的交换而与第二基因座处的标志分离。
如本文使用的，关于特定基因座和/或等位基因使用的术语“由……定义并包括其的染色体区间”是指由所述基因座/等位基因限定并涵盖所述基因座/等位基因的染色体区间。
如本文所使用的，术语“杂交(cross)”或“经杂交的(crossed)”是指通过授粉融合配子以产生子代(例如，细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一个植物由另一个授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠是来自相同的植物时)两者。术语“使杂交(crossing)”是指通过授粉使配子融合以产生子代的行为。
如本文使用的，术语“栽培品种”和“品种”是指可以通过结构或遗传特点和/或表现与相同物种内的其他品种区别开的一组相似的植物。
如本文使用的，术语“期望的等位基因”和“目的等位基因”可互换使用以指与所期望的性状相关联的等位基因。在一些实施例中，“期望的等位基因”和/或“目的等位基因”可以与给定性状的增加或减少相关联，这取决于所期望表型的性质。在一些实施例中，“期望的等位基因”和/或“目的等位基因”可以与形态、颜色等的变化相关联。
如本文使用的，术语“增强的病原体抗性”或“增强的疾病抗性”是指与一种或多种对照植物(例如，亲本中的一个或两个、或缺乏与针对对应的病原体/疾病的增强的病原体抗性相关联的标志的植物)相比，尽管感染了疾病(例如亚洲大豆锈病)，植物的耐受和/或繁殖能力的改善、增强或增加。增强的疾病抗性包括减少指示对应的疾病(如亚洲大豆锈病、大豆胞囊线虫、疫霉菌等)感染的症状的表达的任何机制(除了全株植物免疫或抗性)。
如本文所用，术语“优良”和“优良品系”是指从针对所期望的农艺表现的育种和选择而产生的任何品系。优良品系可以是基本上纯合的。众多的优良品系是可获得的并且对于本领域技术人员是已知的。
如本文所用，术语“优良种质”是指衍生自或能够产生优良植物的任何种质。
如本文所使用的，术语“外来的”、“外来的品系”和“外来的种质”是指不是优良的任何植物、品系或种质。通常，外来的植物/种质不是衍生自任何已知的优良植物或种质，而是选择的以将一个或多个所希望的遗传元件引入育种程序(例如，将新颖的等位基因引入育种程序中)。
“遗传图谱”是对给定物种内的一个或多个染色体上的基因座之间的遗传连锁关系的描述，通常以图表或表格形式描绘。对于每个遗传图谱，基因座之间的距离是通过它们之间的重组频率来测量的。基因座之间的重组可以使用各种标志来检测。遗传图谱是定位群体、所用标志的类型以及不同群体之间每个标志的多态性潜力的产物。一个遗传图谱与另一个遗传图谱的基因座之间的顺序和遗传距离可以不同。
如本文使用的，术语“基因型”是指与可观察到的和/或可检测的和/或所表现的性状(表型)形成对照，在一个或多个遗传基因座处的个体(或个体组)的遗传组成。基因型由个体遗传自其亲本的一个或多个已知基因座的一个或多个等位基因定义。术语基因型可以用来指单一基因座处、多个基因座处的个体的遗传组成，或者更普遍地，术语基因型可以用来指其基因组中所有基因的个体遗传构成。可以例如使用标志来间接表征基因型和/或通过核酸测序来直接表征基因型。
如本文所使用的，术语“种质”是指属于或来自个体(例如，植物)、个体群体(例如，植物品系、品种或家族)、或来源于品系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的部分，或可以从该生物或细胞中分离。通常，种质提供了具有特定分子构成的遗传物质，该分子构成提供了对于生物体或细胞培养物的一些或所有遗传品质而言的物理基础。如本文使用的，种质可以是指可以从中生长新植物的种子、细胞(包括原生质体和愈伤组织)、或组织，以及可以培养成全株植物的植物部分(例如，茎、芽、根、叶等)。
“单倍型”是多个遗传基因座处个体的基因型，即等位基因的组合。典型地，定义单倍型的遗传基因座在物理和遗传上是连锁的，即在同一染色体区段上。术语“单倍型”可以指特定基因座(例如单标志基因座)处的多态性，或者是沿着染色体区段的多个基因座处的多态性。
如本文所使用的，术语“杂合的”是指如下遗传状态，其中不同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座处。
如本文所使用的，术语“纯合的”是指如下遗传状态，其中相同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座处。
如本文使用的，术语“杂种”是指当至少两个遗传上不相同的亲本杂交时产生的种子和/或植物。
如本文所使用的，术语“近交”是指基本上纯合的植物或种类。术语可以是指在整个基因组中基本上纯合的植物或品种，或者相对于特别感兴趣的基因组部分是基本上纯合的植物或植物品种。
如本文使用的，术语“indel”是指在一对核苷酸序列中的插入或缺失，其中第一序列可被称为具有相对于第二序列的插入，或第二序列可被称为具有相对于第一序列的删除。
如本文使用的，术语“基因渗入(introgression)”、“使基因渗入(introgressing)”和“经基因渗入的(introgressed)”是指使一个或多个遗传基因座的期望的等位基因或期望的等位基因的组合从一个遗传背景到另一个遗传背景的自然和人工传送。例如，可以通过相同物种的两个亲本之间的有性杂交将指定基因座处的期望的等位基因传送给至少一个子代，其中这些亲本中的至少一个在其基因组内具有该期望的等位基因。可替代地，例如，等位基因的传送可以通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有期望的等位基因。期望的等位基因可以是标志的经选择的等位基因、QTL、转基因等。包括期望的等位基因的后代可以重复地与具有一个所期望的遗传背景的品系回交，并且对于期望的等位基因进行选择，其中结果是期望的等位基因变得在一个所期望的遗传背景中是固定的。例如，与增强的ASR耐受性相关联的标志可以从供体基因渗入到不具有疾病抗性的轮回亲本中。然后可以将得到的后代重复回交并选择，直到该子代在轮回亲本背景中具有一个或多个ASR耐受性等位基因。
如本文使用的，术语“连锁”是指一个标志基因座与另一个标志基因座或一些其他基因座(例如，ASR耐受性基因座)的相关联程度。分子标志与表型之间的连锁关系可以作为“概率”或“调整的概率”给出。连锁可以表示为所希望的限值或范围。例如，在一些实施例中，当标志以小于约50、40、30、25、20或15个图距单位(或cM)分开时，则任何标志与任何其他标志(遗传上和物理上)连锁。
在本发明的一些方面中，限定连锁的包括范围(例如，从约10cM和约20cM、从约10cM和约30cM、或从约10cM和约40cM)是有利。标志与第二基因座的连锁越紧密，标志对第二基因座的指示效果越好。因此，“紧密连锁的基因座”(如标志基因座和第二基因座)展示约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、或2％或更少的基因座间重组频率。在一些实施例中，相关的基因座展示约1％或更少(例如，约0.75％、0.5％、0.25％或更少)的重组频率。定位于相同染色体并且具有使得两个基因座之间的重组以小于约10％(例如，约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、或0.25％或更少)的频率发生的距离的所述两个基因座也可被认为是彼此“邻近的”。因为一个cM是显示1％的重组频率的两个标志之间的距离，因此任何标志与紧密接近(例如，以等于或小于约10cM的距离)的任何其他标志紧密连锁(遗传上和物理上)。在同一染色体上的两个紧密连锁的标志可以相互定位为约9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更少。
如本文使用的，术语“连锁不平衡”是指遗传基因座或性状(或两者)的非随机分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关联的基因座沿着一段染色体在物理上足够接近，以便它们以高于随机(即非随机)的频率一起分离(在共分离的性状的情况下，控制这些性状的基因座彼此足够接近)。显示连锁不平衡的标志被认为是连锁的。连锁的基因座超过50％的时间(例如从约51％至约100％的时间)进行共分离。换句话说，共分离的两个标志具有小于50％(并且根据定义，在相同染色体上分离小于50cM)的重组频率。如本文使用的，连锁可以存在于两个标志之间，或可替代地，标志和表型之间。标志基因座可以与性状(例如亚洲大豆锈病(此处为“ASR”))“相关联”(连锁)。例如，分子标志与目的性状的连锁的程度被测量为该分子标志与该表型的共分离的统计概率。
连锁不平衡最常见地用量度r2评估，该量度r2使用以下文献中描述的公式计算：Hill和Robertson,Theor.Appl.Genet.[理论和应用遗传学]38:226(1968)。当r2＝1时，两个标志基因座间存在完全的连锁不平衡，意味着所述标志还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。r2大于1/3的值指示足够强的连锁不平衡对于定位是有用的。Ardlie等人,Nature Reviews Genetics[遗传学自然评论]3:299(2002)。因此，当成对标志基因座间的r2值大于或等于约0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0时，等位基因处于连锁不平衡。
如本文使用的，术语“连锁平衡”描述其中两个标志独立地分离的情况，即，在后代中随机分配。显示连锁平衡的标志被认为是不连锁的(无论它们是否位于相同染色体上)。
“基因座”是基因或标志或等位基因所在的染色体上的位置。在一些实施例中，基因座可以涵盖一个或多个核苷酸。
如本文使用的，术语“标志”和“遗传标志”可互换使用，以指已经与表型、性状或性状形式相关联的核苷酸和/或核苷酸序列。在一些实施例中，标志可以与等位基因或目的等位基因相关联，并且可以指示细胞或生物体中等位基因或目的等位基因的存在或不存在。标志可以是但不限于等位基因、基因、单倍型、限制性片段长度多态性(RFLP)、简单重复序列(SSR)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、酶切扩增多态性序列(CAPS)(Rafalski和Tingey，Trends in Genetics[遗传学趋势]9:275(1993))、扩增片段长度多态性(AFLP)(Vos等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]23:4407(1995))、单核苷酸多态性(SNP)(Brookes，Gene[基因]234:177(1993))、序列特征性扩增区域(SCAR)(Paran和Michelmore，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]85:985(1993))、序列标签位点(STS)(Onozaki等人，Euphytica[荷兰植物育种杂志]138:255(2004))、单链构象多态性(SSCP)(Orita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2766(1989))、简单重复序列区间(ISSR)(Blair等人，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]98:780(1999))、逆转座子间扩增多态性(IRAP)、逆转座子微卫星扩增多态性(REMAP)(Kalendar等人，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]98:704(1999))、染色体区间或RNA切割产物(例如Lynx标签)。标志可以存在于基因组核酸或表达的核酸(例如EST)中。术语标志还可以指用作根据本领域熟知的方法用于扩增、杂交和/或检测核酸分子的用作探针或引物(例如引物对)的核酸。大量的大豆分子标志是本领域已知的，并且是已公开的或可以从各种来源如SoyBase互联网资源获得。
可以通过本领域中公认的方法检测对应于群体成员之间的遗传多态性的标志。这些方法包括，例如核酸序列、杂交方法、扩增方法(例如基于PCR的序列特异性扩增方法)、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标志检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、和/或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已知公认的方法也用于检测表达的序列标签(EST)和衍生自EST序列的SSR标志，以及随机扩增多态性DNA(RAPD)。
“标志等位基因”，也描述为“标志基因座的等位基因”，可以指在群体中对标志基因座而言是多态性的该标志基因座处发现的多个多态性核苷酸序列中的一个。
“标志辅助选择”(MAS)是基于标志基因型选择表型的方法。在一些实施例中，标志基因型用于鉴定将被选择用于育种程序或用于种植的植物。在一些实施例中，标志基因型用于鉴定将不被选择用于育种程序或用于种植的植物(即，反选植物(counter-selectedplant))，允许它们从育种/种植群体中去除。
如本文使用的，术语“标志基因座(marker locus和marker loci)”是指在其中可以找到一个或多个特异性标志的生物基因组中的一个或多个特定染色体定位。标志基因座可用于追踪第二连锁基因座(例如编码或有助于表型性状表达的连锁基因座)的存在。例如，标志基因座可以用来监测在基因座(如QTL或单一基因)处的等位基因的分离，这些等位基因遗传地或物理地连锁至该标志基因座上。
如本文使用的，术语“标志探针”和“探针”是指可用于检测标志基因座内一个或多个特定等位基因的存在的核苷酸序列或核酸分子(例如，通过核酸杂交与该标志或标志基因座中的所有或部分互补的核酸探针)。包含约8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个连续核苷酸的标志探针可用于核酸杂交。可替代地，在一些方面，标志探针是指能够区别(即基因分型)存在于标志基因座处的特定等位基因的任何类型的探针。
如本文使用的，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标志”或“基因标志”可以用于指如上文定义的遗传标志，或其用作参照点的编码产物(例如，蛋白质)。分子标志能够源自基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如来自剪接的RNA、cDNA等)。该术语也指与标志序列互补或与位于其侧翼的核苷酸序列，例如，用作能够扩增标志序列的探针和/或引物的核苷酸序列。例如根据沃森-克里克碱基配对原则，当核苷酸序列在溶液中特异性杂交时，所述核苷酸序列是“互补的”。当位于indel区域上时，本文所述的标志中的一些也称为杂交标志。这是因为，根据定义，该插入区域是关于不具有该插入的植物的多态性。因此，该标志仅需要指示该indel区域是否存在。可以使用任何合适的标志检测技术来鉴定这种杂交标志，例如，用于本文提供的实例中的SNP技术。
“非天然存在的大豆品种”是自然界中不存在的任何品种的大豆。可以通过本领域已知的任何方法产生“非天然存在的大豆品种”，该方法包括但不限于转化大豆植物或种质、转染大豆植物或种质并将天然存在的大豆品种与非天然存在的大豆品种杂交。在一些实施例中，“非天然存在的大豆品种”可以包含一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施例中，“非天然存在的大豆品种”可以包含天然存在的核苷酸序列的一个或多个非天然存在的拷贝(即天然存在于大豆中的基因的外来拷贝)。在一些实施例中，“非天然存在的大豆品种”可以包含两种或更多种天然存在的核苷酸序列的非天然组合(即，在同一大豆中不天然存在的两种或更多种天然存在的基因，例如在大豆品系中未发现的基因)。
如本文使用的，术语“表型”、“表型性状”或“性状”是指生物体的一种或多种性状和/或表现。表型是对于裸眼或通过本领域已知的任何其他评价手段(例如，显微术、生物化学分析、或电子机械测定)可以观察的表现。在一些情况中，表型或性状直接由单一基因或遗传基因座控制，即，“单基因性状”。在其他情况下，表型或性状是多个基因的结果。应当指出，如本文使用的，术语“疾病抗性表型”考虑了可能影响对应的疾病的环境条件，这样使得该效应是真实且是可重复的。
如本文使用的，术语“植物”可以是指全株植物、其任何部分、或从植物衍生的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可以指以下中的任一项：全株植物、植物组分或器官(例如，根、茎、叶、芽、花、荚等)、植物组织、种子和/或植物细胞。植物细胞是从植物取得的植物细胞，或者是通过培养从取自植物的细胞衍生的植物细胞。因此，术语“大豆植物”可以是指整株大豆植物、大豆植物的一个或多个部分(例如，根、根尖、茎、叶、芽、花、豆荚、种子、子叶等)、大豆植物细胞、大豆植物原生质体和/或大豆植物愈伤组织。
如本文所使用的，术语“多态性”是指基因座处的核苷酸序列中的变异，其中所述变异太常见，而不仅仅是由于自发突变。多态性可以是单核苷酸多态性(SNP)或插入/缺失多态性(本文中也称为“indel”)。另外，该变异可以在转录谱或甲基化模式中。可以通过在两个或更多个种质条目中的一个或多个基因座处进行核苷酸序列比较来确定核苷酸序列的一个或多个多态性位点。
如本文使用的，术语“群体”是指共享共同的遗传衍生(genetic derivation)的植物的遗传上异质的集合。
如本文所使用的，术语“子代”和“子代植物”是指从一个或多个亲本植物通过无性或有性繁殖产生的植物。子代植物可以通过克隆或单一亲本植物自交，或者通过两种亲本植物杂交来获得。
如本文所用，术语“参考序列”是指用作核苷酸序列比较的基础的确定的核苷酸序列。例如通过对在一个或多个目的基因座处的多个品系进行基因分型、在序列比对程序中比对这些核苷酸序列并且然后可以获得比对的共有序列来获得标志的参比序列。因此，参比序列鉴定基因座处等位基因中的多态性。参比序列可以不是来自任何特定生物体的实际核酸序列的拷贝；然而，对于设计针对一个或多个基因座中的实际多态性的引物和探针是有用的。
如本文使用的，术语“疾病耐受性”和“疾病抗性”是指尽管感染了对应的疾病，植物的耐受和/或繁殖能力。当关于种质使用时，这些术语是指尽管感染了对应的疾病，由该种质产生的植物的耐受和/或繁殖能力。在一些实施例中，感染的疾病抗性大豆植物可以与未感染的大豆植物一样(或几乎同样)产生。通常，如果植物或种质显示“增强的病原体抗性”，则标记为“疾病抗性”。
标志的“不利等位基因”是与所述不利植物表型分离的标志等位基因，因此提供了鉴定能从育种程序或种植中移除的植物的益处。
“PI339656”是指澎湖大豆登录号PI339656、PI446934、PI483193、PI505154、PI595799或PI591576。
遗传作图
与特定表型(如疾病抗性)相关联的遗传基因座可以被定位到生物体的基因组中。通过鉴定与目的性状共分离的标志或标志簇，育种人员能够通过选择合适的标志(称为标志辅助选择或MAS的方法)来迅速选择所期望的表型。育种人员也可以使用此类标志来在计算机上模拟设计基因型并实施全基因组选择。
本发明提供了与增强的疾病抗性相关联的标志。可以使用这些标志和/或其他连锁标志的检测来鉴定、选择和/或生产抗病植物和/或从育种程序或种植中消除不抗病的植物。
与增强的疾病抗性相关联的澎湖大豆遗传基因座
本文鉴定了与增强的疾病抗性相关联的标志(参见表1)。本发明的标志可以包含一个或多个遗传基因座处的单个等位基因或等位基因的组合(例如，来自表1的任何标志组合。例如，标志可包含位于第一染色体区间内的一个或多个标志等位基因(例如，SEQ IDNO:1)。
本发明的标志在本文中关于染色体区间(包括PI339656或其子代的如SEQ ID NO:1中任一个所描绘并且如表1所示的测序基因组DNA)内标志基因座的位置进行描述。
标志辅助选择
标志可以用于各种植物育种应用。参见，例如Staub等人，Hortscience[园艺科学]31:729(1996)；Tanksley，Plant Molecular Biology Reporter[植物分子生物学导报]1:3(1983)。主要的目的领域之一是使用标志辅助选择(MAS)增加回交和基因渗入的效率。通常，MAS利用已被鉴定为具有与所希望的性状共分离的显著可能性的遗传标志。推测此类标志位于产生所希望的表型的一个或多个基因中/附近，并且它们的存在表明该植物将具有所希望的性状。预计具有该标志的植物将所希望的表型转移到它们的子代中。
展示出与影响所希望的表型性状的基因座连锁的标志为在植物群体中选择性状提供了有用工具。在表型难以测定或在植物发育的后期阶段发生的情况下，尤其如此。由于DNA标志测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定更大的群体，增加了发现具有从供体品系移动至受体品系的靶区段的重组体的概率。连锁越紧密，标志越有用，这是因为重组不太可能发生于该标志与造成或引起该性状的基因之间。使用侧翼标志降低发生误报选择的几率。理想情况是致病性基因本身内具有标志，使得标志和基因之间的重组不能发生。此类标志称为“完美标志”。
当基因通过MAS渗入时，不仅引入了基因而且引入了侧接区域。Gepts,Crop Sci[作物科学]42:1780(2002)。这称为“连锁累赘”。在供体植物与受体植物极不相关联的情况下，这些侧接区域携带可以编码农艺学上不需要的性状的附加基因。即便与优良大豆品系回交多个周期后，该“连锁累赘”也可以导致产量下降或其他负面农艺学特征。这有时也称为“产量累赘”。侧接区域的大小可以通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为育种人员不能控制该区域或重组断点的大小。Young等人,Genetics[遗传学]120:579(1998)。在经典育种中，通常只是偶然地，选择了有助于减小供体区段大小的重组。Tanksley等人,Biotechnology[生物技术]7:257(1989)。即使在20次回交后，可能找到相当大的仍然与所述基因连锁的供体染色体碎片被选择。然而如果使用标志的话，就可以选取那些在目的基因附近经历了重组的稀有个体。在150株回交植物中，有95％的机会，至少一株植物将经历该基因的1cM(基于单次减数分裂图距)内的杂交。标志允许明确鉴定这些个体。使用300株植物的一次附加回交，在该基因另一侧的1cM单次减数分裂图距内有95％的杂交概率，从而产生在基于单次减数分裂图距的小于2cM的靶基因附近的区段。这用标志可以在两代中实现，而不用标志时则需要平均100代。参见Tanksley等人，同上。当基因的确切定位已知时，围绕该基因的侧接标志可用于在不同的群体大小中对重组进行选择。例如，在更小的群体中，预期重组可以进一步远离该基因，因此需要更远端的侧接标志来检测该重组。
包含密度增强的公开大豆标志的大豆基因组的整合连锁图谱的可用性促进了大豆遗传定位和MAS。
在所有分子标志类型中，SNP是最丰富的，并且具有提供最高遗传图谱分辨率的潜力。Bhattramakki等人,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]48:539(2002)。能以所谓的“超高通量”方式测定SNP，因为它们不需要大量的核酸，并且该测定的自动化是直接的。SNP也有成为相对低成本的系统的益处。这三个因素一起使得将SNP用于MAS中具有高度的吸引力。可利用如下几种方法用于SNP基因分型，包括但不限于：杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶切割、微测序和编码球(coded sphere)。此类方法已经在各种公开中综述：Gut,Hum.Mutat.[人类突变]17:475(2001)；Shi,Clin.Chem.[临床化学]47:164(2001)；Kwok,Pharmacogenomics[药物基因组学]1:95(2000)；Bhattramakki和Rafalski,Discovery andapplication of single nucleotide polymorphism markers in plants[单核苷酸多态性标志在植物中的发现和应用],在Plant Genotyping:The DNA Fingerprinting ofPlants[植物基因分型：植物DNA指纹图谱]中,CABI Publishing[CABI出版社],瓦林福德(Wallingford)(2001)。大范围的可商购的技术利用这些和其他方法询问SNP，包括MasscodeTM(德国凯杰公司(Qiagen)，Germantown，MD)、
Figure BDA0003494708870002841
(好乐杰公司(Hologic)，麦迪逊，WI)、
Figure BDA0003494708870002842
(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特市，CA)、
Figure BDA0003494708870002843
(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特市，CA)和BeadarraysTM(亿明达公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)。
可以使用序列内或跨连锁序列的许多SNP等位基因一起来描述任何特定基因型的单倍型。Ching等人,BMC Genet.[BMC遗传学]3:19(2002)；Gupta等人,(2001),Rafalski,Plant Sci[植物科学]162:329(2002b)。单倍型可以比单个SNP更具信息性，并且可以更详细地描述任何特定的基因型。例如，对于特定的疾病抗性品系或品种，单个SNP可以是等位基因“T”，但等位基因“T”也可以出现在用于轮回亲本的大豆育种群体中。在这种情况下，连锁SNP的等位基因的组合可以更具信息性。一旦将独特的单倍型分配给供体染色体区域，该单倍型可以用于该群体或其任何亚群中以确定个体是否具有特定的基因。使用本领域普通技术人员已知的自动化高通量标志检测平台使得该方法高效且有效。
本发明的标志可以用于标志辅助选择方案中以鉴定和/或选择具有增强的亚洲大豆锈病耐受性的子代。此类方法可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：将第一大豆植物或种质与第二大豆植物或种质杂交，其中该第一大豆植物或种质包含衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基5166731一致，并且选择具有该标志的子代植物。第一和第二大豆植物之一或两者可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，第二大豆植物或种质是优良大豆品种的第二大豆植物或种质。在一些实施例中，第二大豆植物或种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。在另一个实施例中，第一大豆植物包含衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基5166731一致；其中染色体区间进一步包含至少一个如相应表1任一个中描述的等位基因。
用于鉴定和/或选择疾病抗性大豆植物或种质的方法可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：检测与增强的ASR耐受性相关联的标志的存在。标志可以在从植物或种质取得的任何样品中检测到，该植物或种质包括但不限于整个植物或种质、所述植物或种质的一部分(例如来自所述植物或种质的种子切片、叶片冲压片(leaf punch disk)或细胞)或来自所述植物或种质的核苷酸序列。可以使用本领域已知的任何现有或未来的方法(包括但不限于自动化方法：用锋利的刀片去除一部分胚乳、在种子中钻一个小孔并收集所得粉末，用激光切割这些种子并冲压叶圆片)从植物或种质中取得这种样品。大豆植物可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，大豆植物或种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，在样品中检测的标志可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：位于染色体区间内的一种或多种标志等位基因，该染色体区间选自下组，该组由以下组成：
1)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基5166731一致；或
2)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间包含1)中所述的任一染色体区间的一部分，并且其中染色体区间包含至少一个如分别在表1中任一个中展示的SNP标志；或
3)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中任一个中显示的任何SNP标志。
用于产生疾病抗性大豆植物的方法可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：在种质中检测与增强的疾病(例如ASR)抗性相关联的标志，其中所述标志选自表1中任一个，或其中该标志是与表1中任一个中描述的并从所述种质产生大豆植物的任何标志的紧密连锁的基因座。标志可以在从种质取得的任何样品中检测到，该种质包括但不限于所述种质的一部分(例如来自所述种质的种子切片或细胞)或来自所述种质的核苷酸序列。可以使用本领域已知的任何现有或未来的方法(包括但不限于自动化方法：用锋利的刀片去除一部分胚乳、在种子中钻一个小孔并收集所得粉末，用激光切割这些种子并冲压叶圆片)从种质中取得这种样品。种质可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。然后，从根据本领域熟知的用于育种和从种质产生植物的方法鉴定为具有与增强的疾病(例如ASR)抗性相关联的标志的种质来产生疾病抗性大豆植物。
在一些实施例中，在种质中检测的标志可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：位于染色体区间内的一种或多种标志等位基因，该染色体区间选自下组，该组由以下组成：
1)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基5166731一致；或
2)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间包含1)中所述的任一染色体区间的一部分，并且其中染色体区间包含至少一个如分别在表1中任一个中展示的SNP标志；或
3)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中任一个中显示的任何SNP标志。
在一些实施例中，在种质中检测的标志可以包含选自表1中任一个的一个或多个标志等位基因、基本上由其组成、或由其组成。
用于产生和/或选择亚洲大豆锈病抗性/耐受性大豆植物或种质的方法可以包括使第一大豆植物或种质与第二大豆植物或种质杂交，其中所述第一大豆植物或种质包含选自下组的染色体区间，该组由以下组成：
1)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基5166731一致；或
2)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间包含1)中所述的任一染色体区间的一部分，并且其中染色体区间包含至少一个如分别在表1中任一个中展示的SNP标志；或
3)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中任一个中显示的任何SNP标志。
本文还提供了将与增强的疾病(例如ASR、SCN、SDS、RKN、疫霉菌等)抗性/耐受性(例如ASR、SCN、SDS、RKN、疫霉菌等)相关联的等位基因渗入到大豆植物中的方法。用于将与增强的疾病(例如ASR、SCN、SDS、RKN、疫霉菌等)抗性/耐受性相关联的等位基因渗入到大豆植物或种质中的此类方法可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：将包含所述等位基因(供体)(其中所述等位基因选自表1中列出的任何等位基因)或与表1中列出的标志“紧密接近”的标志的第一大豆植物或种质与缺乏所述等位基因的第二大豆植物或种质(轮回亲本)杂交，并且将包含所述等位基因的子代与轮回亲本反复回交。可以通过在其基因组中检测与增强的疾病(例如ASR、SCN、SDS、RKN、疫霉菌等)抗性/耐受性相关联的标志的存在来鉴定包含所述等位基因的子代。标志可以在从子代取得的任何样品中检测到，该子代包括但不限于所述子代的一部分(例如来自所述植物或种质的种子切片、叶片冲压片或细胞)或来自所述子代的核苷酸序列。可以使用本领域已知的任何现有或未来的方法(包括但不限于自动化方法：用锋利的刀片去除一部分胚乳、在种子中钻一个小孔并收集所得粉末，用激光切割这些种子并冲压叶圆片)从子代中取得这种样品。供体或轮回亲本之一或两者可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，轮回亲本是优良大豆品种。在一些实施例中，轮回亲本的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，用于鉴定包含与增强的疾病(例如ASR、SCN、SDS、RKN、疫霉菌、褐茎腐病等)抗性/耐受性相关联的等位基因的子代的标志可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：位于选自下组的染色体区间内的一个或多个等位基因，该组由以下组成：
1)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基5166731一致；或
2)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间包含1)中所述的任一染色体区间的一部分，并且其中染色体区间包含至少一个如分别在表1中任一个中展示的SNP标志；或
3)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中任一个中显示的任何SNP标志。
在一些实施例中，标志可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：位于至少两个不同染色体区间的标志等位基因。例如，标志可包含位于由表1中的任何两个标志定义并且包括其的染色体区间中的一个或多个等位基因。
疾病抗性大豆植物和种质
本发明提供了疾病抗性大豆植物和种质。如上所述，本发明的方法可用于鉴定、产生和/或选择疾病抗性大豆植物或种质(例如针对亚洲大豆锈病具有抗性或增加的耐受性的大豆植物)。除了上述方法，疾病抗性大豆植物或种质可以通过任何方法产生，借这些方法将与增强的疾病耐受性相关联的标志引入大豆植物或种质中，这些方法包括但不限于转化、原生质体转化、或融合，双单倍体技术，胚拯救，基因编辑，和/或通过任何其他核酸转移系统产生。
在一些实施例中，大豆植物或种质包含非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，大豆植物或种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
疾病抗性大豆植物或种质可以是优良大豆品种和包含与增强的疾病(例如ASR)耐受性相关联的等位基因的大豆品种之间的杂交的子代，其中该等位基因在选自下组的染色体区间内，该组由以下组成：
1)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基5166731一致；或
2)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间包含1)中所述的任一染色体区间的一部分，并且其中染色体区间包含至少一个如分别在表1中任一个中展示的SNP标志；或
3)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中任一个中显示的任何SNP标志。
疾病抗性大豆植物或种质可以是基因渗入的子代，其中轮回亲本是优良大豆品种，并且供体包含与增强的疾病耐受性和/或抗性相关联的等位基因，其中该体携带包含SEQ ID NO:1中任一个的染色体区间或其部分，并且其中该染色体区间包含分别选自表1的至少一个等位基因。
疾病抗性大豆植物或种质可以是第一优良大豆品种(例如，测试品系)之间的杂交的子代，和第二优良大豆品种(例如，轮回亲本)与包含与增强的ASR耐受性相关联的等位基因的大豆品种(例如，供体)之间的杂交的子代。
疾病抗性大豆植物或种质可以是第一优良大豆品种与基因渗入的子代之间杂交的子代，其中轮回亲本是第二优良大豆品种，并且供体包含与增强的ASR耐受性相关联的等位基因。
本发明的疾病抗性大豆植物和种质可以包含一种或多种本发明的标志(例如表1中描述的任何标志；或与如表1中描述的任何标志紧密接近的任何标志)。
在一些实施例中，疾病抗性大豆植物或种质可在其基因组内包含与增强的ASR耐受性相关联的标志，其中所述标志位于选自下组的染色体区间内，该组由以下组成：
1)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基5166731一致；或
2)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间包含1)中所述的任一染色体区间的一部分，并且其中染色体区间包含至少一个如分别在表1中任一个中展示的SNP标志；或
3)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中任一个中显示的任何SNP标志。
在一些实施例中，疾病抗性大豆植物或种质可在其基因组内包含标志，该标志包含位于至少两个不同染色体区间中的标志等位基因、基本上由其组成或由其组成。例如，标志可包含位于由表1中的两个标志的任何组合定义并且包括其的染色体区间中的一个或多个等位基因。
疾病抗性大豆种子
本发明提供了疾病抗性大豆种子。如上所述，本发明的方法可用于鉴定、产生和/或选择疾病抗性大豆种子。除了上述方法，疾病抗性大豆种子可以通过任何方法产生，借这些方法将与增强的ASR耐受性相关联的标志引入大豆种子中，这些方法包括但不限于转化、原生质体转化或融合，双单倍体技术，胶原蛋白拯救，基因编辑(例如CRISPR或TALEN或大范围核酸酶)，和/或通过任何其他核酸转移系统产生。
在一些实施例中，疾病抗性大豆种子包含非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，大豆种子与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
疾病抗性大豆种子可以由通过本发明的方法鉴定、产生或选择的疾病抗性大豆植物产生。在一些实施例中，疾病抗性大豆种子由本发明的疾病抗性大豆植物产生。
本发明的疾病抗性大豆种子可包含来自本发明表1的一种或多种标志。
在一些实施例中，疾病抗性大豆种子可在其基因组内包含与增强的ASR耐受性相关联的标志，其中所述标志位于选自下组的染色体区间内，该组由以下组成：
1)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间与SEQ ID NO:1的核苷酸碱基1至核苷酸碱基5166731一致；或
2)衍生自PI339656或其子代的染色体区间，其中所述染色体区间包含1)中所述的任一染色体区间的一部分，并且其中染色体区间包含至少一个如分别在表1中任一个中展示的SNP标志；或
3)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中任一个中显示的任何SNP标志。
实例
以下实例不旨在是一个本发明得以实施的所有不同方式或可以加入本发明中的所有特征的详细目录。本领域的技术人员将理解到可以在不偏离本发明的情况下对不同实施例作出众多变化和添加。因此，以下说明旨在阐述本发明的一些特定实施例，并且并没有穷尽地叙述其所有排列、组合和变化。
实例1：ASR抗性野生大豆属品系鉴定
评估了野生大豆属品系对十六种锈病菌株的锈病抗性(见图1)。使用来自USDA-ARS(FL Q09、FL Q12、LABR13、FLQ11)的单个脓包衍生的分离物和田间群体(FL Q15、NC06、Vero、GLC15、UBL、BR南(BR south)和BR中心(BR central))单个脓包衍生的分离株生成锈病数据，在封闭的设施中进行筛选。
锈病等级是根据Burdon和Speer,TAG,1984修改的分组进行分类的(见图2)。在北美和南美，每次用约4株植物筛选每个登录号>2次。
实例2：等位基因挖掘和关联到PI339656ASR基因座
将抗性亲本与易感的澎湖大豆品系杂交并产生F1植物(见表2)。F1植物是自交受精的并且从自交F1植物收获F2种子。播种约200颗F2种子，收集每株植物的叶组织用于DNA制备，然后用豆薯层锈菌接种植物以确定每个F2个体的抗性/易感表型。将来自50个抗性F2和50个易感F2的组织在分开的库中组合，并从每个库制备基因组DNA。针对这些库中的每个，从DNA制备Illumina测序文库，并且在两个Illumina HiSeq2000 2x 100bp配对末端(PE)泳道中对每个文库进行测序。调整测序读段以除去PHRED质量分数<15的碱基。
作为一个非限制性实例，ASR抗性表型可以包括在暴露于ASR的植物的叶上形成没有孢子的病损，而ASR易感表型包括在暴露于ASR的植物的叶上形成孢子。还有其他表型可用于区分ASR抗性植物和易感植物。
使用GSNAP(WU和NACU 2010)作为配对末端片段，将质量调整的读段与PI339656参比基因组序列进行比对。如果一对读段不能一起比对，则将它们作为单体处理以进行比对。如果读段唯一地定位到参考，则将它们用于随后的分析(每36bp≤2个错配，并且每75bp少于5个碱基作为尾部)。
基于读段深度，在BSA分析之前过滤SNP，其中保留具有40至200x读段深度的SNP。使用卡方检验(Chi-square)来选择两个库中两个等位基因之间具有显著不同读段的SNP。使用经验贝叶斯方法(LIU等人,2012)来估计在抗性库和易感库两者中每个SNP标志与因果基因座(causal locus)之间不存在重组的条件概率。SNP和因果基因之间连锁的概率是这两个条件概率的几何平均值。发现大约780个SNP可能与靶基因座连锁。使用表型F2个体，将这些假定连锁的SNP的子集用于精细定位基因座。
参见参考文献：LIU,S.,C.-T.YEH,H.M.TANG,D.NETTLETON和P.S.SCHNABLE,2012Gene Mapping via Bulked Segregant RNA-Seq(BSR-Seq)[经由混合集群RNA-Seq(BSR-Seq)进行基因定位].PLoS ONE[公共科学图书馆期刊]7:e36406和Wu,T.D.以及S.Nacu,2010Fast and SNP-tolerant detection of complex variants and splicingin short reads[快速和SNP耐受的复杂变体检测和短读段中的剪接].Bioinformatics[生物信息学]26:873-881。
表8：植物杂交和研究类型
Figure BDA0003494708870002931
1.PI339656 Data2Bio LLC(埃姆斯公司(Ames)，爱荷华州(Iowa))用于四倍体大 豆的gBSA-Seq分析的实验室方法。
四倍体大豆群体中因果基因座的染色体发现，
PI339656中因果基因座的染色体发现使用Data2Bio基因组分离群体分组分析(gBSA)技术进行。理论上，抗性由单个显性等位基因控制。Data2Bio从在两个易感组织库和两个抗性组织库中提取的DNA样本中生成了几个文库，并在八(8)个Illumina HiSeq20002x 100bp配对末端(PE)泳道中对它们进行了测序。用于后续分析的参考基因组总结、从原始数据到质量修整的读段处理、
比对、SNP发现和SNP影响展示在图3-5中。经过各种过滤步骤，在PI339656基因组中鉴定出4,610,234个信息性SNP。然后使用贝叶斯方法计算性状相关联概率。接下来，创建了靠前重叠群(top contig)的性状相关联SNP(概率截止值为0.01)的物理图谱(图3-5)。一种支架，支架14851，被鉴定并定位到PI339656的14号染色体(SEQ ID NO:1)。来自这个富集支架的SNP被定位到公开大豆基因组。数据表明，因果R基因可能定位在14号染色体上3.18到3.5MB的区间内或附近。
实例3：胚拯救和将R基因区间基因渗入到大豆品系中
进行胚拯救并施加化学处理以产生双二倍体芽。如果双二倍体植物是可育的，它们将用于与大豆回交。与大豆回交和随后的胚拯救需要进行几代，以逐渐消除多年生大豆属染色体。
远缘杂交：将优良先正达大豆品系(RM 3.7至4.8)用作雌性(花粉接种者)，并将澎湖大豆的多种登录用作雄性或花粉供体。在适当的发育阶段从含有花药的大豆属植物中选择花是重要的。新鲜、全开、鲜艳的花朵保持具有成熟花粉的花药。花粉应呈现松散的黄色尘状。这些花从大豆属植物中取出并带至大豆植物进行授粉。来自大豆属植物的花粉应在除花后30分钟内使用。鉴定和选择可供授粉的大豆花芽也很重要。当与未成熟的芽相比时，当大豆花芽的尺寸较大时，其通常是可供使用的(ready)。大豆花的萼片颜色较浅，并且花瓣刚刚开始出现。首先，使用一对细尖的镊子小心地从花芽上分离萼片，露出外层花瓣。然后，轻轻地抓住并去除花上的花瓣(总共5篇)，露出雌蕊周围的雄蕊环。由于在花药开始脱落花粉前1天，柱头受到花粉，因此认识到“雌性可供使用，雄性未能供使用(not ready)”的阶段性发育是很重要的。当在这个发育阶段授粉大豆花时，没有必要去除雌花。找到大豆花上的柱头。然后使用1朵雄花，小心地剥离花瓣以暴露花药，并将花粉粒轻轻地撒在大豆花的柱头上。在此过程中，应随时注意不要损害柱头。在授粉后的第二天开始，将激素混合物喷洒在授粉的花上，并且最终每天发育F1豆荚1X直至收获。授粉的花或豆荚充满了激素混合物的轻雾，注意不要使花/豆荚过早地从植物上脱落。该混合物含有100mg GA3、25mg NAA和5mg激动素/L蒸馏水。这些激素有助于保持豆荚发育和增加的豆荚生长。
收获：在授粉后大约14至16天收获来自远缘杂交的豆荚。文献中的收获日期建议19到21天。在授粉后14至16天的豆荚收获比文献中建议的早约5天，缩短了时间线。在选择单独的豆荚收获之前，确认萼片被移除(这表明远缘杂交尝试)并且种子大小与针对远缘杂交预期的一样。收集豆荚并根据远缘杂交组合进行计数以确定杂交成功。多个大豆雌性和澎湖大豆的5个不同的登录的平均杂交成功率大约为40％。远缘杂交豆荚可以含有1至3个种子，但通常在每个F1荚中发现2个种子。
胚拯救：我们的胚拯救方案涉及从胚直接芽再生，而不是通过胚发生再生，从而使植物恢复更快(与长达1年时间线相比，芽在大约2-3个月内恢复)。我们的方案不包括转移到萌发培养基后在黑暗中培养。我们的方案不需要转移到生根培养基。
将收获的豆荚收集并带回实验室进行灭菌。首先用70％EtOH冲洗豆荚2至3分钟，然后在平台振荡器上以大约130RPM将其置于10％Clorox漂白剂中持续另外30分钟。最后，用无菌水冲洗豆荚多次以除去任何残留的漂白剂。在豆荚灭菌后可以立即开始胚分离，或者在胚分离之前豆荚可以在4℃储存长达24小时。接下来，将灭菌的豆荚放入层流净化罩中，在其中可以拯救胚。将个体豆荚置于无菌培养皿中并使用手术刀和镊子打开。沿着远缘杂交豆荚的长度远离种子做一个切口。然后可以容易地打开豆荚以暴露种子。可替代地，可以使用两对镊子来分离豆荚壳。小心地从豆荚中取出种子，并在解剖显微镜下放入无菌培养皿中。需要非常精细的镊子将胚与种子分离。用一只手握住镊子，轻轻地将种子的一侧远离胚，使脐带朝上。另一只手使用另一对镊子从含有胚的种子一侧除去种皮。剥掉胚周围的膜，并将胚从底部向上推。胚应该经过球状发育阶段，并且优选地经过早期心(heart)发育阶段(中期到晚期心阶段、子叶阶段和早期成熟阶段胚是所希望的)。将分离的胚转移到胚拯救培养基，例如大豆ER1-1。此时可以处理胚以诱导染色体加倍。(有关染色体加倍的详细信息，参见下文)将分离的胚在24℃在胚拯救培养基上保留21至30天。胚可以在ER1-1的整个孵育中保持在黑暗中，可以在黑暗中开始孵育并在光照下完成，或者可以在光照下进行整个孵育。该方案中没有愈伤组织诱导阶段。芽直接从胚发育而来。
染色体加倍处理：秋水仙碱或氟乐灵可用于诱导染色体加倍。理想地，对晚期心阶段远缘杂交胚(或更大)进行化学处理以在分离长达1周后的任何时间紧接分离进行诱导染色体加倍。双倍剂可以在固体或液体培养基中混合并施用数小时或长达几天。氟乐灵在固体或液体培养基中以10-40uM浓度使用。此外，秋水仙碱在固体或液体培养基中以0.4-1mg/ml的浓度使用。化学处理后，将胚转移到新鲜胚拯救培养基中。胚拯救后可立即进行秋水仙碱或氟乐灵处理。
芽再生：将发育中的胚从拯救培养基转移到萌发培养基(例如大豆ER GSMv2)中在24℃在光照下约3到5周。可替代地，可以将发育中的胚从拯救培养基转移到伸长培养基(例如大豆E1 0 No TCV)中在24℃在光照下约3到5周。发育中的芽可以从培养基平板转移到含有萌发或伸长培养基的Phytocons中，用于进一步芽发育。将已建立的芽移至土壤中。最初的植物护理对于这些芽的存活至关重要。
倍性分析：使用流式细胞仪进行倍性分析。从培养物中或在土壤中建立后的小芽中收集用于倍性分析的叶组织。将组织在干冰上收集并储存在-80℃直至分析，或在湿冰上收集并在同一天进行分析。0.5cm2的样品尺寸是足够的。根据Sysmex试剂盒中的说明书制备样品。每个样品组含有未处理的F1植物(未处理以诱导染色体加倍)作为对照。以下是方法说明：远缘杂交-我们的远缘杂交成功率明显高于文献中报道的。不进行雌性花去雄，这节省了时间并降低了对柱头损害的风险。
以上实例清楚地说明本发明的优点。虽然已经参考某些实施例的具体细节描述本发明，但不希望此类细节被视为对本发明范围的限制，除非它们被包括在所附权利要求书中或到它们被包括在所附权利要求书中的程度。
在整个申请中，引用了各种专利、专利出版物和非专利出版物。这些专利、专利出版物和非专利出版物的披露内容通过引用以其整体在此并入本申请中，以便更全面地描述本发明所属领域的现状。

Claims (22)

1.一种优良大豆植物，所述优良大豆植物的基因组中引入了来自澎湖大豆品系的染色体区间，所述澎湖大豆品系选自由PI339656、PI591576或其子代组成的登录品系组，其中所述染色体区间赋予与不包含所述染色体区间的对照植物相比增加的亚洲大豆锈病(ASR)抗性。
2.如权利要求1所述的植物，其中所述染色体区间包含SEQ ID NO:1或其部分。
3.如权利要求1-2所述的植物，其中所述染色体区间包含与增加的ASR抗性相关联的SNP标志，其中所述SNP标志与如表1中所列出的有利SNP标志中任一个一致。
4.如权利要求1-3所述的植物，其中所述染色体区间衍生自澎湖大豆1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20号染色体。
5.如权利要求1-4所述的植物，其中所述染色体区间对应于澎湖大豆基因组内对应于SEQ ID NO:1的位置。
6.如权利要求1-5中任一项所述的子代植物或种子。
7.一种衍生自如权利要求1-6所述的植物的植物细胞或植物部分。
8.如权利要求1-7所述的植物，其中所述植物进一步显示出对选自以下的任一个胁迫的抗性：疾病(如白粉病、终极腐霉菌、疫霉根腐病、叶斑病、稻瘟病、褐斑病、根结线虫、大豆胞囊线虫、大豆脉坏死病毒、大豆茎溃疡病、大豆猝死综合征、叶瘟和穗瘟、锈病、蛙眼叶斑病、褐茎腐病、镰刀菌或纹枯病)；昆虫有害生物(如粉虱、蚜虫、麦蛞蝓、甘蔗螟、绿蚜或蚜虫)；非生物胁迫(如耐旱性、水淹、高水平盐度、重金属、铝、锰、镉、锌、UV-B、硼、缺铁失绿症或耐寒性(即极端温度))。
9.一种优良大豆植物，其包含赋予增加的对ASR的抗性的ASR抗性等位基因，并且其中所述ASR等位基因包含至少一个选自表1中任一个中描述的“有利”单核苷酸多态性(SNP)的组的SNP。
10.一种优良大豆植物，其包含来自澎湖大豆的染色体区间，所述染色体区间包含至少一个选自表1的有利SNP标志。
11.如权利要求10所述的植物，其中所述澎湖大豆是PI339656或其子代中的任一个。
12.一种产生对ASR具有增加的抗性的大豆植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含对应于SEQ ID NO:1的染色体区间的澎湖大豆植物品系或其子代；
b.基本上如实例3所述或如US 7,842,850所述或转基因地实施胚拯救方法；
c.收集由b)的方法产生的种子
d.将c)的种子再生为植物。
13.如权利要求12所述的方法，其中a)的澎湖大豆植物品系是PI339656、PI591576或其子代。
14.一种鉴定或选择具有衍生自澎湖大豆的ASR抗性等位基因的大豆植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a.从大豆植物中分离核酸；
b.在所述核酸中检测与增加的ASR抗性相关联的分子标志的存在，其中所述分子标志位于如表1中描述的标志的20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM内；以及
c.从而鉴定或选择具有衍生自澎湖大豆的ASR抗性等位基因的大豆植物。
15.一种大豆物种的植物，其中所述植物的基因组的一部分通过使用化学诱导的染色体加倍从野生大豆属物种获得，并且其中所述部分赋予所述植物与不包含所述部分的对照植物相比增加的对ASR的抗性。
16.一种大豆物种的植物，其中所述植物的基因组包含染色体区间，所述染色体区间赋予与不包含所述染色体区间的对照植物相比增加的对ASR的抗性，的其中所述染色体区间从野生大豆属物种引入所述植物中，并且其中具有所述染色体区间的所述植物通过化学诱导的染色体加倍获得。
17.如权利要求18所述的植物，其中所述染色体区间从澎湖大豆植物品系引入。
18.如权利要求16-17中任一项所述的植物，其中所述澎湖大豆植物品系是登录品系PI339656、PI591576或其子代中的任一个。
19.如权利要求16-18中任一项所述的植物，其中所述染色体区间从澎湖大豆的14号染色体引入。
20.如权利要求16-19中任一项所述的植物，其中所述染色体区间对应于澎湖大豆基因组内对应于SEQ ID NO:1或其部分的位置。
21.如权利要求16-20中任一项所述的子代植物或种子。
22.一种衍生自如权利要求16-21所述的植物的植物细胞或植物部分。
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