CN115175556A - 与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座 - Google Patents

与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座 Download PDF

Info

Publication number
CN115175556A
CN115175556A CN202080059267.1A CN202080059267A CN115175556A CN 115175556 A CN115175556 A CN 115175556A CN 202080059267 A CN202080059267 A CN 202080059267A CN 115175556 A CN115175556 A CN 115175556A
Authority
CN
China
Prior art keywords
plant
soybean
nucleic acid
resistance
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202080059267.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115175556B (zh
Inventor
单志慧
郝青南
陈海峰
杨艳艳
张婵娟
陈李淼
袁松丽
曹东
郭葳
张晓娟
陈水莲
杨中路
邱德珍
周新安
刘清利
B·W·布莱廷格
董淑杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Syngenta Biotechnology China Co Ltd
Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Original Assignee
Syngenta Biotechnology China Co Ltd
Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Syngenta Biotechnology China Co Ltd, Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences filed Critical Syngenta Biotechnology China Co Ltd
Priority to CN202311040417.6A priority Critical patent/CN117904170A/zh
Publication of CN115175556A publication Critical patent/CN115175556A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115175556B publication Critical patent/CN115175556B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H6/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their botanic taxonomy
    • A01H6/54—Leguminosae or Fabaceae, e.g. soybean, alfalfa or peanut
    • A01H6/542—Glycine max [soybean]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
    • A01H1/045—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection using molecular markers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
    • A01H1/12—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield
    • A01H1/122—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • A01H1/1245—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, e.g. pathogen, pest or disease resistance
    • A01H1/1255—Processes for modifying agronomic input traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, e.g. pathogen, pest or disease resistance for fungal resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A01H5/12—Leaves
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Testing Resistance To Weather, Investigating Materials By Mechanical Methods (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了使用衍生自大豆株系SX6907的标志、基因和染色体区间来鉴定、选择和/或产生对亚洲大豆锈病具有抗性的大豆植物或种质的方法和组合物。还提供了抗亚洲大豆锈病的大豆种子、植物和种质。

Description

与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年7月1日提交的中国专利申请号201910584420.1的优先权，其披露内容以其全文并入本文。
序列表
本申请含有一份已经以ASCII格式电子提交的序列表并且将该序列表通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2020年6月22日，名为115479.000346_SequenceListing_22June2020_ST25.txt并且大小为167,289字节。
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种与大豆中锈病抗性相关联的蛋白、其编码基因和用途。
背景技术
大豆(Soybean，Glycine max)是世界四大油料作物之一，也是生产蛋白质最重要的作物之一。锈病是全球大豆生产中的主要疾病，防治该疾病的主要方法是施用叶面杀真菌剂。
目前还没有完全抗锈病的商品化品种。锈病的病原菌为豆薯层锈菌，锈病病原菌的寄主包括广泛的豆科植物(分别地，17个属中至少31个物种；Slaminko等人,(2008)PlantDis.[植物疾病],92:797-771；19个属中至少42个物种；Frederick等人,(2002)Mycology[真菌学],92:217-227)。此外，另外152个物种已被认为是豆薯层锈菌的潜在宿主(Bonde等人,(2008)Plant Dis.[植物疾病],92:30-38；Goellner等人,(2010)Molecular PlantPathology[分子植物病理学],11:169-177；Ono等人,(1992)Mycol.Res.[真菌学研究],96(10):825-850；和Slaminko等人,(2008)Plant Dis.[植物疾病],92:797-771)。杀真菌剂的应用是目前唯一可用的减轻锈蚀的方法。
很少有大豆资源对豆薯层锈菌具有抗性。大豆资源对豆薯层锈菌的抗性对个体生理小种具有特异性，因此，在利用抗性资源进行繁育时，如果忽略这种抗性特异性，可能会因宿主抗性与生理小种之间的不相容性而丧失抗性资源中的抗性，这不利于抗性资源的持续利用。
培育锈病抗性品种是防止锈病危害最经济有效的方法。通过在大豆种质和其他豆科植物中探索新的抗病基因，并将它们作为单个基因、多个基因或以多个基因盒的形式转移到大豆中，这些抗性基因可能能够通过同源或异源表达提供对豆薯层锈菌的抗性。因此，需要能够引入商业大豆植物以控制锈病抗性的新颖抗锈病基因。
发明内容
本概述列出了本披露主题的若干实施例，并且在许多情况下列出了这些实施例的变化和排列。
因此，本披露主题的一个目的是提供用于将锈病抗性传递到非抗性大豆种质或植物品系的方法。另外，本披露主题提供了新颖的大豆品系，其在其基因组中包含衍生自大豆株系SX6907并且进一步在所述新颖的大豆品系中赋予亚洲大豆锈病(本文中，“ASR”)抗性的染色体区间、基因座和/或基因。
本发明提供了衍生自大豆株系SX6907的染色体区间，当将其引入植物(例如大豆例如大豆株系Williams 82)中时是足以赋予与不包含所述染色体区间的对照植物相比增加的锈病抗性，例如比如亚洲大豆锈病(“ASR”)抗性。本发明还提供了衍生自大豆株系SX6907的蛋白质和核酸，它们赋予了锈病抗性。
还提供了用于鉴定、选择和产生具有增强的锈病抗性的大豆属(Glycine)植物(包括野生大豆属(例如短绒野大豆)和大豆品系)的组合物和方法。还提供了锈病抗性大豆植物和种质。
在一些实施例中，提供了鉴定锈病抗性大豆植物或种质的方法。此类方法可以包括在大豆植物或种质中检测与增强的疾病抗性(特别是ASR抗性)相关联的遗传基因座或分子标志(例如SNP或数量性状基因座(QTL))。在一些实施例中，遗传基因座或分子标志与包含SEQ ID NO 11、12或13的核苷酸序列或其部分、或其部分的染色体区间的存在相关联，其中其部分与ASR抗性相关联。在另一个实施例中，遗传基因座或分子标志与SEQ ID NO:2的核苷酸或其与ASR抗性相关的部分的存在相关联。在又一个实施例中，遗传基因座或分子标志与编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核苷酸或其与ASR抗性相关的部分的存在相关联。
在一些实施例中，提供了产生ASR抗性大豆植物的方法。此类方法可以包括在大豆植物或种质中检测与增强的病原体(例如ASR)抗性相关联的遗传基因座和/或遗传标志的存在，以及从所述大豆种质中产生子代植物。在一些实施例中，这些方法用于产生新颖的ASR抗性大豆株系。
其他实施例包括选择疾病抗性大豆植物或种质的方法。此类方法可以包括使第一大豆植物或种质与第二大豆植物或种质杂交，其中该第一大豆植物或种质包含衍生自包含与增强的疾病和/或ASR抗性和/或耐受性相关联的SEQ ID NO 2、11、12或13中任一个或其部分的大豆株系SX6907或其子代植物的遗传基因座，并选择具有遗传基因座的子代植物或种质。
在一些实施例中，提供了将与增强的锈病抗性相关联的、衍生自大豆株系SX6907的遗传基因座基因渗入到大豆植物或种质的方法。此类方法可以包括将第一大豆植物或种质(该大豆植物或种质包含与增强的锈病(ASR)抗性相关联的、衍生自大豆株系SX6907的染色体区间(例如SEQ ID No:11、12、或13或其部分))与第二大豆植物或种质(该大豆植物或种质用缺乏所述基因座)杂交，并任选地将包含所述遗传等位基因的子代植物与第二大豆植物或种质重复回交以产生具有增强的病原体抗性的大豆植物(例如大豆)或种质，该大豆植物或种质包含与增强的ASR抗性相关联的、衍生自大豆株系SX6907和/或ZRYCR1的染色体区间。在一个实施例中，染色体区间包含SEQ ID NO:2。在另一个实施例中，染色体区间包含SEQ ID NO:1。
包含与增强的病原体抗性相关联的染色体区间的子代可以通过在其基因组中检测与衍生自大豆登录号株系SX6907和/或ZRYCR1的所述染色体区间相关联或与其遗传连锁的标志的存在来鉴定，其中所述染色体区间包含SEQ ID NO 11、12或13或其部分，并且该标志可以是如表1中描述的有利等位基因中任一个。
还提供了通过本发明的方法鉴定、产生或选择的大豆植物和/或种质，以及衍生自通过这些方法鉴定、产生或选择的大豆植物或种质的任何子代或种子。在一个实施例中，与SEQ ID NO 11、12或13中任一个中描述的染色体区间的存在相关联的分子标志可用于鉴定或选择对ASR具有抗性的植物品系。另外的所述分子标志可以位于所述染色体区间的20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、和1cM内，或者来自如表1中描述的与ASR抗性相关联的任何对应的有利等位基因。在另一个实施例中，所述分子标志可以位于如表1中描述的与ASR相关联的任何SNP标志的20cM、10cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM内。
还提供了非天然存在的大豆种子、植物和/或种质，其包含衍生自与增强的锈病抗性相关的株系SX6907和/或ZRYCR1的一个或多个遗传基因座。在具体实施例中，遗传基因座包含SEQ ID NO:11、12或13中的任一个，或其一部分和/或如表1中所描绘的任何有利等位基因。在其他实施例中，遗传基因座包含SEQ ID NO:2的核酸序列或编码SEQ ID NO:1的蛋白质的核酸。
与增强的锈病(ASR)抗性相关的标志可以包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：与增强的病原体(ASR)抗性相关联的衍生自株系SX6907和/或ZRYCR1的一个或多个遗传基因座处的单个等位基因或等位基因的组合。在一个实施例中，标志在如SEQ ID NO:11、12或13描述的染色体区间内。在另一个实施例中，标志在SEQ ID NO:2内。在另一个实施例中，标志是如表1中描述的有利等位基因中任一个。
还提供了用于产生具有增强的疾病抗性的大豆属植物的其他组合物和方法。在本发明的一个方面，提供了一种DNA构建体，其包含在植物细胞中起作用的启动子，该启动子与编码跟SEQ ID NO:1具有至少80％100％同源性的蛋白质的DNA分子可操作地连接。本披露内容还涉及DNA分子。示例性的DNA分子包括(B1)SEQ ID NO:2中所示的DNA分子；(B2)与(B1)中定义的DNA分子在严格条件下杂交并编码该蛋白质的DNA分子；(B3)与(B1)和(B2)中定义的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性并编码该蛋白质的DNA分子。
本发明的另一方面涉及包含所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细菌或转基因细胞系。本发明还涉及制备可育转基因植物的方法，所述方法包括提供包含RG21基因和RG22基因中的至少一个的植物表达盒，并在允许受体细胞摄取所述植物表达盒的条件下使所述受体植物细胞与所述植物表达盒接触；选择含有所述植物表达盒的所述受体植物细胞；从所选择的受体植物细胞再生植物；并且鉴定对大豆病原体，特别是ASR有抗性的可育转基因植物。
在本发明的另一方面，提供了可育转基因植物，其包含如上所述的植物表达盒，并且其中所述植物对大豆病原体，特别是ASR具有抗性。
在本发明的另一方面，提供了在田间控制ASR的方法，所述方法包括种植来自包含如本文所述的表达盒的植物的种子的步骤。
作为另外的方面，涉及产生本发明的转基因植物的种子和由本发明的转基因植物产生的种子。
还提供了衍生自本发明的转基因植物的收获产物，其中所述收获产物任选地包含本发明的核苷酸序列、表达盒、载体和/或至少一种蛋白质或DNA分子。进一步提供了衍生自本发明的收获产物的加工产物，其中所述收获产物任选地包含本发明的核苷酸序列、表达盒、载体和/或至少一种蛋白质或DNA分子。
仍另外，本披露作为另外的方面，提供了产生对大豆病原体具有增加的抗性的转基因植物的方法。在实施例中，该方法可以包括增加与SEQ ID NO:1具有至少80％-100％同源性的蛋白质的表达水平和/或活性。在另一个方面，本披露涉及用于繁育具有改进的锈病抗性的植物品种的方法，这些方法包括在受体植物中增加与SEQ ID NO:1具有至少80％-100％同源性的蛋白质的表达水平和/或活性的步骤。
本发明的组合物还包括用于检测本文披露的新颖抗性基因的探针和引物对。
上述的以及本发明的其他目的和方面将在以下阐述的附图和说明中进行详细解释。
附图说明
图1是具有锈病抗性基因RppRC1的重组载体pB2GW7-RppRC1的质粒图谱。
图2是RppRC1转基因植物T1代的PCR检测图。M：标志。L1-1、L1-2、L1-3为转化事件L1的T1植物的部分单株，L2-1、L2-2、L2-3为转化事件L2的T1植物的部分单株，和阴性：阴性对照天隆1号，阳性：阳性对照SX6907。
图3示出了RT-PCR鉴定RppRC1基因在T1代转基因植物中的表达。L1-2是转化事件L1的T1植物的单株，L2-1是转化事件L2的T1植物的单株。
图4A和4B示出了转基因植物的DNA分析。图4A示出了RppRC1转基因植物的DNA分析。L1-1、L1-2、L1-3、L1-4和L1-5分别是转化事件L1的T1植物的部分单株。L2-1和L2-2为转化事件L2的T1株的部分单株，而天隆1号为阴性对照。图4B示出了具有空载体的转基因植物的DNA分析。L3-1、L3-2、L3-3、L3-4、L3-5和L3-6是空载体转化事件L3的T1植株的部分单株。CK是天隆1号。
图5示出了T0转基因植物在接种后12天的抗性鉴定表型。SX6907是抗性对照并且表现免疫性；RppRC1转化事件L2表现免疫性；空载体转化事件L3表现易感性；非转基因天隆1号表现易感性。
图6示出了T1转基因植物在接种后12天的抗性鉴定表型。SX6907是抗性对照并且表现免疫性；RppRC1转化事件L2的T1植株的单株L2-1表现免疫性；阴性对照天隆1号表现易感性。
参考图1-6，相同的转化事件标记相同的标签，相同的单株标记相同的标签。
具体实施方式
在背景技术和整个说明书中引用或描述了各种出版物、文章和专利；这些参考文献中的每一个通过引用以其全文并入本文。已经包括在本说明书中的文件、行为、材料、装置、文章等的讨论是出于提供本发明的上下文的目的。这样的讨论并不承认任何或所有这些事项构成与任何披露或要求保护的发明相关的现有技术的一部分。
本文引用的所有专利、公开的专利申请和出版物均以引用方式并入，如同在本文中充分阐述一样。
除非另外指明，本文所用的所有科学技术术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同意义。否则，本文使用的某些术语具有说明书中规定的含义。
本申请涉及编码用于锈病抗性的蛋白的新基因及其在植物中，特别是在大豆中提供锈病抗性的用途。在本发明的一个实施例中，该基因衍生自大豆(Glycine max)SX6907。
因此，在一个方面，本申请提供了与植物中的锈病抗性相关的蛋白质、其编码基因及用途。在本发明中，将RppRC1基因转化入大豆品种天隆1号获得的转基因大豆的锈病抗性显著高于野生型大豆，说明RppRC1和其编码基因可以调节和控制豆科植物的针对锈病的抗性，并且提高过表达后植物的锈病抗性。RppRC1及其编码基因可用于提高豆科作物的疾病抗性并且对繁育具有疾病抗性的新品种具有重要意义。
本发明的其他方面包括将锈病抗性传递到非抗性大豆种质或植物系中的方法。另外，本披露主题提供了新颖的大豆(Glycine max)品系，其在其基因组中包含衍生自大豆SX6907并且进一步在所述新颖的大豆品系中赋予大豆锈病抗性的染色体区间、基因座和/或基因。
定义
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本披露主题所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的意义。
尽管认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，但是提出以下定义是为了使本披露主题容易理解。
除非在上下文中另有明确说明，否则本文使用的单数形式“一种(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数提及。因此，例如，对“一个细胞”的提及包括多个这样的细胞，对“该蛋白质”的提及包括对本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等价物的提及，等等。除非另有明确说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如在说明书和权利要求中使用的，术语“包含”及其语法变体可以包括“由……组成”和“基本上由……组成”的方面。“包含”及其语法变体也可以表示“包含但不限于”。
如本文使用的，词语“或”指特定列表的任何成员并且还包括该列表的成员的任何组合。
如本文使用的，术语“和/或”是指并且涵盖一个或多个相关联的列出项的任何及全部可能组合，连同当以可替代性(“或”)解释时组合的缺少。
该范围在本发明中可以表示为从“大约”一个特定值和/或“大约”另一个特定值。当表达这样的范围时，其他方面包括从一个特定值和/或到其他特定值。类似地，当值表示为近似值时，应该理解为通过使用先行词“约”，具体值形成另一个方面。还应该理解，每个范围的端点都与另一个端点显著相关和独立。还应理解，本发明披露了多个值，除了值本身外，每个值在本文中也以“约”该特定值的形式披露。例如，如果披露了值“10”，则也披露了“约10”。还应理解，还披露了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果披露了10和15，则还披露了11、12、13和14。
术语“基本上由……组成”(以及其语法上的变体)当应用于本发明的多核苷酸序列时，意指由所列举的序列(例如，SEQ ID号)以及该列举的序列的5’和/或3’端上的全部十个或更少(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10)的另外的核苷酸两者组成的一个多核苷酸序列，这样使得该多核苷酸序列的功能未实质上发生改变。该总共十个或更少的另外的核苷酸包括全部数量的两个端上加在一起的另外的核苷酸。术语“实质上改变的”，当应用于本发明的多核苷酸时，是指与由所列举的序列组成的多核苷酸序列的表达水平相比，表达多核苷酸序列的能力增加或减少至少约50％或更多。
如本文使用的，关于植物的术语“引入”意指以任何方式完成，该方式包括但不限于：基因渗入、转基因、规律成簇的间隔短回文重复修饰(CRISPR)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)(Feng等人2013,Joung和Sander 2013)、大范围核酸酶或锌指核酸酶(ZFN)。
如本文使用的，术语“大豆”是指大豆和使用大豆(包括“野生大豆属”植物)培育或培养的任何植物品种。
如本文使用的，术语“野生大豆属”是指多年生大豆属植物，例如灰毛大豆(G.canescens)、银毛大豆(G.argyrea)、澎湖大豆(G.clandestine)、G.latrobeana、白色大豆(G.albicans)、G.aphyonota、沙生大豆(G.arenaria)、弯大豆(G.curvata)、弯裂片大豆(G.cyrtoloba)、扁豆荚大豆(G.dolichocarpa)、镰状大豆(G.falcate)、G.gracei、密毛大豆(G.hirticaulis)、乳绿大豆(G.lactovirens)、阔叶大豆(G.latifolia)、小叶大豆(G.microphylla)、蒙蒂-道格拉斯大豆(G.montis-douglas)、G.peratosa、G.pescadrensis、G.pindanica、G.pullenii、黄紫大豆(G.rubiginosa)、G.stenophita、G.syndetika、或短绒野大豆中任一种。
在本发明中，“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另有限制，否则包括在以下方面具有天然核苷酸基本特性的已知类似物(例如肽核酸)：它以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交。
术语“变体”及其语法变体指的是基本相似的序列。对于核酸分子，变体包含在天然核酸分子的一个或多个位点缺失和/或添加一个或多个核苷酸，和/或在天然核酸分子的一个或多个位点取代一个或多个核苷酸。
术语“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然氨基酸聚合物。
如本文使用的，“天然”核酸分子或蛋白质分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。
如本文使用的，术语“编码(coding)”或“编码(encoding)”及其语法变体用于表示核酸包含所期望的信息，其通过使用密码子来指导核苷酸序列(例如豆科序列)翻译为特定的蛋白质。编码蛋白质的核酸可以在核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如，内含子)，或者可以缺少这样的中间非翻译序列(例如，如在cDNA中)。
如本文使用的，术语“等位基因”是指在特定基因座处出现的两个或更多个不同核苷酸或核苷酸序列中的一个。
当标志与性状连锁并且当标志的存在指示了所希望的性状或性状形式是否会和/或会以什么程度发生在包含标志的植物/种质中时，则该标志与该性状“相关联”。类似地，当标志物与等位基因连锁并且当标志物的存在指明了等位基因是否存在于包含标志物的植物/种质中时，则该标志物与该等位基因“相关”。例如，“与增强的病原体抗性相关联的标志”是指其存在或不存在可用于预测植物是否和/或在何种程度上显示病原体抗性表型的标志(例如，与大豆植物中的ASR(锈病)抗性“相关联的”如本文中描述的任何有利SNP等位基因)。
如本文使用的，术语“回交”和“回交的”是指一种方法，凭借该方法将子代植物反复与其亲本之一回交。在回交方案中，“供体”亲本是指具有待基因渗入的所期望的等位基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座被基因渗入其中的亲本植物。例如，参见Ragot,M.等人，Marker-assisted Backcrossing:A Practical Example,in Techniques et Utilisations desMarqueurs Moleculaires Les Colloques[标志辅助回交：实践范例，分子标志技术和应用专题讨论会]第72卷，第45-56页(1995)；以及Openshaw等人，Marker-assisted Selectionin Backcross Breeding,in Proceedings of the Symposium“Analysis of MolecularMarker Data,”[回交繁育中的标志辅助选择，专题讨论会会议记录“分子标志数据分析”]，第41-53页(1994)。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指第二次使用轮回亲本，“BC2”是指第三次使用轮回亲本，以此类推。
厘摩(“cM”)是重组频率的度量单位。一个cM等于有1％的机会，一个遗传基因座处的标志会由于单代中的交换而与第二基因座处的标志分离。
如本文使用的，关于特定基因座和/或等位基因使用的术语“由……定义并包括其的染色体区间”是指由所述基因座/等位基因限定并涵盖所述基因座/等位基因的染色体区间。
如本文使用的，术语“杂交(cross)”或“经杂交的(crossed)”是指通过授粉融合配子以产生子代(例如，细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一个植物由另一个授粉)和自交(自花授粉，例如当花粉和胚珠是来自相同的植物时)两者。术语“使杂交(crossing)”是指通过授粉使配子融合以产生子代的行为。
如本文使用的，术语“栽培品种”和“品种”是指可以通过结构或遗传特点和/或表现与相同物种内的其他品种区别开的一组相似的植物。
如本文使用的，术语“所希望的等位基因”、“有利等位基因”和“目的等位基因”可互换使用以指与所希望的性状(例如ASR抗性)相关联的等位基因。
如本文使用的，术语“抑制”、“减少”等及其语法变体是指靶基因产物的表达或功能的任何减少，包括表达或功能的任何相对减少，直至并包括完全消除靶基因产物的表达或功能。
术语“增强”及其语法变体指改善、增加、放大、复制、上升和/或升高以减少一种或多种疾病症状。
如本文使用的，术语“增加”、“增强”等及其语法变体用于指靶基因(例如，抗性基因)产物的表达、功能或活性与易感植物相比的任何促进或增益或增加，从而提供对一种或多种病原体(例如，层锈菌属)或疾病(例如，锈病)的增强的抗性。此外，如本文使用的，术语“导致”或“增加”及其语法变体可以指靶基因产物的更高表达，使得水平相对于缺乏本文披露的靶基因或蛋白质的细胞或植物而言增加10％或更多、50％或更多、或100％。
本发明中使用的术语“免疫性”或“免疫”是指不存在任何宏观上可见的疾病症状。在本发明中使用的术语“部分抗性”是指存在宏观上可见的病损(其中没有或具有有限的孢子形成)和/或任何疾病症状的范围或程度的减少和/或任何疾病症状进展的延迟，并且可能，例如，表现出病损数量减少或其中孢子形成减少的病损。如本文使用的，就锈病而言，术语“易感性”或短语“缺乏抗性”是指在孢子形成水平等于或高于参考标准(例如，Williams或Peking品种)中观察到的孢子形成水平的情况下发生病损。
本文使用的术语“抗性”是指植物中由植物病原体引起的一种或多种疾病症状不存在或减少。抗性可能意味着当与对疾病易感的植物或不包含减少一种或多种疾病症状的有效抗性基因的植物相比时，疾病症状，例如患病植物的数量、落叶和相关的产量损失降低、最小化或减少。此外，抗性可能包括预防或延迟病原体增殖。一般而言，术语“抗性”包括上文定义的免疫性和部分抗性。
如本文使用的，术语“增强的病原体抗性”、“增强的植物病原体抗性”或“增强的疾病抗性”是指与一种或多种对照植物(例如，亲本中的一个或两个、或缺乏与针对对应的病原体/疾病的增强的病原体抗性相关联的标志的植物)相比，尽管感染了疾病(例如亚洲大豆锈病)，植物的耐受和/或繁殖能力的改善、增强或增加。增强的疾病抗性包括减少指示对应的疾病(如亚洲大豆锈病、大豆胞囊线虫、疫霉菌等)感染的症状的表达的任何机制(除了全株植物免疫或抗性)。
“植物病原体”及其语法变体可在本文中用于指例如担子菌纲的层锈菌属的真菌病原体(包括豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi)和山马蝗层锈菌(Phakopsorameibomiae))。植物疾病或豆科作物的疾病可以是例如锈病。
本发明使用的术语“疾病抗性基因”或“抗性基因”是指编码能够增强或改善植物防御或免疫系统应答的蛋白质的基因。
术语“直系同源物”及其语法变体是指衍生自共同祖先基因并且由于物种形成而存在于不同物种中的基因。
“优良品系”或“优良品种”是农艺学上有优势的品系，该品系是从针对有优势的农艺学表现的许多个周期的选育而产生的。众多的优良品系是可获得的并且对于大豆繁育领域的普通技术人员是已知的。“优良群体”是一类优良个体或品系，其可以用来代表在给定作物物种(如大豆)的农艺学上有优势的基因型方面的现有技术。类似地，“优良种质”或种质的优良品种是农艺学上有优势的种质，通常源自和/或能够产生具有有优势的农艺学表现的植物，例如现有的或新开发的大豆优良品系。
“优良”植物是来自优良品系的任何植物，因此优良植物是来自优良品种的代表性植物。农民或大豆繁育者可商购的优良大豆品种的非限制性实例包括：AG00802、A0868、AG0902、A1923、AG2403、A2824、A3704、A4324、A5404、AG5903、AG6202、AG0934；AG1435；AG2031；AG2035；AG2433；AG2733；AG2933；AG3334；AG3832；AG4135；AG4632；AG4934；AG5831；AG6534；和AG7231(阿斯格罗种子公司(Asgrow Seeds)，德梅因(Des Moines)，爱荷华州，美国)；BPR0144RR、BPR 4077NRR和BPR 4390NRR(生物植物研究所(Bio Plant Research)，营点(Camp Point)，伊利诺伊州，美国)；DKB17-51和DKB37-51(迪卡白遗传公司(DeKalbGenetics)，迪卡尔布(DeKalb)，伊利诺伊州，美国)；DP 4546RR、和DP 7870RR(三角洲和松树陆地公司(Delta&Pine Land Company)，卢博克市(Lubbock)，德克萨斯州，美国)；JG03R501、JG 32R606C ADD和JG 55R503C(JGL有限公司(JGL Inc.)，格林卡斯尔(Greencastle)，印第安纳州，美国)；NKS 13-K2(先正达种子公司NK部门(NK Division ofSyngenta Seeds)，黄金谷(Golden Valley)，明尼苏达洲，美国)；90M01、91M30、92M33、93M11、94M30、95M30、97B52、P008T22R2；P16T17R2；P22T69R；P25T51R；P34T07R2；P35T58R；P39T67R；P47T36R；P46T21R；和P56T03R2(先锋良种国际有限公司(Pioneer Hi-BredInternational)，庄士敦(Johnston)，爱荷华州，美国)；SG4771NRR和SG5161NRR/STS(大豆遗传学有限责任公司(Soygenetics,LLC,)，拉斐特(Lafayette)，印第安纳州，美国)；S00-K5、S11-L2、S28-Y2、S43-B1、S53-A1、S76-L9、S78-G6、S0009-M2；S007-Y4；S04-D3；S14-A6；S20-T6；S21-M7；S26-P3；S28-N6；S30-V6；S35-C3；S36-Y6；S39-C4；S47-K5；S48-D9；S52-Y2；S58-Z4；S67-R6；S73-S8；和S78-G6(先正达种子公司，亨德森市(Henderson)，肯塔基州，美国)；Richer(北极星种业有限责任公司(Northstar Seed Ltd.)，亚伯达省(Alberta)，加拿大)；14RD62(斯汀种子公司(Stine Seed Co.)，爱荷华州，美国)；或Armor 4744(阿莫尔种子有限责任公司(Armor Seed,LLC)，阿拉斯加州，美国)。
如本文使用的，术语“农艺学上优良的”意指具有许多可区分性状(例如出苗、活力、营养活力、疾病抗性、结实(seed set)、可立性、产量和脱粒性)的基因型，其允许生产者收获具有商业意义的产物。
如本文使用的，术语“商业上显著的产量”或“农艺学上可接受的产量”是指商业对比(check)品种如AG2703或DKB23-51的至少100％的谷物产量。
如本文使用的，术语“外来的”、“外来的品系”和“外来的种质”是指不是优良的任何植物、品系或种质。通常，外来的植物/种质不是衍生自任何已知的优良植物或种质，而是选择的以将一个或多个所希望的遗传元件引入繁育程序(例如，将新颖的等位基因引入繁育程序中)。
术语“种质”在本发明中用于指衍生自个体(例如，植物)、个体群体(例如，植物种系、品种或家族)的遗传物质或衍生自株系、品种、物种或培养物的克隆。种质可以是生物体或细胞的一部分，或者可以从生物体或细胞中分离出来。种质提供具有特定分子组成的遗传物质，为生物体或细胞培养物的一些或全部遗传特性提供物理基础
“遗传图谱”是对给定物种内的一个或多个染色体上的基因座之间的遗传连锁关系的描述，通常以图表或表格形式描绘。对于每个遗传图谱，基因座之间的距离是通过它们之间的重组频率来测量的。基因座之间的重组可以使用各种标志来检测。遗传图谱是定位群体、所用标志的类型以及不同群体之间每个标志的多态性潜力的产物。一个遗传图谱与另一个遗传图谱的基因座之间的顺序和遗传距离可以不同。
如本文使用的，术语“基因型”是指与可观察到的和/或可检测的和/或所表现的性状(表型)形成对照，在一个或多个遗传基因座处的个体(或个体组)的遗传组成。基因型由个体遗传自其亲本的一个或多个已知基因座的一个或多个等位基因定义。术语基因型可以用来指单一基因座处、多个基因座处的个体的遗传组成，或者更普遍地，术语基因型可以用来指其基因组中所有基因的个体遗传构成。可以例如使用标志来间接表征基因型和/或通过核酸测序来直接表征基因型。
如本文使用的，术语“种质”是指属于或来自个体(例如，植物)、个体群体(例如，植物品系、品种或家族)的遗传物质或衍生自品系、品种、物种或培养物的克隆。种质可以是生物体或细胞的部分，或可以从该生物或细胞中分离。通常，种质提供了具有特定分子构成的遗传物质，该分子构成提供了对于生物体或细胞培养物的一些或所有遗传品质而言的物理基础。如本文使用的，种质可以是指可以从中生长新植物的种子、细胞(包括原生质体和愈伤组织)、或组织，以及可以培养成全株植物的植物部分(例如，茎、芽、根、叶等)。
“单倍型”是多个遗传基因座处个体的基因型，即等位基因的组合。典型地，定义单倍型的遗传基因座在物理和遗传上是连锁的，即在同一染色体区段上。术语“单倍型”可以指特定基因座(例如单标志基因座)处的多态性，或者是沿着染色体区段的多个基因座处的多态性。
如本文使用的，术语“杂合的”是指如下遗传状态，其中不同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座处。
如本文使用的，术语“纯合的”是指如下遗传状态，其中相同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座处。
如本文使用的，术语“杂种”是指当至少两个遗传上不相同的亲本杂交时产生的种子和/或植物。
如本文使用的，术语“近交”是指基本上纯合的植物或种类。术语可以是指在整个基因组中基本上纯合的植物或品种，或者相对于特别感兴趣的基因组部分是基本上纯合的植物或植物品种。
如本文使用的，术语“indel”是指在一对核苷酸序列中的插入或缺失，其中第一序列可被称为具有相对于第二序列的插入，或第二序列可被称为具有相对于第一序列的删除。
如本文使用的，术语“基因渗入(introgression)”、“使基因渗入(introgressing)”和“经基因渗入的(introgressed)”是指使一个或多个遗传基因座的所期望的等位基因或所期望的等位基因的组合从一个遗传背景到另一个遗传背景的自然和人工传送。例如，可以通过相同物种的两个亲本之间的有性杂交将指定基因座处的所希望的等位基因传送给至少一个子代，其中这些亲本中的至少一个在其基因组内具有该所希望的等位基因。可替代地，例如，等位基因的传送可以通过两个供体基因组之间的重组而发生，例如在融合的原生质体中，其中至少一个供体原生质体在其基因组中具有所希望的等位基因。所希望的等位基因可以是标志的经选择的等位基因、QTL、转基因等。包括所希望的等位基因的后代可以重复地与具有一个所希望的遗传背景的品系回交，并且对于所希望的等位基因进行选择，其中结果是所希望的等位基因变得在一个所希望的遗传背景中是固定的。例如，与增强的ASR耐受性相关联的标志可以从供体基因渗入到不具有疾病抗性的轮回亲本中。然后可以将得到的后代重复回交并选择，直到该子代在轮回亲本背景中具有一个或多个ASR耐受性等位基因。
如本文使用的，术语“连锁”是指一个标志基因座与另一个标志基因座或一些其他基因座(例如，ASR耐受性基因座)的相关联程度。分子标志与表型之间的连锁关系可以作为“概率”或“调整的概率”给出。连锁可以表示为所希望的限值或范围。例如，在一些实施例中，当标志以小于约50、40、30、25、20或15个图距单位(或cM)分开时，则任何标志与任何其他标志(遗传上和物理上)连锁。例如，本发明的实施例提供了与ASR抗性染色体区间(其包含SEQ ID NO2、11、12或13的任一个的核苷酸序列)紧密连锁的标志基因座。
在本发明的一些方面中，限定连锁的包括范围(例如，从约10cM和约20cM、从约10cM和约30cM、或从约10cM和约40cM)是有利。标志与第二基因座的连锁越紧密，标志对第二基因座的指示效果越好。因此，“紧密连锁的基因座”(如标志基因座和第二基因座)展示约10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、或2％或更少的基因座间重组频率。在一些实施例中，相关的基因座展示约1％或更少(例如，约0.75％、0.5％、0.25％或更少)的重组频率。定位于相同染色体并且具有使得两个基因座之间的重组以小于约10％(例如，约9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.75％、0.5％、或0.25％或更少)的频率发生的距离的所述两个基因座也可被认为是彼此“邻近的”。因为一个cM是显示1％的重组频率的两个标志之间的距离，因此任何标志与紧密接近(例如，以等于或小于约10cM的距离)的任何其他标志紧密连锁(遗传上和物理上)。在同一染色体上的两个紧密连锁的标志可以相互定位为约9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、1cM、0.75cM、0.5cM或0.25cM或更少。
如本文使用的，术语“连锁不平衡”是指遗传座位或性状(或两者)的非随机分离。在任一情况下，连锁不平衡意味着相关联的基因座沿着一段染色体在物理上足够接近，以便它们以高于随机(即非随机)的频率一起分离(在共分离的性状的情况下，控制这些性状的基因座彼此足够接近)。显示连锁不平衡的标志被认为是连锁的。连锁的基因座超过50％的时间(例如从约51％至约100％的时间)进行共分离。换句话说，共分离的两个标志具有小于50％(并且根据定义，在相同染色体上分离小于50cM)的重组频率。如本文使用的，连锁可以存在于两个标志之间，或可替代地，标志和表型之间。标志基因座可以与性状(例如亚洲大豆锈病)“相关联”(连锁)。例如，分子标志与目的性状的连锁的程度被测量为该分子标志与该表型的共分离的统计概率。
连锁不平衡最常见地用量度r2评估，该量度r2使用以下文献中描述的公式计算：Hill和Robertson,Theor.Appl.Genet.[理论和应用遗传学]38:226(1968)。当r2＝1时，两个标志基因座间存在完全的连锁不平衡，意味着所述标志还未进行重组分离并且具有相同的等位基因频率。r2大于1/3的值指示足够强的连锁不平衡对于定位是有用的。Ardlie等人,Nature Reviews Genetics[遗传学自然评论]3:299(2002)。因此，当成对标志基因座间的r2值大于或等于约0.33、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、或1.0时，等位基因处于连锁不平衡。
如本文使用的，术语“连锁平衡”描述其中两个标志独立地分离的情况，即，在子代中随机分配。显示连锁平衡的标志被认为是不连锁的(无论它们是否位于相同染色体上)。
“基因座”是基因或标志或等位基因所在的染色体上的位置。在一些实施例中，基因座可以涵盖一个或多个核苷酸。
如本文使用的，术语“标志”和“遗传标志”可互换使用，以指已经与表型、性状或性状形式相关联的核苷酸和/或核苷酸序列。在一些实施例中，标志可以与等位基因或目的等位基因相关联，并且可以指示细胞或生物体中等位基因或目的等位基因的存在或不存在。标志可以是但不限于等位基因、基因、单倍型、限制性片段长度多态性(RFLP)、简单重复序列(SSR)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、酶切扩增多态性序列(CAPS)(Rafalski和Tingey，Trends in Genetics[遗传学趋势]9:275(1993))、扩增片段长度多态性(AFLP)(Vos等人，Nucleic Acids Res.[核酸研究]23:4407(1995))、单核苷酸多态性(SNP)(Brookes，Gene[基因]234:177(1993))、序列特征性扩增区域(SCAR)(Paran和Michelmore，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]85:985(1993))、序列标签位点(STS)(Onozaki等人，Euphytica[荷兰植物育种杂志]138:255(2004))、单链构象多态性(SSCP)(Orita等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2766(1989))、简单重复序列区间(ISSR)(Blair等人，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]98:780(1999))、逆转座子间扩增多态性(IRAP)、逆转座子微卫星扩增多态性(REMAP)(Kalendar等人，Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]98:704(1999))、染色体区间或RNA切割产物(例如Lynx标签)。标志可以存在于基因组核酸或表达的核酸(例如EST)中。术语标志还可以指用作根据本领域熟知的方法用于扩增、杂交和/或检测核酸分子的用作探针或引物(例如引物对)的核酸。大量的大豆分子标志是本领域已知的，并且是已公开的或可以从各种来源如SoyBase互联网资源获得。
可以通过本领域中公认的方法检测对应于群体成员之间的遗传多态性的标志。这些方法包括，例如核酸序列、杂交方法、扩增方法(例如基于PCR的序列特异性扩增方法)、限制性片段长度多态性检测(RFLP)、同功酶标志检测、通过等位基因特异性杂交(ASH)进行的多核苷酸多态性检测、植物基因组的扩增可变序列检测、自主序列复制检测、简单重复序列检测(SSR)、单核苷酸多态性检测(SNP)、和/或扩增片段长度多态性检测(AFLP)。已知公认的方法也用于检测表达的序列标签(EST)和衍生自EST序列的SSR标志，以及随机扩增多态性DNA(RAPD)。
“标志等位基因”，也描述为“标志基因座的等位基因”，可以指在群体中对标志基因座而言是多态性的该标志基因座处发现的多个多态性核苷酸序列中的一个。
“标志辅助选择”(MAS)是基于标志基因型选择表型的方法。在一些实施例中，标志基因型用于鉴定将被选择用于繁育程序或用于种植的植物。在一些实施例中，标志基因型用于鉴定将不被选择用于繁育程序或用于种植的植物(即，反选植物(counter-selectedplant))，允许它们从繁育/种植群体中去除。
如本文使用的，术语“标志基因座(marker locus和marker loci)”是指在其中可以找到一个或多个特异性标志的生物基因组中的一个或多个特定染色体定位。标志基因座可用于追踪第二连锁基因座(例如编码或有助于表型性状表达的连锁基因座)的存在。例如，标志基因座可以用来监测在基因座(如QTL或单一基因)处的等位基因的分离，这些等位基因遗传地或物理地连锁至该标志基因座上。
如本文使用的，术语“标志探针”和“探针”是指可用于检测标志基因座内一个或多个特定等位基因的存在的核苷酸序列或核酸分子(例如，通过核酸杂交与该标志或标志基因座中的所有或部分互补的核酸探针)。包含约8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个连续核苷酸的标志探针可用于核酸杂交。可替代地，在一些方面，标志探针是指能够区别(即基因分型)存在于标志基因座处的特定等位基因的任何类型的探针。
如本文使用的，当鉴定连锁基因座时，术语“分子标志”或“基因标志”可以用于指如上文定义的遗传标志，或其用作参照点的编码产物(例如，蛋白质)。分子标志能够源自基因组核苷酸序列或表达的核苷酸序列(例如来自剪接的RNA、cDNA等)。该术语也指与标志物序列互补或与位于其侧翼的核苷酸序列，例如，用作能够扩增标志物序列的探针和/或引物的核苷酸序列。例如根据沃森-克里克碱基配对原则，当核苷酸序列在溶液中特异性杂交时，所述核苷酸序列是“互补的”。当位于indel区域上时，本文所述的标志中的一些也称为杂交标志。这是因为，根据定义，该插入区域是关于不具有该插入的植物的多态性。因此，该标志仅需要指示该indel区域是否存在。可以使用任何合适的标志检测技术来鉴定这种杂交标志，例如，用于本文提供的实例中的SNP技术。
“非天然存在的大豆品种”是自然界中不存在的任何品种的大豆。可以通过本领域已知的任何方法产生“非天然存在的大豆品种”，该方法包括但不限于转化大豆植物或种质、转染大豆植物或种质并将天然存在的大豆品种与非天然存在的大豆品种杂交。在一些实施例中，“非天然存在的大豆品种”可以包含一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施例中，“非天然存在的大豆品种”可以包含天然存在的核苷酸序列的一个或多个非天然存在的拷贝(即天然存在于大豆中的基因的外来拷贝)。在一些实施例中，“非天然存在的大豆品种”可以包含两种或更多种天然存在的核苷酸序列的非天然组合(即，在同一大豆中不天然存在的两种或更多种天然存在的基因，例如在大豆品系中未发现的基因)。
术语“转化”及其语法变体在本发明中用于指例如将核酸片段转移到宿主生物的基因组中，从而获得遗传上稳定的遗传。包含转化的核酸片段的宿主生物称为“转基因”生物。术语“宿主细胞”及其语法变体是指其中发生重组DNA构建体转化的细胞，并且可以包括酵母细胞、细菌细胞和/或植物细胞。
如本文使用的，术语“转基因”及其语法变体是指植物，包括衍生自该植物的任何部分，例如细胞、组织或器官，其中外源核酸(例如，包含一种或多种核酸的重组构建体、载体或表达盒)通过基因工程方法，例如农杆菌转化被整合到基因组中。通过基因技术，将外源核酸稳定整合到染色体中，使下一代也可以是转基因的。如本文使用的，“转基因”及其语法变体还包括生物处理，其包括植物杂交和/或自然重组。
如本文使用的，术语“引物”是指当置于诱导合成引物延伸产物的条件(例如在核苷酸和用于聚合的试剂(如DNA聚合酶)的存在下并且在合适的温度和pH)下时能够退火至核酸靶并用作DNA合成的启动点的寡核苷酸。为了在延伸和/或扩增中获得最大效率，在一些实施例中，引物(在一些实施例中是延伸引物，并且在一些实施例中是扩增引物)是单链的。在一些实施例中，引物是寡脱氧核苷酸。引物通常足够长以在用于聚合的试剂存在下引发延伸和/或扩增产物的合成。引物的最小长度可以取决于许多因素，包括但不限于该引物的温度和组成(A/T对比G/C含量)。在扩增引物的情况下，这些扩增引物通常作为由一个正向和一个反向引物组成的一对双向引物提供，或作为DNA扩增领域中(例如在PCR扩增中)常用的一对正向引物提供。如此，应该理解的是，如本文使用的术语“引物”可以指超过一种引物，特别是在关于待扩增的靶区域的一个或多个末端序列的信息中存在一些歧义的情况下。因此，“引物”可以包括含有代表该序列中的可能变异的序列的引物寡核苷酸的集合，或包括允许典型的碱基配对的核苷酸。可以通过任何本领域已知的合适的方法来制备引物。用于制备特异性序列的寡核苷酸的方法是本领域已知的，并且包括例如适当的序列的克隆和限制以及直接化学合成。化学合成方法可以包括例如美国专利号4,458,066中披露的磷酸二酯或三酯法、二乙基氨基磷酸酯法和固相支持体法。若需要，可以通过并入可检测部分，例如光谱部分、荧光部分、光化学部分、生物化学部分、免疫化学部分或化学部分来标记引物。可以对如表1中描述的任何有利SNP产生诊断ASR抗性(即能够基于ASR抗性等位基因的存在来鉴定或选择)的引物。PCR方法在手册中已经很好地描述，并且是本领域技术人员已知的。通过PCR扩增后，可以通过与探针多核苷酸杂交来检测靶多核苷酸，所述探针多核苷酸在严格至中度严格的杂交和洗涤条件下与靶序列形成稳定的杂交体。如果预期探针与靶序列基本上完全互补(即，约99％或更多)，则可以使用严格条件。如果预期有一些错配，例如如果预期变体品种会导致探针不完全互补，则可以降低杂交的严格性。在一些实施例中，选择条件以排除非特异性/偶然结合。影响杂交的条件和针对非特异性结合选择的条件是本领域已知的，并且描述于例如Sambrook和Russell(2001)中。Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册]，第三版，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，冷泉港实验室，纽约，美国。通常，较低的盐浓度和较高温度的杂交和/或洗涤增加了杂交条件的严格性。
如本文使用的，术语“表型”、“表型性状”或“性状”是指生物体的一种或多种性状和/或表现。表型是对于裸眼或通过本领域已知的任何其他评价手段(例如，显微术、生物化学分析、或电子机械测定)可以观察的表现。在一些情况中，表型或性状直接由单一基因或遗传基因座控制，即，“单基因性状”。在其他情况下，表型或性状是多个基因的结果。应当指出，如本文使用的，术语“疾病抗性表型”考虑了可能影响对应的疾病的环境条件，这样使得该效应是真实且是可重复的。
如本文使用的，术语“植物”及其语法变体可以指全株植物、其任何部分或衍生自植物的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可以指以下任一个：全株植物、植物组分或器官(例如，根、茎、叶、芽、花、豆荚等)、植物组织、种子和/或植物细胞。植物细胞是植物的细胞，其直接从种子或植物中获得，或衍生自从植物获得的细胞培养物。再生植物的后代、变体和突变体在本发明的范围内，条件是这些部分包含引入的抗性基因。因此，术语“大豆植物”可以是指整株大豆植物、大豆植物的一个或多个部分(例如，根、根尖、茎、叶、芽、花、豆荚、种子、子叶等)、大豆植物细胞、大豆植物原生质体和/或大豆植物愈伤组织。
如本文使用的，术语“植物部分”包括但不限于胚、花粉、种子、叶、花(包括但不限于花药、胚珠等)、果实、茎或枝、根、根尖、细胞(包括在植物和/或植物部分中完整的细胞)、原生质体、植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块等。因此，植物部分包括可以再生成大豆植物的大豆组织培养物。此外，如本文使用的，“植物细胞”是指植物的结构和生理单位，包括细胞壁并且也可以指原生质体。本发明的植物细胞可以处于分离的单细胞形式，或者可以是培养的细胞，或者可以是作为较高级的组织单位(例如像，植物组织或植物器官)的一部分。
如本文使用的，术语“多态性”是指基因座处的核苷酸序列中的变异，其中所述变异太常见，而不仅仅是由于自发突变。多态性可以是单核苷酸多态性(SNP)或插入/缺失多态性(本文中也称为“indel”)。另外，该变异可以在转录谱或甲基化模式中。可以通过在两个或更多个种质条目中的一个或多个基因座处进行核苷酸序列比较来确定核苷酸序列的一个或多个多态性位点。
如本文使用的，术语“紧密连锁”是指连锁标志在给定标志的情况下显示约10％或更低的交换频率(例如，该给定标志在紧密连锁的ASR标志的约10cM内)。换言之，紧密连锁的位点在至少约90％的时间共分离。关于染色体上的物理位置，可以将紧密连锁的标志分开例如约1兆碱基(Mb；1百万个核苷酸)、约500千碱基(Kb；1000个核苷酸)、约400Kb、约300Kb、约200Kb、约100Kb、约50Kb、约25Kb、约10Kb、约5Kb、约4Kb、约3Kb、约2Kb、约1Kb、约500个核苷酸、约250个核苷酸或更少。
如本文使用的，术语“群体”是指共享共同的遗传衍生(genetic derivation)的植物的遗传上异质的集合。
如本文使用的，术语“子代”和“子代植物”是指从一个或多个亲本植物通过无性或有性繁殖产生的植物。子代植物可以通过克隆或单一亲本植物自交，或者通过两种亲本植物杂交来获得。
如本文使用的，术语“参考序列”是指用作核苷酸序列比较的基础的确定的核苷酸序列。例如通过对在一个或多个目的基因座处的多个品系进行基因分型、在序列比对程序中比对这些核苷酸序列并且然后可以获得比对的共有序列来获得标志的参比序列。因此，参比序列鉴定基因座处等位基因中的多态性。参比序列可以不是来自任何特定生物体的实际核酸序列的拷贝；然而，对于设计针对一个或多个基因座中的实际多态性的引物和探针是有用的。
如本文使用的，术语“疾病耐受性”和“疾病抗性”是指尽管感染了对应的疾病，植物的耐受和/或繁殖能力。当关于种质使用时，这些术语是指尽管感染了对应的疾病，由该种质产生的植物的耐受和/或繁殖能力。在一些实施例中，感染的疾病抗性大豆植物可以与未感染的大豆植物一样(或几乎同样)产生。通常，如果植物或种质显示“增强的病原体抗性”，则标记为“疾病抗性”。
标志的“不利等位基因”是与所述不利植物表型分离的标志等位基因，因此提供了鉴定能从繁育程序或种植中移除的植物的益处。例如，人们可以从植物繁育程序计划中消除携带针对ASR抗性不利等位基因的植物品系。
植物锈病
本发明涉及与植物的锈病抗性相关的蛋白质、编码这样的蛋白质的核酸序列及其用途。本发明披露的蛋白质及其编码基因和方法可用于保护植物免受锈病病原体的侵害。在某些实施例中，锈病是豆科植物锈病。
在其他实施例中，豆科植物锈病是大豆锈病。大豆锈病的病原菌可能是豆薯层锈菌或山马蝗层锈菌。如以下和权利要求中所使用的，每一提及大豆锈病都包括亚洲大豆锈病。
在本发明的具体实施例中，大豆锈病的病原体具体为豆薯层锈菌的生理小种SS4。
在优选的实施例中，本发明涉及与豆科植物的锈病抗性相关的蛋白质。
豆科植物可以是大豆属植物、鹰嘴豆属植物、木豆属植物、扁豆属植物、苜蓿属植物、菜豆属植物、豌豆属植物、葛藤属植物、车轴草属植物或豇豆属植物。
大豆属植物可以是沙生大豆(Glycine arenaria)、Glycine argyrea、野生豆(Glycine cyrtoloba)、灰色大豆(Glycine canescens)、澎湖大豆(Glycineclandestine)、弯大豆(Glycine curvata)、镰叶大豆(Glycine falcata)、阔叶大豆(Glycine latifolia)、小叶大豆(Glycine microphylla)、Glycine pescadrensis、Glycine stenophita、Glycine syndetica、盐地野生大豆(Glycine soja Seib.etZucc.)、Glycine max(L.)Merrill.、烟豆(Glycine tabacina)或短绒野大豆(Glycinetomentella)。
鹰嘴豆属植物可以是鹰嘴豆(Cicer arietinum)、Cicer echinospermum、网状鹰嘴豆(Cicer reticulatum)或长叶鹰嘴豆(Cicer pinnatifidum)。
扁豆属植物可以是紫花扁豆(Lablab purpureus)。
苜蓿属植物可以是蒺藜苜蓿或紫花苜蓿。
菜豆属植物可以是菜豆(Phaseolus vulgaris)、棉豆(Phaseolus lunatus)、尖叶菜豆(Phaseolus acutifolius)、或荷包豆(Phaseolus coccineus)。
豌豆属植物可以是阿比西尼亚豌豆(Pisum abyssinicum)、亚洲豌豆(Pisumsativum)、高豌豆(Pisum elatius)、绒叶豌豆(Pisum fulvum)、外高加索豌豆(Pisumtranscaucasium)、或矮豌豆(Pisumhumile)。
葛藤属植物可以是葛根。
车轴草属植物可以是黄车轴草(Trifolium aureum)或西方车轴草(Trifoliumoccidentale)。
豇豆属植物可以是豇豆(Vigna unguiculata)、Vigna dalzelliana、长叶豇豆(Vigna oblongifolia)、短果豇豆(Vigna parkeri)、细叶豇豆(Vignafilicaulis)、柯氏豇豆(Vigna kirkii)、黄豇豆(Vigna luteola)、放射豇豆(Vigna radiata)、三叶豇豆(Vignatrilobata)、黄豇豆(Vigna luteola)、或芒戈豇豆(Vigna mungo)。
此外，豆科植物可以是以下任何一种：大豆、苜蓿、三叶草、豌豆、菜豆、扁豆、羽扇豆、牧豆树、角豆、大豆、花生或罗望子。
在本发明的具体实施例中，植物具体为大豆品种天隆1号(Tianlong No.1)。
本发明披露的蛋白质及其编码基因和方法可用于保护植物免受锈病病原体的侵害。宿主和病原体之间的相互作用可以描述为“免疫性”到“部分抗性”到“易感性”的连续体。
本发明所披露的方法可以增加、增强或改善大豆对专性活养寄生真菌豆薯层锈菌(锈病的主要病原体)或山马蝗层锈菌的抗性。例如，可以将增加或增强的对锈病病原体的抗性与病原体对易感植物的影响进行比较。抗性增加或增强的表现可能有不同程度，但与疾病症状(如病斑颜色)和在植物或植物组织(如叶)上观察到的发病率相关。可以给出免疫性、抗性和易感性的值。例如，抗性值表示植物对植物疾病(例如锈病)的抗性程度。这些值还可用于比较例如目的植物(例如、转基因豆科植物)和易感植物(例如天隆1号或Williams)或参考标准之间的抗性程度。
本发明披露的蛋白质及其编码基因和方法涉及从豆科植物中分离抗性基因，随后将该抗性基因转移到受体植物，例如大豆，以提供或增强对豆薯层锈菌的抗性。应用的一个实施例包括将抗性基因转移到性相容或不相容的物种以产生抗病性。本发明的抗性基因可以单独使用或与其他抗性基因或与非抗性基因叠加使用以提供或增强受体物种对锈病的抗性。
因此，本发明披露的转基因方法可以单独使用或与其他策略组合使用以在植物中产生或赋予锈病抗性。其他可用策略包括但不限于阻断效应子的功能活性、抑制病原体或病原体因子(例如真菌)被摄取进入宿主细胞(例如植物细胞)和/或常规抗性繁育。
本发明披露的方法可以提供或增强植物的锈病抗性，使锈病病原体无法繁殖或锈病病原体的繁殖系数显著降低。因此，当与对层锈菌属敏感或耐受的植物相比时，本发明的方法可以减轻豆科植物锈病的一种或多种症状(即疾病症状)。本发明所指的植物还包括转基因豆科植物(例如大豆)，通过基因工程方法将疾病抗性基因或蛋白质引入其中，以当暴露于豆科植物锈病时增强它们对疾病的抗性。
本发明的植物、植物部分或植物细胞衍生自植物，包括但不限于大豆、苜蓿、三叶草、豌豆、菜豆、小扁豆、羽扇豆、牧豆树、角豆树、花生和罗望子。
本发明的植物属于豆科。豆科的示例包括但不限于菜豆属(例如四季豆、青豆、菜豆、棉豆(Phaseolus lunatus)、尖叶菜豆(Phaseolus acutifolius)、和荷包豆)；大豆属(例如野生大豆、和大豆(Glycine max(L.)))；豌豆属(例如去荚豌豆(有时称为光滑豌豆或圆豌豆、菜豌豆))、皱粒豌豆、糖豆豌豆(也被称为雪豌豆、食荚豌豆或巨豌豆(Pisumgranda))；花生(落花生(Arachis hypogaea))、三叶草(车轴草属物种)、苜蓿(苜蓿属)、野葛(葛根)、普通苜蓿、苜蓿(紫花苜蓿)、鹰嘴豆(鹰嘴豆属)、扁豆(小扁豆(Lensculinaris))、和羽扇豆(羽扇豆属)；野豌豆(野豌豆属)、蚕豆(broad bean)(蚕豆(Viciafaba))、山黧豆(山黧豆属)(例如家山黧豆、和块茎山黧豆(Lathyrus tuberosus))；豇豆属(例如乌头叶豇豆(Vigna aconitifolia)、棱角豇豆(Vigna angularis)、芒戈豇豆、放射豇豆(Vigna radiata)、地下豇豆(Vigna subterrane)、赤小豆(Vigna umbellata)、野豇豆(Vigna vexillata)、和紫皮豇豆(Vigna unguiculata)(也称为长虹豆或虹豆))；木豆、硬皮豆属(例如地果硬皮豆(Macrotyloma geocarpum)、和大叶瘤硬皮豆(Macrotylomauniflorum))；四棱豆(Psophocarpus tetragonolobus)、Sphenostylis stenocarpa、埃及黑豆、紫花扁豆、豆薯(Pachyrhizus erosus)、和瓜儿豆(Cyamopsis tetragonolobus)；和/或刀豆属(例如洋刀豆(Canavalia ensiformis)、和蔓性刀豆(Canavalia gladiata))。
染色体区间
本发明的一个实施例涉及衍生自大豆株系SX6907的染色体区间。当将这些染色体区间引入植物(例如大豆例如大豆株系Williams 82)中时是足以赋予与不包含所述染色体区间的对照植物相比增加的锈病抗性，例如比如亚洲大豆锈病(“ASR”)抗性。
SEQ ID NO 11、12或13是衍生自大豆株系SX6907的染色体区间。遗传作图研究表明，大豆株系SX6907包含与ASR抗性相关的染色体区间(例如对应于SEQ ID NO 11、12或13)。可以将这些染色体区间或其部分引入(即通过使用标志辅助繁育(MAB)或通过使用GM或GE引入渗入)到大豆品系中以创建大豆品系对ASR等各种疾病的抗性。例如，这些染色体区间可以被引入大豆品系Williams 82。
表1显示了SEQ ID NO 11、12或13中与ASR抗性相关的单核苷酸多态性(SNP)。
表1：在SEQ ID NO 11、12或13中与针对ASR的增加的抗性相关联的SNP位置
Figure BDA0003513827270000291
Figure BDA0003513827270000301
Figure BDA0003513827270000311
Figure BDA0003513827270000321
Figure BDA0003513827270000331
Figure BDA0003513827270000341
Figure BDA0003513827270000351
Figure BDA0003513827270000361
Figure BDA0003513827270000371
Figure BDA0003513827270000381
Figure BDA0003513827270000391
Figure BDA0003513827270000401
Figure BDA0003513827270000411
Figure BDA0003513827270000421
Figure BDA0003513827270000431
Figure BDA0003513827270000441
Figure BDA0003513827270000451
Figure BDA0003513827270000461
Figure BDA0003513827270000471
Figure BDA0003513827270000481
Figure BDA0003513827270000491
Figure BDA0003513827270000501
Figure BDA0003513827270000511
Figure BDA0003513827270000521
Figure BDA0003513827270000531
Figure BDA0003513827270000541
Figure BDA0003513827270000551
Figure BDA0003513827270000561
Figure BDA0003513827270000571
Figure BDA0003513827270000581
Figure BDA0003513827270000591
Figure BDA0003513827270000601
Figure BDA0003513827270000611
Figure BDA0003513827270000621
Figure BDA0003513827270000631
Figure BDA0003513827270000641
Figure BDA0003513827270000651
Figure BDA0003513827270000661
Figure BDA0003513827270000671
可以开发寡核苷酸引物(本文中，“引物”)并将其用于鉴定携带SEQ ID NO:11、12或13中描述的发现与ASR抗性高度相关联的染色体区间中任一个的植物。也可以开发引物并用于鉴定携带SEQ ID NO:2的植物。具体地，关于鉴定或产生具有SEQ ID NO:11、12或13中描述的与ASR抗性相关联的染色体区间中任一个或一部分的大豆品系，本领域普通技术人员可以开发引物以检测如表1所鉴定的任何单核苷酸多态性(本文中，“SNP”)。
Figure BDA0003513827270000682
测定(例如，通常为两步等位基因鉴别测定或类似测定)、KASPTM测定(通常是下文定义的一步等位基因鉴别测定或类似测定)、或两者均可用于鉴定如本文所披露的与增加的ASR抗性相关联的SNP(例如，如表1中描述的有利等位基因)。在示例性两步测定中，使用正向引物、反向引物和两种测定探针(或杂交寡核苷酸)。将正向和反向引物用于扩增包含与ASR抗性基因座相关联的SNP的遗传基因座(例如，表1中所示的任何有利等位基因)。然后使用测定引物(在一些实施例中，这些测定引物被用例如荧光团差异标记以允许在单个反应中区分两种测定探针)来测定存在于SNP位置的特定核苷酸，这些测定引物在每对中针对存在于SNP位置的核苷酸而彼此不同(尽管注意到在任何给定的对中，探针在它们的5'或3'末端可以不同而不影响它们区分存在于相应SNP位置的核苷酸的能力)。在一些实施例中，设计测定引物和反应条件使得测定引物将仅与100％完全匹配的序列的反向互补物杂交，从而允许基于杂交的检测来鉴定存在的哪种或哪些等位基因。
在本发明的一个实施例中，可以采用以下测定来鉴定与本文披露的增加的ASR抗性相关的SNP：
Figure BDA0003513827270000681
Figure BDA0003513827270000691
Figure BDA0003513827270000692
Figure BDA0003513827270000701
遗传作图
与特定表型相关的遗传基因座，例如抗锈病性，可以在生物体的基因组中进行定位。通过鉴定与目的性状共分离的标志或标志簇，繁育人员能够通过选择合适的标志(称为标志辅助选择或“MAS”的方法)来迅速选择所希望的表型。繁育人员也可以使用此类标志来在计算机上模拟设计基因型并实施全基因组选择。
在某些实施例中，本发明提供与增强的锈病(例如亚洲大豆锈病)抗性相关联的标志。可以使用这些标志和/或其他连锁标志的检测来鉴定、选择和/或生产锈病抗性，更具体地亚洲大豆锈病抗性(本文中“ASR”)植物和/或从繁育程序或种植中消除不具有疾病抗性的植物。
与增强的疾病抗性相关联的遗传基因座
本文鉴定了与增强的疾病抗性相关联的标志(参见表1指示与增强的ASR抗性相关联的有利标志)。本发明的标志可以包含一个或多个遗传基因座处的单个等位基因或等位基因的组合(例如，来自表1的有利标志的任何组合)。例如，标志可以包含位于第一染色体区间(例如SEQ ID NO:11)内的一个或多个标志等位基因和位于第二染色体区间(例如SEQID NO:12或SEQ ID NO:13)内的一个或多个标志等位基因。
标志辅助选择
标志可以用于各种植物繁育应用。参见，例如Staub等人，Hortscience[园艺科学]31:729(1996)；Tanksley，Plant Molecular Biology Reporter[植物分子生物学导报]1:3(1983)。主要的目的领域之一是使用标志辅助选择(MAS)增加回交和基因渗入的效率。通常，MAS利用已被鉴定为具有与所希望的性状共分离的显著可能性的遗传标志。推测此类标志位于产生所希望的表型的基因中/附近，并且它们的存在表明该植物将具有所希望的性状。预计具有该标志的植物将所希望的表型转移到它们的子代中。
展示出与影响所希望的表型性状的基因座连锁的标志为在植物群体中选择性状提供了有用工具。在表型难以测定或在植物发育的后期阶段发生的情况下，尤其如此。由于DNA标志测定比田间表型分析更省力并且占用的物理空间更小，可测定更大的群体，增加了发现具有从供体品系移动至受体品系的靶区段的重组体的概率。连锁越紧密，标志越有用，这是因为重组不太可能发生于该标志与造成或引起该性状的基因之间。使用侧翼标志降低发生误报选择的几率。理想情况是致病性基因本身内具有标志，使得标志和基因之间的重组不能发生。此类标志称为“完美标志”。
当基因通过MAS渗入时，不仅引入了基因而且引入了侧接区域。Gepts,Crop Sci[作物科学]42:1780(2002)。这称为“连锁累赘”。在供体植物与受体植物极不相关联的情况下，这些侧接区域携带可以编码农艺学上不需要的性状的附加基因。即便与优良大豆品系回交多个周期后，该“连锁累赘”也可以导致产量下降或其他负面农艺学特征。这有时也称为“产量累赘”。侧接区域的大小可以通过附加的回交而减小，虽然这并不总是成功的，因为繁育人员不能控制该区域或重组断点的大小。Young等人，Genetics[遗传学]120:579(1998)。在经典繁育中，通常只是偶然地，选择了有助于减小供体区段大小的重组。Tanksley等人，Biotechnology[生物技术]7:257(1989)。即使在20次回交后，可能找到相当大的仍然与所述基因连锁的供体染色体碎片被选择。然而如果使用标志的话，就可以选取那些在目的基因附近经历了重组的稀有个体。在150株回交植物中，有95％的机会，至少一株植物将经历该基因的1cM(基于单次减数分裂图距)内的杂交。标志允许明确鉴定这些个体。使用300株植物的一次附加回交，在该基因另一侧的1cM单次减数分裂图距内有95％的杂交概率，从而产生在基于单次减数分裂图距的小于2cM的靶基因附近的区段。这用标志可以在两代中实现，而不用标志时则需要平均100代。参见Tanksley等人，同上。当基因的确切定位已知时，围绕该基因的侧接标志可用于在不同的群体大小中对重组进行选择。例如，在更小的群体中，预期重组可以进一步远离该基因，因此需要更远端的侧接标志来检测该重组。
包含密度增强的公开大豆标志的大豆基因组的整合连锁图谱的可用性促进了大豆遗传定位和MAS。
在所有分子标志类型中，SNP是最丰富的，并且具有提供最高遗传图谱分辨率的潜力。Bhattramakki等人,Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]48:539(2002)。能以所谓的“超高通量”方式测定SNP，因为它们不需要大量的核酸，并且该测定的自动化是直接的。SNP也有成为相对低成本的系统的益处。这三个因素一起使得将SNP用于MAS中具有高度的吸引力。可利用如下几种方法用于SNP基因分型，包括但不限于：杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶切割、微测序和编码球(coded sphere)。此类方法已经在各种公开中综述：Gut,Hum.Mutat.[人类突变]17:475(2001)；Shi,Clin.Chem.[临床化学]47:164(2001)；Kwok,Pharmacogenomics[药物基因组学]1:95(2000)；Bhattramakki和Rafalski,Discovery andapplication of single nucleotide polymorphism markers in plants[单核苷酸多态性标志在植物中的发现和应用],在Plant Genotyping:The DNA Fingerprinting ofPlants[植物基因分型：植物DNA指纹图谱]中,CABI Publishing[CABI出版社],瓦林福德(Wallingford)(2001)。大范围的可商购的技术利用这些和其他方法询问SNP，包括MasscodeTM(德国凯杰公司(Qiagen)，Germantown，MD)、
Figure BDA0003513827270000721
(好乐杰公司(Hologic)，麦迪逊，WI)、
Figure BDA0003513827270000722
(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特市，CA)、
Figure BDA0003513827270000723
(应用生物系统公司(Applied Biosystems)，福斯特市，CA)和BeadarraysTM(亿明达公司(Illumina)，圣地亚哥，加利福尼亚州)。
可以使用序列内或跨连锁序列的许多SNP等位基因一起来描述任何特定基因型的单倍型。Ching等人,BMC Genet.[BMC遗传学]3:19(2002)；Gupta等人,(2001),Rafalski,Plant Science[植物科学]162:329(2002b)。单倍型可以比单个SNP更具信息性，并且可以更详细地描述任何特定的基因型。例如，对于特定的疾病抗性品系或品种，单个SNP可以是等位基因“T”，但等位基因“T”也可以出现在用于轮回亲本的大豆繁育群体中。在这种情况下，连锁SNP的等位基因的组合可以更具信息性。一旦将独特的单倍型分配给供体染色体区域，该单倍型可以用于该群体或其任何亚群中以确定个体是否具有特定的基因。使用本领域普通技术人员已知的自动化高通量标志检测平台使得该方法高效且有效。
本发明的标志可以用于标志辅助选择方案中以鉴定和/或选择具有增强的亚洲大豆锈病抗性的子代。此类方法可以包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：将第一大豆植物或种质与第二大豆植物或种质杂交，其中第一大豆植物或种质包含衍生自SX6907的染色体区间，其中所述染色体区间包含SEQ ID NO 11、12或13，或其编码ASR抗性的部分，其中染色体区间包含SEQ ID NO:2或编码SEQ ID NO:1的核酸，并且选择具有该标志的子代植物。第一和第二大豆植物之一或两者可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，第二大豆植物或种质是优良大豆品种的第二大豆植物或种质。在一些实施例中，第二大豆植物或种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。在另一个实施例中，第一大豆植物包含衍生自SX6907的染色体区间，其中所述染色体区间包含SEQ ID NO11、12或13，并且其中染色体区间进一步包含至少一个如表1所示的等位基因。在另一个实施例中，第一大豆包含的染色体区间包含SEQ ID NO:2的核酸序列，或其编码ASR抗性的部分，或编码SEQ ID NO:1的蛋白质的核酸序列，或其编码ASR抗性的部分。
生产疾病抗性植物
用于鉴定和/或选择疾病抗性大豆植物或种质的方法可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：检测与增强的ASR耐受性相关联的标志的存在。标志可以在从植物或种质取得的任何样品中检测到，该植物或种质包括但不限于整个植物或种质、所述植物或种质的一部分(例如来自所述植物或种质的种子切片、叶片冲压片(leaf punch disk)或细胞)或来自所述植物或种质的核苷酸序列。可以使用本领域已知的任何现有或未来的方法(包括但不限于自动化方法：用锋利的刀片去除一部分胚乳、在种子中钻一个小孔并收集所得粉末，用激光切割这些种子并冲压叶圆片)从植物或种质中取得这种样品。大豆植物可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，大豆植物或种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。在一些实施例中，在样品中检测的标志可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：位于染色体区间内的一种或多种标志等位基因，该染色体区间选自：
1)包含SEQ ID NO:2或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
2)编码SEQ ID NO:1的蛋白质序列或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
3)包含SEQ ID NO 11、12或13或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；或
4)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中显示的任何有利SNP标志。
可替代地，一个或多个标志等位基因可以位于SEQ ID NO:2内。
用于产生疾病抗性大豆植物的方法可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：在种质中检测与增强的疾病(例如ASR)抗性相关联的标志，其中所述标志选自表1，或其中该标志是与表1中描述的并从所述种质产生大豆植物的任何标志的紧密连锁的基因座。可替代地，该方法可以包括以下、基本上由以下组成或由以下组成：在种质中检测与SEQID NO:2相关联的标志。标志可以在从种质取得的任何样品中检测到，该种质包括但不限于所述种质的一部分(例如来自所述种质的种子切片或细胞)或来自所述种质的核苷酸序列。可以使用本领域已知的任何现有或未来的方法(包括但不限于自动化方法：用锋利的刀片去除一部分胚乳、在种子中钻一个小孔并收集所得粉末，用激光切割这些种子并冲压叶圆片)从种质中取得这种样品。种质可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。然后，从根据本领域熟知的用于繁育和从种质产生植物的方法鉴定为具有与增强的疾病(例如ASR)抗性相关联的标志的种质来产生疾病抗性大豆植物。
在一些实施例中，在种质中检测的标志可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：位于染色体区间内的一种或多种标志等位基因，该染色体区间选自：
1)包含SEQ ID NO:2或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
2)编码SEQ ID NO:1的蛋白质序列或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
3)包含SEQ ID NO 11、12或13或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；或
4)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中显示的任何有利SNP标志。
在另一个实施例中，标志位于SEQ ID NO:2的核酸。在一些实施例中，在种质中检测的标志可以包含选自表1的一个或多个标志等位基因、基本上由其组成、或由其组成。
用于产生和/或选择亚洲大豆锈病抗性/耐受性大豆植物或种质的方法可以包括使第一大豆植物或种质与第二大豆植物或种质杂交，其中所述第一大豆植物或种质包含选自以下的染色体区间：
1)包含SEQ ID NO:2或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
2)编码SEQ ID NO:1的蛋白质序列或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
3)包含SEQ ID NO 11、12或13或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
4)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中显示的任何有利SNP标志；或
5)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中显示的任何SNP标志，并且与不包含该染色体区间的第二大豆植物杂交，然后产生具有增加的ASR抗性的子代植物。第一或第二大豆植物或种质之一或两者可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，第二大豆植物或种质是优良大豆品种的第二大豆植物或种质。在一些实施例中，第二大豆植物或种质的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
在一个实施例中，大豆植物可用于将亚洲大豆锈病抗性/耐受性引入大豆株系Williams 82。
可替代地，用于产生和/或选择亚洲大豆锈病抗性/耐受性大豆植物或种质的方法可以包括使第一大豆植物或种质与第二大豆植物或种质杂交，其中所述第一大豆植物或种质包含SEQ ID NO:2的核酸序列或编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白质。
本文还提供了将与增强的疾病(例如ASR、SCN、SDS、RKN、疫霉菌等)抗性/耐受性相关联的等位基因渗入到大豆植物中的方法。用于将与增强的疾病(例如ASR、SCN、SDS、RKN、疫霉菌等)抗性/耐受性相关联的等位基因渗入到大豆植物或种质中的此类方法可以包括以下、基本上由以下组成、或由以下组成：将包含所述等位基因(供体)(其中所述等位基因选自表1中列出的任何等位基因)或与表1中列出的标志“紧密接近”的标志的第一大豆植物或种质与缺乏所述等位基因的第二大豆植物或种质(轮回亲本)杂交，并且将包含所述等位基因的子代与轮回亲本反复回交。可以通过在其基因组中检测与增强的疾病(例如ASR、SCN、SDS、RKN、疫霉菌等)抗性/耐受性相关联的标志的存在来鉴定包含所述等位基因的子代。标志可以在从子代取得的任何样品中检测到，该子代包括但不限于所述子代的一部分(例如来自所述植物或种质的种子切片、叶片冲压片或细胞)或来自所述子代的核苷酸序列。可以使用本领域已知的任何现有或未来的方法(包括但不限于自动化方法：用锋利的刀片去除一部分胚乳、在种子中钻一个小孔并收集所得粉末，用激光切割这些种子并冲压叶圆片)从子代中取得这种样品。供体或轮回亲本之一或两者可以是非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，轮回亲本是优良大豆品种。在一些实施例中，轮回亲本的基因组与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
在一些实施例中，用于鉴定包含与增强的锈病抗性/耐受性相关的等位基因的子代的标志可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：位于选自以下的染色体区间内的一个或多个等位基因：
1)包含SEQ ID NO:2或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
2)编码SEQ ID NO:1的蛋白质序列或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
3)包含SEQ ID NO 11、12或13或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
4)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中显示的任何有利SNP标志；或
5)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中显示的任何SNP标志或与所述区间(SEQ ID NO 11、12或13)紧密接近的任何紧密连锁的标志。
在一些实施例中，标志可以包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：位于至少两个不同染色体区间的标志等位基因。例如，标志可包含一个或多个等位基因，该一个或多个等位基因位于由SEQ ID NO 11、12或13中的任何两个标志定义并包括其的染色体区间中。
疾病抗性大豆植物和种质
在另一个实施例中，本发明提供了抗锈病的大豆植物和种质。如上所述，本发明的方法可用于鉴定、产生和/或选择疾病抗性大豆植物或种质(例如针对亚洲大豆锈病具有抗性或增加的耐受性的大豆植物)。除了上述方法，抗ASR的大豆植物或种质可以通过任何方法产生，借这些方法将与增强的疾病耐受性相关联的标志引入大豆植物或种质中，这些方法包括但不限于转化、原生质体转化、或融合，双单倍体技术，胚拯救，基因编辑，和/或通过任何其他核酸转移系统产生。
在一些实施例中，大豆植物或种质包含非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，大豆植物或种质与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
疾病抗性大豆植物或种质可以是优良大豆品种和包含与增强的锈病抗性(例如ASR)相关联的等位基因的大豆品种之间的杂交的子代，其中该等位基因在选自以下的染色体区间内：
1)包含SEQ ID NO:2或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
2)编码SEQ ID NO:1的蛋白质序列或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
3)包含SEQ ID NO 11、12或13或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
4)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中显示的任何有利SNP标志。
在其他实施例中，疾病抗性大豆植物或种质可以是优良大豆品种和包含与增强的锈病抗性(例如ASR)相关联的等位基因的大豆品种之间的杂交的子代，其中等位基因包含SEQ ID NO:2或编码SEQ ID NO:1的蛋白质。
本发明的一个实施例是具有亚洲大豆锈病抗性/耐受性并且包含SEQ ID NO:2的核酸序列或选自以下的染色体区间的大豆植物：
1)包含SEQ ID NO:2或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
2)编码SEQ ID NO:1的蛋白质序列或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
3)包含SEQ ID NO 11、12或13或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；或
4)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中显示的任何有利SNP标志。
在某些实施例中，与不包含所述染色体区间的对照植物相比，该染色体区间赋予了增加的亚洲大豆锈病(ASR)抗性。大豆植物可能衍生自株系Williams 82
疾病抗性大豆植物或种质可以是基因渗入的子代，其中轮回亲本是优良大豆品种，并且供体包含与增强的疾病耐受性和/或抗性相关联的等位基因，其中该体携带包含SEQ ID NO:11、12或13中任一个的染色体区间或其部分，并且其中该染色体区间包含分别选自表1的至少一个等位基因。
疾病抗性大豆植物或种质可以是第一优良大豆品种(例如，测试品系)之间的杂交的子代，和第二优良大豆品种(例如，轮回亲本)与包含与增强的ASR耐受性相关联的等位基因的大豆品种(例如，供体)之间的杂交的子代。
疾病抗性大豆植物或种质可以是第一优良大豆品种与基因渗入的子代之间杂交的子代，其中轮回亲本是第二优良大豆品种，并且供体包含与增强的ASR耐受性相关联的等位基因。
本发明的疾病抗性大豆植物和种质可以包含一种或多种本发明的标志(例如表1中描述的任何标志；或与如表1中描述的任何标志紧密接近的任何标志)。
在一些实施例中，疾病抗性大豆植物或种质可在其基因组内包含与增强的ASR耐受性相关联的标志，其中所述标志位于选自以下的染色体区间内：
1)包含SEQ ID NO:2或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
2)编码SEQ ID NO:1的蛋白质序列或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
3)包含SEQ ID NO 11、12或13或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；或
4)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中显示的任何有利SNP标志。
在其他实施例中，标志位于SEQ ID NO:2的核酸序列。
在一些实施例中，疾病抗性大豆植物或种质可在其基因组内包含标志，该标志包含位于至少两个不同染色体区间中的标志等位基因、基本上由其组成或由其组成。例如，标志可以包含位于由表1中的两个标志的任何组合定义并包括其的染色体区间中的一个或多个等位基因，和位于由表1中的两个标志的任何组合定义并包括其的染色体区间中的一个或多个等位基因。
在某些实施例中，疾病抗性大豆植物衍生自大豆株系Williams82。
疾病抗性大豆种子
本发明还提供了疾病抗性大豆种子。如上所述，本发明的方法可用于鉴定、产生和/或选择疾病抗性大豆种子。除了上述方法，疾病抗性大豆种子可以通过任何方法产生，借这些方法将与增强的ASR耐受性相关联的标志引入大豆种子中，这些方法包括但不限于转化、原生质体转化或融合，双单倍体技术，胶原蛋白拯救，基因编辑(例如CRISPR或TALEN或大范围核酸酶)，和/或通过任何其他核酸转移系统产生。
本发明的一个实施例是来自大豆株系Williams 82的种子，其已被修饰以具有亚洲大豆锈病抗性/耐受性。
在一些实施例中，疾病抗性大豆种子包含非天然存在的大豆品种。在一些实施例中，大豆种子与优良大豆品种的基因组是至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
疾病抗性大豆种子可以由通过本发明的方法鉴定、产生或选择的疾病抗性大豆植物产生。在一些实施例中，疾病抗性大豆种子由疾病抗性大豆或野生大豆属植物(例如短绒野大豆)植物产生，其包含以下中的任一个：对应于SEQ ID NO:11-13的染色体区间，包含SEQ ID NO:2的染色体区间，或编码SEQ ID NO:1的蛋白质的染色体区间，或这些区间的编码ASR抗性的任何部分。
本发明的疾病抗性大豆种子可以包含来自本发明的表1的一种或多种标志、通过使用其选择或通过使用其产生。
在一些实施例中，疾病抗性大豆种子可在其基因组内包含与增强的ASR耐受性相关联的标志，其中所述标志位于选自下组的染色体区间内，该组由以下组成：
1)包含SEQ ID NO:2或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
2)编码SEQ ID NO:1的蛋白质序列或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；
3)包含SEQ ID NO 11、12或13或其编码ASR抗性的部分的染色体区间；或
4)大豆中与增加的ASR抗性相关联的从SNP标志跨越20cM、15cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM的染色体区间，其中该SNP标志选自下组，该组由以下组成：表1中显示的任何有利SNP标志。
在其他实施例中，标志位于SEQ ID NO:2的核酸序列。
赋予锈病抗性的蛋白质
除了提供具有增加的亚洲大豆锈病抗性的大豆植物，在某些实施例中，本发明提供与锈病抗性，特别是亚洲大豆锈病抗性(本文中，“ASR”)相关的蛋白质。在特定实施例中，这些蛋白质赋予增加的亚洲大豆抗性。该蛋白质及其编码基因可用于保护植物免受锈病病原体的侵害。
在某些实施例中，蛋白质由SEQ ID NO:2的核酸序列编码。在其他实施例中，蛋白质与SEQ ID NO:1的核酸序列编码的蛋白质具有至少75％、至少85％、至少90％、至少、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在其他实施例中，蛋白质由包含SEQ NO:11、12或13的核酸序列的染色体区间编码。在其他实施例中，蛋白质与包含SEQ NO:11、12或13的核酸序列的染色体区间编码的蛋白质具有至少75％、至少85％、至少90％、至少、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。
在某些实施例中，本披露的蛋白质衍生自大豆并命名为RppRC1。在本发明的一个实施例中，该蛋白质具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在本发明的另一个实施例中，该蛋白质与SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少75％、至少85％、至少90％、至少、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％同一性。在一个实施例中，本披露的蛋白质可以是以下蛋白质中的任一种：
(A1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质；
(A2)与以下相比具有一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且与以下具有相同功能的蛋白质：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列；
(A3)与以下具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性并且与以下具有相同功能的蛋白质：(A1)或(A2)中定义的氨基酸序列；以及
(A4)通过在(A1)至(A3)中任一项中定义的蛋白质的N末端和/或C末端加标签而获得的融合蛋白。
在另一个实施例中，本披露的蛋白质可以是以下蛋白质中的任一种：
(A5)具有由包含SEQ NO:11、12或13的核酸序列的染色体区间编码的氨基酸序列的蛋白质；
(A6)与以下相比具有一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且与以下具有相同功能的蛋白质：由包含SEQ NO:11、12或13的核酸序列的染色体区间编码的氨基酸序列；
(A7)与以下具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性并且与以下具有相同功能的蛋白质：(A5)或(A6)中定义的氨基酸序列；以及
(A8)通过在(A5)至(A7)中任一项中定义的蛋白质的N末端和/或C末端加标签而获得的融合蛋白。
在这些蛋白质中，标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白融合并一起表达的多肽或蛋白质，以利于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。标签可以是FLAG标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
在这些蛋白质中，同一性是指氨基酸序列之间的同一性。互联网上的同源检索网站可用于确定氨基酸序列之间的同一性，例如NCBI主页网站上的BLAST网页。例如，在高级BLAST2.1中可以通过以下获得同一性值(％)：使用blastp作为程序，将预期(Expect)值设置为10，将所有过滤器(Filters)设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，设置缺口(Gap)存在损失，每残基缺口损失，和λ比率分别为11、1和0.85(默认值)，并检索一对氨基酸序列的同一性进行计算。
本发明的蛋白质可以由本文披露的核酸分子产生或通过使用标准分子生物学技术产生。
本发明包括分离的或基本上纯化的蛋白质。“分离的”或“纯化的”蛋白质或其生物活性部分基本上或大部分地不含与蛋白质伴随或相互作用的组分，这些组分通常存在于蛋白质的自然环境中。基本上不含细胞材料的蛋白质包括具有少于约30％、约20％、约10％、约5％或约1％(以干重计)的污染蛋白质的蛋白质配制品。当实施例中的蛋白质或其生物活性部分通过重组方法生产时，最优选地，培养基具有的少于约30％、约20％、约10％、约5％或约1％(以干重计)的化学前体或化学物质不是目的蛋白质。片段和变体相关的蛋白质在本披露的范围内。
本发明涵盖的变体蛋白质是生物活性的，即它们继续具有天然蛋白质生物活性(即如本发明所述增强植物抗性(即植物对真菌病原体的抗性)的能力)。例如，可以通过遗传多态性或通过人工操作来获得此类变体。本发明的天然蛋白质的生物活性变体可与天然蛋白质的氨基酸序列或SEQ ID NO:1具有至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性，如通过本领域已知的序列比对程序确定。本发明中披露的蛋白质的生物活性变体可以与蛋白质相差少至约1至15个氨基酸残基，少至约1至10个(例如，约6至10个)，少至约5个，少至4、3、2或甚至1个氨基酸残基。
本申请中披露的蛋白质可以被修饰，例如，通过包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。这种操作的方法是本领域已知的。例如，可以通过在DNA中突变来制备抗性蛋白质的氨基酸序列变体和片段。诱变和多核苷酸修饰的方法是本领域已知的。
在一个实施例中，本发明的蛋白质是SEQ ID NO:1的生物活性片段，其可以保护植物免受锈病病原体的侵害。
本发明中披露的蛋白质还包括天然存在的蛋白质及其变体、片段和经修饰形式。此类变体和片段仍将具有赋予或增强植物对真菌病原体的抗性所需的能力。
核酸分子
本发明的另一个实施例涉及与锈病抗性有关的核酸分子。这些核酸分子编码本发明的蛋白质，即一种赋予增加的锈病(例如亚洲大豆锈病)抗性的蛋白质。核酸分子可以是DNA，例如cDNA、基因组DNA或重组DNA。核酸分子也可以是RNA，例如mRNA。
在某些实施例中，核酸分子是基因RppRC1(命名为RppRC1)。在本发明的一个实施例中，核酸分子具有SEQ ID NO:2的核酸序列。在另一个实施例中，核酸分子具有与SEQ IDNO:2的核酸序列至少75％、至少85％、至少90％、至少、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的核酸序列。本披露的核酸分子的实施例包括：
(B1)具有SEQ ID NO:2的核酸序列的DNA分子；
(B2)在严格条件下与SEQ ID NO:2的核酸序列杂交并编码上述蛋白质的DNA分子；以及
(B3)与(B1)和(B2)中定义的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性并编码如上所述蛋白质的DNA分子。
在其他实施例中，核酸分子包含染色体区间，该染色体区间包含SEQ ID NO:11、12或13的核酸序列，或其编码ASR抗性的部分。在另一个实施例中，核酸分子具有与包含SEQID NO:11、12或13的核酸序列的染色体区间至少75％、至少85％、至少90％、至少、至少95％、至少97％、至少98％、或至少99％相同的核酸序列。在某些实施例中，核酸分子编码ASR抗性。此类核酸分子的实施例包括：
(B4)具有SEQ ID NO:11、12或13的核酸序列或其编码ASR抗性的部分的DNA分子；
(B5)在严格条件下与SEQ ID NO:11、12或13的核酸序列杂交并编码上述蛋白质的DNA分子；以及
(B6)与(B4)和(B4)中定义的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性并编码赋予植物增加的锈病抗性的蛋白质的DNA分子。
对于上述基因，严格条件可以如下：在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中在50℃杂交，并在2×SSC、0.1％SDS中在50℃漂洗；严格的条件也可以是：在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中在50℃杂交，并在1×SSC、0.1％SDS中在50℃漂洗；严格的条件也可以是：在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中在50℃杂交，并在0.5×SSC、0.1％SDS中在50℃漂洗；严格的条件也可以是：在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mM EDTA的混合溶液中在50℃杂交，并在0.1×SSC、0.1％SDS中在50℃漂洗；严格的条件也可以是：在7％SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中在50℃杂交，并在0.1×SSC、0.1％SDS中在65℃漂洗；严格的条件也可以是：在6×SSC和0.5％SDS溶液中在65℃杂交，然后分别地用2×SSC和0.1％SDS洗膜一次，用1×SSC和0.1％SDS洗膜一次。
在另一个实施例中，核酸分子编码SEQ ID NO:1的氨基酸或与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少75％、至少85％、至少90％、至少、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的蛋白质。
本发明包括分离的或基本上纯化的核酸分子。“分离的”或“纯化的”核酸分子或其生物活性部分基本上或大部分地不含与核酸分子伴随或相互作用的组分，这些组分通常存在于核酸分子的自然环境中。因此，分离或纯化的核酸分子或蛋白质在通过重组技术(例如PCR扩增)产生时基本上不含其他细胞材料或培养基，或者在通过化学方法合成时基本上不含化学前体或其他化学品。最优选地，“分离的”核酸分子不包含以下序列(例如，蛋白质编码序列)：这些序列在核酸分子来源的生物体基因组DNA中天然地位于该核酸分子侧翼(即位于该核酸分子5'和3'末端的序列)。例如，在本发明的一些实施例中，分离的核酸分子可以包含小于约5kb、约4kb、约3kb、约2kb、约1kb、约0.5kb或约0.1kb的核苷酸序列，这些核苷酸序列在核酸分子来源的细胞基因组DNA中天然地位于该核酸分子侧翼。与编码的核苷酸序列相关的片段和变体在本披露的范围内。“片段”及其语法变体是指核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分以及由其编码的蛋白质。核苷酸序列的片段可以编码蛋白质片段，这些蛋白质片段保留了天然蛋白质的生物活性并具有赋予植物抗性(即抗真菌)的能力。可替代地，可用作杂交探针的核苷酸序列片段不一定编码保持生物活性的蛋白质片段。因此，核苷酸序列的片段可以在至少约15个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸和至多编码本文披露的蛋白质的全长核苷酸序列的范围内。
编码所披露蛋白质的生物活性部分的核苷酸序列片段可以编码至少约15、约25、约30、约40或45、约50个连续氨基酸或至多存在于该实施例的全长蛋白质中的氨基酸总数(例如，SEQ ID NO:1的857个氨基酸)。可用作杂交探针或PCR引物的核苷酸序列的片段通常不必编码蛋白质的生物活性部分。
当提及特定的核酸分子时，术语“全长序列”是指天然序列的完整核酸序列。“天然序列”及其语法变体在本发明中用于指内源序列，即存在于生物体基因组中的未工程化的序列。
因此，本发明披露的核苷酸序列的片段可以编码蛋白质的生物活性部分，或者也可以是用作杂交探针或PCR引物的片段。在某些实施例中，本发明的核酸分子包含至少约15、约20、约50、约75、约100或约150个核苷酸或至多存在于本文披露的全长核苷酸序列中的核苷酸数(例如，SEQ ID NO:2的2574个核苷酸)。
本领域技术人员将认识到本发明的核酸变体将被配置为保留开放阅读框。对于核酸分子，保守变体包括由于遗传密码的简并性而编码本发明蛋白质中的氨基酸序列的那些序列。天然等位基因变体可以通过众所周知的分子生物学技术来鉴定，例如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体核酸分子还包括合成的核酸分子，例如通过使用定点诱变产生但仍编码本发明蛋白质的那些。通常，本文披露的特定核酸分子的变体可与特定核酸分子具有至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性，如通过本领域熟知的序列比对程序确定。
本发明的特定核酸分子(即参考核酸分子)的变体也可以通过比较由变体核酸分子编码的蛋白质和由参考核酸分子编码的蛋白质之间的序列同一性百分比来评估。可以使用本领域已知的序列比对程序计算任何两种蛋白质之间的序列同一性百分比。在本发明的任何给定核酸分子对通过比较由给定核酸分子对编码的两种蛋白质共有的序列同一性百分比来评估的情况下，两种编码蛋白质之间的序列同一性百分比为至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性。
变体核酸分子和蛋白质还包括通过诱变和重组程序(包括但不限于诸如DNA改组的程序)获得的序列和蛋白质。重组多核苷酸文库可以由一组相关序列多核苷酸(其包含具有基本序列同一性并且能够在体外或在体内同源重组的序列区域)产生。例如，使用这种方法，编码目的结构域的序列基序可以在本发明披露的蛋白质基因和其他已知蛋白质基因之间改组，以获得编码具有改进的目的特性(例如增加的赋予或增强植物对真菌病原体的抗性的能力)的蛋白质的新基因。这种DNA改组策略是本领域已知的。
本披露包括基于它们与本文所示的完整序列或其变体和片段的序列同一性而分离的序列。此类序列包括作为所披露的序列的直系同源物的序列。当它们的核苷酸序列和/或由其编码的蛋白质序列共享至少约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多序列同一性时，存在于不同物种中的基因被认为是直系同源物。直系同源物的功能通常在各种物种中高度保守。因此，本披露包括编码赋予或增强真菌植物病原体抗性的蛋白质并与本发明中披露的序列或其变体或片段杂交的分离的核酸分子。
在PCR方法中，寡核苷酸引物可以设计用于PCR反应，以从任何目的生物体中提取的cDNA或基因组DNA中扩增相应的DNA序列。用于设计PCR引物和用于通过PCR进行克隆的方法是本领域已知的并且披露在以下文件中：Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning:ALaboratory Manual[分子克隆：实验室手册](第2版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress[冷泉港实验室出版社],普莱恩维尤,纽约)。已知的PCR方法包括但不限于使用配对引物、嵌套引物、单特异性引物、简并引物、基因特异性引物、载体特异性引物、部分错配引物等的方法。
在杂交技术中，已知核酸分子的全部或部分被用作探针，该探针选择性地杂交到存在于来自选择的生物的一组克隆的基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组文库或cDNA文库)中的其他相应的多核苷酸上。杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团如32P或任何其他可检测标志进行标记。因此，例如，可以通过将基于本实施例的多核苷酸的合成的寡核苷酸进行标记来制备杂交探针。制备杂交探针和构建cDNA文库和基因组文库的方法是本领域已知的。
可以使用各种程序来确定DNA、RNA或蛋白质的特定序列是否存在。这些包括例如DNA印迹、RNA印迹、蛋白质印迹和ELISA分析。这些技术在本领域中是众所周知的。
本发明披露的蛋白质及其编码基因和方法可用于调节植物中一种或多种蛋白质的含量。术语“调节”及其语法变体在本发明中用于指相对于来自相应的未转化植物(即未根据本披露的方法进行遗传修饰的植物)的蛋白质含量，遗传修饰的(即转化的)植物中蛋白质含量的增加或减少。
如本文使用的，术语“表达”及其语法变体是指产生多核苷酸的生物合成或过程，包括基因产物的转录和/或翻译。例如，本发明中披露的核酸分子可以从DNA模板转录(例如转录成mRNA或其他RNA转录物)和/或转录的mRNA随后翻译成蛋白质。术语“基因产物”及其语法变体可以指例如转录物和编码的蛋白质。基因产物(即目的基因产物)的表达或功能的抑制(或增加)可以在任何两种植物之间进行比较的环境中，例如，基因产物在遗传修饰的植物中的表达或功能相对于基因产物在相应但易感的野生型植物或其他易感植物中的表达或功能。野生型植物中基因产物的表达水平可能不存在。例如，“野生型”植物可以是不表达外源抗性基因的植物、植物细胞或植物部分。
可替代地，靶基因产物的表达或功能的抑制(或增加)可以在以下环境中，其中在同一植物或不同植物内的植物细胞、细胞器、器官、组织或植物部分之间进行比较并包括同一植物或不同植物的发育阶段或时间阶段之间的比较。在转录或翻译水平下调靶基因产物的表达或下调靶基因产物的功能活性的任何方法或组合物可用于实现对靶基因产物的表达或功能的抑制。类似地，在转录或翻译水平上诱导或上调靶基因产物的表达，或增加或激活或上调靶基因产物的功能活性的任何方法或组合物可用于实现靶基因或蛋白质的增加的表达或功能。用于抑制或增强基因表达的方法是本领域众所周知的。
本发明披露的基因和核酸分子包括天然存在的序列及其突变体或经修饰形式。本发明中披露的蛋白质还包括天然存在的蛋白质及其变体、片段和经修饰形式。此类变体和片段仍将具有赋予或增强植物对真菌病原体的抗性所需的能力。在一个实施例中，在编码变体或片段的DNA中产生的突变通常不会将序列置于阅读框之外，并且优选地不会产生互补区，该互补区可能产生二级mRNA结构。
表达盒、重组载体、重组细菌或转基因细胞系
本申请还提供了含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细菌或转基因细胞系。
表达盒是指能够在宿主细胞中表达蛋白质的DNA，该DNA不仅包括启动编码蛋白质的基因转录的启动子，还包括终止转录的终止子。此外，表达盒还可以包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异性启动子和诱导型启动子。启动子的示例包括但不限于：花椰菜花叶病毒组成型启动子35S；来自番茄亮氨酸氨基肽酶(“LAP”)的创伤诱导型启动子(Chao等人,(1999)Plant Physiol[植物生理学]120:979-992)；来自烟草病程相关1(PR1)的化学诱导型启动子，(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟基酸S-甲基酯)诱导；番茄蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均由茉莉酸甲酯诱导)；热休克启动子；四环素诱导型启动子；种子特异性启动子，例如粟种子特异性启动子pF128、种子贮藏蛋白特异性启动子(例如、菜豆蛋白、油菜籽蛋白、油质蛋白和大豆β伴大豆球蛋白启动子(Beachy等人,(1985)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]4:3047-3053)。它们可以单独使用或与其他植物启动子组合使用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂碱和章鱼碱合酶终止子(参见，例如：Odell等人,(I985)Nature[自然],313:810；Rosenberg等人,(1987)Gene[基因],56:125；Guerineau等人,(1991)Mol.Gen.Genet[分子和普通遗传学],262:141；Proudfoot(1991)Cell[细胞],64:671；Sanfacon等人,Genes Dev.[基因与发育],5:141；Mogen等人,(1990)Plant Cell[植物细胞],2:1261；Munroe等人,(1990)Gene[基因],91:151；Ballad等人,(1989)Nucleic AcidsRes.[核酸分子研究],17:7891；Joshi等人,(1987)Nucleic Acid Res.[核酸分子研究],15:9627)。
构建含有核酸分子的重组表达载体。使用的植物表达载体可以是Gateway系统载体或二元农杆菌载体，例如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。
使用RppRC1构建重组表达载体时，可在转录起始核苷酸前添加任何增强型、组成型、组织特异性或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因泛素启动子(pUbi)等，其可单独使用或与其他植物启动子组合使用。此外，在使用本发明的基因和/或染色体区间构建植物表达载体时，也可以使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻近起始密码子的区域等，但必须与编码序列在同一阅读框中，以确保整个序列的正确翻译。翻译控制信号和起始密码子的来源很广泛，可以是天然的或合成的。翻译起始区可以来自转录起始区或结构基因。
为了便于转基因植物细胞或植物的鉴定和筛选，可以对植物表达载体进行工程化，例如，通过添加可在植物中表达并编码能产生颜色变化或发光化合物的酶的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标志(庆大霉素标志、卡那霉素标志等)或对化学试剂有抗性的标志基因(如抗除草剂基因)等。
转基因细胞系可以是繁殖材料或非繁殖材料。
在具体的实施例中，表达盒中启动蛋白质编码基因转录的启动子具体为编码基因的原始内源启动子，编码基因的原始内源启动子的核苷酸序列示于SEQ ID NO:7。
在本发明的另一个实施例中，所述重组载体具体为通过以下获得的重组质粒：在pB2GW7载体的attR1和attR2位点之间克隆上述核酸分子(SEQ ID NO:2)并且用SEQ ID NO:7所示的RppRC1基因的内源启动子替换SacI和SpeI酶消化位点之间的35S启动子。
本发明披露的抗性基因可以作为转基因表达以产生抗锈病植物。使用本发明中描述的或本领域技术人员已知的不同启动子将导致基因表达在不同条件下被调节(即启动子可以基于期望的结果来选择)。例如，可能需要在特定组织系统或器官(例如叶)中更高水平的表达来增强抗性。完整基因(例如，天然启动子和编码序列)可以作为转基因插入，从而允许与其他性状快速组合，例如昆虫抗性或除草剂抗性。
在一些实施例中，核酸序列可以与目的核酸分子序列的任何组合叠加以形成具有所期望表型的植物。这种叠加可以通过DNA构建体中的基因组合来实现，或者通过将一种或多种具有转基因的植物与包含所期望组合的另一种植物株系杂交来实现。例如，本发明披露的核酸分子或其片段可以与任何其他核酸分子或其他基因叠加。所得组合还可以包括任何一种目的核酸分子的多个拷贝。本发明中披露的核酸分子也可以与任何其他基因或基因组合叠加以产生具有所期望的多种性状组合的植物。这些性状包括但不限于作为动物饲料所期望的性状，例如高油基因、平衡氨基酸、增加的消化率、昆虫抗性、疾病抗性或除草剂抗性、无毒和疾病抗性基因、农艺性状(例如雄性不育、开花时间)和/或转化技术性状(例如细胞周期调节或基因靶向)。
任何方法，包括但不限于通过任何常规或已知方法或遗传转化的植物杂交繁育，都可用于聚集不同的基因。如果性状由遗传转化的植物堆叠，则目的多核苷酸序列可以在任何时间以任何顺序组合。例如，包含一种或多种所期望性状的转基因植物可用作靶标以通过后续转化引入更多性状。在共转化方案中，性状可以与目的多核苷酸同时引入，目的多核苷酸由转化盒的任意组合提供。例如，如果要引入两个序列，则这两个序列可以包含在分开的转化盒(反式)或相同的转化盒(顺式)中。这些序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。在一些情况下，期望引入可以抑制目的核酸分子表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中产生所期望的性状组合。
构建的载体或表达盒不存在于初始植物的基因组或转基因植物的基因组中，并且不位于初始植物基因组中的天然基因座处。
本发明披露的组合物可以通过基因渗入的方法产生或维持。当该方法重复两次或更多次时，基因渗入有时被称为“回交”。在基因渗入或回交中，“供体”亲本是指具有渗入所需基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座渗入的亲本植物。初始杂交产生F1代。术语“BC1”是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，依此类推。
本发明还可以包括所描述的序列，这些序列可以由在目的植物中表达的表达盒或DNA构建体提供。表达盒可以包括与本发明披露的序列可操作地连接的5’和3’异源调节序列。本发明中使用的术语“可操作地连接”是指待表达的核酸与调节序列(包括启动子、终止子、增强子和/或其他表达控制元件(例如，聚腺苷酸化信号))连接，连接方式允许核酸的表达(即当载体被引入宿主植物细胞时，核酸在宿主植物细胞中表达)。此类调节序列是本领域熟知的并且包括可以在多种宿主细胞中直接组成型表达以及在特定宿主细胞中或在特定条件下直接表达的那些核苷酸序列。载体的设计可以取决于例如要转化的宿主细胞的类型，或所期望的核酸表达水平。表达盒可以包含一种或多种要共转化到植物中的另外基因。此外，可以在多个表达盒中提供任何另外的基因。
本发明的表达盒可以包含多个限制性酶消化位点，用于插入核苷酸序列，从而处于调节区的转录调节之下。表达盒还可以包含选择性标志基因。
表达盒以5’-3’转录方向还可以包含转录和翻译起始区、本披露的DNA序列以及在植物中起作用的转录和翻译终止区。转录起始区，即启动子，相对于植物宿主可以是天然的或相似的或外来的或异源的。此外，启动子可以是天然序列或可替代地是合成的序列。术语“异源”是指起始转录区不存在于引入起始转录区的天然植物中。如本文使用的，嵌合基因包含与转录起始区可操作地连接的编码序列，该转录起始区与该编码序列异源。启动子的示例包括但不限于花椰菜花叶病毒35S和大豆泛素6。
尽管可以优选使用异源启动子来表达序列，但是可以使用同源启动子或天然启动子序列。此类构建体将改变宿主细胞(即植物或植物细胞)中的表达水平。因此，宿主细胞(即植物或植物细胞)的表型发生了变化。
终止区可以天然具有转录起始区，天然具有可操作地连接的目的DNA序列，或衍生自另一来源。可以从根癌农杆菌的Ti质粒中获得容易获得的终止区(例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区)。
可通过同源或非同源重组方法(例如通过基因组编辑)改变内源基因或源基因抗性直向同源物。当与未修饰的序列相比时，这种改变意味着核苷酸序列具有至少一个修饰并且包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替换、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
在一些实施例中，基因组编辑技术可用于将本发明中披露的抗性基因引入植物基因组中，或基因组编辑技术可用于编辑先前引入植物基因组中的抗性基因。
基因组编辑可以使用任何可用的基因编辑方法来实现。例如，基因编辑可以通过将多核苷酸修饰模板(有时称为基因修复寡核苷酸)引入宿主细胞来实现，其中多核苷酸修饰模板包含宿主细胞基因组内基因的靶向修饰。多核苷酸修饰模板可以是单链或双链的。
可以根据需要优化一个或多个基因以增加在转化植物中的表达。例如，植物偏好性密码子用于合成基因以改善表达。合成植物偏好性选基因的方法是本领域已知的。
已知另外的序列修饰以增强细胞宿主中的基因表达。这些序列修饰包括消除以下序列：编码的假多聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复序列和其他可能对基因表达有害的经完全表征的序列。序列中的G-C含量可以调整为给定细胞宿主的平均水平，该水平可以从宿主细胞中表达的已知基因计算得出。如有必要，可以修饰序列，以避免可能的发夹二级mRNA结构。
表达盒可以另外包含表达盒的构建体中的5’前导序列。这样的前导序列可以增强翻译。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小核糖核酸病毒前导序列，如EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区)；马铃薯y病毒群前导序列，如TEV前导序列(烟草蚀刻病毒)、和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)；苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA(AMVRNA 4)的非翻译前导序列；烟草花叶病毒(TMV)前导序列；以及玉蜀黍褪绿斑驳病毒(MCMV)前导序列(Lommel等人(1991)Virology[病毒学]81:382-385)。也可以使用其他已知的增强翻译的方法，例如内含子。
表达盒中的各种DNA片段可以根据需要在适当的阅读框中进行操作，以确保DNA序列在正确的取向上。为此，衔接子或接头可用于连接DNA片段。此外，还可以使用其他操作来提供方便的限制性位点、去除多余的DNA或去除限制性位点。为此，可能涉及体外诱变、引物修复、限制、退火和再替换(例如，转换和颠换)。
通常，表达盒可以包含用于选择经转化的细胞的选择性标志基因。选择性标志基因用于选择经转化的细胞或组织。标志基因包括对抗生素抗性进行编码的基因，例如对新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)进行编码的基因、连同赋予针对除草剂化合物(例如，草铵膦、草胺膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D))的抗性的基因。上述选择性标志基因列表并不意味着限制。任何选择性标志基因都可以用于本披露。
为了在植物或植物细胞中表达本发明的靶基因和/或蛋白质，本发明的方法包括用编码靶蛋白的核酸分子转化植物或植物细胞。本发明的核酸分子可以与驱动植物细胞中表达的启动子可操作地连接。本领域已知的任何启动子均可用于本发明的方法，包括但不限于组成型启动子、病原体诱导型启动子、创伤诱导型启动子、组织偏好性启动子和化学调节型启动子。启动子的选择可能取决于所期望的表达时间和在转化植物中的位置，以及本领域技术人员已知的其他因素。可以种植或培养经转化的细胞或植物以形成包含被引入例如细胞或植物中的编码R蛋白的一种或多种多核苷酸的植物。
可以使用多种启动子来实施本发明。可以根据所期望的结果选择启动子。也就是说，核酸可以与组成型启动子、组织偏好性启动子或其他启动子组合并在目的宿主细胞中表达。这样的组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利号6,072,050中披露的其他组成型启动子、CaMV 35S启动子、水稻肌动蛋白、泛素、pEMU、MAS、ALS等。此类组成型启动子在本领域中是已知的并且预期用于本披露。
一般来说，使用诱导型启动子，特别是来自病原体的启动子来表达本发明的基因，有利于本发明基因的应用。这样的启动子包括病程相关蛋白(PR蛋白)的启动子，这些蛋白是由病原体感染诱导形成的并且例如是PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、壳聚糖酶等。
在病原体感染部位处或附近局部表达的启动子值得关注。此外，由于病原体可以通过伤口或昆虫引起的病损进入植物，因此伤口诱导型启动子也可以用于本发明的载体构建。此类伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pinII)基因、wun1和wun2、win1和win2、系统素、WIP1、MPI基因等。
化学调节型启动子可以通过应用外源化学调节剂来调节植物中的基因表达。根据使用的目的，启动子可以是化学诱导型启动子，例如通过施用化学物质来诱导基因表达，或者是化学抑制型启动子，例如通过施用化学物质来抑制基因表达。化学诱导型启动子在本领域中是已知的，并且包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(它是由苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(它是由用作萌发前除草剂的疏水亲电子化合物激活)、以及烟草PR-1a启动子(它是由水杨酸激活)。其他目的化学调节型启动子包括类固醇反应性启动子(例如，糖皮质激素诱导型启动子、四环素诱导型启动子和四环素抑制型启动子)。
组织偏好性启动子可用于靶基因或蛋白质(例如，编码衍生自豆科植物的NB-LRR多肽的多核苷酸序列)在特定植物组织中的靶向增强表达。此类组织偏好性启动子包括但不限于叶特异性启动子、根特异性启动子、种子特异性启动子和茎特异性启动子。组织特异性启动子包括Yamamoto等人,(1997)Plant J.[植物杂志]12(2):255-265；Kawamata等人,(1997)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]38(7):792-803；Hansen等人,(1997)Mol.Gen Genet.[分子和普通遗传学]254(3):337-343；Russell等人,(1997)TransgenicRes.[转基因研究]6(2):157-168；Rinehart等人,(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(3):1331-1341；Van Camp等人,(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2):525-535；Canevascini等人,(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2):513-524；Yamamoto等人,(1994)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]35(5):773-778；Lam,(1994)ResultsProbl.Cell Differ.[细胞分化的结果和问题]20:181-196；Orozco等人,(1993)PlantMolBiol.[植物分子生物学]23(6):1129-1138；Matsuoka等人,(1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA,[美国国家科学院院刊]90(20):9586-9590；和Guevara-Garcia等人,(1993)Plant J.[植物杂志]4(3):495-505。此类启动子可用于修饰本披露的核苷酸序列。
叶特异性启动子是本领域已知的。参见，例如Yamamoto等人,(1997)Plant J.[植物杂志]12(2):255-265；Kwon等人,(1994)Plant Physiol.[植物生理学]105：357-67；Yamamoto等人,(1994)Plant CellPhysiol.[植物细胞生理学]35(5):773-778；Gotor等人,(1993)Plant J.[植物杂志]3,509-18；Orozco等人,(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]23(6):1129-1138；和Matsuoka等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],90(20):9586-9590。
“种子偏好性”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育过程中具有活性的那些，例如种子贮藏蛋白的启动子)和“种子萌发”启动子(在种子萌发过程中具有活性的那些)。这种种子偏好性启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息)、mi1ps(肌醇-1-磷酸合酶)和celA(纤维素合酶)。珠蛋白-1(Glob-1)是首选的胚特异性启动子。对于双子叶植物而言，种子特异性启动子包括但不限于菜豆β-菜豆球蛋白基因启动子、油菜籽蛋白基因启动子、β-伴大豆球蛋白基因启动子、大豆凝集素基因启动子、十字花科蛋白基因启动子等。
本发明的核酸分子的表达可以涉及使用完整的天然抗性基因，其中表达由同源的5’上游启动子序列或其他异源启动子驱动。本领域技术人员将能够鉴定抗性基因以评估其表达水平并选择可用于表达目的抗性基因的偏好性启动子序列。同源或异源抗性基因启动子序列的使用为调节蛋白质表达提供了选择，以避免或最小化与植物防御激活相关的任何潜在不适当或不希望的结果。
特定的大豆启动子包括但不限于来自大豆泛素(subi-1)、延伸因子1A、用于组成型表达的S-腺苷甲硫氨酸合酶、Rpp4和RPG1-B的启动子，以及包含在基因模型中的启动子，例如本领域技术人员已知的用于更密切地调节由NB-LRR基因启动子提供的表达的Glyma启动子。
在本发明的上下文中，种质包括可以从中产生新植物的细胞、种子或组织，或植物部分，例如叶、茎、花粉，或可以培养成全株植物的细胞。
转化植物
由于本发明中披露的抗性基因可以表达为转基因以产生抗锈病植物，因此本发明的某些实施例涉及将核酸分子引入植物的方法。除了上述转化大豆植物外，本发明的核酸也可用于其他植物。
如本文使用的，术语“引入”及其语法变体是指为植物提供核酸分子。在一些实施例中，核酸分子可以以序列进入植物细胞内部的方式(包括它们潜在地插入植物基因组中)存在。本发明披露的方法不依赖于将序列引入植物的具体方法，只要核酸分子进入植物的至少一个细胞内部即可。将核酸分子引入植物的方法是本领域已知的并且包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
植物转化方法的示例包括农杆菌介导的转化和粒子轰击，然后可以通过本领域技术人员已知的方法再生经转化的植物。
核酸分子可以瞬时或稳定地引入宿主细胞，并且可以保持未整合，例如以质粒形式。“稳定转化”或“稳定地转化”及其语法变体是指引入植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并且可以被植物的后代遗传。如本文使用的，“瞬时转化”及其语法变体是指将核酸分子引入植物中但未整合到植物基因组中，或将蛋白质引入植物中。
转化方法和将核酸分子序列引入植物的方法可能取决于要转化的植物或植物细胞的类型。将蛋白质或核酸分子引入植物细胞的合适方法包括但不限于显微注射、电穿孔、直接基因转移、Lec1转化和弹道粒子加速。随着更新的方法变得可用，这样的方法也可以用于本发明，因为转化或转染的方法不是关键的。
可以按照常规方法将转化的细胞培养成植物。然后可以将这些植物培养并用相同的转化品系或不同的品系授粉，然后可以鉴定具有所需表型特征的组成型表达的后代。可以培养两代或更多代植物，以确保所需表型特征的表达得到稳定维持和遗传。然后收获种子以确保已实现所需表型特征的表达。在一些实施例中，转化的种子或转基因种子具有稳定掺入其基因组中的核苷酸构建体或表达盒。
本发明包括包含本发明披露的核酸分子序列的种子，这些种子可以发育成或用于发育一种或多种与例如野生型品种的植物种子相比对病原体(例如真菌)或病原体形成的感染具有增强的抗性的植物。本发明的特征在于来自转基因豆科植物的种子，其中种子包含本发明披露的核酸分子。
目的植物包括豆科作物物种，包括但不限于苜蓿(紫花苜蓿)；三叶草或车轴草(三叶草属物种)；豌豆，包括Pisum satinum、Gajanus cajan、紫皮豇豆和Lathyrus物种；普通豆(蝶形花科或豆科)；扁豆(小扁豆(Lens culinaris))；羽扇豆(羽扇豆属物种)；牧豆树(牧豆树属物种)；长豆(长角豆(Ceratonia siliqua))、大豆(soybean)(大豆(Glycinemax))、花生(落花生(Arachis hypogaea)或罗望子(酸豆(Tamarindus indica)。术语“豆科物种”和“豆科作物物种”在本文中用于指代植物并且可以例如是目的植物。豆科物种或豆科作物物种可以是植物、植物部分或植物细胞。
调节和增强锈病抗性
本发明还提供了本文所述的蛋白质、核酸重组载体、重组细菌或转基因细胞系在调节植物对锈病的抗性中的用途。在该用途中，该蛋白质或其编码基因在植物中的表达水平和/或活性增加，并且植物对锈病的抗性增强。
此外，本发明涉及增强植物对植物病害如锈病的抗性的方法。该方法可以包括通过在繁育过程(即针对锈病抗性的繁育过程)中将来自豆科植物的抗性基因渗入种质来赋予对病原体(例如锈病)的抗性。
如本文所披露的基因渗入方法也可用于产生对以下任何一种具有增加的抗性的大豆植物：大豆胞囊线虫、细菌性脓疱、根结线虫、大豆灰斑病、疫霉菌、褐茎腐病、线虫、黑粉病、二孢白粉菌、菊科白粉菌、小麦白粉菌、瓜类单囊壳、黄瓜白粉菌、终极腐霉菌、葡萄钩丝壳、豌豆球腔菌、稻瘟菌、稻平脐蠕孢、稻瘟菌、立枯丝核菌、大豆疫霉菌、麦二叉蚜、烟粉虱、玉米蚜、网纹野蛞蝓、小蔗螟、麦二叉蚜或桃蚜。
在一个实施例中，该方法改善了锈病抗性。改善植物对锈病的抗性的方法可以包括增加植物中上述蛋白质的表达水平和/或活性，其中改善植物对锈病的抗性不仅可以赋予原本不抗锈病的植物以锈病抗性，还可以进一步增强原本抗锈病的植物的锈病抗性。增加植物中蛋白质的表达水平和/或活性不仅可以使原本不表达这些蛋白质的植物表达这些蛋白质，还可以进一步增加原本表达这些蛋白质的植物中这些蛋白质的表达水平和/或活性。此外，在某些实施例中，增加植物中蛋白质的表达水平和/或活性可以通过转基因方式或通过有性杂交来实现。
植物品种繁育方法
在另一个实施例中，本发明提供了具有改进的锈病抗性的植物品种的繁育方法。
具有改善的锈病抗性的植物品种的繁育方法可以包括增加上述蛋白质在受体植物中的表达水平和/或活性的步骤，其中改善锈病抗性不仅可以赋予原本不抗锈病的植物以锈病抗性，还可以进一步增强原本抗锈病的植物的锈病抗性。增加上述蛋白质在受体植物中的表达水平和/或活性不仅可以使原本不表达这些蛋白质的植物表达这些蛋白质，还可以进一步增加原本表达这些蛋白质的植物中这些蛋白质的表达水平和/或活性。
此外，增加植物中蛋白质的表达水平和/或活性可以通过转基因方式或通过有性杂交来实现。
繁育方法
在另一个实施例中，本发明提供了具有改进的锈病抗性的转基因植物的繁育方法。
具有改善的锈病抗性的转基因植物的繁育方法可以包括将本文所述的核酸分子引入受体植物以获得与受体植物相比具有改善的锈病抗性的转基因植物，其中改善锈病抗性不仅可以赋予原本不抗锈病的植物以锈病抗性，还可以进一步增强原本抗锈病的植物的锈病抗性。
此外，可以通过将上述表达盒或重组载体引入受体植物来实现将核酸分子引入受体植物。
上述方法中，将表达盒或重组载体引入受体植物具体可以是：采用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培养成植物。
本发明还涉及通过繁育方法获得的转基因植物。因此，在一个实施例中，本发明提供了一种通过使用本文所述的方法繁育获得的具有改进的锈病抗性的转基因植物，或者是大豆(大豆)SX6907，或者使用大豆(大豆)SX6907作为亲本进行有性杂交后获得的包含上述核酸分子的子代植物。在一个实施例中，可以使用在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登录号为CGMCC No.17575的大豆(大豆)SX6907的衍生物。
本文中的植物可以是全株植物，或者可以是植物细胞、种子或组织，或植物部分，例如叶、茎、花粉或可培养成全株植物的细胞。
测定和试剂盒
在某些实施例中，本发明的核酸或氨基酸分子可用于测定植物的锈病抗性。因此，本发明还包括用于本文所述测定的试剂盒。蛋白质或核酸分子或表达盒、重组载体或重组细菌或包含这些核酸分子的转基因细胞系也可以与说明书一起包装，作为完成本发明披露的测定的试剂盒的组成部分。本发明的试剂盒可包括本发明的蛋白质或核酸分子或表达盒、重组载体或重组细菌或包含这些核酸分子的转基因细胞系和适当的说明书(书面和/或作为音频、视频或视听材料提供)的任何组合。例如，该试剂盒还可包含具有与以下对应或互补的序列：与转基因事件的特定区域具有80％至100％序列同一性的序列。该试剂盒可以包括执行测定或检测方法所需的任何试剂和材料。
本发明的实施例还包括以下任何生物材料或应用：
(D1)用于扩增上述核酸分子的引物对。在某些实施例中，引物对是分别由SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的两条单链DNA构成的引物对1，或分别由SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示的两条单链DNA构成的引物对2。
(D2)用于扩增上述核酸分子的探针。
(D3)包含引物对和/或探针的试剂盒。
(D4)包含上述核酸分子的植物。
(D5)引物对或探针或试剂盒在鉴定待测植物是否包含上述核酸分子中的应用。
(D6)引物对或探针或试剂盒在鉴定待测植物是否具有上述核酸分子所赋予的锈病抗性中的应用。
(D7)DNA分子，其为SEQ ID NO:7所示的DNA分子，或通过从SEQ ID NO:7中添加、缺失和/或取代一个或多个核苷酸而获得的具有启动子功能的DNA分子。
(D8)DNA分子用于启动目的基因的表达的用途。在某些实施例中，目的基因是上述核酸分子。
用于要求保护的本发明的大豆(大豆)SX6907衍生物的保藏信息：
分类命名： 大豆
拉丁名： 大豆
保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位缩写： CGMCC
地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期： 2019年6月28日星期五
保藏中心注册号： CGMCC No.17575
实例
以下实例有助于更好地理解本发明，但不限制本发明。以下实例中的实验方法均为常规方法。以下实例中所用的测试材料，除特别说明外，均购自一般生化试剂店。对于以下实例中的定量测试，设置三个重复测试，并将结果取平均值。
实例1：RppRC1基因的克隆
大豆是一种古老的自花授粉四倍体豆科植物，基因组大小约为1.1Gbp。不同抗性大豆种质对豆薯层锈菌的反应明显不同。大豆(大豆)SX6907是中国农业科学院油料作物研究所从中国大豆种质中选择的锈病抗性资源。该品种目前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登录号CGMCC No.17575，该品种对豆薯层锈菌的反应是免疫。
以大豆SX6907基因组(RppRC1基因的来源)为模板，使用引物F和引物R进行PCR扩增，引物序列如下：
F 5’-ATGGCAGATAGTGTTGTTGCTTTTCTGC-3’(SEQ ID NO:3)；以及
R 5’-TCACAGTTCATTAGAGATTTTGAGCTTACAGC-3’(SEQ ID NO:4)。
得到的扩增产物为SEQ ID NO:2所示的序列。SEQ ID NO:2是RppRC1基因的核苷酸序列，其编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质，该蛋白质命名为RppRC1。
实例2：用大豆RppRC1基因转化大豆
1.重组表达载体的构建
取大豆品种SX6907在正常条件下培养至第一三出复叶生长期的叶片，提取DNA，以DNA为模板，在引物F和引物R(引物序列见实例1)的指导下通过常规PCR方法进行扩增，反应完成后对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并且纯化约2.5kb的DNA片段。同时，以DNA为模板，在PF和PR的指导下通过常规PCR方法扩增得到2525bp启动子pRppRC1片段，并将该片段通过酶消化连接方法连接到载体pB2GW7(载体来自VIB-植物系统生物学，网站：https://gateway.psb.ugent.be/search)中获得重组载体pB2GW7-pRppRC1。
PF：5’-GAGCTCAAAGGCTTTTTTGTTAAGGGAAGGT-3’(下划线部分为SacI识别序列)；
PR：5’-ACTAGTTTCTGTGAAACAGGAAATCTTGGGT-3’(下划线部分为SpeI识别序列)。
然后，将RppRC1基因(SEQ ID NO:2)通过gateway方法克隆到得到的重组载体pB2GW7-pRppRC1中，以得到重组载体pB2GW7-RppRC1。测序证实重组载体pB2GW7-RppRC1是通过以下而得到的重组质粒：在载体pB2GW7的attR1和attR2位点之间插入SEQ ID NO:2所示的2574bp DNA片段，并用SEQ ID NO:7中所示的RppRC1基因的内源启动子替换SacI和SpeI酶消化位点之间的35S启动子。
在最终的重组表达载体pB2GW7-RppRC1中，启动RppRC1基因转录的启动子是原始启动子pRppRC1。除上述元件外，该载体还包含用于细菌选择的壮观霉素抗性基因和作为植物选择性标志的除草剂抗性大豆Bar基因(图1)。
2.大豆转化
将步骤1中构建的包含RppRC1基因的重组表达载体pB2GW7-RppRC1通过冻融法转入根癌农杆菌EHA105中。然后选择阳性转化子进行大豆遗传转化。
农杆菌介导的子叶节点转化(Paz,M.M.,Martinez,J.C.,Kalvig,A.B.,等人,(2006)Plant Cell Report[植物细胞通讯],25,206-213)用于大豆转化，并且转化受体为大豆品种天隆1号(该品种由中国农业科学院油料作物研究所培育(国审号2008023)并且可从其获得)。用于大豆植物转化和再生的培养基如下：
农杆菌培养基：酵母粉10g/L，胰蛋白粉20g/L，琼脂20g/L，利福平50mg/L，壮观霉素100mg/L，作为抗生素。灭菌后，将试剂混合物倒入直径9cm的皮氏培养皿中备用。
农杆菌液体培养基：酵母粉10g/L，胰蛋白粉20g/L，利福平50mg/L，壮观霉素100mg/L，作为抗生素。灭菌以备后用。
共培养基：B5培养基0.32g/L，蔗糖30g/L，乙磺酸，(2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES))6.0g/L，pH调至5.4；灭菌后添加6-苄基氨基嘌呤(6-BA)1.67mg/L，L-半胱氨酸400mg/L，DL-二硫苏糖醇(DTT)150mg/L和乙酰丁香酮200μg/L。
再生芽诱导培养基：MS培养基4.4g/L，蔗糖30g/L，MES 0.6g/L，琼脂8g/L，pH调至5.8；灭菌后添加6-BA 1.67mg/L，头孢毒素(cefotoxin)(Cef)200mg/L，万古霉素(Van)50mg/L，替莫替姆(timentim)(Tim)100mg/L和草铵膦8mg/L。将试剂混合物倒入直径9cm的皮氏培养皿中备用。
再生芽伸长培养基：MS培养基4.4g/L，蔗糖30g/L，MES 0.6g/L，琼脂8g/L，pH调至5.8；灭菌后添加赤霉素(GA3)0.5mg/L，Cef 200mg/L，Van 50mg/L，Tim 100mg/L和草铵膦8mg/L。将试剂混合物倒入直径9cm的皮氏培养皿中备用。
生根溶液：30mg吲哚丁酸(IBA)，溶于10ml清水中；4℃保存，使用时稀释1000倍。
转化过程如下：
种子消毒：取干净的种子，将种子铺在9cm皮氏培养皿中1-2层，将培养皿放入300ml干燥器中，将烧杯放入干燥器中，添加10ml 3％次氯酸钠溶液然后10ml 15％盐酸溶液进入烧杯中，盖上干燥器盖密封16-20小时，然后取出装满种子的皮氏培养皿，将皮氏培养皿放在超净台上约30分钟，吹掉氯气，然后向皮氏培养皿中添加约40ml无菌水，8-12小时后转化。除非另有强调，否则该步骤和以下操作均在无菌条件下进行。
农杆菌准备：取单克隆农杆菌(转移至pB2GW7-RppRC1)，在含有相应抗生素的农杆菌培养基的皮氏培养皿上划线，添加3ml液体农杆菌培养基，轻轻旋转皮氏培养皿以使液体农杆菌培养基覆盖皮氏培养皿，并在28℃下孵育过夜。次日，用共培养基清洗菌苔，制成OD值为0.8-1.2左右的细菌悬浮液备用。
外植体准备：将种子的下胚轴垂直切开，沿下胚轴中线均匀分离出两片子叶。刮擦子叶和下胚轴的接合处，去除子叶节处的真叶。每个种子可制成两个外植体。
感染与共培养：将外植体置于细菌悬浮液中以确保所有外植体均浸入共培养培养基中。20-40分钟后，用移液器除去菌液。将两张无菌圆形滤纸放入共培养皿(直径15cm)中，滤纸直径(约13-14cm)略小于培养皿直径，向每个培养皿中添加10ml共培养基。将感染的外植体铺在滤纸上，切口向上。将培养皿密封并在22℃、18h光周期下孵育5天。
再生芽诱导：共培养后，将外植体切下细长的下胚轴并置于再生芽诱导培养基中。下胚轴区域浸没在培养基中，每培养皿(直径9cm)有6-7个外植体。将培养皿在24℃、18h光周期下孵育。两周后，从下胚轴长出的愈伤组织被切下并转移到新鲜的再生芽诱导培养基中进一步培养两周。
再生芽伸长：从外植体去除子叶，并且从下胚轴长出的新愈伤组织被切下。将得到的外植体转移到再生芽伸长培养基中，每两周进行一次传代培养。从下胚轴长出的新愈伤组织在每次转移时被去除。当芽伸长至3cm以上时，将伸长的芽(>3cm)从外植体切下，剩余的外植体继续在再生芽伸长培养基中培养。
再生芽生根(此步骤可在开放条件下操作)：取空培养皿(直径15cm)，在培养皿里放一张直径略小于培养皿直径的滤纸，加水彻底浸泡滤纸，将伸长的芽的末端浸入3mg/LIBA溶液10-20秒，取出芽，用一张吸水纸包住芽末端，将芽铺在浸泡过的滤纸上，盖上培养皿，并且在24℃、18h光周期下培养芽。每天开盖通风，适当补充水分，保持滤纸湿润。当新根长到2-3cm时，将培养物转移到土壤中并在温室中培养直至结果。
同时，本实验中通过将pB2GW7空载体引入大豆品种天隆1号建立对照(空载体对照)。
3.转基因大豆的鉴定
A.PCR鉴定
随机选取2个T0 RppRC1转基因大豆植物(称为转化事件L1和转化事件L2)的部分T1植物(6个植物，分别记为L1-1、L1-2、L1-3、L2-1、L2-2和L2-3；L1-1、L1-2、L1-3为转化事件L1的T1单株，L2-1、L2-2、L2-3为转化事件L2的T1单株)，并且选择非转基因天隆1号(阴性)和SX6907植物(阳性)；分别提取这些植物的基因组DNA，用实例1的引物F和引物R进行PCR扩增靶基因RppRC1，目标产物大小为2574bp。扩增的产物进行1％琼脂糖凝胶电泳；并且从中获得2574bp条带的植物被记录为阳性。
结果：L1-1、L1-2、L1-3、L2-1、L2-2和L2-3植物均为阳性，非转基因植物为阴性，SX6907植物为阳性，如图2所示。
B.RT-PCR鉴定
分别取步骤2得到的T1 RppRC1转基因大豆(即步骤1中的L1-2和L2-1)、用空载体转化的大豆品系(CK)和非转基因植物天隆1号并且进行总RNA提取；将得到的RNA逆转录得到cDNA，以得到的cDNA为模板，用特异性引物F1和R1对基因RppRC1的cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，其中大豆β肌动蛋白用作内参，其用引物FC和RC扩增。实时荧光定量PCR在CFXConnectTM实时荧光定量PCR仪上运行，在一次平行测试中重复3次。使用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报告的方法计算相对表达水平，即2-ΔΔCT。
ΔΔCT＝(CT.靶-CT.肌动蛋白)时间x-(CT.靶-CT.肌动蛋白)时间0
时间x代表任意时间点，并且时间0代表β-肌动蛋白校正后靶基因表达量翻倍。
上述引物的序列如下：
F1：5’-TCGGCAAAGTTGGTTTTCATCT-3’(SEQ ID NO:5)；
R1：5’-CCATTCCTGGGCTCCACATT-3’(SEQ ID NO:6)；
FC 5’-ATTGGACTCTGGTGATGGTG-3’(SEQ ID NO:8)；以及
RC：5’-TCAGCAGAGGTGGTGAACATT-3’(SEQ ID NO:9)。
结果示于图3。靶基因RppRC1在非转基因天隆1号和具有空载体的植物中基本不表达；而靶基因RppRC1在RppRC1转基因天隆1号L1-2和L2-1中高表达。
C.DNA检测
分别取步骤2中获得的T1 RppRC1转基因大豆植物(L1-1、L1-2、L1-3、L1-4、L1-5、L2-1和L2-1)、非转基因天隆1号植物(阴性)、用空载体转化的T1植物L3-1、L3-2、L3-3、L3-4和L3-5并且进行基因组DNA提取；得到的基因组DNA用内切酶HindIII消化，酶消化产物用地高辛杂交检测试剂盒Ⅱ(化学发光法)进行DNA检测，其中以BAR基因为探针，探针引物如下：
F2：5’-AGAAACCCACGTCATGCCAGTT-3’(SEQ ID NO:10)；以及
R2：5’-ATCGTCAACCACTACATCG-3’(SEQ ID NO:80)(421bp)。
结果示于图4A和4B中。植物L1-1、L1-2、L1-3、L1-4、L1-5是双拷贝，L2-1、L2-1是单拷贝，具有空载体的植物L3-1、L3-2、L3-3、L3-4和L3-5是单拷贝。至于RppRC1转基因大豆，这些可能代表了RppRC1基因的拷贝数。
实例3：转基因大豆锈病抗性检测
在本实例中，将实例2中获得的转基因植物接种豆薯层锈菌的生理小种SS4(描述于“Shan Zhihui等人,Pathogenic responses ofPhakospora pachyrhizi in differentlegume hosts[不同豆科植物宿主中豆薯层锈菌的病原反应].Chinese Journal of OilCrop Sciences[中国油料作物科学杂志],2008,30(4):497-500”，其可从申请人向公众披露，并且只能用于重复本发明的实验，不能用于其他目的)，并对植物的疾病症状进行评分，以确定RppRC1基因对锈病的作用。
首先，对T0转化事件L1和L2进行了初步测试，以评估RppRC1转基因对锈病感染的作用。具体操作如下：从T0植物取完全展开的新叶，用豆薯层锈菌生理小种SS4悬浮液(1×105个孢子/ml)以10μl/每平方厘米的接种量喷雾并且接种。以未转化的受体基因型天隆1号(阴性对照)和来自同一事件的用空载体转化的植物(空载体对照)作为易感对照，并且以未转化的疾病抗性品种SX6907作为疾病抗性对照(阳性对照))。接种后，在25℃、16小时光照/8小时黑暗的光周期、相对湿度65％-85％的温室中培养植物。接种后12-15天对疾病症状进行评分。根据病斑的性质和孢子的破裂情况确定植物的疾病抗性。植物被定性评价为免疫性(IM：无病损)、高抗性(R：红黑色病斑，少量孢子形成)和易感性(S：黄褐色病斑，大量孢子形成)。参阅“Bromfield,KR.,Melching,JS.,Kingsolver,CH.1980，Virulence andAggressiveness of Phakopsora pachyrhizi Isolates Causing Soybean Rust[豆薯层锈菌分离株引起大豆锈病的毒力和侵袭性].Phytopathology[植物病理学].70:17-21”。结果显示阳性对照和转化的植物(T0转化事件L1和L2)均表现出免疫性，而具有空载体的植物和阴性对照植物表现出易感性，如图5和表3-1所示。
然后，对T1转基因植物L1-1、L1-2、L1-3、L2-1和L2-1以及用空载体转化的植物L3-1进行了RppRC1基因针对豆薯层锈菌的功效的测试。T1种子在生长箱条件下种植，并且待植物长到两片真叶完全展开时进行接种和鉴定。用豆薯层锈菌生理小种SS4的孢子悬浮液进行接种。接种方法同上。未转化的品种天隆1号植物为易感对照，未转化的疾病抗性品种SX6907植物为疾病抗性对照。12天后观察到症状。结果表明，在抗性等级为免疫性的转基因植物L1-1、L1-2、L1-3、L2-1和L2-1的叶上均未观察到病斑形成和孢子形成。分子检测表明，转基因植物包含全长的RppRC1基因，并且具有其高表达水平。未转化的植物的叶和用空载体转化的植物L3-1的叶产生黄褐色病斑并产生大量孢子，表现出易感反应(图6和表3-2)。
这些锈病感染测试的结果表明，RppRC1基因可以通过转基因提供对豆薯层锈菌的抗性。
Figure BDA0003513827270001111
Figure BDA0003513827270001112
实例1-3证实，将RppRC1基因转化入易感大豆品种天隆1号获得的转基因大豆的锈病抗性显著高于受体亲本天隆1号，说明RppRC1和其编码基因可以调节和控制豆科植物的针对锈病的抗性，并且提高过表达后植物的锈病抗性。RppRC1及其编码基因可用于提高豆科作物的疾病抗性并且对繁育具有疾病抗性的新品种具有重要意义。
实例4：使用基因编辑进行锈病抗性基因等位基因替换。
在本实例中，基因编辑用于用赋予增加的对豆薯层锈菌的锈病抗性的区间或基因替换野生型基因。
首先，设计了两种gRNA以靶向插入区域。在本实例中，gRNA旨在靶向大豆Williams82的736bp区域和1642bp区域。设计供体DNA序列，其包括SEQ ID NO:13的区间的6057pb部分，进一步被修饰以在每侧包括500bp同源臂。其他示例包括该区间的其他部分，但典型的示例将包括含有编码权利要求1的蛋白质的核酸序列的部分。
其次，Cas12a编辑机器、gRNA和供体DNA使用基因枪介导的转化递送至至少一个植物细胞。
然后可以用例如PCR和测序来筛选靶向的插入事件。也可以使用表型评估。
本发明的编号实施例
以下是本发明所考虑和涵盖的所有实施例。在某些方面，本发明的编号实施例包括：
1.一种蛋白质，其选自由以下组成的组：
(A1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质；
(A2)与以下相比具有一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且与以下具有相同功能的蛋白质：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列；
(A3)与以下具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性并且与以下具有相同功能的蛋白质：(A1)或(A2)中定义的氨基酸序列；以及
(A4)通过在(A1)至(A3)中任一项中定义的蛋白质的N末端和/或C末端加标签而获得的融合蛋白。
2.一种核酸分子，其编码如实施例1所述的蛋白质。
3.如实施例2所述的核酸分子，其中该核酸分子是基因并且其中该基因是以下中任何一个的DNA分子：
(B1)SEQ ID NO:2中所示的DNA分子；
(B2)与(B1)中定义的DNA分子在严格条件下杂交并编码该蛋白质的DNA分子；
(B3)与(B1)和(B2)中定义的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性并编码该蛋白质的DNA分子。
4.一种表达盒、重组载体、重组细菌或转基因细胞系，其包含如实施例2或3所述的核酸分子。
5.如实施例4所述的表达盒，其特征在于启动该表达盒中该核酸分子转录的启动子是原始内源启动子，并且该原始内源启动子的核苷酸序列在SEQ ID NO:7中显示。
6.如实施例4所述的重组载体，其特征在于该重组载体是通过以下获得的重组质粒：在pB2GW7载体的attR1和attR2位点之间克隆该核酸分子并且用SEQ ID NO:7所示的RppRC1基因的内源启动子替换SacI和SpeI酶消化位点之间的35S启动子。
7.如实施例1所述的蛋白质或如实施例2或3所述的核酸分子、或如实施例4-6中任一项所述的重组载体、重组细菌或转基因细胞系在调节植物对锈病的抗性中的用途。
8.如实施例7所述的用途，其特征在于在该用途中，该蛋白质或其编码基因在该植物中的表达水平和/或活性增加，并且该植物对锈病的抗性增强。
9.一种方法，该方法选自：
(C1)用于改善植物对锈病的抗性的方法，其包括以下步骤：增加如实施例1所述的蛋白质在该植物中的表达水平和/或活性；或
(C2)用于繁育具有改善的对锈病的抗性的植物品种的方法，该方法包括以下步骤：增加如实施例1所述的蛋白质在受体植物中的表达水平和/或活性。
10.如实施例9所述的方法，其特征在于增加该植物中该蛋白质的表达水平和/或活性可以通过转基因方式或通过有性杂交来实现。
11.一种繁育具有改善的对锈病的抗性的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：将如实施例2或3所述的核酸分子引入受体植物以获得转基因植物；与该受体植物相比，该转基因植物具有改善的对锈病的抗性。
12.如实施例11所述的方法，其特征在于将该核酸分子引入该受体植物是通过将如实施例4-6中任一项所述的表达盒或重组载体引入该受体植物来实现。
13.一种引物对，其用于扩增如实施例2或3所述的核酸分子。
14.如实施例13所述的引物对，其特征在于该引物对是分别由SEQ ID NO:3和SEQID NO:4所示的两条单链DNA构成的引物对1，或分别由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的两条单链DNA构成的引物对2。
15.一种探针，其用于扩增如实施例2或3所述的核酸分子。
16.一种试剂盒，其包含如实施例13或14所述的引物对和/或如实施例15所述的探针。
17.一种植物，其包含如实施例2或3所述的核酸分子。
18.如实施例17所述的植物，其特征在于该植物是通过使用如实施例11或12所述的方法繁育获得的具有改善的对锈病的抗性的转基因植物，或者是大豆SX6907，或者使用大豆SX6907为亲本有性杂交后获得的包含如实施例2或3所述的核酸分子的子代植物；该大豆SX6907在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登录号为CGMCC No.17575。
19.如实施例13或14所述的引物对或如实施例15所述的探针或如实施例16所述的试剂盒在鉴定待测植物是否包含如实施例2或3所述的核酸分子中的用途。
20.如实施例13或14所述的引物对或如实施例15所述的探针或如实施例16所述的试剂盒在鉴定待测植物是否具有如实施例2或3所述的核酸分子赋予的对锈病的抗性中的用途。
21.如实施例7-20中任一项所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其特征在于该锈病是豆科植物锈病。
22.如实施例21所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其特征在于该豆科植物锈病是大豆锈病。
23.如实施例22所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其特征在于大豆锈病的病原菌是豆薯层锈菌或山马蝗层锈菌。
24.如实施例23所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其特征在于该豆薯层锈菌是豆薯层锈菌的生理小种SS4。
25.如实施例7-24中任一项所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其特征在于该植物是豆科植物。
26.如实施例25所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其特征在于该豆科植物是以下中的任何：大豆、苜蓿、三叶草、豌豆、菜豆、扁豆、羽扇豆、牧豆树、角豆、大豆、花生或罗望子。
在另一方面，本发明的编号实施例包括：
1.一种优良大豆植物，其基因组中具有来自第二大豆属植物的染色体区间，其中与不包含所述染色体区间的对照植物相比，所述染色体区间赋予了增加的亚洲大豆锈病(ASR)抗性。
2.如实施例1所述的植物，其中该染色体区间衍生自大豆株系SX6907。
3.如实施例1或2所述的植物，其中该染色体区间包含SEQ ID NO:2或其任何部分，其中该部分在该植物中赋予了增加的ASR抗性。
4.如实施例4所述的植物，其中该染色体区间包含与SEQ ID NO:2至少85％、至少90％或至少95％相同的核酸序列。
5.如实施例1-4中任一项所述的植物，其中该染色体区间编码SEQ ID NO:1的蛋白质，其中蛋白质在该植物中赋予了增加的ASR抗性。
6.如实施例1-5中任一项所述的植物，其中来自该第二大豆属植物的该染色体区间插入该植物的第18号染色体。
7.如实施例1-6中任一项所述的植物，其中来自该第二大豆属植物的该染色体区间插入大豆株系Williams 82的第18号染色体上在约碱基对56,680,416处开始并且在约碱基对56,677,361处结束的区域或其他大豆株系中的等效区域。
8.如实施例1-7中任一项所述的植物，其中该染色体区间包含SEQ ID NO:11-13或其任何部分，其中所述部分在所述植物中赋予了增加的ASR抗性。
9.如实施例1-7中任一项所述的植物，其中该染色体区间包含与增加的ASR抗性相关联的SNP标志，其中所述SNP标志与如表1中所列出的有利SNP标志中任一个对应。
10.如实施例1-9中任一项所述的植物，其中该区间衍生自该第二植物的第18号染色体。
11.如实施例1-10中任一项所述的植物，其中通过分子标志选择来选择或鉴定所述植物的至少一个亲本品系，其中基于位于所述染色体区间内或与其紧密连锁的分子标志的存在来选择或鉴定所述亲本品系，所述染色体区间对应于SEQ ID NO:11-13中任一个，其中所述分子标志与增加的ASR抗性相关联。
12.如实施例11所述的植物，其中该分子标志是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状基因座(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
13.如实施例11或12所述的植物，其中该分子标志是SNP标志，并且该分子标志是如表1中所示的任何有利标志。
14.如实施例1-13中任一项所述的植物，其中该植物是农艺学上优良的大豆植物，该大豆植物具有商业上显著的产量和/或商业上易感的活力、结实、可立性或脱粒性。
15.如实施例1-13中任一项所述的植物，其中所述区间通过对应于以及包含SEQID NO:2或11中任一个的序列的基因组编辑而引入所述植物基因组中。
16.如实施例15所述的植物，其中该区间通过以下而引入：与对应于SEQ ID NO:11-13的任一个的区间同源的大豆基因组区域的基因组编辑或对应于SEQ ID NO:11-13的任一个的区间的直系同源物的基因组编辑，并且进一步对所述大豆基因组区域进行至少一个基因组编辑以包括对应于如表1中描述的任何有利等位基因的至少1个等位基因改变，其中所述大豆基因组区域在基因组编辑之前不包含所述等位基因改变，并且进一步地其中所述基因组编辑在植物中赋予了增加的ASR抗性。
17.如实施例16所述的植物，其中该基因组编辑通过CRISPR、TALEN、大范围核酸酶或通过基因组核酸的修饰来完成。
18.如实施例1-17中任一项所述的植物，其中所述区间通过对应于以及包含SEQID NO:11-13中任一个的序列的转基因表达而引入所述植物基因组中。
19.如实施例1-18中任一项所述的植物，其中该染色体区间包含SEQ ID NO:11，或其赋予ASR抗性的部分。
20.如实施例1-18中任一项所述的植物，其中该染色体区间包含SEQ ID NO:12，或其赋予ASR抗性的部分。
21.如实施例1-18中任一项所述的植物，其中该染色体区间包含SEQ ID NO:13，或其赋予ASR抗性的部分。
22.一种具有商业上显著的产量的农艺学上优良的大豆植物，该大豆植物包含衍生自大豆SX6907的染色体区间、包含SEQ ID NO:2的染色体区间、包含SEQ ID NO:11-13的染色体区间、编码SEQ ID NO:1的蛋白质的染色体区间、或其部分，其中与不包含所述染色体区间的对照植物相比，所述染色体区间或其部分在所述植物中赋予了增加的ASR抗性。
23.一种衍生自如实施例1-22中任一项所述的植物的植物细胞、种子或植物部分。
24.一种来自如实施例1-23中任一项所述的植物的子代植物。
25.一种产生对亚洲大豆锈病(ASR)具有增加的抗性的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供第一大豆植物，其在其基因组中包含对应于SEQ ID NO:11、12或13的染色体区间、或编码SEQ ID NO:1的蛋白质的染色体区间或包含SEQ ID NO:2的染色体区间，其中所述第一大豆植物对ASR具有增加的抗性；
b)将a)的大豆植物与不包含所述染色体区间的第二大豆植物杂交；并且
c)通过从所述子代植物中分离核酸并在所述核酸内检测与增加的ASR抗性相关联的等位基因，从b)的杂交中选择子代植物，并且进一步地其中所述等位基因与对应于SEQID NO:11、12或13的染色体区间或编码SEQ ID NO:1的蛋白质的染色体区间或包含SEQ IDNO:2的染色体紧密连锁或位于其内，从而产生对ASR具有增加的抗性的大豆植物。
26.如实施例25所述的方法，其中该等位基因对应于如表1中描述的有利等位基因中任一个。
27.如实施例25或26所述的方法，其中该第一或第二大豆植物是优良大豆植物。
28.一种产生对亚洲大豆锈病(ASR)具有增加的抗性的增加的抗性的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)从大豆植物中分离核酸；
b)在a)的核酸中检测与增加的ASR相关联的至少一个分子标志，其中所述分子标志位于20cM、10cM、5cM、1cM 0.5cM内，或与跟来自大豆第18号染色体的包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:11或其部分的基因组区域对应的染色体区间紧密连锁，其中所述部分赋予植物增加的ASR抗性；
c)基于b)中检测的分子标志的存在，选择植物；并且
d)从c)的鉴定为具有与增加的ASR抗性相关联的所述等位基因的植物产生大豆子代植物。
29.如实施例28所述的方法，其中该分子标志与如表1中描述的有利等位基因中任一个紧密连锁或由其组成。
30.一种鉴定或选择具有增加的ASR抗性的大豆植物的方法，该方法包括以下步骤：
a)从大豆植物中分离核酸；
b)在该核酸中检测与增加的ASR抗性相关联的分子标志的存在，其中该分子标志位于如表1中描述的标志的20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM内；并且
c)基于在b)中检测的分子标志，鉴定或选择具有增加的ASR抗性的大豆植物。
31.如实施例30所述的方法，其中在b)中检测的等位基因由如表1中描述的任何有利标志组成。
32.如实施例28-31中任一项所述的方法，其中该分子标志是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状基因座(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
33.如实施方式28-32中任一项所述的方法，其中该检测包括扩增标志基因座或该标志基因座的一部分，并检测得到的经扩增的标志扩增子。
34.如实施例33所述的方法，其中该扩增包括：a)将扩增引物或扩增引物对与从第一大豆植物或种质分离的核酸混合，其中该引物或引物对与该标志基因座的至少一部分互补或部分互补，并且能够使用该大豆核酸作为模板通过DNA聚合酶启动DNA聚合；以及b)在包含DNA聚合酶和模板核酸的DNA聚合反应中延伸该引物或引物对以产生至少一个扩增子。
35.如实施例33或34所述的方法，其中该扩增包括采用聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)，使用分离自大豆植物或种质的核酸作为该PCR或LCR中的模板。
36.如实施例28-35中任一项所述的方法，其中该核酸选自DNA或RNA。
37.一种诊断ASR抗性的引物，其中所述引物可用于PCR反应以指示与ASR抗性相关联的等位基因的存在，其中所述等位基因是如表1中描述的任何有利等位基因。
38.一种赋予大豆植物ASR抗性的方法，该方法包括：
a)提供来自具有ASR抗性的大豆植物的第18号染色体的核酸分子，其中所述核酸编码ASR抗性；并且
b)将该核酸分子插入缺乏ASR抗性的大豆株系的第18号染色体，从而产生与不包含该核酸的对照植物相比具有增加的ASR抗性的植物，
其中该核酸分子选自由以下组成的组：
编码SEQ ID NO:1的蛋白质的核酸；
包含SEQ ID NO:2的核酸序列的核酸或其任何部分，其中该部分在该植物中赋予了增加的ASR抗性；以及
包含SEQ ID NO:11的染色体区间。
39.如实施例38所述的方法，其中该核酸分子衍生自大豆株系SX6907。
40.如实施例38或实施例39所述的方法，其中该核酸分子插入大豆植物的第18号染色体。
41.如实施例38-40中任一项所述的方法，其中该核酸分子插入在约碱基对56,680,416处开始并且在约碱基对56,677,361处结束的区域。
42.如实施例39-41中任一项所述的方法，其中该方法包括Cas12a介导的基因替换。
43.根据实施例38至42中任一项所述的方法，其中该方法包括2种gRNA。
44.如实施例43所述的方法，其中该方法包括SEQ ID NO:79和/或SEQ ID NO:81的gRNA。
45.如实施例38-44中任一项所述的方法，其中该方法包括用PCR和/或测序来筛选靶向的插入。
46.一种蛋白质，其选自：
(A1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质；
(A2)与以下相比具有一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且与以下具有相同功能的蛋白质：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列；
(A3)与以下具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性并且与以下具有相同功能的蛋白质：(A1)或(A2)中定义的氨基酸序列；或
(A4)通过在(A1)至(A3)中任一项中定义的蛋白质的N末端和/或C末端加标签而获得的融合蛋白。
47.一种核酸分子，其编码如实施例46所述的蛋白质。
48.如实施例47所述的核酸分子，其中该核酸分子是以下中的任何：
(B1)SEQ ID NO:2中所示的DNA分子；
(B2)与(B1)中定义的DNA分子在严格条件下杂交并编码该蛋白质的DNA分子；或
(B3)与(B1)和(B2)中定义的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性并编码该蛋白质的DNA分子。
49.一种表达盒、重组载体、重组细菌或转基因细胞系，其包含如实施例47或48所述的核酸分子。
50.如实施例49所述的表达盒，其特征在于启动该表达盒中该核酸分子转录的启动子是原始内源启动子，并且该原始内源启动子的核苷酸序列在SEQ ID NO:7中显示。
51.如实施例50所述的重组载体，其特征在于该重组载体是通过以下获得的重组质粒：在pB2GW7载体的attR1和attR2位点之间克隆该核酸分子并且用SEQ ID NO:7所示的RppRC1基因的内源启动子替换SacI和SpeI酶消化位点之间的35S启动子。
52.如实施例46所述的蛋白质或如实施例47或48所述的核酸分子、或如实施例49-51中任一项所述的重组载体、重组细菌或转基因细胞系在调节植物对锈病的抗性中的用途。
53.如实施例47所述的用途，其中该蛋白质或其编码基因在该植物中的表达水平和/或活性增加，并且该植物对锈病的抗性增强。
54.一种改善植物对锈病的抗性的方法，该方法包括增加如实施例46所述的蛋白质在该植物中的表达水平和/或活性；
55.一种繁育具有改善的对锈病的抗性的植物品种的方法，该方法包括增加如实施例46所述的蛋白质在受体植物中的表达水平和/或活性。
56.如实施例54或55所述的方法，其中增加该植物中该蛋白质的表达水平和/或活性可以通过转基因方式或通过有性杂交来实现。
57.一种繁育具有改善的对锈病的抗性的转基因植物的方法，该方法包括以下步骤：将如实施例47或48所述的核酸分子引入受体植物以获得转基因植物；与该受体植物相比，该转基因植物具有改善的对锈病的抗性。
58.如实施例56所述的方法，其中将该核酸分子引入该受体植物是通过将如实施例49-51中任一项所述的表达盒或重组载体引入该受体植物来实现。
59.一种引物对，其用于扩增如实施例47或48所述的核酸分子。
60.如实施例59所述的引物对，其中该引物对是分别由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的两条单链DNA构成的引物对1，或分别由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的两条单链DNA构成的引物对2。
61.一种探针，其用于扩增如实施例47或48所述的核酸分子。
62.一种试剂盒，其包含如实施例59或60所述的引物对和/或如实施例61所述的探针。
63.一种植物，其包含如实施例47或48所述的核酸分子。
64.如实施例63所述的植物，其中该植物是通过使用如实施例56或57所述的方法繁育获得的具有改善的对锈病的抗性的转基因植物，或者是大豆SX6907，或者使用大豆SX6907为亲本有性杂交后获得的包含如实施例47或48所述的核酸分子的子代植物；该大豆SX6907在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登录号为CGMCC No.17575。
65.如实施例59或60所述的引物对或如实施例61所述的探针或如实施例62所述的试剂盒在鉴定待测植物是否包含如实施例45或46所述的核酸分子中的用途。
66.如实施例59或60所述的引物对或如实施例61所述的探针或如实施例62所述的试剂盒在鉴定待测植物是否具有如实施例47或48所述的核酸分子赋予的对锈病的抗性中的用途。
67.如实施例52-66中任一项所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其中该锈病是豆科植物锈病。
68.如实施例67所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其中该豆科植物锈病是大豆锈病。
69.如实施例68所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其中大豆锈病的病原菌是豆薯层锈菌或山马蝗层锈菌。
70.如实施例69所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其中该豆薯层锈菌是豆薯层锈菌的生理小种SS4。
71.如实施例52-70中任一项所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其中该植物是豆科植物。
72.如实施例73所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其中该豆科植物是以下中的任何：大豆、苜蓿、三叶草、豌豆、菜豆、扁豆、羽扇豆、牧豆树、角豆、大豆、花生或罗望子。
序列表
<110> Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of AgriculturalSciences
SYNGENTA CROP PROTECTION AG
SYNGENTA BIOTECHNOLOGY CHINA CO, LTD
<120> 与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座
<130> 115479.000346
<150> CN 201910584420.1
<151> 2019-07-01
<160> 84
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 857
<212> PRT
<213> 大豆
<400> 1
Met Ala Asp Ser Val Val Ala Phe Leu Leu Asp Asn Leu Ser Arg Leu
1 5 10 15
Leu Glu Asp Glu His Lys Leu Leu Ser Gly Val Glu Asp Lys Val Asn
20 25 30
Ser Leu Cys Asn Glu Leu Lys Phe Ile His Ile Phe Leu Lys Asn Ser
35 40 45
Glu Gly Lys Arg Ser His Asp Thr Val Lys Glu Val Val Ser Gln Ile
50 55 60
Arg Asp Val Ala His Lys Ala Glu Asp Val Val Asp Thr Tyr Val Thr
65 70 75 80
Asn Ile Thr Arg His Lys Gln Arg Ser Lys Leu Ser Lys Leu Phe His
85 90 95
Leu Lys Glu Gln Val Met Val Leu His Gln Val Asn Ser Asp Ile Glu
100 105 110
Lys Ile Arg Ser Gln Ile Asp Asp Ile Tyr Lys Asn Arg Asp Arg Tyr
115 120 125
Gly Ile Gly Glu Gly Glu Phe Arg Ser Glu Glu Ala Ala Ala Glu Ala
130 135 140
Glu Ser Leu Leu Lys Arg Arg Arg Glu Val Glu Glu Glu Asp Val Val
145 150 155 160
Gly Leu Val His Asp Ser Ser His Val Ile Gln Glu Leu Met Glu Ser
165 170 175
Glu Ser Arg Leu Lys Val Val Ser Ile Ile Gly Met Gly Gly Leu Gly
180 185 190
Lys Thr Thr Leu Ala Arg Lys Ile His Asn Asn Asn Gln Val Gln Leu
195 200 205
Arg Phe Pro Cys Leu Ala Trp Val Ser Val Ser Asn Asp Tyr Arg Pro
210 215 220
Lys Glu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Lys Cys Ser Met Ser Ser Thr Ser
225 230 235 240
Glu Phe Glu Lys Leu Ser Glu Glu Glu Leu Lys Lys Lys Val Ala Glu
245 250 255
Trp Leu Lys Glu Lys Arg Tyr Leu Val Val Leu Asp Asp Ile Trp Glu
260 265 270
Thr Gln Val Trp Asp Glu Val Lys Gly Ala Phe Pro Asp Asp Gln Thr
275 280 285
Gly Ser Arg Ile Leu Ile Thr Ser Arg Asn Lys Asp Val Ala His Tyr
290 295 300
Ala Gly Thr Ala Ser Pro Tyr Asp Leu Pro Ile Leu Asn Glu Asp Glu
305 310 315 320
Ser Trp Glu Leu Phe Thr Lys Lys Ile Phe Arg Gly Glu Glu Cys Pro
325 330 335
Ser Asp Leu Glu Pro Leu Gly Arg Ser Ile Val Lys Thr Cys Gly Gly
340 345 350
Leu Pro Leu Ala Ile Val Val Leu Ala Gly Leu Val Ala Lys Lys Glu
355 360 365
Lys Ser Gln Arg Glu Trp Ser Arg Ile Lys Asp Val Ser Trp His Leu
370 375 380
Thr Glu Asp Lys Thr Gly Val Met Asp Ile Leu Lys Leu Ser Tyr Asn
385 390 395 400
Asn Leu Pro Gly Arg Leu Lys Pro Cys Phe Leu Tyr Phe Gly Ile Tyr
405 410 415
Pro Glu Asp Tyr Glu Ile Ser Ala Arg Gln Leu Ile Gln Tyr Trp Ile
420 425 430
Ala Glu Gly Phe Ile Gln Pro Gln Lys Thr Gly Ile Ala Asp Thr Thr
435 440 445
Glu Leu Glu Asp Val Ala Asp Phe Tyr Leu Asp Glu Leu Val Asp Arg
450 455 460
Ser Leu Val Gln Val Ala Glu Arg Arg Ser Asp Gly Gly Val Lys Thr
465 470 475 480
Cys Arg Ile His Asp Leu Leu Arg Asp Leu Cys Leu Ser Glu Ser Lys
485 490 495
Ser Asp Lys Phe Leu Glu Val Cys Thr Asn Ser Asn Ile Asp Thr Val
500 505 510
Ser Asn Thr Asn Pro Arg Arg Met Ser Ile His Leu Lys Gly Asp Ser
515 520 525
Gly Val Ser Ala Asn Thr Phe Asn Lys Ser Cys Thr Arg Ser Met Phe
530 535 540
Ile Phe Gly Ser Asp Asp Arg Met Asp Leu Val Pro Val Leu Lys Asn
545 550 555 560
Phe Glu Leu Ala Arg Val Leu Asp Cys Asp Ser Phe Ile Gly Phe Ser
565 570 575
Ser Tyr Pro Val Pro Arg Asp Leu Lys Arg Met Ile His Leu Arg Tyr
580 585 590
Leu Arg Ile Cys Val Lys His Leu Pro Asp Cys Val Cys Ser Leu Trp
595 600 605
Asn Leu Glu Thr Leu Asp Val Thr Tyr Glu Thr Thr Val Ser Ser Lys
610 615 620
Ile Trp Thr Leu Lys Arg Leu Arg His Leu Tyr Leu Ser Gly Gly Gly
625 630 635 640
Lys Leu Pro Val Val Leu Pro Lys Ala Asn Arg Met Glu Asn Leu Gln
645 650 655
Thr Leu Leu Leu Asp Gly Ser Tyr Gly Ile Asp Thr Tyr Pro Gln Gln
660 665 670
Val Ile Ser Leu Leu Lys Ile Asp Ile Phe Pro Arg Leu Arg Lys Leu
675 680 685
Ala Leu Arg Tyr Pro Asp Gly Pro Asp Met Leu Ser Ser Leu His His
690 695 700
Leu Ser Asn Leu Arg Ser Leu Lys Val Ile Arg Gly Phe Glu Leu Pro
705 710 715 720
Ser Asp Thr Asn Ala Phe Pro Ser Asn Leu Thr Lys Ile Thr Leu Ala
725 730 735
Ala Val Arg Asp Leu His Phe Met Lys Thr Leu Gly Gln Leu Thr Asn
740 745 750
Leu Gln Ile Leu Lys Leu Arg Phe Gly Lys Val Gly Phe His Leu Asp
755 760 765
Ile Gly Arg Gly Glu Phe Pro Gln Leu Gln Val Leu His Met Thr Gln
770 775 780
Ile Asn Val Arg Gln Trp Arg Leu Glu Lys Asp Ala Met Pro Arg Leu
785 790 795 800
Arg His Leu Val Ile Asn Asp Cys Glu Glu Leu Ser Glu Leu Pro Glu
805 810 815
Glu Leu Trp Ser Met Thr Ala Leu Arg Val Val His Val Ser Arg Pro
820 825 830
Ser Glu Glu Leu Ala Asn Ser Leu Lys Asn Val Glu Pro Arg Asn Gly
835 840 845
Cys Lys Leu Lys Ile Ser Asn Glu Leu
850 855
<210> 2
<211> 2574
<212> DNA
<213> 大豆
<400> 2
atggcagata gtgttgttgc ttttctgcta gataacttgt ctcggctgct tgaagatgag 60
cacaagttgc tttctggcgt ggaggacaaa gtcaactctc tttgcaatga gctcaagttt 120
atacacatct tcctcaagaa ttccgagggc aagcgcagtc atgacacagt gaaagaagtg 180
gtgagccaaa tcagagatgt cgcccacaaa gctgaagatg tggttgacac ctacgttacc 240
aacatcacca ggcataaaca gagaagcaaa ctgagcaagt tattccacct caaagaacaa 300
gtcatggtgc ttcaccaagt caactctgac atagagaaga tcaggagtca gatcgatgac 360
atctataaga acagggacag atatggcatt ggagaaggtg aattccgaag cgaagaagct 420
gctgcagagg cagaatcact cctcaaaaga aggagggagg tggaggaaga agatgtggtg 480
ggcttagtgc atgactcaag ccatgtaatt caggaactca tggagagtga gtcacgtctt 540
aaagttgttt ccataattgg aatgggaggg ttgggtaaga ccactcttgc ccgtaagatc 600
cataacaaca atcaagtgca gctgcggttt ccttgccttg catgggtttc tgtgtccaat 660
gattacagac ccaaggaatg tcttctcagc cttctcaaat gctcaatgtc atccacatct 720
gaatttgaaa aattaagtga ggaagaactg aagaagaagg tagcggaatg gttgaaagag 780
aagaggtatc tggtagtgct tgatgacatc tgggaaaccc aagtatggga tgaggttaaa 840
ggagcctttc cagatgacca aacaggtagt agaattctca taacaagtcg caacaaagac 900
gtggcacact atgctggaac tgcgtctccc tacgaccttc ccatcctcaa tgaagatgaa 960
agctgggaac tcttcacaaa gaagattttt cgaggtgaag aatgcccgtc tgatttagag 1020
cctctgggta gatccattgt gaaaacttgt gggggtttac cacttgccat tgtggtttta 1080
gcaggactcg ttgccaagaa ggagaagtca caaagagagt ggtcaagaat caaggatgtg 1140
agttggcatc ttacagagga taagactgga gtgatggata tactgaagct tagctacaac 1200
aacttgcctg gaagattaaa gccttgcttt ctgtattttg gaatctatcc agaagactat 1260
gagatcagtg caagacaatt gatccaatat tggatcgcag aagggttcat acaaccacaa 1320
aaaactggaa ttgcagatac aacagaactg gaagatgtag ctgactttta cttggatgag 1380
ctggtggatc gcagcttggt gcaagtggca gaaagaagga gtgatggggg tgtcaagaca 1440
tgtcggattc atgatcttct acgtgatctt tgcttgtcag aaagcaagtc tgataagttt 1500
ctggaggttt gcacaaactc caacattgat accgtcagta ataccaatcc ccgtagaatg 1560
tccatccact tgaaaggaga ctcgggtgtc tctgcaaaca catttaacaa atcatgcact 1620
cgttctatgt tcatctttgg tagtgatgat agaatggacc tagttcctgt tttgaaaaac 1680
ttcgagttgg cccgtgtgct tgattgtgat tcgtttattg ggttttcgtc ttatccagtc 1740
cccagagatt tgaagaggat gatccatcta agatacttga gaatatgcgt caagcacctt 1800
ccagattgtg tatgcagcct ttggaatcta gaaacactgg atgtaacata tgaaaccaca 1860
gtatccagta aaatttggac gttgaagcgg ctgagacatc tttatttgag tgggggaggg 1920
aagttaccag tcgtcctgcc aaaagcaaat agaatggaga atctccaaac ccttttgtta 1980
gatggtagct atggtataga cacgtatcca caacaagtga tttccctgtt gaaaattgac 2040
atatttccta ggttgcgaaa attagctttg cgctatcctg atggaccaga tatgttatca 2100
agtctacacc acctcagcaa tcttcgtagc ctaaaagtaa ttcgcggttt tgaacttcca 2160
tcagacacca atgcgtttcc atcaaatctt accaagataa ccttagcagc agtccgggat 2220
ttacatttca tgaagacact ggggcaactt accaaccttc aaatcttgaa actaagattc 2280
ggcaaagttg gttttcatct tgatattggc aggggagagt tcccgcaact tcaagtgctt 2340
catatgacgc aaataaatgt aagacaatgg agattagaga aagatgcaat gcctcgactt 2400
cgccatctgg tcattaatga ctgtgaagaa ttgtcagagc ttccagaaga actttggtca 2460
atgactgcct taagagtggt gcatgtttca cggccctccg aagaattggc taacagtctc 2520
aaaaatgtgg agcccaggaa tggctgtaag ctcaaaatct ctaatgaact gtga 2574
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 3
atggcagata gtgttgttgc ttttctgc 28
<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 4
tcacagttca ttagagattt tgagcttaca gc 32
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 5
tcggcaaagt tggttttcat ct 22
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 6
ccattcctgg gctccacatt 20
<210> 7
<211> 2525
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 7
aaaggctttt ttgttaaggg aaggtgtcct aagtactaac ccacgaagga atgagggaag 60
tgaggatggt aacatgtcaa ataaatttgg aatttagttc ccgaaatttt tgagtgttaa 120
ttattgtagg aatttactca tttcatgata aaacttgaca tggagtaccg gacttaaaaa 180
agaaaaacat gacatgaagt ggatttggag tcaagttttc tctcaaggca aactggattt 240
attctccgta ctcacttatt aaacaaggtt aaaacaatta ggtttgattg acattttggc 300
cttcagggtt gtctttataa ttttttcata tacgaaaaaa gttataagtt ttaatttctg 360
tacacacata taagttaagt tttgatctcc gtgatcaacg cagctagtat gtatgtggca 420
cctattcatt tgctttactg agccttctca agtgtttgtt gtccacgcct gaatataatg 480
atttattcaa gaaaacaacg gattgaggaa gaactgaaga aggtagcaga atggttgaag 540
gggaaaaatt acctggtgat gcttgatgac atatgggatg aggttaaagg tgcatttcca 600
gatgaccaaa atggtagcag aatactaata acaaggaggt ggcatactat gtacaagaac 660
aattttcaat aggatcatct tagaccttaa gagcattgac gtaaagatag atgacgaaga 720
tcaagccatc attctgttga gctttcgtcc taagccattt gatcattttg ctgatacaat 780
gttgtataga aaggctactc tatcaatgga tgaggtcaag gctgctttga actcaaaaga 840
aaatcaaggg gagaatgact ctggcagtaa aagactcttt tctactttct tgtgctgatg 900
tcagtttttt gtctcctttt ttctttcatg gtcattattg tgctgatgtt ttaacatcat 960
ttacatgttt attgtaaaag gctctttgct ctggcagagt ttgatgagat gatttgcaat 1020
tcctctgctt ctttctattc acttttctgc tttcttgtgt tccacaacca cttgaccaga 1080
tttttcagtt agcttagcat ttaagcctga gaaattatgc atcatttcat ttgtttgttg 1140
tacaaccata tttaatgtta acctctctcc cttgtttttc cattctaaac atggatcatg 1200
tttttgttta ttggtctaaa gtgttgtttc atgttatttt tctttctctt ttcccaatgg 1260
aaggtccttt catgatttag ttagaataga taactgataa cacaattagt tggaaaggaa 1320
gatgttagag tgtatgttga taatgggaga caaatcatag tgatcagttt tagaattgga 1380
gtgaaagcat acagacattg cttttgtgcc ttgtctctgc tactctaccc aaacctttgc 1440
tggttttatc atggatataa ttcattattt tatgatcttt ttggtagatt ttctaccaaa 1500
attcatttct tcttttcggt gatgctatat agtacgaatt agttttgcac caagaagtac 1560
gaatccactt ggcaaaatat gatcgtacaa atattaattt gaaagaataa aatctagaca 1620
tgcaagttct aactaccctc tttcaaactg gaatttgtgg aattgttgga attttggaaa 1680
agcttgttct ttacatcaat gtatatattc tcccaaattg tcttacaaca caaaaaaact 1740
tgagtatttt cttacatatt atctgcctac atttttgcgc ttaactggat tatggaaaaa 1800
taatttgcta atgagatata ctaggacaga tggatgaaaa ttacaccaac ttttaacaaa 1860
ggtttaaata cagttttttt ttatttataa tttatcatat ttttgccttt agtctttata 1920
tttttttttg tttttaagct ttgtaaatta tatttatttt atttttaatt tttaaagcac 1980
cttaaataat attttgacaa gtgaaaaaaa gtgttatcta aaatgttaga acgaaaaata 2040
aaaaaatata atttataagg actaaacttt ttttacaaaa aaaataaaaa aaatactaaa 2100
gaataaaaaa atatttaaga caataacaat ttgctgaata caacagaaaa gttagttaga 2160
acacaataac aatttttaaa gattattgtt aaagactctg cattttaaaa ttctaactaa 2220
tttttgtttc taaaccatgg aagactttta tttcataaac acaataacaa ttaaacaaaa 2280
ctcacaattt aaaaaaaaat cagagtcatc aaatatatta atatttaaag acagaaaaaa 2340
aaataaacaa ataaagttga gaaagccaac ctataattaa aaaggttgac agaaacgcgg 2400
gtccacgcgt atgcgcgttc tttcccttta ttggcgtcca cttgttatct ttcgttctct 2460
actctgtaaa ttatctgtcc acaaactctc tagagtttcc acccaagatt tcctgtttca 2520
cagaa 2525
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 8
attggactct ggtgatggtg 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 9
tcagcagagg tggtgaacat t 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 10
agaaacccac gtcatgccag tt 22
<210> 11
<211> 32767
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 11
ggatccgtag acaatgtcgg tggcaaggat gcagtctgtt agcaaaacaa atggtaggaa 60
gaactaatga tcaacacaaa tagtgaagca gcagtaaaag ctttcaatta aaagcaaatt 120
tacaaaggct gcataacatt tatgatgggt ttggatgagt ggtaaggaga agagaaaaat 180
gacacaaacc cttgtgtaga agatatttaa tgagatggga tggaatggga aagtcttgat 240
aagtacagga ttgtgaatga acaaatgcac caatagcccc atccttaatt tggatatatg 300
attttctgat tcttgatgta gaacaactgc tagagccttt caattgcatt actaggttcg 360
aggtttgctt gcttgtgtaa gtgagaaggg aagattgaaa ataagatgga atgaagaaaa 420
aataaattaa agtcatggct caaagtgaaa ataagtatat tttattttcc tatttctcat 480
gtttctgcta aaggcaagtg tacattcatc tcaattcacc taccaaacta tgcagatact 540
aagaccatgc atgtccagga aatataatca taaattcgct aactatccac ctaccgaacc 600
aagcagatac caagaccatg catgtccagg aaatataatc ataattcata acagactagc 660
acaagtttaa gtctttattt gtatatttat atagaagtta cccttgatga tggcgtaacg 720
gatggtggct caagagatag cctagcagaa cctgactgtg aaccctgtat aattcagatt 780
acagagtaaa cataggaaca agtttcaaag gaaagtaaac aagggaaaac cttgaggggt 840
gggggaaggg ggaactacaa tataaaacca aacttgactg cattcattct ttggcttata 900
gttaaataaa tttactaagc taatgaacaa aatatatact attaaactaa caagacatcc 960
tataaaatag cctattatgc ctaattgata ataacagttc tcccaaaagg cataattgca 1020
ttgataaatg ggagttgagg aaaatgcttt accctggaag agggtgaaac tggtggaagc 1080
tcaagggctg gcctggaaga actggaagaa gatgcctata taatataaaa atgtcttagt 1140
atattatatt atatactata tacagcaaaa aaatagaaag aagataattg aaagcagatc 1200
tgaaattaag actgcaaagc caaagccaga aaaaaaatat ccatcgtaac taatggaagt 1260
ctggttcatg cctgaatata ctctgtggat ctgctattct ccaaagtctt ggtaaattga 1320
cacaacatgt tcactccttc aattgtggcc acctaagcag attaaagccg gtaaaaagta 1380
aatcacagat ataaacaata ttcataacct aaaaaaggtc tataattaaa ttatgcagtg 1440
actgaagtca aattgaccat acctgcttct cttctatttc tttaatttta gattcctgag 1500
aagccaagta atcaggttta agttaaaaca cccaataata aattaaagaa ataactgaat 1560
tgttgcaatt gatttaccag aacatggact gcaacatgaa aagacttcga atcttcactt 1620
attgtatctg ctttccgttg aattacatat atctgcaaca ggagatattc tattgttaaa 1680
caaggaagaa gacaaaatta gacataaaaa atctttactc acatcctccc tggtactttc 1740
agtaatggca gcacattctt ctaaattttt atccagaccg ttgattcttg cagataattt 1800
cttcttggta tcctgaaacc attgcagata agtaattttt cattctcaat aacttcatgg 1860
taaaacaact gtcaatgtaa ttcttaatgt ccagataaag aaagaaaagt aaactgagct 1920
gaatgcaaaa tttaaaagca tcatcattta tagaacacac aaagttcctt ttcaaaattt 1980
tgtttgaaat ataagatttg ttcgattcaa taatggaacc ataccaattt tcacaatgaa 2040
agtgataaat gtaagttatg cacttaacga ggtcacaaaa tatttacatg aataatatta 2100
ccacaaaggc ttgacagtaa aatcaagctc aaagattatt tgaatgcagt cataataaag 2160
agaatgagct caattaagta gtattttttg tctctctgtt gatctaaatg acacatttat 2220
cctaacgtgc acttccagtg tttcagggga accacacatg agctcgatgt ataaaacatg 2280
aacaaactaa gatcatcatc aagttcatat gttacgtatt ttctagttca aaagcatcag 2340
aataaataat acataattat gttattaaaa atatttaatg atttgctcct tgacattttg 2400
ttatatagct gtactctagt taacagatag ttatcaactt atcattcatt gtcatctttg 2460
ataaagaatg tctggttttg acacagtcta agaagaacaa actatgcaat aaaagggaaa 2520
aattacccca attgattcat aaagctttcc catctgatta ccaattgatg tgcaagcatc 2580
agacaaacca cgccttgttg caaacatcag atcaggaagc ttccatccct gcaaacacac 2640
gagagccata aaactcattc ataagagagt ggggtaattg aagatttgga gatagtatgg 2700
tgagataaaa gaaaattcat ttttaaaaaa attagagaat aagtgaacta acagccagct 2760
gctcaggcat aaagtttagt atagctaaat tcatgtacta tgacagatct aagtgtaaga 2820
gagaagggac aagccttcaa gaatttgtgg gaataataca tgtagattgt tgtaatataa 2880
caagcaacaa aattgttgat tttcttgcat agttttaaga gttctctttt tgggtgcata 2940
aattttattc ccagaaacta aaattcctgg atttgccact ccatgcaaac ctgccaacta 3000
ataatcatct aacagcaagt aatggatagt tgattctgct ctaagttatg tggaaaatat 3060
tagtaacatg agttgagctc aactcaaacc agtaaatcca actctcaaaa aagaatgata 3120
acaatttatg ggaacagaaa gaaactgcta caactcaaac aaacatgaat gccatatgat 3180
caaatcattt ttttaaaaaa aaaaagtcaa aaatggttta tatattctac aagattagca 3240
agctctcaat ttcacacttg acagttatca tgacaatata tagcaggaat ctggatcctc 3300
tgcagcctct cccagcaagg tttctctcct tcccaaatct caaccaccca tcacattctc 3360
tttcctcttc agctactaag ttcaactaca acagtcaaga tcttggctgg acagtggcgg 3420
gagagaaatt aagtggagag tatccgtgtg caaagagcag atggcactcg ttaaaagcac 3480
caatatttaa attcaaatta gccataaagc ttccaataag aatgtatcac tacagcatcc 3540
tgttacttaa atcaaaaatt gagagagaaa agacattacc ttccaccaaa cgtatccata 3600
tcctaccaca acaataacaa tcactgttgc atattttctc ccacctgtgc atttcccaaa 3660
caagtcagaa aataaaaaag gagtaaaaaa taataaggaa acattgtttt gcaaattaac 3720
acgtcaacat ttattaaatt gctgaagaaa taacaaaagg cccctataat gtgtataaga 3780
aagtagctaa ccagtacctg ttccacttgc atttacaata gtgattgatc tatctctagc 3840
aagaagttgt agttcctgcc gaagactgtt aacctgtaga tcaacagtta atcagaattt 3900
tcaattaccc ctgtattgct atattggtat atatttacaa atatagcatt tgttttagta 3960
gccaattcaa caggggggaa ataaaaatcc cacttcaact gctaagtgct aaaagatata 4020
actttaatta tataaatgtt ttcattcaat tcatagaatg tcagaactca gcattattag 4080
cactctatat tgggaatcta tgataaaaat gaatgcacag tgtaacttca taaattccca 4140
aagcagcaga cccagcatgc actttaactt taaataattt atgatcagat cacaacctac 4200
ttcagaatga atgttgtaac agaatcaatg ctatgaatta tagtacttgt gacccagttg 4260
tttgtttcaa ttttgaaaca tgcaacagaa gctattttta gttctcagac aagtacgagg 4320
ttaattgtta agattagcat taacattata tacatttact tgtacgtaac atatgttcaa 4380
aatacaactt cagttgttat gaataagaca tatatatgag taaaaaaaat atgcatatgc 4440
tcagaactca agtcatgtat atgattcact aaatgatgtt cagcatgatg catgagacta 4500
aacttaacta gacaaagaac tattcctaat taaaataaaa ttaaatataa tcaataatga 4560
aaaggcagca acaacaacaa cgacatgcat acctgagcca acaaagcatc attatgcggc 4620
tgctttttaa cagttggagc aggatcatcg cttttaagtt gcctcaaaac aacctggcaa 4680
aaaagtctac aatcagtaaa aagcctgcat actttttttt ttttgctcag caaaaatata 4740
tatattatag attgaaatag taccagtggt actatgggta caaaagcctg catacttgat 4800
taccaagaat aaatgacagt taccatatac tcactatatt aatagaaatt ggacccaatc 4860
acagatataa aataatagca accaaaatat tgccaaactt gggattttag gatacaagac 4920
aagttgaaag aatttgccta aatttctcaa gtacatacaa caacaaccag tgtatcccaa 4980
caggtggaat cagccacata gatcaagcag ggttctatta aaaaaccaaa gttttagtaa 5040
aactatttag aacatggtct ttttactatt ttttaatagt gtctcctaat atttccttgg 5100
ccttcatcca atcaaactat cttccatatg tttcctttga tccatttgtc tcactactag 5160
actagagcct ctattggcct tcttacatga ctaaactacc ttaggaaagt ttccatcatc 5220
ttctccttat aatcacatat tatacccaaa atagtcccct taacaggaat cctaaatgta 5280
tgccattctc atctatattg ctttgtagtg tacattgtag taaaataaat caaatcctat 5340
atgttgccat tctcattttt gcttgcatga gttagagcat tatgatagtc ttcaacacta 5400
tttttttttg ttttataaat tcgatttctg aaatacaatt ccccccatac ccttacctta 5460
ggtctagaaa ttgcaccccc cataccataa accctctcct acacattcac acaacgtagc 5520
tacagtacag actagctctc cttgaacttc tgttgtttta aatatcatct caatcatacc 5580
actttggaca ccgaaaagag gataatcgca tcttaaaaca tgggaggggt agcaaaatca 5640
taagcatcat ttaccgagag ggaaaaaaaa ttgcatttat caatttgtac ccgtcagcat 5700
agttcattaa atgtatacat ccttcactag tgaaaaaaaa aatgcataaa aaaaataaca 5760
aaaacagcag cacccagaga aacaagttga gctttcaaaa cccaacctta aaagcaccag 5820
aggcgagacc agagacatct ggcagacgcc cttcttttgc aattactgaa ccagctatac 5880
ctaaaacaca aacaagcaaa cgaacgcatt tcagtgaggc attcaaaatt cgagtttcgt 5940
cgaaaaacct agattaacgt gccaccacga gcaaacgaac ctaaattgag atggcatcaa 6000
ttttggggga aaaaaagatt tggagaaaat aattaaaatt aaataaagag aatgacagtg 6060
tgtgtgaacc tgcgccgacg agaatgaaga gcttgccgag tgaaagagcc atggcgccag 6120
tgagtctgag caaacaagct agcgcactct gttgcgaagc atttagcgcg aaacgatgcg 6180
tttaggatta ggctatgtgc gattgtgcgt tgagattgtt tatgtttggg cactggtgag 6240
aattgatcag cgagacaaag aagacaatga aatcgaacaa acccttgcga ttgcggtgct 6300
ccctgctcct ttgtttcctc agtggacgac cctagttttg aagctgtgaa aataaataaa 6360
aatactagta tattaatagt atattccctt tctagttgtg caacaaacaa caattacaaa 6420
tatgagttta gagtgtgttt tgaatgaaag atggaaatat tattaaagat aaacttttgt 6480
acttttttta ttgggaccta ttgattatac tctatctttt atttttcaca aatggattat 6540
attctatctc aattcaaatt tatctttatt tttatatttt ttatttttta tcatgtaaat 6600
caaacatacc attaatactt ataaaatata gactcatata cagtataaga cagttttata 6660
taattaatta ataataaaat attattcata atatttttaa aataaaagaa aataagtgga 6720
tatattaata atgtattata ttatcattaa attataaatg attatgtaag ataagtttgt 6780
tattttttat aataattata atgttatatt cttaaataaa taagtttata ttattatcta 6840
aaggaagaga gataacgtag aatacaaaaa ttgacataaa atattgcaat gataacacct 6900
ctccctcatt aaacaaattg acaaatttta aaaatcatac caataataat aaaatatttt 6960
atatgattta tacatacatg attactaaat tcttaaaata attattattt atgtttataa 7020
acttatctct tttaatttga gattggatta cattgtaaaa ttaatttatt ctgcaagtat 7080
atatgaacta attttctata tttatcacta tgaacatgag tataaaaaaa tggaggagaa 7140
aaatctttgt catcaaattt gtaaatacaa ttagcagatc tcatttgcct aattatctgt 7200
ctggtttcat gtcagatttt ttttacctta tttattagaa gtttggataa ccaggccatt 7260
cttcctttaa gtggtttcca aattcttcaa cattgtgtcg cccaagccat gaagatccct 7320
attttattgt tattattatt actattatta ttaagtgtta atttaattgt tatctttcat 7380
tattgtggct ttttttaata ctaatgtgcc caataatcta tttaaaagaa taatctgtat 7440
tcaatttttg atatgtgaaa aaaattaaat caaccacaat catcacattc cgtggtttaa 7500
agatataact taatcaaatt aagatagtta atatttatga tttcaacatt cattcatttt 7560
taaatattta attattatta ttattaaaaa taatttattg agtgaatatc aaaattgaac 7620
tgtgtcatga tgtaacaagt tatgaatcgt gattatcatt tgccacataa tcaggtaacg 7680
tgacattaaa actgttaata gagaaaaaaa tgtaggggac gaaaaacgct aaaaaaaata 7740
tttagaaatt aaaaataaat ttgacaaaaa gtttagagat aaaaaaaaca aatttaatcc 7800
taaaataatc tgtaatattc ctttttaaaa agtaacgaaa tatgtgcaat attatgtgat 7860
tttccggcta gtatcttatt atttctttct ttttgtcttt taattattgg acaaacaatc 7920
gaatatggcc agaagctagc cttggataga ggctttacgc acatcatcat ttgaatctga 7980
ttctacagag gacggtatcc tactatccct agtctcccaa ctctgcaggg atgaccatgt 8040
ggcataaatc tcaaaaacat ctaagtgtaa ttaaatcaaa tattatctca ctcacaccga 8100
agtggttggt cattaattat tcagttttat tcatctaata cattgtaaat gtcatggact 8160
tggttaaaat ttgttagtgt tgaccaaagt aaagataagt agtaggaaag ttgacttaca 8220
ctcaagaatc ttttaaaatc tttaagattg tttttgtcaa aatattctct caaaatccca 8280
atccaataca tccattagct tgttattaca tcaaaatagg atatagttgg acatgggagt 8340
gtcttttcta tatattaaac tatcttacat agtatttcct caatcacaag gaaacaccag 8400
tccaccttgg aagaactcct atcttagcct tctaggcatc aggcatgcca gagtcaatac 8460
tctcaagaga aatgtgagtt tgtaactttt aatggaaaag attaaactca acactgaaaa 8520
ctgtattttg atcatacata tatataaacc taacgaataa aaaaaaatac atgtatgtac 8580
ctaggacatc accactttag aattgagatt gaaccttcgc cttaaaactg aataacaacg 8640
caatattgtt ggggcaaaat acataagata tgtctattct gaaaaaaata acaacaataa 8700
acccttatcc cactaggtca aaatcaaaat gaaataaaaa tgcaactaac taacaacatc 8760
atctgcctgc aaaagagtgc ctttaaaatc catcttgaaa agggttatat ttttttaatt 8820
ttatttattt aatttgtaat ttcacctgag ttgataatcg aacctgaggc aaaaagaaac 8880
atgagcatcc ttctctcctg cacgctagga aatggtataa ttgacatttg tgatgttcct 8940
tcttgctgct tctattctcc caagaattcc cttaactgct atatcaaatg catcttcaat 9000
ggtctctaat ctagaacttg gataacgata tattatcctt ggaataagtc ttacaatctc 9060
ctttctcatt gccaacactt cactttttgg aactctagac aatttctcat tgatcattac 9120
tctcttctct ctgacatctc tttctggtat gtacacagag tagctagaac catttctggg 9180
caaatgccac aaatattggt tatatgctga ttctggatga aagaaaacag gaatgcaacc 9240
tgccaaaatt gagtcaaaag ttgatctcct agtgaatgaa tcccctggag gctgtaaaca 9300
gaaaactgag ctctgaaaca cctttgtaac atgcacagga tcattgcaat aattatgacc 9360
gtcattgcaa cttagaagtt tgcagctcct agaggattgg cattgtttga ttatctcatt 9420
tctgatggag gatgatgaat tagaattagg ccttggagca cctgcaaatg aaaacaagta 9480
aggccttttc acttttatca tttttttctg ccactgaaaa acctccttat ccttggaggg 9540
gtgaaagtaa gttggatatg ggattggaaa ctcattgacc tttgagccag attcaattag 9600
cataattgac atgtttcttg cttctggaaa aagcattagc ttggtgcccc agtcatcatt 9660
attttctgtt cttctcctga agtcccaacc aactctccct ccaaccatga aatgatctct 9720
accccacatt cttttccatt cgggttgttg agccagccac ttcactagtt cttttggtga 9780
agcatctctg attgaaacat tgaagcctcc ccagaggtac tgacccacat caaggccagc 9840
atagtagggt acatatatag cagaagccag tgaggaatca ttggttaagc acttgtagtt 9900
cttcattgtg ttatggaaaa taacctcaag tgaaaattgg ttagttgcat accagctttc 9960
cttcaataga gccttctcct ttgatttctc aataaccttc tgtccaaggc ctaagttaga 10020
catgtaaggg cacatatcat cccacttcat gagagagtga caccccttca gcaaatcctc 10080
attgaacctg ctagcaagat cataaacata gacatattga cctgaacaag aatccaaatt 10140
tctagtggac aaatttgaaa caagtccaac attgtctcta ttcaaaggag gggaactcat 10200
gtggactctc ttatccactt caccatgtgc ttcaggaact atggtctctg tgtgattctc 10260
tacaatgtac cttggtatat tggaggcccc acttgataca ctattttgat tggtatgatt 10320
aaattttcta ggacaatcgg cattttcatt ataattgaaa gaagaatttg atggtaaaaa 10380
tgtaatgcca cgatcactca cagccatata atagtcccag agaagtaatg acatacaaaa 10440
aatgaaggag gtgaaaaaca caaaccggat tttatcaaag tacttgctca acggagggtt 10500
gtccatgttt tctttttggc cttttgagat tcagtaaaag tgaatgtgtt tttctctgat 10560
gatatgggga gagggtgaca tagagagatt tgtgtaatgc aaagtttgtg tgtgatttgg 10620
ggactttatc aaaggaatga tctgatatgg aaaagaaaag tgggaaagat attattgaca 10680
ttgaaaattt ccttttttac ttgaaaagac tgaataacaa tggaaagtaa tcaaagtatt 10740
actgtttaat tgaagaaagc attaaaaata aaatcgtgca aaggatcaaa aaccaaaatt 10800
aatagtactg taattccgta catgaatatt tctcaagaga tgtgcttcac aacatacatt 10860
caatgcatta agattgagat tcttttatta taatattgat aatcatacat atatgtttat 10920
gatattatac gattgggtcc agatcttggg aaatgcttcc ccattatcat ttagtatcta 10980
aatggtcttc attgattttc tatagttatt ccagagacac cagatagcaa caccatgcat 11040
ggagaagcag cacaatgtag accttcaggc ttcagccacc ttatttataa ctatatatag 11100
ccacccacta tatgaaattc caaaatccac cttttatatt ataaaattcg aaatctactt 11160
aattattaat taaaagttat agtttttatt ttacttatta ctaacaatta attattaaag 11220
taatatttca ttaaataaaa ttatttttat ttttagatta aaattttcaa gatctatttt 11280
taaattttaa tttatatttt ttattatcca taagttttat tcttttatta aaaatttacg 11340
ttttaggtat attttgaatt tttacaaatt actggtgtaa tggactggat aatttttagt 11400
tataggtgat atgaatattg caaatatata cagctgctga agtgattaat gatataatat 11460
catgtaaatt ataaaagcct gtttacaaat tattcattga tttttgcatc ttaagttcag 11520
tagagtgtgt aaattatgat aaatccttga taccagataa aaaaataaaa agagaacagt 11580
attattgcta acttcgttat ttttggggaa cagatccaag aagcatgcaa aaagggtagt 11640
acacgatact atcattatcc tctatcatta tggcctgaac aattagacat tcaactcgta 11700
gttgcaaaga ttaaattgca agagccgagt tctatcaact gatctatatt cccctgagcc 11760
aaatgaagta tgcacgaagg agttaagtca gttttctatt cgttttcttg acgcagtgga 11820
gcagttcact ggcgccatgg acaagccctg gtttggagga tttgctgatt gggaagtgat 11880
ggaaacgggg ttgatagtta cataattact gggttactgt gaagaggttg aaagatgcta 11940
gttggaactt ggaagagtgc gttcagggat cacattttcc taatggcagc agcccttctc 12000
ccttattcac ggtatgtatg tatgtattct tattttttaa agcttcttta atcacactgc 12060
aagtgattgc tcattcatta tttttcagtt ttaattcgta taatatataa ttctcctaaa 12120
ctcaaatatt gggaaaatta aataattaat gttggcctac actcatgagt catgatcatg 12180
aataatgggt gaatataaat gggttcaagg ggagtggttt gcttgggaaa tccaagtgtt 12240
ttaagaggtt tttaatggag atcgaagtgg ctgtgttgga ttactcatgg aggtggcgga 12300
aagatcaatc aggaaactac atacatagct ttgtgagatc ttcaattcgg ttcttgtatt 12360
gatgacactt tggcaaatac ttggaatctg aaagtccctc caaagatcat tttttttttc 12420
ctttggagac ttgtcagaaa caggctccgt agtggtgata atctgctaag gaggaacgtc 12480
gtggtaagtg gtggctgctt tttttttttt tatctgagaa taaaaaacag tgttaaggaa 12540
attataacaa atcacgcgtt atattcaacc aaatgagtta gactacctta actagtggtg 12600
acatttatag ttgtcatttt gctatggttg gttgggtgga tctgaatagt tacttacccg 12660
catctgtaaa atcacacaac tcacagcacg agtttttgtt gcttggaaca aagattatgc 12720
aagcaagtga agagtagttt ggtgggggtg ttatatgtgt actcttggaa cacattagat 12780
aatattgatt taaacgaaaa gatctttcat aggcagaaca tcatacagga tattatttta 12840
atttccattc gtggacctga ctcaagaatt tcgatgcatc cttttcatac tcatatgttc 12900
agtggtgctt gaatccaggt gtgtgtttga aggagtagca tgatcctctt atcaaatttt 12960
gttattgaac tgctatatga tttagtgatc ctcaggtttg ttgtttcctg actgatgagt 13020
tctgtagtac tggattagtt taaaagagat ttcaatggat gtgtcccttt aaaggaaaaa 13080
aaaaattata taatgagtaa ttaaaatata ataaagggga tggggggagt acttagcaaa 13140
aatagcaagt agaaatttgg cccaactctc aggcaggggc tgagctaggc catttctttt 13200
gaggggggca aatttaaaaa ctaaaattaa ttatacttac aatattaata tgttaaattt 13260
aactaataat taaaatatct ataataatta ttatatttga acatcataat taatcataaa 13320
ttatttttaa aatcaaattt atttattttc ctaatgataa aaaaaccaag ttttattttt 13380
taatttgaga ataataagaa tttaaatttt atgcatgatc tgttgttcat gattgttgta 13440
tggtgatgaa tcagcaagca tagatcagtg tattgagacg tgtgtttgac acacctcttt 13500
aaggatttat tcacgtgtgt aaatttccca caatttaatt ggtcctttct aagagcttaa 13560
attttataat tataaatcaa ttaaaaatta ttctagatat aatttttaaa ataattacta 13620
taaaatttag taattttagc atacataatg catagcaata attgaatgat aatatatata 13680
taacatttat agtgctagtg tatttacatt aaattatagg attactatat ctctacttta 13740
aaaaaaacta caatgaaata aatatttttt atctttttat taaaaaaatt agtgaaaagg 13800
aagatgtctt aaaaattatg aaaattgatg gtcttataat tttttagaag tgtatctatt 13860
ttgaatgatg agaaagatag aaagatagca aaaaatacgt gagatgcaat aggtcaagtg 13920
aagagaaaga aaaggaaaga taaaaaaaaa aatgatggaa aaagggttat aaaaaataac 13980
aaaaaaaagt atataaaatc attattgaaa aagtatatgc ccatatttat gtatttcttt 14040
cttctttaga aatgaatttc tacagcatat acacacacat cagtcgtcta actcagaaac 14100
atcaacggtc tactacttca aacacactat acatgtccaa ttggacacat cactaaagac 14160
attcggatac atattaattc ttccttgatt agagattgat tactattatc gtattggata 14220
ttaacaaaac atattcagat ttttgtcttt gattttattc ctaaacaccc cgtctcatta 14280
gcttcagaat tcttcatttc caacctcaat tctttgattt gagaaataac cctgttatag 14340
gttcaaagat tttcttctac aaataaatga accccataca aggtagacga ataaaaaaat 14400
acatgtatgt acctagggca tcaccacatt agaattgaga tcgaaccttt gccttaaaaa 14460
tgaataacaa cgcaatattt actgggggaa atacatagga tatgtctatt ctgaaaaaat 14520
aacaacaaca aagtcttgtc cgggtgaaaa tcaaactgaa atgaacatgc agctaagtga 14580
caacatcttc tgcctgcaag accattccaa gttcttataa gagtgcttta aaatccatct 14640
cgaaaaggga tatattttct gaattttttt atttaatttg taatttcacc tgactggata 14700
attgaacctg aggcaaagag aaacatagaa tccttgtctc ctgcacatta ggaaatggta 14760
taattgacat ttgtaatgtt ccttcttact gcttctattc tcccaagaat tcccttaact 14820
gctataccaa atgcatcttc aacggtcact gatctagaac ttggataacg atatattatt 14880
cttggaataa gtcttattat ctcctttctc atttccaaca cttcactttt tggaacctta 14940
gacaacttct cattgatcat tactctcttc tctctgacat ctctttctgg tatgtacaca 15000
gagtagctag aaccatttct gggcaaatgc cacaaatatt ggttatatgc tgattctgga 15060
tgaaagaaaa caggaatgca acctgccaaa attgagtcaa aagttgatct cctagtgaat 15120
gaatcccctg gaggctgtaa acagaaaact gagctctgaa acacctttgt aacatgcaca 15180
ggatcattgc aataattatg accatcattg caacttagaa gtttgcagct cctagaggat 15240
tgacattgtt tgattatttc atttctgatg gaggatgatg aatgccttga agcacctgca 15300
aatgaaaaca agtaaggcct tgaaactttt atcatttttt tctgccactg aaaaaactct 15360
ttatccttgg aggggtgaaa gtaagttgga tatgggattg gaaactcatt gtcctttgaa 15420
ccagattcaa ttagcaaaat tgacatgttt cttgcttctg gcaaaagcat tagcttggtg 15480
ccccagtcat tattattttc tgttcttctc ctgaagtccc aaccaattct ccctacaacc 15540
atgaaatgat ccctacccca cattcttttc cactcgggtt gtcgtgccag ccatttcact 15600
agttcttttg gtgaagcatc tctgattgaa acattgaagc ctccccagag gtactgaccc 15660
acatcaaggc cagcatagta gggtacatat atagcagaag cctgtgagga atcattggtt 15720
aagcacttgt agttcttcag tgtgttatgg aaaataactt caagtgaaaa ttggttggtt 15780
gcataccagc tttccttcaa caaaaccttc tcctttgatt tctcaataac cttaggtcca 15840
aggcctaagt tagacatgta aagacacata tctatcgact tcctgagaga gtgacaccct 15900
ttcagcaaat cttcattgaa cctgctagca agatcataaa catagatata ttgaccagaa 15960
caagaatcca aatttcttgt gggaacattt gtaacaactc caacattgtc tctatccaaa 16020
ggaggggaat tcatgtggac tctcttatcc acttcaccat gtgctgcagg aactatggtc 16080
tctgtgtgat tctctacaat gcgccttggt atattggagg caccacttgt tacaccattt 16140
tgattggtat gattagattt tctaggacaa tcggcagtgt cattaagatt gaaagaagaa 16200
tttgagggtt taggcatgtg tgcttgtttt gcatcattca tgttgaaaaa taaaaaggta 16260
atgccatgac cactcacagc catgtaatag tccaagagaa gcaatgacaa acataagata 16320
aaggaggtga aaaacacaaa ccggatttta tcaaagtact tcctcaacgg aggcttgccc 16380
atgttttctg tttggccaga tgtttacatt aacccacaca ccatgcttaa ctaattgagc 16440
tgaaaccctt cattttgttt ggccttttaa aattcagtta aagagaatgt gttttctctt 16500
atgatatggg gagacataga gagatttgtg taaagcttta gtgttatttg gggcctgtat 16560
caaagttatg atctcatatg gaaaagaaaa gaagaaaaga tattattgac tttaaaatat 16620
agtaatgagt attcctttaa gttgagagga acaactaaat atttggtgat ttgaactaat 16680
gttttttaaa cactaatttt ttgttttttt tatattttct ttttttctca tctttaatat 16740
atttatcaaa ttttctaatt atttttttaa ataaatcata attttattat tattttacat 16800
aattacttca cttcagtgtt aatcatatca aaatcttata atttaacaag tcaaaatttt 16860
taagtttcaa ttaaattttt aagttcaagc tagtttttca actaatttga tcatttatct 16920
ttattatatc tttattaata tacaccatgt ctaaattttc ctcaaaaaaa cttttaagga 16980
taattattta atttcatatt ctaaaaataa cgttgcaaca actatgaaat ataatttcat 17040
attaatacaa aaggtcacgt aattatttat aaatactttt gtattaatat taaaatacga 17100
aggtattaat tacgcaattt catatttaaa aaaagtcatc tttattttat ctttattata 17160
taaattataa agtaatgtac accaagtcta aatttttccc tcaaagattt tgaggataat 17220
tatgtaattt catactctac ataaaaagtc acaataatta tgaaacagaa ttaatttcac 17280
attaatacaa agtattaatt atgcaatttc gtattttaaa aaagtcatct ttattaaata 17340
taaaaaaatg tatatatata tatataataa agatatatta atttattatc cataagtatt 17400
tattaaataa ataaatacag attttaagaa aaaaaaaatt ttgttggcat aataaaaaat 17460
catgagatta aactatgtaa aaattatcaa aataaatttt atctcttcca acatatctac 17520
agttatagta aaaaaaaaaa attaaactaa tgtcaacatt tgtttgtaaa gaagtcaatc 17580
atctatcaat tctgtttgac tttgtttgta ttttaaggaa gtatttatta gtagtttaaa 17640
aatatttgat ttatgaagca tattttaaga gaatatttat taatcataag tatttatatt 17700
tataattact aatttaaatt tattattcta ggtttcaaaa tagtttttat atgtaataag 17760
aatagtaaat atgaatttaa ttatttagtt ccaactaaaa aatttaaaat tttaagatga 17820
taaagtttgg taattattat atctttatct ttatctccaa agataggttg ttgggaccct 17880
ttttttttaa aaaaaaaaag ggtaaatagt ataatttttt attacattta atagatttat 17940
gtttttcatt attattatta ttattattat tattgttaca attttcaatt gttaaaatac 18000
catatgcttt gaattaattt tttttgttat taaatgagtt cctaaaattt ggcatcattt 18060
tcacattttc aaatagtagt ttttgattac ttactgtaaa ttgtgcaatt tcaataatta 18120
ttattgaatg ccctttataa cccattggcc aaccatacaa caggttaatt ttcaaataaa 18180
tttcaaaatt aaaagattca ctatttttaa aaatttaaaa ggttgaccat catttgcttc 18240
ttctcaattc tcaagcattt aaaaggatcg ttcctttctc tttgctggag gggaccacgg 18300
tggatagagt aactaacttt gcgagctatt cgagaaggtt agtctggtct atatgaatca 18360
tattttaaga aaatgtttgt taatcataag tatttatatt tataattact aatttagaaa 18420
aaaaagtatt tatatataat aagattaata aatatgaact taattattta attatagcta 18480
aaaattaatt ttttaagaat acattaataa taaattttaa caattatgat gtctttatct 18540
ttatctctat ataaagatat aaagataggg ttggtgggag ctagtttttt cttcaaataa 18600
gggtaaataa gacatttttt tctattacat ctaatagatt tgtctttttc aacaataata 18660
ataatatatt attattacaa ttttcaatct ttaaaatact atatgctttg aatttatttt 18720
ttttgttttt ttaatgtgat ttttttatta agtgagttcc taaaatttgc catcattttc 18780
acattttcaa atagtaattt tttattactt acagtaaatt gtgcaatttc aacacttgaa 18840
tgccccttta taacccattg accaacgata caacaggtta attttcaaat aaatttgaaa 18900
attaaaaaaa atcaccattt tcaacaatct aattctcaag cattcaaaat gaattgttcc 18960
ttgacttcct tcatctttgc tagaggggac cctgctaggc acgtagagta attaattttc 19020
cgagctttct gagaatgtta gagaggttta tatgaaccat atttttaata aaatgtttgt 19080
taataataag tatttatatt tataatcatt aatttaactt gtgcaatttt aacgattatt 19140
attgaatgcc ctttataacc cattgaccaa ccctacaaca ggttagcttt atcttaattc 19200
tcaggcattt aaaaagaatt gttccttcat atttgctgga ggggatcaat aagacatttt 19260
ttcttttaca tttaatagat ttgtcttttc aatattatta ttattagact taaatatatt 19320
ttttctatga taaatacata ttttttatat ttgatcctaa taaatttcgg attgagtccc 19380
taatatttta aaaaatttat cttagatact tactgttagt tcgtatgaac tggacacacg 19440
taaaaatgtg atgtattatg tcggattatt gtttatataa gttggatttt attatttttt 19500
aacaaagaaa atattttttt ttaataatcc aatatgtata aatagaaatc acaaaggtta 19560
tatttgacat gacacatcac acttctacgt gtctaattaa gagtcatgta ggattacata 19620
ttaatgatag agactttaag ataaaaaatt taaaacatta gaatccaaat tcgaaagaaa 19680
aatttatcaa agaccaaaca caaaaaatat atatttatca agaaccaaac atatatttaa 19740
cccttattat tacaccattt tcaattttaa aaatatcata ttctttgaaa ttattatttt 19800
tattaaatga gttccaaaaa tttgacatca ttttcacatc ttcaaataat ggtttttatt 19860
acttagggta aacggtgcaa tttcgacaat tattattgaa tgccctttat aacccattga 19920
ccaaccctac aacaggttaa ttttcaaata aatttcaaaa ttaaaaaatt caccattttt 19980
aacaatttaa aaggtttatc ctctcattca tgttttttta ttataacttt taacaataaa 20040
aaattataat ttttagagta aaatatgttt aaagtctttg taaaatttga aaagtattaa 20100
tttaattttc ataaaacttt tggtattaat ttgatcatgt aaaaataaac acatattttt 20160
catgatcctc agtagtaact ctgatagata ataatctgac atggttaata tatttaaatg 20220
tgtaatttaa ttataaatga attaaataat ttgtggcggt taaaatttcc tgaatgaatt 20280
gaacaatgtt tttgcagcta aaaccttaaa aattacaatt tttgtcactt attgtatgat 20340
tttctcgcat tttctgatgt gatgagaaaa ataaaataac aatgagttct aatgtcttct 20400
aagtgtgctt gaaaaagaag gtaaagagag aaaatgatta agttagttag ttaatttctt 20460
aaagaaacca tctaatagag ttattaataa aggaccatta aaaatatact ttatttttat 20520
gtggaccaaa ttcatgtttt tttattggat caaagatcat gttcttaatg gccaaccgaa 20580
agtcattgat ggtggacaat tacaccccat cacattcatg atattaaaat tttacctttt 20640
gcaccctcta aatttatata tggaacccat taccaagtaa cataccctta tattgacata 20700
tggatgtgca aaaatagtct ctcactatga taaaattaca aataatttat tatttttatc 20760
tactaaataa atttccccta ctagtctagg gtctttccgt gggtgttttt aacctattgg 20820
attaaaaact aattaaactc atgattttgt tatgataaca aaaacaaaac aaaaatacat 20880
tcaaaagcat gacggcaaag agtgatgaga ggggagagag ggaaaaaaag aaaagaaatg 20940
aatgaaagaa gaaaaggata agaggaaaga agaaaggaaa agaggaaaga gtggtggctg 21000
gagaagggtg aggtgaaatc attcaaaagg tatcttggtc tatgttcttg atttatagtg 21060
tcaagagtaa ttttatagga atcaatagta tcatcccttt aaataagatt gagcaattca 21120
aaattaattt tcagagccca taaattattg atttaaccgt ttaacctatt ttatttttaa 21180
aacaatgatt taacctactt ttacacaagt tacaaatcaa cgatgataat cttttttatt 21240
ctgaattaat gatgataatc tgttaacttg agtaatataa tttttttcaa ttttctctag 21300
tttttttatg caaaatatgg ttacggtatt tcattcataa tcaatgatta aatccaatgg 21360
ggagctgaat caaagactta gttacaagta agaagtccta aagtccttac taaagaataa 21420
atcacatgat taacttgtct cccgctaaaa ctcatcctag aatgatgacc cagtattgcc 21480
atgagtggga tagtcaacaa tcatcttaca accaattttc tctagttttg ttgcttgaaa 21540
acttttttat gatttatcac tcttattttt ttatatagtt tcaatcttag taaatactat 21600
caaataaata atttttgtaa cacaattaat aattttacgt tggagaaagt ggaaaaaaaa 21660
cctttacata tcatatgatt tgttcataat atttttataa aataattaat tagacatgta 21720
ccaagtcata tgggacagac tcaagtcaaa ataaaatata tttaaaactt atattctgtt 21780
aatccaactc tcttttttat caagttattc ctccatttat tggacttaac acatttaaca 21840
ttcctacttt cttgttgtgg tacatgactc aatttgtcat tgccacttgg aatagttggg 21900
ttccttggag agtggctctc ccctcaagct atgcacttta aaaatatttc gaatactttc 21960
tgccttgtga tgatggtaat tttttccaaa gtaatttatc ttacctttga atgcacccat 22020
cggtgaaaat tttgtttttt agccaagatt cccaaaaaac tgctttgctt tacgaaaata 22080
tattaaaatt ctgaagttat cttacggtga tattttcaca taaaaatgtt tttaaaaaaa 22140
tattcattaa aacatataca aaatttttga aacctgcatt cattcacaat aaaaccagta 22200
gtcgaaactc aactggcaaa attgactttg actaataaaa gtatatgtat atcacaccac 22260
ccaactaatt gaagttaaaa aaaatgaaat gtattttacc caatcatgaa ataaggataa 22320
aatgaataaa aaacaaatag atggccacgc gcaaaaaata ttactagaag agctcccttg 22380
tgattcactc tatgatgttg atatacacaa gttaagtaag actcaataat aggctcagac 22440
taagttaact aattacttct aaatgacata cttataaagg aaataaagtg gatggaacaa 22500
aaactctata atgcaaagat gtgaaaaaat ctgcaaaaga atgccttagt acacaagtga 22560
tgctagttag gaggagccca ctttggaata tgattattat ttgggagctt gtagaggaac 22620
agaagttagt tatagaaccc agtactaatc caacttattg gcctagcaat cttaaaagca 22680
tttttatttt tcatacaaat tcctaaagca ggttgagttg cacagtttaa ccaactaacc 22740
actctattac tctaacacac ccactccatt atcatttata tatacacata ccaaacttgg 22800
attgaaaata gtttcctttc cgcacgtaaa tcattctaac ttgctcataa agacaaacag 22860
gaacctaaat ataaccccat tctaggtacc cttttttgat agatagatag ctatataggc 22920
taataagctc ttgaatatta gaacttgcta tagctataca cacataaaat ttggggttag 22980
gaagagatga gaaaccgtat tgaaagatta gtagttccat ggtctttcag ctgtgcttcc 23040
cattcaagtg tgaaattagg tgcacccaaa ggaccaaaag aagattcaaa aggaactatt 23100
gtttcaagta gtttctgctt tctttcttat cagcatccat ttctctattc aatttttttt 23160
ctttgttaag tgattggagt gctatcttgt aatttgagat attcgttatg caaggaagac 23220
aagaaggaca agatagatca ttcatcaggg cccaaatgaa gagaggcaag ccttctgggt 23280
ttctggttct accaaagcct aatgtagcta ctagcataca gagaataatc aagggcatca 23340
agaatttatc tcaattattt ggtgagtaca acaatctcta tttttattaa ttaattttgt 23400
ttgttatgaa tcatggctgg tcttaattac atgaaatttc aatttccatt acccgataaa 23460
aattaaagaa acatataaat cattttatca atatattcta attagcagac aatcatacta 23520
ctccttgagt gatcaaatat ttgattatta agtttgtatg tatgtgtgaa aaaaaattca 23580
ataaaagata taagcttctt aaatatatct tcatatctca aaaaattagt ttccaaagtc 23640
tttgtcctga acagcccata aatcatttct taaatgtata taatttatgg taggtggtgc 23700
attattcttt atcctttctg atatataatt ctctttttct tgtggatctt tctcttcttc 23760
tttttttatg tgttatatga ttacttttgg actatgtatg acctgggcta ctcaacttgt 23820
ccaattgaat atactggaca caacttttat gggcccataa cattagaaaa atgaaacata 23880
tatatgtagc tgaaatttag aggcatcgaa ggagttagtt agatcagagg agtagtttga 23940
agttttgaag gccgattatg attttaggtg attatattaa ctcgtctccc ttatttgaaa 24000
tgattttatc cagctgtgga gtatggggac actaaattct aataatatgc atacaacata 24060
attgtatttg attttagtgt ctgaatccta cctactaaag aaacggacac aacattaaat 24120
aaatgagacc ttagcaaaat atatgaaatc atgtataatt aaaaaaacaa tactcgttag 24180
ttaagttaaa aagtagataa tgataaaact aacgaaaata gttatgaaat catctgtaca 24240
accaataatg aaattagtaa cctgagttct gtggcaaaaa atggaaaaca aggaatgcaa 24300
taactaaaca caaatttaaa agactcttgc aagaactctc aaccctacgt tgatctaaaa 24360
ctgtctctgt gtgtgattaa gtttttttaa catctacaca ttaagttatt aaaatttgat 24420
ctatcattca agaaaatttg tcattggtgc cttttcaaaa atagaataaa tgtcgttgga 24480
ctgggctttg cttacagcat atggactggg ctagagccac atttaaggtt aattttaata 24540
taattctttg cttaagttat tataatattc taacttattt aaactctaca tgtttatatt 24600
cgctctgttg catctttgta atgtgtcgat tgttgaatgt tttcttcact tgaatttagt 24660
ttacaaaaaa gaggatgtcg aaaaaatgga acctgagatg gaaattgggt atccaacaga 24720
tgtgaagcat gtgacacata ttggaattga tgggtcaaca accattacaa ataatgtcaa 24780
gggttgggac aatctgaagg cacctgaatt attgtctctg tctccaattt cattcaagca 24840
atttgaattg gccatggcta gccaagctca atatcctctc attaacgatc ttaattcctc 24900
taaatgtggt tagaacactt tatgggaatg atggcacttc caagtccctt cttctaattg 24960
tagattaatg atgattgatg acgatgtatt taggagttca tatacaagtg cataaattga 25020
atattcgtga atgtttgtaa tctctttcac tctttgtttt gctcggttct tgagattgcc 25080
taagcttcat tacttcaagt cttccatttt aaaattgagt ttttctgtct ataatatttt 25140
atcaatcaaa agaaagaaaa aagcttagta ggactcactt tttatcaact aaaaatttgt 25200
tttaagttat ccatcgctat tcatttaact attattattt atttattaca gattttacct 25260
ataaatattc actggtgtgg atgttgtagt catctctaca catgtaaatt ttgatttgac 25320
aataaatcta ccttaaaact aaataaattg attgatatat ccttctattt ccaggaaaaa 25380
aaagaagcaa acataatgat aatacacttt tttattattc ttaataattt tctattattc 25440
tcttattact ttgatcatat atgtttttat ttttttattt ttgtctcagt ttatttcgtt 25500
tgaagtccaa aaatgaaaaa aaaaacattt ttagctatgt cttatttttt atttaatttt 25560
tggagatcat tccacaacat agccaataca attaattttt tttaaaaaaa tatacacaaa 25620
attagtaaaa tgattttttt tgggttcatt aattaattaa tacggtgcct tggaggattg 25680
taatatacgc cgacaacaaa tgtggctctt tagtcatttc ataaactaaa ttggcatgtt 25740
cattcaacaa atatatttct aagattaaag catcattttt aaaacatatt ccttagcttt 25800
ttaaacatat aaaacaattc ataattaaat aatatatatt ttgtacagta aaagttatac 25860
aaaaatttat ataatcatga cagagattga ataagacaga gaagtgttaa atacaacaag 25920
caacgtgatg aaaagaacta gagaaaaaaa actactaatg ttatagaaaa tggtgtaaat 25980
atttgttata taatataaat ctataatttg atataaagag taaaagagtg attaagtttt 26040
agattaaatt gcatactgat ataataaaaa tatatatttt agattaattt acaaaatatt 26100
gcttcaattt taacctattg gtactttttt tcccccaaaa ttataagttt acattattct 26160
cactcaaact ttaaacatat agtaattatt tcattttttt ttctagaagt ataactaagt 26220
tccatacaac tttatatgta tattctaaaa aattattaga aagaataaaa gatattcaac 26280
tgttaatgat gaaaaaattg tgaattatta aacatttaaa atccaaacag ataattgaaa 26340
atttaagaaa taatttatca aaattataaa attatgccaa gcttttgtca ttaaagttaa 26400
gtttatgttc tagaaaagac catttgttta tggtttagtg tgtctattga gttgacaaac 26460
aaagaagtgt gtactattga gtacaattaa ttatagaaga taattcgttg ataagtttct 26520
ttccgttgcc gttacttatg tcattctcca gttctttctt tattccttaa ccatttcccc 26580
ccctcttctt cactctattc tttccatagt taaaaacttt taatttcaaa ctagggagaa 26640
taattttaat aaaattaatt ttaaattagt aatgtcatta caataaataa ataatatata 26700
taaactaatt ttaagttaaa aagtgtgtta ataaaagatt ttaaattgtg atcacaattt 26760
cttaatccct gattacaatt ttcttatttt ttgagtatta aaataattat tttaaaataa 26820
tttgaattat attttgtgat tgaaagtgta taaaaattat tattttaatt ttaataataa 26880
tttttcatat tttaataaaa gatgtacatt ttaacataag cttatgtcaa caattaattt 26940
cagtccattt cttttgcaat aataatcacg ttagaagaga atagacccgc gaatctgaat 27000
cagaaaaaat ataggaataa atagacttgc caactaaacc gagtgaaggg gcaataaggt 27060
cattcgaggt gtcctcctta ttatttgtcg gtgccgtagc gtggttcttt gcctcaaagc 27120
cagtctgttc ttacttaaac atcgaacact tcgtgtccca cctagacctt acccaccgtc 27180
gattccccta aacgtgttcg acatttaatc acacacacta agcacacata acaccatcgg 27240
agaaggacct tccatcaacc cataactagt cgtagtatta tttcattgat tctctccctt 27300
ctctttctct ctgcgacaac agatgatgga gacgacggcg aagcgaaacg ctgtcgttgc 27360
gccaatcgcg gcgttgttgt tggtggtgct actcgcggcg agtgtggtgg tggaggctca 27420
ggagaactcg gacgtgaaga cgctggtgaa gcacatgcac gggaagaagt actgcgacaa 27480
aggatgggaa tgtaagggct ggtcaattta ctgttgtaac ctcactatta ctgattattt 27540
ccagacctac cagttcgaga atctcttctc caagcggaac tcgccggtgg cgcacgccgt 27600
cggattttgg gactaccact cgttcatcgc cgctgccgcg cttttcgagc cgcaagggtt 27660
cggcaccacc gggaacaaga cgatgcagat gatggagatt gcggcgttcc tcggacacgt 27720
cggcagcaag acctcttgtg agtactactc tcgtatcgat aatttgttga tttagttttg 27780
tcaacttcgt tgagattgcg cgcgcgtgtg agagagagtt tgtttaggtt gagctagcgg 27840
tttttgaggt tgtgagatct gtgtgtgttg tagtgtttga gacttcgaat gatttggatt 27900
ttgttgttgt gttgcataat ttgatttctg tgctgtaaac cttgttttgt ttggaactgg 27960
agtcggtgca gtcgattttt catgcattta catagtcatt gaatgatttg gatttgttat 28020
tgtgttgtct gatttgattg ctattttgta agccttgatt tgtttggaac tgtattctgt 28080
gcattcaatt tttttcatgc attcaggcag ttgttgcatt tgtaactgac tattggatga 28140
agattggacg actcggattt tgaatgtgta ttttatggtc tggtttatca aaataaagca 28200
tgagtcatcc gatcttcatt caacggatct gagtagatga atgtgtgaat gcgtggaaaa 28260
ttgtcttaga tgtctttatt tgtgatttac atggtgtctg atgtgtttaa gcacattttg 28320
tgaggtagaa tgttgttttg tgagagttga tttatcggag acatgtgaat aggatttatt 28380
gtttgtgttg tgggagttgc gtgtggtgca gcggttgatt tagttttgct ttaaatttgg 28440
acaactgtgt ggtgttattg ttcttataat gctggtgtca ggtggttatg gagtggctac 28500
cggaggacct ttggcctggg gtctttgtta caaccatgaa atgagtccta tgcagtcata 28560
ctgtgatgac tacttcaaac tcacataccc ctgtacacct ggtgctgagt actatggtcg 28620
tggagctatt cccattttct ggtatgtgta tgtttgtttg gctgtatgta taatagaagc 28680
atattttcct ggttttggaa ttgcctgttt attgtcattg tttgaataaa ttgcgctgta 28740
atacatagag atgcctaaag gtagctagtc ttagaaagtt tctttatcat tcctgaaaat 28800
tgccattctt ctcaaatttt tcttgtattg tttaacttaa gtattctgca atatccctga 28860
ccagtctgta ccaaatcaat tagacttgtt gaaaggttaa ccaaacatcc caaggttatt 28920
tgttcttaat ttatagcttc ccctattgtc tgaaaaaatg agttaataga tagcagttag 28980
gtactagtgc tctcaacaat taattcatcc gaagcacctc aatggctatg atcataaaca 29040
ctttagcaaa gaagtatatg gcctgagcag tctatgaaat gtaaatgaca catttcatag 29100
aaagataact attatatggt taaaaccttt aaaatatcat ttagcttccc attgtgcgat 29160
tataggtcct tcaaatcaca ataaagaaaa tataagagtt aagtgggcat tgcaaagttt 29220
tgaaagatta tagtaatgaa aaagaaactg ttgcaacaag agataaagta ggataagggt 29280
gggggaaata gaacaaaagc agtaattgat tagttactgc agagatacag agctggattt 29340
ctgggtttgt gtaaatgatt tatgaaatta tcagtgatac caatgaaaat taaaaataat 29400
gtatgcatgt gcagattttc agttaagacc agtcaagtct taaacctgtt cccttacttt 29460
ctattgttct gatatactag tttctgtttg gtctgaatgg taggatattt gaccatatca 29520
gtatattggc agtgtgatca acttaagtag catctcagac tgtcaactga cattttgtca 29580
aagaagaaat tgtttgaaga tttaaactag tattttatgc atatttttag gcaagtctag 29640
ttatatttca ttggagccat tttttacttg aaacgtatag ataggctgta agaaaactat 29700
ttattaggtt ttatcaacat cattgtgctt gttgaatgtg gaggttatac ttaatggtat 29760
catcaatata ggaactacaa ctatggtgct gttggagaag ctttgaagat cgacctactc 29820
agccatccag aatacataga gcagaatgcc acccttgctt tccaggctgc tatttggaga 29880
tggatgacac caatgaaaaa gtcacagccc tctgcgcatg atgcctttgt cggcaactgg 29940
aagcctacca agaatgatac tatggagaat cgtcttcctg gatttggcac tacaatgaac 30000
attctctatg gggatggtgt ttgtggacaa ggtgatgtgg actcgatgaa caatatcgtt 30060
tcccattacc agtattatct tgaccttcta ggtgttggtc gagaacaggc tgggccccat 30120
gaaatcctta catgcgctga gcaggttcct ttcaacccat cttccaaacc tgcttcttca 30180
tcttaagatt atatttatta gcatatgata ttgttgtacc aatccctttg aaagtgaaag 30240
ttaataaggg ttcttgaaat tattggtatg caataatttt gaactgcgtg gtagtgtggg 30300
aattcattat atagcttttg ttcgttgtta tctagaagtt ttagtcattt gtaatatcat 30360
atgtcgtgaa aaatttgtat ctggtatata tgtacgttat gggcgatttt gttattttta 30420
tatatacatt ccttggttgc aatgtaaatt tgaatatggt catgtcaaac aaaatccatt 30480
tcgagtcatc taggtcttca ttagtggcta acaatataag ttatttatgc cacgtattta 30540
aaatttcaat taaatagcat tattgtacat ctgccacgca gagaaaatag aggaaaatga 30600
tttgcgtgtt aatttttaag atgacagggt tatgttctaa ttttgcattt gacataaagt 30660
ctgctttatg ttttaacaag agtaataaat gtcttttttt agaattatcc tcctttcggg 30720
gtgattgcct catgttaata tcaaatctac cagaagcaac acgagatagt agtattttga 30780
tgatttttgt gaagcctata atgaaagcat aaggtatgaa aatattttca ggggaaatgt 30840
gttccattct aattcaaata agggcatctt gtaggtttca atacaaaaat ttgcaaagta 30900
atccctataa atcgtctgta aaataagtaa tgtaaatctg caacctaata aaattatctt 30960
cttggccgaa atatgatcag ttgccacatt tgtccataaa tctgaatcta ataatatgaa 31020
aagttgagat aaaaatttat tgtcgtttat agaaataaat aaatggaccg gtctttactc 31080
atacagcaga ataaataaag ggacttatat ccttcacctc tctaaagact aaagtggctt 31140
ttcttatttt ggaataccta tttcgggtag gttatagagt cctcttttat tttagaatat 31200
aatcatactc taagatagtt attttaaaag agtcttattc tgaaatgata ctctagaata 31260
taattttttg cattccagaa tagctatttc aatatatgta agttttcgta ttgtgtggaa 31320
acatatctta ttctaaaata atagttttgg agtactcctt tggcaatggt gttttcaaag 31380
atgaactcct gcgcaaacat aagcttctcc agggacaaat ccatggtggt ggaactccca 31440
acagaggcct tcatggaggt gtggcggcaa ttgtcaacgg tgttccgatc atatggcaaa 31500
catactgtcg tgagcgacaa atcagagtgg cgttccactg tgggccaatg tggcttgcac 31560
gactataggc ccaaaggctg tatctgttca taattaatcg atcgagcgca attttacttg 31620
gattacagtg atgttttctc gtttttatga ttcacaacat ccctgtatat atatatatat 31680
atatatatat atatatatat ataatatata tatatatata tttacaatgt attagttaac 31740
ttattgaatt caaatgttaa tttaaataca caatgataaa aaaaaggata acgtagtttg 31800
atcaagtcta atatttggaa agtacaaggc taagaaaaca agtacatcta aaataagctt 31860
ttagaagaaa aaaattaaga cggtaacgaa taatcttata actcatttaa ccttctccat 31920
gaaagcgttc gtgcacaaga aaataatcgt attagataat gttttctgaa aatgtaaaaa 31980
ggatttctct agttatttat ttttattata gattagatat ctaaatttag tagttatggg 32040
cacaaatgat tatggttgac atatttttcg agtgtcctcc ggcgtggatt cggattgcta 32100
ttttaacgga ttttttaagt tttcttttac tgtggtttct agtttgagct taactctctt 32160
ttagcaccaa aaataaaaat gatattaaac ttattttagt tttattgata tgtattgatg 32220
atttaatggt atagttatca tgttttgtta aaaaaaaaga atcattttta cgatgttgac 32280
atttttttca cagatagata ctgtcatttt agatagtttt gtattttaat acacttgtct 32340
acattattta gttgctcata agtttacaat cattaagtaa aataaataat attaattaag 32400
tattttaatt agaaatattt aatcaataat gttgcattgc tgcttaaatt tactataaag 32460
agtgtgtgtg tgagttatgt gatgaagtag tgtttctaca tttcttgttg cacaaatgtt 32520
acctaaacaa tttcatgtta actttagaga atgaaaggtt aggcatgcaa ttttactctt 32580
atgactaatt agtattttag actgtgcaat gacaagataa ttgtctaatt tatataacta 32640
aaatttgtaa tatattaata tattttaata aataaattat attataatta aatttaaaat 32700
aaataatatt tttaacttat aaaatatatt ttagacttat gataaacaaa ttatatagtg 32760
ataacag 32767
<210> 12
<211> 32767
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 12
ttattaggtt ttatcaacat cattgtgctt gttgaatgtg gaggttatac ttaatggtat 60
catcaatata ggaactacaa ctatggtgct gttggagaag ctttgaagat cgacctactc 120
agccatccag aatacataga gcagaatgcc acccttgctt tccaggctgc tatttggaga 180
tggatgacac caatgaaaaa gtcacagccc tctgcgcatg atgcctttgt cggcaactgg 240
aagcctacca agaatgatac tatggagaat cgtcttcctg gatttggcac tacaatgaac 300
attctctatg gggatggtgt ttgtggacaa ggtgatgtgg actcgatgaa caatatcgtt 360
tcccattacc agtattatct tgaccttcta ggtgttggtc gagaacaggc tgggccccat 420
gaaatcctta catgcgctga gcaggttcct ttcaacccat cttccaaacc tgcttcttca 480
tcttaagatt atatttatta gcatatgata ttgttgtacc aatccctttg aaagtgaaag 540
ttaataaggg ttcttgaaat tattggtatg caataatttt gaactgcgtg gtagtgtggg 600
aattcattat atagcttttg ttcgttgtta tctagaagtt ttagtcattt gtaatatcat 660
atgtcgtgaa aaatttgtat ctggtatata tgtacgttat gggcgatttt gttattttta 720
tatatacatt ccttggttgc aatgtaaatt tgaatatggt catgtcaaac aaaatccatt 780
tcgagtcatc taggtcttca ttagtggcta acaatataag ttatttatgc cacgtattta 840
aaatttcaat taaatagcat tattgtacat ctgccacgca gagaaaatag aggaaaatga 900
tttgcgtgtt aatttttaag atgacagggt tatgttctaa ttttgcattt gacataaagt 960
ctgctttatg ttttaacaag agtaataaat gtcttttttt agaattatcc tcctttcggg 1020
gtgattgcct catgttaata tcaaatctac cagaagcaac acgagatagt agtattttga 1080
tgatttttgt gaagcctata atgaaagcat aaggtatgaa aatattttca ggggaaatgt 1140
gttccattct aattcaaata agggcatctt gtaggtttca atacaaaaat ttgcaaagta 1200
atccctataa atcgtctgta aaataagtaa tgtaaatctg caacctaata aaattatctt 1260
cttggccgaa atatgatcag ttgccacatt tgtccataaa tctgaatcta ataatatgaa 1320
aagttgagat aaaaatttat tgtcgtttat agaaataaat aaatggaccg gtctttactc 1380
atacagcaga ataaataaag ggacttatat ccttcacctc tctaaagact aaagtggctt 1440
ttcttatttt ggaataccta tttcgggtag gttatagagt cctcttttat tttagaatat 1500
aatcatactc taagatagtt attttaaaag agtcttattc tgaaatgata ctctagaata 1560
taattttttg cattccagaa tagctatttc aatatatgta agttttcgta ttgtgtggaa 1620
acatatctta ttctaaaata atagttttgg agtactcctt tggcaatggt gttttcaaag 1680
atgaactcct gcgcaaacat aagcttctcc agggacaaat ccatggtggt ggaactccca 1740
acagaggcct tcatggaggt gtggcggcaa ttgtcaacgg tgttccgatc atatggcaaa 1800
catactgtcg tgagcgacaa atcagagtgg cgttccactg tgggccaatg tggcttgcac 1860
gactataggc ccaaaggctg tatctgttca taattaatcg atcgagcgca attttacttg 1920
gattacagtg atgttttctc gtttttatga ttcacaacat ccctgtatat atatatatat 1980
atatatatat atatatatat ataatatata tatatatata tttacaatgt attagttaac 2040
ttattgaatt caaatgttaa tttaaataca caatgataaa aaaaaggata acgtagtttg 2100
atcaagtcta atatttggaa agtacaaggc taagaaaaca agtacatcta aaataagctt 2160
ttagaagaaa aaaattaaga cggtaacgaa taatcttata actcatttaa ccttctccat 2220
gaaagcgttc gtgcacaaga aaataatcgt attagataat gttttctgaa aatgtaaaaa 2280
ggatttctct agttatttat ttttattata gattagatat ctaaatttag tagttatggg 2340
cacaaatgat tatggttgac atatttttcg agtgtcctcc ggcgtggatt cggattgcta 2400
ttttaacgga ttttttaagt tttcttttac tgtggtttct agtttgagct taactctctt 2460
ttagcaccaa aaataaaaat gatattaaac ttattttagt tttattgata tgtattgatg 2520
atttaatggt atagttatca tgttttgtta aaaaaaaaga atcattttta cgatgttgac 2580
atttttttca cagatagata ctgtcatttt agatagtttt gtattttaat acacttgtct 2640
acattattta gttgctcata agtttacaat cattaagtaa aataaataat attaattaag 2700
tattttaatt agaaatattt aatcaataat gttgcattgc tgcttaaatt tactataaag 2760
agtgtgtgtg tgagttatgt gatgaagtag tgtttctaca tttcttgttg cacaaatgtt 2820
acctaaacaa tttcatgtta actttagaga atgaaaggtt aggcatgcaa ttttactctt 2880
atgactaatt agtattttag actgtgcaat gacaagataa ttgtctaatt tatataacta 2940
aaatttgtaa tatattaata tattttaata aataaattat attataatta aatttaaaat 3000
aaataatatt tttaacttat aaaatatatt ttagacttat gataaacaaa ttatatagtg 3060
ataacagatt tctattttga gcacatgtga ctaattattg aatcatctta aaatgcatat 3120
tctagttcaa tttaatttga atcagattga tattcgagat aactttttca attttcagtt 3180
tatgtagtta taactttgca gttcaattat cacaatgtgc ttctgattga atatgttgat 3240
gaacacactt caattatagg aaacatggaa aacacaagtc ttttctctca tttgtttctc 3300
ccatgaaatc tctgtagact ttttccaagt cccactcctt aaaaaatgtt gtcgggacaa 3360
acttgttccc cagatttaca gtcaaataaa tacgatcgag tttggacaaa caaggatgaa 3420
gaccagataa actacctcaa cctcatgcca tgcatgattt ttttcttctt aatagaaatt 3480
ttaataatca aattgatgca cagactattt tttcttcttt ttttttttac cactttagtt 3540
gggatctttg atttttttta aagagattct aaaatatttt tactagtttt aatcgtttga 3600
tcagttatga gatttgttct cataaattta atatgtattg tgaattgaat tagacttgtt 3660
gcataaacag tattctttta aaataataga agttgggtga ttgaaataat cgactttgtt 3720
gactgagtca ccaacatgtt cacgttaagt tttttaatcg tgaaactgac gcgcatggaa 3780
gccaaacacg tgcatgtaca tttacgagta aaaaatggat gaatctagaa tgtcgttaat 3840
ttagacaaag aggaaatttg gtagtgtttt ctgctattac acaatctttc caaagaaaaa 3900
ccttcaacaa tctattttgt cttcatcata tatataacat gagatattga ttatccttat 3960
ttttaatcaa ttaaatcact taattttttt taaaaagtat ttttacaatg ttgataaaat 4020
cggcctgccc aattcctcat atttgttttt tactcgatta attcattcat tactggttca 4080
agtttattta tttaagtaaa taaataaatt taaacttaaa attaaactta tttaaatgaa 4140
tggaacccaa gctttgaaaa ttcaacatta tataaagatt gatgaatagc tcgtttatgt 4200
atatataaat catgtttttt atgaaaataa ttttatctct taaaaataag ttaaatagat 4260
tattaagtat gttttctatt aatttttaac ttcacttatc acatgctaga ctcatttttc 4320
tattagtaga taattattaa aaattatatt gataaagttt aaaatttatt taagaaaatt 4380
ttcataaaaa aataattaag ctataaatga gctaaataag tcaatctaaa gttttaatat 4440
ttcataacaa accaaatcca aactttctac aaggctagat taaataaata aatcaagctt 4500
gagtcattaa ttttttttcc cacaaacata gtccaagttt caagagctca actggattta 4560
cccttattta catccctagt gttaaatatt tgaaagaaga gtttatagtc tataataatc 4620
ctataaagtt tgaacaaaag gtggtctaaa taataatttt tccaatccct tataattaat 4680
taacgagtcg tttgttatga gactatttta gtgattttga taaaaaaaaa atagcttatt 4740
tactttttga cgcaacttat ttactaagaa agataactta tgacaactac accaattcca 4800
tttataattt tttttggtct gtaaatcaat caacaatgaa tgccaattag taaaatttga 4860
cgactatgac aattccattt gattctgtca accaacagtg tacatcaatt gttttaattg 4920
accattaatt atagtagatg gaaaaagact aatattttaa atgaaaaaaa atttaaaaat 4980
ggtataattt tttgaataaa gtctctgtcg tatacacttt tttttggaag aaatgtctta 5040
tacatgcatg gttaataatt gagtcccaat taacgtattt aagagactct ctattttaag 5100
gtaaagagat cataattatc ataacttttt ttaatgttat ttttacacaa actaattaat 5160
atatttaagg gactagtatt attttggact aaatttatta tgatttaaaa gtaactttaa 5220
atctaaaact taacataaaa tcttaaaaaa ataaaataaa agttatttgt ttttttaact 5280
aaaaaatatt tttataacta aaaaaaagtt ttttttccgg tcacaccaat ttattcaata 5340
tgaaagtaga aagaaacaaa aaatataact tgtttttaaa atttattttc cttatttaaa 5400
aaataagtat ttttattttt tttgctacaa ttttaattaa cctagctttt tttaaatgaa 5460
aaaaataaaa atgtgaataa ctattttttg gtaggcgaaa aattaggaat aagttgaatc 5520
aagcattact ttaatatttc acaaaaaaaa aactttaatc tcttcttgaa atgcaccaat 5580
ctctccctta cagtgaaaaa aatatgctta aaataaatat aacatgtctt aactcttcaa 5640
ataaatatgc ttaatgtgaa agtttttttt tccgtaaaaa aaaaaaaact cttaataaac 5700
ttttcttcgt acaggcaatt ggaaattaaa ctcaaatcaa tctacttaac ttaaaaacat 5760
gatttattgt ctttaataga tttgactgtt tttcgaacca ccgacatcta acagagaaga 5820
atagatcaag taatgataaa ccattaataa cattgaatta agtcattaaa agtaagtgtt 5880
acgtactttt gataatttac gaaatttaaa accgtatttg aaccgaaatt atgataatgg 5940
catgaagttc atccgtcata ttaggtatat ccttttacat attttttgac ataattttaa 6000
ttatttaacg attgtgtaaa attttctgac aaaaatatat ttaaattatt cagtaaaata 6060
ttttatatga gacttattta acattaaata ttaggtataa aaaaactgtc actgtggatc 6120
tattaattaa ttagtgattt taaatttgaa aattttaaat caataaatat tgataagttt 6180
ggatggattg tttattctaa aaatctatga aaatataatg tttttgtgta tacattttta 6240
catctatttt atttttataa ttgcattcat aagttattat tttatcttta taattatttt 6300
cacaaatcat tcactatatt atatttattt ttaattaaaa aatatgaaaa tgcagtgaga 6360
catgaagtgc ctattttttc cttataaaaa taaaaattat aacttgaacc gaattaatct 6420
aataagattt gagttactta ggcagagtta taaagccact taaataaaat aaattaataa 6480
ataaatttaa cattgaatta agtcattaaa agtaggtgtt acgtaaaatt ctatgacaaa 6540
aatacattta aattatttag tataatattt tatatgagac ttatttaacg ttgaaaaaaa 6600
tgtcagtgtg gatctattaa ttcattagtg attttaaatt tgaaaatttt aatttattga 6660
taagattgaa tgaattgttt attctaaaat tctataatgt gaacatgacg ttttagtgta 6720
tacatatttt tatatttatt ttatctttac aactatatta gtaagttatt attttatttt 6780
tataattatt tttacaaatt attcactagt attgtctttt attttaatta aaaaaaaagc 6840
atgaaaatac agtaagatag gagatactta ttttctcttc ataaaaacaa aaattataac 6900
ctaaactgag tcaatctaat tacatttgag gtagtttgat tggattataa agccacccat 6960
attaaataaa ttaataaaca cataaaaaat agaaaaataa atattgatgt aaaattataa 7020
taaaagaaaa ttttctgaaa aaaagttgaa atgaatataa tttattagta ctttgttttc 7080
tgattccata atcctatcca tccactcccg agaaacccaa tcatccgcac cgtccaatcc 7140
gcgcgtcatt gtttatttat gacgttgtcg ttctgatcca tactctcaat caatatttaa 7200
ttcccttatt ttttgcgtgg cggagaaaca aaatctgttt gcttcaaagc caccacctgc 7260
cggtgacgca cccgctcgtg acggtagcgc tgcccttaac gttttccgac acaagacgac 7320
gaacgcctcg ttcaattctt cttcaaccga catttttgtt tgattcgaag attcgcttct 7380
cagttttcgc gggcgattct caaggaaccc aaggagatag cgctggatcg agaatctcga 7440
ttcggttatt tgcgatttca cgctttgatt tttgcgctat tcagcatacg cgttttttca 7500
gttccgattc tcgcgctttc cgacaagttt actgtgctga tacacggctg gaatttccga 7560
tttcattgca atcatgactc aggttccatt tttaattgct tttttctttt atgcgtttga 7620
ttgtgttagt ttctgaatct gaatgtctag ggccatggtt tgtggtttct gaaatgatta 7680
taattttttt tttttatcaa atgttaattg ttttgttagc aataggaatc gaacctgcca 7740
ccttttccac ctttccttct ttcttaacca cccaaccaaa cttatatctt catgaaatga 7800
ttataatgat ggtgtttgat catgattatg atgatgacga tgaatatgaa tatgattatg 7860
atgatgacga tgaatatgaa tatgaacatg attacgatga tgacgatgat tgtgattatg 7920
atgatgtttg attattgttg taatgatgat gatgattgtg gcaggcggtg gaggtgctga 7980
atcggtatgg gacggatctg gtgggggagc cgagaggttc tgattctgag tgtttggcgg 8040
gttttgagtg ttttctgaac attgtgaggg cattgggaat gggatcgtgc atctcggagg 8100
ttggagctgg tggaagttcc cctcctcttc ttcctttttc gcctgaatca aacatggatg 8160
gtgggaagag gaggaggtta aggggttcct cttcctttga tttcaaagtg cctgggagga 8220
tgttcttgaa tgggtcaagc gaggttgcat ccatgtattg caagcaagga agaaaaggga 8280
tcaaccaaga tgctatgctt gtttgggagg ttagcctgcc ctcccccctc tcagcatcta 8340
ttaatgttgt ttcgggatat tgtctttttc attacatttg tatgattgta tgcacattat 8400
gtggtttgca gtaatagaaa tgaaggaagt ttaaaaggaa tcaaagttga gtaggtattc 8460
tgcttttgtc ataagttttt ttattttatt ttttaaatca ttgaattggt tagttatgtc 8520
ttattgttta gcatatcttt cagcttagaa caagtttaca tgatttagtg cttaaatttt 8580
tatttttttt gtgtgtattt ggaataaata tgagctgata tgtggagcct tgaagtaatg 8640
agtatgctat tacctttgtc tgacctttac ctctgttcat ttcttttcca aatactcttc 8700
tcaatcttct taggttgtta gtagtgcctt gtcatactgc caatgcagta taaaatataa 8760
ataacatcct ccctccattc ttttctaata gatcattgtg ttctccatct cttcccactt 8820
cagcatagtt tgaatgagat acatcaattt tacaaaacaa tagtttttgt tataatgtcc 8880
tacatcggcc aagaacatgg ccaaaatact ccttataaca gttgaaaaaa tcttctttcc 8940
ttgagttaac ttttggggtt gagttaaacc taacccattg ctatagtttc tttattctct 9000
ttctcttaca atttgagtct tcagatgtgt actcacagtt ttgttgtttc agtttgcact 9060
aacgttaatg atctagatat taataatgtg tacaaaactt tgtctatttt ccttgtgcag 9120
aacttttgtt caaaggaaga caccattttt tgtggtgttt ttgatggtca tggaccttat 9180
ggccacaagg ttgcaaagaa agttagggat tcttttcctt taaagcttaa tgcccaatgg 9240
gatttgcatc ataagaatag agatggactc agtgatcata gcagcgccac aggaagttat 9300
aaatctgaag ggaatggatt tagactggtg gatgagaaaa ctagtcccac tgatcatgaa 9360
cttgatgaaa cagatactat tttgacatta cgagaatctt ttttgaaggc ttgtaagatt 9420
atggataaag aactgaagca tcatcctgat attgactgct tttgtagtgg gactacagca 9480
gttactttgg tcaagcaggt aagaaatata aattacaatg taatgttctc ttgattattt 9540
cttatttgct ttttacatgt ggtttactga tgttctttca ggggctggac cttgttattg 9600
gaaatgttgg tgactcgaga gctgtattgg gtacccgaga tcatgaggat tcccttattg 9660
ctgttcagtt gaccgttgac cttaagccaa atcttccaag tacctctctt tctctcttct 9720
cccctccatt cccccctcca ttcccccctt gtgtgtatct tctcaatgaa cttgataagt 9780
tggagaactc catctcctta ttttatttcc cttgaaatat tgaatcaata ttgccagctt 9840
cataattatg atgtgagtga cagtgcttgt ctgatttaga taaatgaact tgataagttg 9900
aagaactcca tctctttctc ttttctgttt tgattttacc ctgtgtcttt gggagattta 9960
aataggtttc cctctgcttt atggagataa tctctatttt ttttatcaaa caatacaaat 10020
tccctgtagc tgaaacctta cttttttctt tgtttctctg atttattata tctaacttca 10080
atgccttttt ctcttttgtt ttagggcctg tttggataag cttctttaga agcacttcca 10140
agagaagaaa ataagaagaa aataatgatg agtttcttca taagataaaa tgagttatct 10200
attagctacc cattaactaa tttgtagaag ctctctcata tagcttctct aaaagatgag 10260
aggacgtcta caaattagct aatggttagc taatggacaa ctcattttta tggaaaagct 10320
catttcattt ttttcttcat atcttctcct aaaagtgctt ccagagaagc ttacccaaac 10380
ggacccttat ccaatatatt tcattggttc ccttttagaa caacttgact tttgtgagac 10440
aaatgttttc aggattggtg aatctatatt ttcattgtat gatttaataa actctgtgac 10500
ttggaaattg gaatttattt tgatttttga tacatcagtc agtgtggcat atctatatgg 10560
gtatgaatgt gtgatgtaaa gttgttttcc cttaggggaa gaagagagga tcaagcttcg 10620
tagaggaagg gttttttccc ttcagaatga acctgatgtg gctcgagttt ggctgcctaa 10680
ctctgatttc cctggtcttg ctatggctcg ggcatttgga gatttttgcc ttaaggactt 10740
tggattgatt gctgttccag atatctcata tcaccgcctt accgagaagg atgaatttgt 10800
tgtgttagca acagatgggg taaggcctta tgaggctctt ttcttatgat atactgtctt 10860
ctatgatctg catgtgttga aattgattca tttcaatatc atatttgtag ttagccaatt 10920
ctaaaatgaa aatatgaaat tgactttaaa tagtatttga atgccacttg caacagttaa 10980
aaaaaccaaa tttggttcta atttcactgt atttaaattg acatcttact gtttaagcta 11040
actacttatc atgtaaaact tattattatg agttaactac taatgtaaat gatgaacaca 11100
aacctaatat caaaagctgt atcaatatat attttttgat ccagttgtat ctcaaaccca 11160
tgttcatata cacagataca catgttattt ctattctctt tcaaactgga atttgtaaat 11220
tgttgagctt ttggaaaagc ttgttcttta catcaatata gcgatttacc cttttctttc 11280
gcctctcctt tgaagttgta actctaattt ttctcttatg gtccatatta tgttgtaact 11340
tgaaaattta tattctctga attgtcttat atatatatat atataatata tatacaaata 11400
catacttgat tagatggaat attgaattat tttaaactgt tggattcttg ggggcagatt 11460
tgggatgttc tgtcaaatga agaagttgtg gacattgtgg catctgctcc acagtctact 11520
gctgctagag cactggttga gtcagctgtt cgggcatgga agacaaaatt tcctttttgt 11580
aaggttgatg attgtgccgc agtttgcctc ttctttgatt ctgattcaga tttcaagtca 11640
acagatacaa aagacaagtt aataccggag gcatctattg accaatctga gcagttagct 11700
ttacttggtg aaaagggagt tggaaatgaa gctgaaaaaa agcagcaata gcgcaagttt 11760
tgtaccatgt ctctcccaag ccttgttggt tttatcgaaa aggttgggta aattgtgccg 11820
caacagtcaa aagagaaagg aggatcatta ttttgatgat ttttcggtag ttttctgcca 11880
atattctttt cattatttat ctttcatttc cttcgacagc atttgaggga agagggggtt 11940
atatatatat atatatatat atatatatat atttcttatc tggaggaaaa ggggtaccgg 12000
gctttttttt ttgttgctgg aggtcatttt ccttctctgt atatttggta gatttggagt 12060
ttttgtaaat ccaactctct agattcatat tatatagtct gttctgaagt ctgccgtttt 12120
tcatttgcat cattcttagg ttatagtttc caatttagtc tgtgaaaaca tgagaactgg 12180
aaagaattgg atttatttct tatggacttt cgagtcaggt ttttgtacct ctgtgttgtg 12240
ttgccgtcag ggattaatga tattgtctgt gtgatcctat tatgggtttt gtgtggaaaa 12300
tttactctga cggaaatttg tctttaagct atacgagtaa aactgtattt accttttgat 12360
ttaaatttta ttatttcatg attttaactt aattttgaga aggataaatt atttttaaaa 12420
aaggcttttt tgttaaggga aggtgtccta agtactaacc cacgaaggaa tgagggaagt 12480
gaggatggta acatgtcaaa taaatttgga atttagttcc cgaaattttt gagtgttaat 12540
tattgtagga atttactcat ttcatgataa aacttgacat ggagtaccgg acttaaaaaa 12600
gaaaaacatg acatgaagtg gatttggagt caagttttct ctcaaggcaa actggattta 12660
ttctccgtac tcacttatta aacaaggtta aaacaattag gtttgattga cattttggcc 12720
ttcagggttg tctttataat tttttcatat acgaaaaaag ttataagttt taatttctgt 12780
acacacatat aagttaagtt ttgatctccg tgatcaacgc agctagtatg tatgtggcac 12840
ctattcattt gctttactga gccttctcaa gtgtttgttg tccacgcctg aatataatga 12900
tttattcaag aaaacaacgg attgaggaag aactgaagaa ggtagcagaa tggttgaagg 12960
ggaaaaatta cctggtgatg cttgatgaca tatgggatga ggttaaaggt gcatttccag 13020
atgaccaaaa tggtagcaga atactaataa caaggaggtg gcatactatg tacaagaaca 13080
attttcaata ggatcatctt agaccttaag agcattgacg taaagataga tgacgaagat 13140
caagccatca ttctgttgag ctttcgtcct aagccatttg atcattttgc tgatacaatg 13200
ttgtatagaa aggctactct atcaatggat gaggtcaagg ctgctttgaa ctcaaaagaa 13260
aatcaagggg agaatgactc tggcagtaaa agactctttt ctactttctt gtgctgatgt 13320
cagttttttg tctccttttt tctttcatgg tcattattgt gctgatgttt taacatcatt 13380
tacatgttta ttgtaaaagg ctctttgctc tggcagagtt tgatgagatg atttgcaatt 13440
cctctgcttc tttctattca cttttctgct ttcttgtgtt ccacaaccac ttgaccagat 13500
ttttcagtta gcttagcatt taagcctgag aaattatgca tcatttcatt tgtttgttgt 13560
acaaccatat ttaatgttaa cctctctccc ttgtttttcc attctaaaca tggatcatgt 13620
ttttgtttat tggtctaaag tgttgtttca tgttattttt ctttctcttt tcccaatgga 13680
aggtcctttc atgatttagt tagaatagat aactgataac acaattagtt ggaaaggaag 13740
atgttagagt gtatgttgat aatgggagac aaatcatagt gatcagtttt agaattggag 13800
tgaaagcata cagacattgc ttttgtgcct tgtctctgct actctaccca aacctttgct 13860
ggttttatca tggatataat tcattatttt atgatctttt tggtagattt tctaccaaaa 13920
ttcatttctt cttttcggtg atgctatata gtacgaatta gttttgcacc aagaagtacg 13980
aatccacttg gcaaaatatg atcgtacaaa tattaatttg aaagaataaa atctagacat 14040
gcaagttcta actaccctct ttcaaactgg aatttgtgga attgttggaa ttttggaaaa 14100
gcttgttctt tacatcaatg tatatattct cccaaattgt cttacaacac aaaaaaactt 14160
gagtattttc ttacatatta tctgcctaca tttttgcgct taactggatt atggaaaaat 14220
aatttgctaa tgagatatac taggacagat ggatgaaaat tacaccaact tttaacaaag 14280
gtttaaatac agtttttttt tatttataat ttatcatatt tttgccttta gtctttatat 14340
ttttttttgt ttttaagctt tgtaaattat atttatttta tttttaattt ttaaagcacc 14400
ttaaataata ttttgacaag tgaaaaaaag tgttatctaa aatgttagaa cgaaaaataa 14460
aaaaatataa tttataagga ctaaactttt tttacaaaaa aaataaaaaa aatactaaag 14520
aataaaaaaa tatttaagac aataacaatt tgctgaatac aacagaaaag ttagttagaa 14580
cacaataaca atttttaaag attattgtta aagactctgc attttaaaat tctaactaat 14640
ttttgtttct aaaccatgga agacttttat ttcataaaca caataacaat taaacaaaac 14700
tcacaattta aaaaaaaatc agagtcatca aatatattaa tatttaaaga cagaaaaaaa 14760
aataaacaaa taaagttgag aaagccaacc tataattaaa aaggttgaca gaaacgcggg 14820
tccacgcgta tgcgcgttct ttccctttat tggcgtccac ttgttatctt tcgttctcta 14880
ctctgtaaat tatctgtcca caaactctct agagtttcca cccaagattt cctgtttcac 14940
agaaatggca gatagtgttg ttgcttttct gctagataac ttgtctcggc tgcttgaaga 15000
tgagcacaag ttgctttctg gcgtggagga caaagtcaac tctctttgca atgagctcaa 15060
gtttatacac atcttcctca agaattccga gggcaagcgc agtcatgaca cagtgaaaga 15120
agtggtgagc caaatcagag atgtcgccca caaagctgaa gatgtggttg acacctacgt 15180
taccaacatc accaggcata aacagagaag caaactgagc aagttattcc acctcaaaga 15240
acaagtcatg gtgcttcacc aagtcaactc tgacatagag aagatcagga gtcagatcga 15300
tgacatctat aagaacaggg acagatatgg cattggagaa ggtgaattcc gaagcgaaga 15360
agctgctgca gaagcagaat cactcctcaa aagaaggagg gaggtggagg aagaagatgt 15420
ggtgggctta gtgcatgact caagccatgt aattcaggaa ctcatggaga gtgagtcacg 15480
tcttaaagtt gtttccataa ttggaatggg agggttgggt aagaccactc ttgcccgtaa 15540
gatccataac aacaatcaag tgcagctgcg gtttccttgc cttgcatggg tttctgtgtc 15600
caatgattac agacccaagg aatgtcttct cagccttctc aaatgctcaa tgtcatccac 15660
atctgaattt gaaaaattaa gtgaggaaga actgaagaag aaggtagcgg aatggttgaa 15720
agagaagagg tatctggtag tgcttgatga catctgggaa acccaagtat gggatgaggt 15780
taaaggagcc tttccagatg accaaacagg tagtagaatt ctcataacaa gtcgcaacaa 15840
agacgtggca cactatgctg gaactgcgtc tccctacgac cttcccatcc tcaatgaaga 15900
tgaaagctgg gaactcttca caaagaagat ttttcgaggt gaagaatgcc cttctgattt 15960
agagcctctg ggtagatcca ttgtgaaaac ttgtgggggt ttaccacttg ccattgtggt 16020
tttagcagga ctcgttgcca agaaggagaa gtcacaaaga gagtggtcaa gaatcaagga 16080
tgtgagttgg catcttacag aggataagac tggagtgatg gatatactga agcttagcta 16140
caacaacttg cctggaagat taaagccttg ctttctgtat tttggaatct atccagaaga 16200
ctatgagatc agtccaagac aattgatcca atattggatc gcagaagggt tcatacaacc 16260
acaaaaaact ggaattgcag atacaacaga actggaagat gtagctgact tttacttgga 16320
tgagctggtg gatcgcagct tggtgcaagt ggcagaaaga aggagtgatg ggggtgtcaa 16380
gacatgtcgg attcatgatc ttctacgtga tctttgcttg tcagaaagca agtctgataa 16440
gtttctggag gtttgcacaa actccaacat tgataccgtc agtaatacca atccccgtag 16500
aatgtccatc cacttgaaag gagactcggg tgtctctgca aacacattta acaaatcatg 16560
cactcgttct atgttcatct ttggtagtga tgatagaatg gacctagttc ctgttttgaa 16620
aaacttcgag ttggcccgtg tgcttgattg tgattcgttt attgggtttt cgtcttatcc 16680
agtccccaga gatttgaaga ggatgatcca tctaagatac ttgagaatat gcgtcaagca 16740
ccttccagat tgtgtatgca gcctttggaa tctagaaaca ctggatgtaa catatgaaac 16800
cacagtatcc agtaaaattt ggacgttgaa gcggctgaga catctttatt tgagtggggg 16860
agggaagtta ccagtcgtcc tgccaaaagc aaatagaatg gagaatctcc aaaccctttt 16920
gttagatggt agctatggta tagacacgta tccacaacaa gtgatttccc tgttgaaaat 16980
tgacatattt cctaggttgc gaaaattagc tttgcgctat cctgatggac cagatatgtt 17040
atcaagtcta caccacctca gcaatcttcg tagcctaaaa gtaattcgcg gttttgaact 17100
tccatcagac accaatgcgt ttccatcaaa tcttaccaag ataaccttag cagcagtccg 17160
ggatttacat ttcatgaaga cactggggca acttaccaac cttcaaatct tgaaactaag 17220
attcggcaaa gttggttttc atcttgatat tggcagggga gagttcccgc aacttcaagt 17280
gcttcatatg acgcaaataa atgtaagaca atggagatta gagaaagatg caatgcctcg 17340
acttcgccat ctggtcatta atgactgtga agaattgtca gagcttccag aagaactttg 17400
gtcaatgact gccttaagag tggtgcatgt ttcacggccc tccgaagaat tggctaacag 17460
tctcaaaaat gtggagccca ggaatggctg taagctcaaa atctctaatg aactgtgaaa 17520
ggcaagtggg accgccttct tacattgcag acataagttg tagtctttca atatccttca 17580
taatatttgt tttttaatcc cgaccccatt tccattttct ttgtccaaat aaatttccaa 17640
tttaaaatag cggatattca aattgagaat ggatgttgct tccttgccgt gtatggagtt 17700
gtgtctcatg attattgatt acatatttat aatacctaga gtttcttttc tatttgtgaa 17760
taatatatta aattaagggg gtgtcatgta aaagagaagt ttttttttcc ctaaaaatta 17820
tatattaaaa aatttatttt ctcatatttg atatacattt ttaaaaataa atactaatgt 17880
aaaatgatat tttttgaaaa tatttttaat caatttctca tgaaaacttg aatatttatg 17940
tatatgtata tatatagttt aactatattt aatcttgaat tactaatcat tcctcacagt 18000
tattatacac tacaaaagta atcctacgat taattaactt tatcatagta atcatagcca 18060
ttgaaaatta accatattcc tttacatcca atcaaaagaa ggagaaaaaa aaacaaattc 18120
ttttagcacg tttaaatgtt aaagctaatt attcaaatga ctaagaagaa aaattataag 18180
ctccaaagta aaacattgat tatcaaatta tcctatctaa aactctaaag aagttatgtt 18240
aatgttaaat gaaatattca ttcggcccaa ttgttaaaaa aaatcatagc tgtacaaatt 18300
agagaaataa gatgaaaagg gagagaaata tgaaataaaa tagttaatgc aatacaaaga 18360
gataaagaaa aaaaaatgaa ttgtaaaaaa tgtaataagt atttgttgta acaatattat 18420
aactcttgct aaaaataggt caaacaaatg gagtcaacca gcacagaaat gctctacaat 18480
aactaatgtt aaatatttgc aactataact tcaattccgt gcgtgacttg tatatgttaa 18540
ttatacattt ggcattgaga tccaagctaa gtcaaaaatc aaagtctaat aacatataca 18600
attggtggta agattttgca atttacatat tcaccatggg aattgagaag aaaaatttga 18660
cccaaagcga aggttcccaa tggtcagtgt cctagttttc cttgaagatt acatttataa 18720
atcatggaag ttcctgaaaa gtcaatttct cacatagcat ttttttcatg ttctttctat 18780
tttcaaatcc tttgaccata attttgactt tgatatatgt atttgttgct tcatttcaat 18840
atacccattt atgaagtaga gcaagtagag acaaaatcat cacccagttg atgtttaaac 18900
cacaagcaaa agaaatgtag tggaaaccaa ctaaatggac tgttcccgtt cgctcatccc 18960
tcactttaat gcttgaagaa cctgtgagat acagcataga aaatattact aatgagccat 19020
tatgcaaaat taaaggaaat aatgcaagtc atttgaattt gatttcttat aatttttttg 19080
acaattctac ccaaaccttt atataacacg tcaatcctat attatcttta attcatcaat 19140
taaacataag taagaaatct gatgtgaaac aaaaagtaag tggataaaaa gaaataagga 19200
cgacactttt acatcaaaca cctccaggat cagcatgcag atactttaaa gttttaaaat 19260
ggatcgttaa actacacaga actattcctt tctcagaatt aagaactaag ggtcaactcc 19320
gtttgagaaa aatgttttat tatttttcat tttcaatttt cacaaaaatg ggagagttga 19380
gacaaatgtg aaaaaaatac taaatttaca tgttctatta tagatgtttt cacaaaaatc 19440
tacaaatgtt ttatattatt catttatatt atttaaaata cagaagatta taaagaacta 19500
ataatgatac ttacagttgt actcagtcca tccaataacc tgattttcaa ggtcatagat 19560
gtattacatg ttctattata gatgttttca caaaaatcta caaatgtttt atatcattca 19620
tttatattat ttaaaataca gaagattata aagaactaat aatgatactt acagttgtac 19680
tcagtccatc caataacctg attttcaagg tcatagaaga caagtttatt tgtaagcact 19740
aaatctgcaa caaataaaaa tacaggtgag gctgcatagt aaggtcatgg aaagcaagct 19800
ttctagtgat ccaaagttgt gataactcca ttataattta catctagaaa aaatataagg 19860
aaatttcttc caccagtaaa aataatacat ttattataat atttagcttg taagtttctt 19920
ccaaaacaag catggggcca cttctctcca taaaaaatct caagaccaat aatatgctac 19980
aaaactttca ccagcaaatt gcaaaaggtt gtcagaacct acattcacac ctttaagccc 20040
cctatcaatt aatcatcata tctttgacca gattaaataa aaagtaaaaa agaaaaaaca 20100
gaaaaaggcc cttctcagct aaatcctcgt cttttgcttt agaaggaaga tttaggatgt 20160
agtaatcgaa agcaaacttc tactacctct tgatttagga acttgtatca aaaaatacag 20220
aacacagccc aatttctttc aaatctccag ttaagatact cacaagatcc tatacaaatg 20280
tattccagga tatgcattta taatgtattt gtcttgttta tttaagaact cagaagtaat 20340
caggttcaaa aatatctttt atctcaaaat gccattaaaa aagtaaccct ttctttcctc 20400
ttataatggc tacggcagtc tcattctaaa tctggaagca gtattcagca aattggtggc 20460
aaatatatct atcggtacag aaaaggattt gaagagaata cctcccaata aggtcatatt 20520
tttgctatct cttgattgtg tcccactatt ttgccaacca atacaccaga aatctccctg 20580
cagatgcaca ttagtatttt atttatagta tggtatataa agattatgat catagaaatc 20640
attgacataa aaaagaccag ctcagtagta gtgcacatta ataaatgagt cttttgaaaa 20700
atcattttaa aactattgcg agtatctaaa attacaaaaa gaataacagt ttataaggtt 20760
gaaaatacga aaagataata tttggtgcat ttgcaaattg caactccaga atccattctg 20820
gaactcaaaa ctaatttgaa gcagatggga tacaaaaggt ttttaaaatg cattgtgggc 20880
actttgggca gaagcaactt tttattactt tagcccagaa tacagttagg ccaagatgca 20940
gttggtctaa tatatataga gagagaggag ggatcaagtt actttaagag gaactctttt 21000
aaagttactc tccatcctca cactgttcat tctcttgaaa cctaatagtt gtaatgagta 21060
attaatctta atcattagat tttaaggaaa tgaatggtga agatgaggag taactctctt 21120
agagttactc ttgaaactct tgaagtaact tgattcctct tcatatatat atatatgaca 21180
tagaaggccg acaacaggtc ccaaaacaag ccaaataaaa ctcggctaat cataacaaaa 21240
cacacaaaga tataatgaga tttgcaatat acttacagac ggaaataaat aatcttgtgg 21300
ataaaccttc aacgagagcc cattttcaaa ataaaatgtg acagctggaa atccatcatc 21360
aacactgcaa cataaaataa aataaccatt acacccctac atgaagctga taatacagac 21420
ataaatgcat aggatatgca aagggagcag tccagttatc aaagcactcc aacaatacat 21480
actcaataag aaagttcata gaacaaaacc tacaaaatat tataacttaa tttcaaaaag 21540
agtttttccg attatcaaat taagatttca aatggcaaat attttttgtc cacttatcaa 21600
acccatagtc aaaatggcaa gatttcctag acaattcctt taacatataa tgtagattac 21660
aatttacatg caaatgtcgt tattactatt atcaagaaaa gaatttatta agacagaaaa 21720
aaaagatata gagacaggat aagaaatcct catggattac agatgacacc actaaaataa 21780
aaggaaaaaa gaaacaaaaa tcaagacatt tgcaacacgg caaaccaaca aagagcataa 21840
aaccataaac cagccactac agattaagta acaacattaa catgatcaaa taaaaatcat 21900
aaaacaatat gtgaaccgat actgtaaaac aagcaacaga attaaaagga aaaaatttca 21960
aagcatacat tcattactgc atactacagt gaaaatagaa aaaatatata acaggaagat 22020
aagacatcta ccaaaataaa aaacaaagtg agagagtgaa tagtcctatc ctggaaaact 22080
tgctatgcca tgaaaaagtt acttgaagat ccaggaatat aacctcaaac accaaccact 22140
acagatgtca ttgctcatga cagcaagctt aaacaatgcc aacatggcat tcaattgcca 22200
tattgaagga tggtgactaa tttaaacaaa taataacaac aaaacaatga aatcagtgag 22260
tgaagaactg agttgatact agaggagctg gtctggtaaa cttaatggta atttcaccct 22320
gttcaaaaaa gatttctcac catacaattt tcaaaggaga tcaaagtaaa acagaatttg 22380
ccaaaagtca aaaccacttc tgatgtgttt ttgtgcagtc ttctggtttc ctttaccaca 22440
cattgctgaa ggacaattct acctagaaca gaggagacaa acactcacca ccttgccatt 22500
tttaatgtga catatgccat gcatcatgga caacacagct atgggagtgc aactgtgcca 22560
tgttcaatag catgcaaaag aagttttaga gaaagtgacc ctcaacacac ccagtatgga 22620
agcacatact tttaacaaca ttgtcaaccc tgaaccacca ttatcaaaac cacacacttt 22680
aggtccttcc ttccaaaaca aactggacta caaagaattc ttctaaaacc tgtatgccga 22740
agtaagctag caaaacactt gcgcttgttc caaccaacag caagacacta tatgcataca 22800
atatgcacgc atgcaatatg catatttctt ttcagatgtg ttcaagaaag aaaagattat 22860
gttagcagtt aaacccccag ttatagtagc aatacagtat atggattagt taatatgaat 22920
gttatgcatc ctacctctca gaatattgaa aacatgtata ctcgtcatgg agagtctgaa 22980
cttttagatc gggttgctga gaaattatct aacaagagaa agcaattcag acaactgcaa 23040
tgtaaattta gaaatttagt aatttgcaaa atttaagatt tttatgtacc ttatatacta 23100
gcggctcata aattccttca ggcagatagg ccaaggttgt accactgtca attattgtcc 23160
cttttctgtc tccttgtgtt gatgtatctg ttgatagact aaggaaagca tggccaactt 23220
gaactgcagt catattaaca ctgtagtgtg gcctaaaaaa ccaaattttc aaatgtcata 23280
ttctctcaaa atatggattt ttgtaaacca atatctgaat agaagagaga ttctatcatt 23340
aagatctcat agctaaggct atgtttgacc cagcttattt tttgcttaaa agctacatta 23400
aagttaaagc taaaataaaa actttaaaat taaagtagaa gttgtttggt agtcttagct 23460
taaaaactcc ttttaagata aaagatttgt ttcaactagt tacggaagaa aagaaggagg 23520
gaagatatgt ggctaatttt aaaaagctac tttagttagg gtttttttaa atgctaattt 23580
tctccctttt catttattta atggtcctca aatattaaga gtttttctct aaatgtgttt 23640
ggctcagttt ctccttttaa ggagaagaaa aaggaaaaaa gagccgggcc aaacacctac 23700
atatgtggcc tagatactac ttataatgac ttgggcaagc ttccaaggtt gattcagccc 23760
cagtctgata tcaattctag taaaagtaaa caaaactatg agtgcataaa caaaattgac 23820
caacatccag catatagaag catccagcat ggacatgaaa atttaacaaa gatatattgt 23880
tttttcattt agaatatagg ggaagaaagt gctgactttt atggttgaaa accactgaaa 23940
tcctaccgcc agcttcaact aacatgagtt cactttacat tccaattaca gtttacacat 24000
gacaccttca gcttcaaaga atcttttaaa ccaaaatttt aataccactg aaatgatgac 24060
ctcgttagcc agttgaggcc tacattccat ttagagtgta gatgtgttga gacatgtcac 24120
tgatgacttg agaagaaacc attaatcaat actccccctg gactcatata taagcaaaaa 24180
agtgatcttg taagttggac ttaaatataa gcaaatctaa ctaattttgt cttatttaat 24240
gctatcattc ctaaaacatc cctcatttaa ttgtaattct attttcaatg actctttttt 24300
attcatgata gcaagttcca acgaaagata ttttagaaat aaccttattt tttcgcttga 24360
gattagtaaa attaaatgat gtcaactaat tttctaaatt agtgtgaaat tagttatttt 24420
tgcttatata tgagtccaaa gggagtatct agcaaggaca ggctagagta gagcttataa 24480
aggcttggga aatcctcacc tcatgggcta gttcttgggt taatttagcc caaattcaat 24540
agaagctaca tgttttatta tatcgtaaaa cattaaaata tttgcacaaa aaataatgta 24600
gtcactaaca aaaacatgat taaaaaaaaa ctagaacaaa cttatcttca aaagagtaat 24660
taataacact ataagaaaaa ctaatctcat tctaaagtgt attaagtgaa tggcatactg 24720
gtctggtaat aatggagtca tgttcacttt aggttgcaca acatgcccaa tagcaaatat 24780
accacctcca tttactccat ttaagcaatg agcaaacatc tttttcactt tgccagaaga 24840
agcaagttgt gaaatcattg atgaattagc ttttccaaat ccaagtattc caccaagtgc 24900
ctcttcattc gaagaactta gatctccaga ttgtctagca ccacaactac aaaacagcaa 24960
aaaactcatt ttaaatataa aaagagggag aaatatgaac caaaagatgc atgcaataga 25020
caacattaaa ttatcataca caataagaat caccgagaaa ccattataac ctgaatgcct 25080
ccaaaatcac atcaagctgt ttgagtatta gaaaaaggta tttctaggag tgttccatat 25140
gataaggtgt tctattcact gcctcaatat ttactaaacc atgttattta cagcatgttt 25200
ggtaaaactg aaaactttag cattggaaga ttataaattc aagcgctgat attgtgctaa 25260
aggaagctat tagcatttaa catacctaac aaagataaaa caaacgaaat tattgtccag 25320
gaaatagttc ctgttgatac atcactgact gcacaaatgc tgaattattc aatatttttt 25380
ttacataaat ttatttttca gattgagtag ggttcaagct tggaacacaa caaaaggagg 25440
actgcaagaa gtacaagcct atatcaatat caacgtcagc agtctcactc tcaatcttac 25500
tcaaattggt agctgaccca aaccaatatc aaaatcaagt attttttcag gctccaatat 25560
tagttttggt gaggagttgg acgcaattta tatacttcat aatgaaataa aaagcatact 25620
cgacagtttt tgaaaagcaa tgcctgcaca ccagtgcacc cactttatgt taatatcata 25680
tgcagatatg agaaattatg ctattgcaag tttgcaacta aagcaacagg ttaaattact 25740
atgaacaaac atgcatggta ttggtatctg agttcatgac ttatgagaaa ttaatgtcca 25800
ctaacagcaa cagatcaaaa gtaatagaca tacacaatac ataatagcac acattactgc 25860
caaaagaaaa ctcacccaaa tacaatactt ccatttgctg aatcagtttt aaggtcccca 25920
gacacttgat cataaagtac gatatccttt acaaagtaac cagcagtcga gctcccatca 25980
ccatatatct ccagatatgg acaggaaata ttagcagtgc atccggtcag cagaccccca 26040
ttgatctctt tgcaaaactc ttgatcacag ggaacaaatt taccagagga ggattccttt 26100
atgtcgtaga gtgtaaggtc catcttcgat acacagaaaa agaaattcaa atgaataaaa 26160
acatcaaatg ttgaaatgag aaggctgtac atgattcagc catgtgagaa ttgtcttgca 26220
agggatggtc taccatggta cacgccctga tagtgtaaag gattttatac actctcaacc 26280
aatcagaaac tcccatgtaa ggtaattatg ttgaatttta tcataactca tttaaaagtc 26340
acccctagca tgatttccga ttagttgaca gtgcaaaaga tcgctacaca atgcataaat 26400
tttaaactca ggttgtaatc catcctaatt ttaaaatgca tacacaaagc acaaaaaaaa 26460
aaaaaaaaaa ctaagcaagc acgtttggca agtaatgaag ataataaggg tagcttaaac 26520
taaaaagatg agaagcattc accaaggttg cttctggtgg ggcattcttt gcactgaatg 26580
caattcaccc acataatgtc actaccttac taattatcag gcaccgatgg tattcttctt 26640
gatattggca ggggagagtt cccgcaactt caagtgcttc atatgagggg aatatatgta 26700
agaaaatgga gattaaagaa agatacaatg cctcgtcttc gacgtctggt cattgacagt 26760
tgtgagttgc ctgagcttcc agaagagctt tggtcattga ctgccttact aatggtgcat 26820
gtttcgtcgc cctcccaaga attggctaac agtctaaaaa atgtggtgct gaggaatggc 26880
tgtaagctca taatctctaa aagttgtgtt gatgaatggt tttaagctca caatcatcta 26940
gtgcttcata actgttggaa taatggcaat gcaagtgggc attgctgggt tttgttatgg 27000
tctttctata tccatcatga taacgtgcag tggttcttat cattctgtat ctttctaact 27060
ttctaatctc attgccacac gtgttgtgat tgctagattt ccattttaat ctcagttttt 27120
gtctaatttc tttttctttc ttggaccttt gttctgaagt tgtaacttta tttacatgtt 27180
gattgtaaaa ggatatttat tctggcagtg tttgattaaa tgatttgtaa ttcctctgct 27240
tctgtctatt cacttttcta ctttcttttc ttagatgacc cgatatttct gttagcttag 27300
cattgaggca tgagttacat atatgcatta tttcattcat ttgttgttca gtgtgctcaa 27360
ctatatttga ttgtgcgtta attttccctc ttttcccctt cttttcccat ccaaagtaag 27420
tgtttcgtct ggtccctaat ataaagtatt taactttttt ccattattta tcctattaaa 27480
tactctaact atatgtactt ttaggtaatt atgcataata ttgttattta tgacaagtta 27540
actatcatta ataagagtaa aattgataca ttaatttatt tatttttatt ggtatgtgta 27600
attttgttat ttttatttat tggttttggt gttgtctcac gagatgtctt tttcctggtt 27660
gaggtgtgtt tctcttctca tttcttagat ggaatagtta cttgataaca taattaattg 27720
tataatggga gataaatggt tttcatcttc tcttctcatt tctttttttc ccattcattt 27780
ttctggccga gtgatacaga ggagtaaagg aatgaggact tgtttcaagt aagagtaact 27840
ccaaaatagc aaagagactg aaaagggaat ttctgagtaa taatttctct gccttctttc 27900
attccgtgct tggatacata taggatagat ttttccccta ataacctgag gatacgagta 27960
ataaattcaa acagaattca gattctaata acaatatgaa aatgatcaat tttaggtgat 28020
aaaagtaatt actcttaaaa ctaaatggca gagctagtgt ccaacctagt ccttcgtaga 28080
catggcaatg gggcggatcg ggtacagata ttgtctcccc aatctcttac cccgactcct 28140
caacatatcc ccatacccga tacccgacag gtttgagttt attgtctcat ccccgtaccc 28200
gtcgggtatc gggtatcccc aaccccaatc cacacaccat ttagaaaaat attttttttt 28260
ttgtaaaaaa atattaaaaa tttgatttta gaaaaaaata aattgattgt taaacattta 28320
tttttaacta cttatatatc aataaattta ttataacgcg tgtgtctaca taaatagtta 28380
aaaaaataat attaaattat gtaaaaattt taaaataaaa ttaactagta ataaaaatta 28440
tgtcttttga ttaaattatg caaaaattct aaagatttta agtggcaggg cgggtttggg 28500
ttcggggtcg gaacgggtct agtaatccca tacccgtacc cgtacccgac ttttggttat 28560
tgaaaaaaac ccgaattcat actcataccc ggtcaactcg gatattaccc gtcaaagttg 28620
ggacggacac tcatttcttg tgtccttgtg tcactcttct caagcttggg tctcttttta 28680
ttgggcccaa cacttatttc ttgtgtcctt gtgtcacttg ggccaactgg cctatagtga 28740
taagacatat ttgttatgtt cgtaacacta acacccagtt tctattagaa tgctgttact 28800
tggaatttga gaaggaattg gagtgaaaaa atcttacaga aagcagcaat gacattgctt 28860
ttgatgatat tttggtagtt tctatgtcaa aattcttttt ttttctcttt ccttaccatt 28920
tgtatccttt tatagtattt ttttttcact ccatttaaca tttgttacat aaaagacatg 28980
acaggaccaa tatattacat catcagatgt ttgatagtgg ataatcaact aaagaaagaa 29040
ctaaaataat tgattttgaa aaaaaaaaac taattatttt aatttaagaa ttaaaaaaaa 29100
tcaaaatttg cattatacga aactaaaact aaattttaag cctaataata taatgttcac 29160
aaggtgacta aacgaccagg gtaagtggta actcctcctt tttggtcctc tactatcata 29220
aattaatgag cttataacta gttctcatat ggtaacaaaa agacgtaaaa aatgtttacc 29280
tttaaagctg catacatcag acggtattca acaagaaata gaaatattag cagcaacaga 29340
tttgaagtgg aatgttttga tttcttatat attcagaaga gttgaaatta aacaacttaa 29400
agcagagttc aagctcactg aatactgata ctttgtcctc tgagaagtta atctccggat 29460
gctacgcact ccttattttt ctttcacttt atgcaattta aatacctctc catttcaatg 29520
gcataattct aaaatgttca tcagataagt cctaaaagat ttcccaaatt attcttgatt 29580
cgttttcccc ggcaactagt ttattacaaa aaaaatcaca gaaggaaaag gaagacacgt 29640
gtgaatgcta ggactaaaga gtgtttgacc gttgacgtca aggtgaagtt tctcttgact 29700
tgcctcgcag cttctcaata atatcacagc tcgaaaaaga agacacaatc ggtaaggtga 29760
agtttctctt gccttgcctg gcagcttccc aactactacc aatatgtgct tatgtacttt 29820
ggtctcagta taggatatat gtgctcagtg cctcctccaa agcattaata tactttcact 29880
taccaaatca aatggatact gaaattgatg agagcattga cgaggccgat atcagatttg 29940
atgcaaggag ttatagttcc agactgaaca gtatgataag gagtgagact gagtcaattt 30000
tgggagcatc ccctgtccat gagggagcag ctgcagaaga ggtgcgccaa atcagagatg 30060
tcgcccacaa agctgaagat gtggttgaca cttacgttgc caacatcgcc aaatcagaca 30120
tggtgcttca ccaagtcaac tctgacatag agaagatcag gagtgtgctc aatgagatct 30180
atgagaacag cattggagaa ggtgaattcc gaagcgaaga agctgctgca gaagcagaat 30240
cactcctcaa gagaaggagg gaggtggagg aagaagatgt agtgggctta gtgcatgact 30300
caagccatgt aattcaggaa ctcatggaaa gtgagtcacg tcttaaagtt gtgtccataa 30360
ttggaatggg agggttgggt aagaccactc ttgcccgtaa gatctataac aacaatcaag 30420
tgcagctgtg gtttccttgc cttgcatggg tttctgtgtc caacgattac agacccatgg 30480
tatttcttct cagccttctc aaatgttcaa tgtcatccat atctgaattt gaagaattaa 30540
gtgaggcaga actgaagaag gtagcagaat ggttgaaagg gaagaagtat ctggtagtgc 30600
ttgatgacat ctgggaaacc caagtatggg atgaggttaa aggagccttt ccagatgacc 30660
aaacaggtag tagaattctc ataacaagtc gcaacaaaga ggtggcacac tatgctggaa 30720
ctgcgtctcc ctactacctt cccatcctca atgaagatga aagctgggaa ctcttcacaa 30780
agaagatttt tcgaggtgaa gaatgcccat ctgatttaga tcctctgggt agatccattg 30840
tgaaaacttg tgggggttta ccacttgcta tcgtgatttt agcaggactc gttgtcaaga 30900
aggagaagtc acaaagagag tggtcaagaa tcaaggaagt gagtaggcat cttatagagg 30960
ataagactgg agtgatggat atactgaagc ttagctataa caacttgcct ggaagattaa 31020
agccttgctt tctgtatttt ggaatctatc cagaagacta tgacatcagt gcaaagcaat 31080
tgatccaata ttggatcgca gaaggtttca tacaaccaca aaaaactgga attgcagata 31140
caacagaact ggaagatgta gctgactttt acttggatga gctagtggat cgcagcttgg 31200
tgcaagtggc aaaaaggagg agtgatgggg tgtcaagaca tgtcggattc atgatcttct 31260
acgtgttctt tgcatgtcag aaagcaagtc tgataagttt ctggaggttt gcacaaactc 31320
caacattgat accgtcacta ataccaatcc ccgtagaatt tccatccact ggaaacgaga 31380
cttggatgtc tctgcaaaca tatttcacaa atcatgcact cgttctatgt tcatctttgg 31440
tgaaaatcgt agcatgaatc tagttcctgt tttgaaaaac ttcaagttgg ctcgtgtgct 31500
tggttgtgat atgatgcaag gggtttggtc tgattcagtc tccagagatt tgaagaggat 31560
gatccatcta agatacttga gaatagaagt ggagcacctt ccagattgtg taagcagcct 31620
ttggaatcta gaaacactgc atgtaagata tcgtgggaca gtatccagta aaatttggac 31680
gttgaagcgg ctgagacatc tttatttgat agggggaaag ataccagtcg tcctgccaaa 31740
agcaaataga atggagaatc tccaaaccct tttgttatcg ggtaattatt cacaacaaac 31800
tctttcccgg ttgaacagtg gcatatttcc caggttgcga aaattagctt tacgctttgg 31860
atttcaattc gccatgttac caagtctaca ccacctcaac aatcttcata gcctaaatgt 31920
aatgtaccct tttgaacttc catcagacac caatgcgttt ccatcaaatc ttaccaagat 31980
aaccttgaag ctagatgcag actgtgaccg tgatctccaa cctttaatga agacactagg 32040
gcgacttacc aaccttcaaa tcttgaaact tattaatttt ggtttattgt cctatggggt 32100
agagcttctt gatattggca ggggagagtt cccgcaactt caattgcttc atatgggtaa 32160
aataaatgta agacaatgga gattagagaa agatgcaatg cctcgacttc gacgtctggt 32220
cattgacagt tgtgagttgc ctgagcttcg agaagagctt tggtcattga ctgccttaat 32280
aatggtgcat gttgttagaa aaataaaata aaaaaatgaa ggaaaataaa tatgaagaag 32340
atgcacagtc ttgaattaaa taacaaaata gcagtaacaa attaaattta attgacaaca 32400
cataaataat gcattatatc ataatgagca caaggaaaaa ttaaataaag ggaaagaatt 32460
aaatagcctg ggttgaagcg tgtaaacgct attcttagag agaaaacgcc cccactgcac 32520
gggtaagaaa ttctgattgc gctcttctcc caagttacga caacccgttg gttccgatcg 32580
tgtgcagcga aaggatcccc gaaccttatg aacaccaatg ctcttgctct cacaaaaatt 32640
aaggaaaaga aagagataaa tttttggcag aaagaaacca gagctctcag tctgtcattt 32700
ctaggaaaga ggaaagagat atatataggc attttgcaac aacaaaatat taccgttaga 32760
aatataa 32767
<210> 13
<211> 32767
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 13
ttttatttcc cttgaaatat tgaatcaata ttgccagctt cataattatg atgtgagtga 60
cagtgcttgt ctgatttaga taaatgaact tgataagttg aagaactcca tctctttctc 120
ttttctgttt tgattttacc ctgtgtcttt gggagattta aataggtttc cctctgcttt 180
atggagataa tctctatttt ttttatcaaa caatacaaat tccctgtagc tgaaacctta 240
cttttttctt tgtttctctg atttattata tctaacttca atgccttttt ctcttttgtt 300
ttagggcctg tttggataag cttctttaga agcacttcca agagaagaaa ataagaagaa 360
aataatgatg agtttcttca taagataaaa tgagttatct attagctacc cattaactaa 420
tttgtagaag ctctctcata tagcttctct aaaagatgag aggacgtcta caaattagct 480
aatggttagc taatggacaa ctcattttta tggaaaagct catttcattt ttttcttcat 540
atcttctcct aaaagtgctt ccagagaagc ttacccaaac ggacccttat ccaatatatt 600
tcattggttc ccttttagaa caacttgact tttgtgagac aaatgttttc aggattggtg 660
aatctatatt ttcattgtat gatttaataa actctgtgac ttggaaattg gaatttattt 720
tgatttttga tacatcagtc agtgtggcat atctatatgg gtatgaatgt gtgatgtaaa 780
gttgttttcc cttaggggaa gaagagagga tcaagcttcg tagaggaagg gttttttccc 840
ttcagaatga acctgatgtg gctcgagttt ggctgcctaa ctctgatttc cctggtcttg 900
ctatggctcg ggcatttgga gatttttgcc ttaaggactt tggattgatt gctgttccag 960
atatctcata tcaccgcctt accgagaagg atgaatttgt tgtgttagca acagatgggg 1020
taaggcctta tgaggctctt ttcttatgat atactgtctt ctatgatctg catgtgttga 1080
aattgattca tttcaatatc atatttgtag ttagccaatt ctaaaatgaa aatatgaaat 1140
tgactttaaa tagtatttga atgccacttg caacagttaa aaaaaccaaa tttggttcta 1200
atttcactgt atttaaattg acatcttact gtttaagcta actacttatc atgtaaaact 1260
tattattatg agttaactac taatgtaaat gatgaacaca aacctaatat caaaagctgt 1320
atcaatatat attttttgat ccagttgtat ctcaaaccca tgttcatata cacagataca 1380
catgttattt ctattctctt tcaaactgga atttgtaaat tgttgagctt ttggaaaagc 1440
ttgttcttta catcaatata gcgatttacc cttttctttc gcctctcctt tgaagttgta 1500
actctaattt ttctcttatg gtccatatta tgttgtaact tgaaaattta tattctctga 1560
attgtcttat atatatatat atataatata tatacaaata catacttgat tagatggaat 1620
attgaattat tttaaactgt tggattcttg ggggcagatt tgggatgttc tgtcaaatga 1680
agaagttgtg gacattgtgg catctgctcc acagtctact gctgctagag cactggttga 1740
gtcagctgtt cgggcatgga agacaaaatt tcctttttgt aaggttgatg attgtgccgc 1800
agtttgcctc ttctttgatt ctgattcaga tttcaagtca acagatacaa aagacaagtt 1860
aataccggag gcatctattg accaatctga gcagttagct ttacttggtg aaaagggagt 1920
tggaaatgaa gctgaaaaaa agcagcaata gcgcaagttt tgtaccatgt ctctcccaag 1980
ccttgttggt tttatcgaaa aggttgggta aattgtgccg caacagtcaa aagagaaagg 2040
aggatcatta ttttgatgat ttttcggtag ttttctgcca atattctttt cattatttat 2100
ctttcatttc cttcgacagc atttgaggga agagggggtt atatatatat atatatatat 2160
atatatatat atttcttatc tggaggaaaa ggggtaccgg gctttttttt ttgttgctgg 2220
aggtcatttt ccttctctgt atatttggta gatttggagt ttttgtaaat ccaactctct 2280
agattcatat tatatagtct gttctgaagt ctgccgtttt tcatttgcat cattcttagg 2340
ttatagtttc caatttagtc tgtgaaaaca tgagaactgg aaagaattgg atttatttct 2400
tatggacttt cgagtcaggt ttttgtacct ctgtgttgtg ttgccgtcag ggattaatga 2460
tattgtctgt gtgatcctat tatgggtttt gtgtggaaaa tttactctga cggaaatttg 2520
tctttaagct atacgagtaa aactgtattt accttttgat ttaaatttta ttatttcatg 2580
attttaactt aattttgaga aggataaatt atttttaaaa aaggcttttt tgttaaggga 2640
aggtgtccta agtactaacc cacgaaggaa tgagggaagt gaggatggta acatgtcaaa 2700
taaatttgga atttagttcc cgaaattttt gagtgttaat tattgtagga atttactcat 2760
ttcatgataa aacttgacat ggagtaccgg acttaaaaaa gaaaaacatg acatgaagtg 2820
gatttggagt caagttttct ctcaaggcaa actggattta ttctccgtac tcacttatta 2880
aacaaggtta aaacaattag gtttgattga cattttggcc ttcagggttg tctttataat 2940
tttttcatat acgaaaaaag ttataagttt taatttctgt acacacatat aagttaagtt 3000
ttgatctccg tgatcaacgc agctagtatg tatgtggcac ctattcattt gctttactga 3060
gccttctcaa gtgtttgttg tccacgcctg aatataatga tttattcaag aaaacaacgg 3120
attgaggaag aactgaagaa ggtagcagaa tggttgaagg ggaaaaatta cctggtgatg 3180
cttgatgaca tatgggatga ggttaaaggt gcatttccag atgaccaaaa tggtagcaga 3240
atactaataa caaggaggtg gcatactatg tacaagaaca attttcaata ggatcatctt 3300
agaccttaag agcattgacg taaagataga tgacgaagat caagccatca ttctgttgag 3360
ctttcgtcct aagccatttg atcattttgc tgatacaatg ttgtatagaa aggctactct 3420
atcaatggat gaggtcaagg ctgctttgaa ctcaaaagaa aatcaagggg agaatgactc 3480
tggcagtaaa agactctttt ctactttctt gtgctgatgt cagttttttg tctccttttt 3540
tctttcatgg tcattattgt gctgatgttt taacatcatt tacatgttta ttgtaaaagg 3600
ctctttgctc tggcagagtt tgatgagatg atttgcaatt cctctgcttc tttctattca 3660
cttttctgct ttcttgtgtt ccacaaccac ttgaccagat ttttcagtta gcttagcatt 3720
taagcctgag aaattatgca tcatttcatt tgtttgttgt acaaccatat ttaatgttaa 3780
cctctctccc ttgtttttcc attctaaaca tggatcatgt ttttgtttat tggtctaaag 3840
tgttgtttca tgttattttt ctttctcttt tcccaatgga aggtcctttc atgatttagt 3900
tagaatagat aactgataac acaattagtt ggaaaggaag atgttagagt gtatgttgat 3960
aatgggagac aaatcatagt gatcagtttt agaattggag tgaaagcata cagacattgc 4020
ttttgtgcct tgtctctgct actctaccca aacctttgct ggttttatca tggatataat 4080
tcattatttt atgatctttt tggtagattt tctaccaaaa ttcatttctt cttttcggtg 4140
atgctatata gtacgaatta gttttgcacc aagaagtacg aatccacttg gcaaaatatg 4200
atcgtacaaa tattaatttg aaagaataaa atctagacat gcaagttcta actaccctct 4260
ttcaaactgg aatttgtgga attgttggaa ttttggaaaa gcttgttctt tacatcaatg 4320
tatatattct cccaaattgt cttacaacac aaaaaaactt gagtattttc ttacatatta 4380
tctgcctaca tttttgcgct taactggatt atggaaaaat aatttgctaa tgagatatac 4440
taggacagat ggatgaaaat tacaccaact tttaacaaag gtttaaatac agtttttttt 4500
tatttataat ttatcatatt tttgccttta gtctttatat ttttttttgt ttttaagctt 4560
tgtaaattat atttatttta tttttaattt ttaaagcacc ttaaataata ttttgacaag 4620
tgaaaaaaag tgttatctaa aatgttagaa cgaaaaataa aaaaatataa tttataagga 4680
ctaaactttt tttacaaaaa aaataaaaaa aatactaaag aataaaaaaa tatttaagac 4740
aataacaatt tgctgaatac aacagaaaag ttagttagaa cacaataaca atttttaaag 4800
attattgtta aagactctgc attttaaaat tctaactaat ttttgtttct aaaccatgga 4860
agacttttat ttcataaaca caataacaat taaacaaaac tcacaattta aaaaaaaatc 4920
agagtcatca aatatattaa tatttaaaga cagaaaaaaa aataaacaaa taaagttgag 4980
aaagccaacc tataattaaa aaggttgaca gaaacgcggg tccacgcgta tgcgcgttct 5040
ttccctttat tggcgtccac ttgttatctt tcgttctcta ctctgtaaat tatctgtcca 5100
caaactctct agagtttcca cccaagattt cctgtttcac agaaatggca gatagtgttg 5160
ttgcttttct gctagataac ttgtctcggc tgcttgaaga tgagcacaag ttgctttctg 5220
gcgtggagga caaagtcaac tctctttgca atgagctcaa gtttatacac atcttcctca 5280
agaattccga gggcaagcgc agtcatgaca cagtgaaaga agtggtgagc caaatcagag 5340
atgtcgccca caaagctgaa gatgtggttg acacctacgt taccaacatc accaggcata 5400
aacagagaag caaactgagc aagttattcc acctcaaaga acaagtcatg gtgcttcacc 5460
aagtcaactc tgacatagag aagatcagga gtcagatcga tgacatctat aagaacaggg 5520
acagatatgg cattggagaa ggtgaattcc gaagcgaaga agctgctgca gaagcagaat 5580
cactcctcaa aagaaggagg gaggtggagg aagaagatgt ggtgggctta gtgcatgact 5640
caagccatgt aattcaggaa ctcatggaga gtgagtcacg tcttaaagtt gtttccataa 5700
ttggaatggg agggttgggt aagaccactc ttgcccgtaa gatccataac aacaatcaag 5760
tgcagctgcg gtttccttgc cttgcatggg tttctgtgtc caatgattac agacccaagg 5820
aatgtcttct cagccttctc aaatgctcaa tgtcatccac atctgaattt gaaaaattaa 5880
gtgaggaaga actgaagaag aaggtagcgg aatggttgaa agagaagagg tatctggtag 5940
tgcttgatga catctgggaa acccaagtat gggatgaggt taaaggagcc tttccagatg 6000
accaaacagg tagtagaatt ctcataacaa gtcgcaacaa agacgtggca cactatgctg 6060
gaactgcgtc tccctacgac cttcccatcc tcaatgaaga tgaaagctgg gaactcttca 6120
caaagaagat ttttcgaggt gaagaatgcc cttctgattt agagcctctg ggtagatcca 6180
ttgtgaaaac ttgtgggggt ttaccacttg ccattgtggt tttagcagga ctcgttgcca 6240
agaaggagaa gtcacaaaga gagtggtcaa gaatcaagga tgtgagttgg catcttacag 6300
aggataagac tggagtgatg gatatactga agcttagcta caacaacttg cctggaagat 6360
taaagccttg ctttctgtat tttggaatct atccagaaga ctatgagatc agtccaagac 6420
aattgatcca atattggatc gcagaagggt tcatacaacc acaaaaaact ggaattgcag 6480
atacaacaga actggaagat gtagctgact tttacttgga tgagctggtg gatcgcagct 6540
tggtgcaagt ggcagaaaga aggagtgatg ggggtgtcaa gacatgtcgg attcatgatc 6600
ttctacgtga tctttgcttg tcagaaagca agtctgataa gtttctggag gtttgcacaa 6660
actccaacat tgataccgtc agtaatacca atccccgtag aatgtccatc cacttgaaag 6720
gagactcggg tgtctctgca aacacattta acaaatcatg cactcgttct atgttcatct 6780
ttggtagtga tgatagaatg gacctagttc ctgttttgaa aaacttcgag ttggcccgtg 6840
tgcttgattg tgattcgttt attgggtttt cgtcttatcc agtccccaga gatttgaaga 6900
ggatgatcca tctaagatac ttgagaatat gcgtcaagca ccttccagat tgtgtatgca 6960
gcctttggaa tctagaaaca ctggatgtaa catatgaaac cacagtatcc agtaaaattt 7020
ggacgttgaa gcggctgaga catctttatt tgagtggggg agggaagtta ccagtcgtcc 7080
tgccaaaagc aaatagaatg gagaatctcc aaaccctttt gttagatggt agctatggta 7140
tagacacgta tccacaacaa gtgatttccc tgttgaaaat tgacatattt cctaggttgc 7200
gaaaattagc tttgcgctat cctgatggac cagatatgtt atcaagtcta caccacctca 7260
gcaatcttcg tagcctaaaa gtaattcgcg gttttgaact tccatcagac accaatgcgt 7320
ttccatcaaa tcttaccaag ataaccttag cagcagtccg ggatttacat ttcatgaaga 7380
cactggggca acttaccaac cttcaaatct tgaaactaag attcggcaaa gttggttttc 7440
atcttgatat tggcagggga gagttcccgc aacttcaagt gcttcatatg acgcaaataa 7500
atgtaagaca atggagatta gagaaagatg caatgcctcg acttcgccat ctggtcatta 7560
atgactgtga agaattgtca gagcttccag aagaactttg gtcaatgact gccttaagag 7620
tggtgcatgt ttcacggccc tccgaagaat tggctaacag tctcaaaaat gtggagccca 7680
ggaatggctg taagctcaaa atctctaatg aactgtgaaa ggcaagtggg accgccttct 7740
tacattgcag acataagttg tagtctttca atatccttca taatatttgt tttttaatcc 7800
cgaccccatt tccattttct ttgtccaaat aaatttccaa tttaaaatag cggatattca 7860
aattgagaat ggatgttgct tccttgccgt gtatggagtt gtgtctcatg attattgatt 7920
acatatttat aatacctaga gtttcttttc tatttgtgaa taatatatta aattaagggg 7980
gtgtcatgta aaagagaagt ttttttttcc ctaaaaatta tatattaaaa aatttatttt 8040
ctcatatttg atatacattt ttaaaaataa atactaatgt aaaatgatat tttttgaaaa 8100
tatttttaat caatttctca tgaaaacttg aatatttatg tatatgtata tatatagttt 8160
aactatattt aatcttgaat tactaatcat tcctcacagt tattatacac tacaaaagta 8220
atcctacgat taattaactt tatcatagta atcatagcca ttgaaaatta accatattcc 8280
tttacatcca atcaaaagaa ggagaaaaaa aaacaaattc ttttagcacg tttaaatgtt 8340
aaagctaatt attcaaatga ctaagaagaa aaattataag ctccaaagta aaacattgat 8400
tatcaaatta tcctatctaa aactctaaag aagttatgtt aatgttaaat gaaatattca 8460
ttcggcccaa ttgttaaaaa aaatcatagc tgtacaaatt agagaaataa gatgaaaagg 8520
gagagaaata tgaaataaaa tagttaatgc aatacaaaga gataaagaaa aaaaaatgaa 8580
ttgtaaaaaa tgtaataagt atttgttgta acaatattat aactcttgct aaaaataggt 8640
caaacaaatg gagtcaacca gcacagaaat gctctacaat aactaatgtt aaatatttgc 8700
aactataact tcaattccgt gcgtgacttg tatatgttaa ttatacattt ggcattgaga 8760
tccaagctaa gtcaaaaatc aaagtctaat aacatataca attggtggta agattttgca 8820
atttacatat tcaccatggg aattgagaag aaaaatttga cccaaagcga aggttcccaa 8880
tggtcagtgt cctagttttc cttgaagatt acatttataa atcatggaag ttcctgaaaa 8940
gtcaatttct cacatagcat ttttttcatg ttctttctat tttcaaatcc tttgaccata 9000
attttgactt tgatatatgt atttgttgct tcatttcaat atacccattt atgaagtaga 9060
gcaagtagag acaaaatcat cacccagttg atgtttaaac cacaagcaaa agaaatgtag 9120
tggaaaccaa ctaaatggac tgttcccgtt cgctcatccc tcactttaat gcttgaagaa 9180
cctgtgagat acagcataga aaatattact aatgagccat tatgcaaaat taaaggaaat 9240
aatgcaagtc atttgaattt gatttcttat aatttttttg acaattctac ccaaaccttt 9300
atataacacg tcaatcctat attatcttta attcatcaat taaacataag taagaaatct 9360
gatgtgaaac aaaaagtaag tggataaaaa gaaataagga cgacactttt acatcaaaca 9420
cctccaggat cagcatgcag atactttaaa gttttaaaat ggatcgttaa actacacaga 9480
actattcctt tctcagaatt aagaactaag ggtcaactcc gtttgagaaa aatgttttat 9540
tatttttcat tttcaatttt cacaaaaatg ggagagttga gacaaatgtg aaaaaaatac 9600
taaatttaca tgttctatta tagatgtttt cacaaaaatc tacaaatgtt ttatattatt 9660
catttatatt atttaaaata cagaagatta taaagaacta ataatgatac ttacagttgt 9720
actcagtcca tccaataacc tgattttcaa ggtcatagat gtattacatg ttctattata 9780
gatgttttca caaaaatcta caaatgtttt atatcattca tttatattat ttaaaataca 9840
gaagattata aagaactaat aatgatactt acagttgtac tcagtccatc caataacctg 9900
attttcaagg tcatagaaga caagtttatt tgtaagcact aaatctgcaa caaataaaaa 9960
tacaggtgag gctgcatagt aaggtcatgg aaagcaagct ttctagtgat ccaaagttgt 10020
gataactcca ttataattta catctagaaa aaatataagg aaatttcttc caccagtaaa 10080
aataatacat ttattataat atttagcttg taagtttctt ccaaaacaag catggggcca 10140
cttctctcca taaaaaatct caagaccaat aatatgctac aaaactttca ccagcaaatt 10200
gcaaaaggtt gtcagaacct acattcacac ctttaagccc cctatcaatt aatcatcata 10260
tctttgacca gattaaataa aaagtaaaaa agaaaaaaca gaaaaaggcc cttctcagct 10320
aaatcctcgt cttttgcttt agaaggaaga tttaggatgt agtaatcgaa agcaaacttc 10380
tactacctct tgatttagga acttgtatca aaaaatacag aacacagccc aatttctttc 10440
aaatctccag ttaagatact cacaagatcc tatacaaatg tattccagga tatgcattta 10500
taatgtattt gtcttgttta tttaagaact cagaagtaat caggttcaaa aatatctttt 10560
atctcaaaat gccattaaaa aagtaaccct ttctttcctc ttataatggc tacggcagtc 10620
tcattctaaa tctggaagca gtattcagca aattggtggc aaatatatct atcggtacag 10680
aaaaggattt gaagagaata cctcccaata aggtcatatt tttgctatct cttgattgtg 10740
tcccactatt ttgccaacca atacaccaga aatctccctg cagatgcaca ttagtatttt 10800
atttatagta tggtatataa agattatgat catagaaatc attgacataa aaaagaccag 10860
ctcagtagta gtgcacatta ataaatgagt cttttgaaaa atcattttaa aactattgcg 10920
agtatctaaa attacaaaaa gaataacagt ttataaggtt gaaaatacga aaagataata 10980
tttggtgcat ttgcaaattg caactccaga atccattctg gaactcaaaa ctaatttgaa 11040
gcagatggga tacaaaaggt ttttaaaatg cattgtgggc actttgggca gaagcaactt 11100
tttattactt tagcccagaa tacagttagg ccaagatgca gttggtctaa tatatataga 11160
gagagaggag ggatcaagtt actttaagag gaactctttt aaagttactc tccatcctca 11220
cactgttcat tctcttgaaa cctaatagtt gtaatgagta attaatctta atcattagat 11280
tttaaggaaa tgaatggtga agatgaggag taactctctt agagttactc ttgaaactct 11340
tgaagtaact tgattcctct tcatatatat atatatgaca tagaaggccg acaacaggtc 11400
ccaaaacaag ccaaataaaa ctcggctaat cataacaaaa cacacaaaga tataatgaga 11460
tttgcaatat acttacagac ggaaataaat aatcttgtgg ataaaccttc aacgagagcc 11520
cattttcaaa ataaaatgtg acagctggaa atccatcatc aacactgcaa cataaaataa 11580
aataaccatt acacccctac atgaagctga taatacagac ataaatgcat aggatatgca 11640
aagggagcag tccagttatc aaagcactcc aacaatacat actcaataag aaagttcata 11700
gaacaaaacc tacaaaatat tataacttaa tttcaaaaag agtttttccg attatcaaat 11760
taagatttca aatggcaaat attttttgtc cacttatcaa acccatagtc aaaatggcaa 11820
gatttcctag acaattcctt taacatataa tgtagattac aatttacatg caaatgtcgt 11880
tattactatt atcaagaaaa gaatttatta agacagaaaa aaaagatata gagacaggat 11940
aagaaatcct catggattac agatgacacc actaaaataa aaggaaaaaa gaaacaaaaa 12000
tcaagacatt tgcaacacgg caaaccaaca aagagcataa aaccataaac cagccactac 12060
agattaagta acaacattaa catgatcaaa taaaaatcat aaaacaatat gtgaaccgat 12120
actgtaaaac aagcaacaga attaaaagga aaaaatttca aagcatacat tcattactgc 12180
atactacagt gaaaatagaa aaaatatata acaggaagat aagacatcta ccaaaataaa 12240
aaacaaagtg agagagtgaa tagtcctatc ctggaaaact tgctatgcca tgaaaaagtt 12300
acttgaagat ccaggaatat aacctcaaac accaaccact acagatgtca ttgctcatga 12360
cagcaagctt aaacaatgcc aacatggcat tcaattgcca tattgaagga tggtgactaa 12420
tttaaacaaa taataacaac aaaacaatga aatcagtgag tgaagaactg agttgatact 12480
agaggagctg gtctggtaaa cttaatggta atttcaccct gttcaaaaaa gatttctcac 12540
catacaattt tcaaaggaga tcaaagtaaa acagaatttg ccaaaagtca aaaccacttc 12600
tgatgtgttt ttgtgcagtc ttctggtttc ctttaccaca cattgctgaa ggacaattct 12660
acctagaaca gaggagacaa acactcacca ccttgccatt tttaatgtga catatgccat 12720
gcatcatgga caacacagct atgggagtgc aactgtgcca tgttcaatag catgcaaaag 12780
aagttttaga gaaagtgacc ctcaacacac ccagtatgga agcacatact tttaacaaca 12840
ttgtcaaccc tgaaccacca ttatcaaaac cacacacttt aggtccttcc ttccaaaaca 12900
aactggacta caaagaattc ttctaaaacc tgtatgccga agtaagctag caaaacactt 12960
gcgcttgttc caaccaacag caagacacta tatgcataca atatgcacgc atgcaatatg 13020
catatttctt ttcagatgtg ttcaagaaag aaaagattat gttagcagtt aaacccccag 13080
ttatagtagc aatacagtat atggattagt taatatgaat gttatgcatc ctacctctca 13140
gaatattgaa aacatgtata ctcgtcatgg agagtctgaa cttttagatc gggttgctga 13200
gaaattatct aacaagagaa agcaattcag acaactgcaa tgtaaattta gaaatttagt 13260
aatttgcaaa atttaagatt tttatgtacc ttatatacta gcggctcata aattccttca 13320
ggcagatagg ccaaggttgt accactgtca attattgtcc cttttctgtc tccttgtgtt 13380
gatgtatctg ttgatagact aaggaaagca tggccaactt gaactgcagt catattaaca 13440
ctgtagtgtg gcctaaaaaa ccaaattttc aaatgtcata ttctctcaaa atatggattt 13500
ttgtaaacca atatctgaat agaagagaga ttctatcatt aagatctcat agctaaggct 13560
atgtttgacc cagcttattt tttgcttaaa agctacatta aagttaaagc taaaataaaa 13620
actttaaaat taaagtagaa gttgtttggt agtcttagct taaaaactcc ttttaagata 13680
aaagatttgt ttcaactagt tacggaagaa aagaaggagg gaagatatgt ggctaatttt 13740
aaaaagctac tttagttagg gtttttttaa atgctaattt tctccctttt catttattta 13800
atggtcctca aatattaaga gtttttctct aaatgtgttt ggctcagttt ctccttttaa 13860
ggagaagaaa aaggaaaaaa gagccgggcc aaacacctac atatgtggcc tagatactac 13920
ttataatgac ttgggcaagc ttccaaggtt gattcagccc cagtctgata tcaattctag 13980
taaaagtaaa caaaactatg agtgcataaa caaaattgac caacatccag catatagaag 14040
catccagcat ggacatgaaa atttaacaaa gatatattgt tttttcattt agaatatagg 14100
ggaagaaagt gctgactttt atggttgaaa accactgaaa tcctaccgcc agcttcaact 14160
aacatgagtt cactttacat tccaattaca gtttacacat gacaccttca gcttcaaaga 14220
atcttttaaa ccaaaatttt aataccactg aaatgatgac ctcgttagcc agttgaggcc 14280
tacattccat ttagagtgta gatgtgttga gacatgtcac tgatgacttg agaagaaacc 14340
attaatcaat actccccctg gactcatata taagcaaaaa agtgatcttg taagttggac 14400
ttaaatataa gcaaatctaa ctaattttgt cttatttaat gctatcattc ctaaaacatc 14460
cctcatttaa ttgtaattct attttcaatg actctttttt attcatgata gcaagttcca 14520
acgaaagata ttttagaaat aaccttattt tttcgcttga gattagtaaa attaaatgat 14580
gtcaactaat tttctaaatt agtgtgaaat tagttatttt tgcttatata tgagtccaaa 14640
gggagtatct agcaaggaca ggctagagta gagcttataa aggcttggga aatcctcacc 14700
tcatgggcta gttcttgggt taatttagcc caaattcaat agaagctaca tgttttatta 14760
tatcgtaaaa cattaaaata tttgcacaaa aaataatgta gtcactaaca aaaacatgat 14820
taaaaaaaaa ctagaacaaa cttatcttca aaagagtaat taataacact ataagaaaaa 14880
ctaatctcat tctaaagtgt attaagtgaa tggcatactg gtctggtaat aatggagtca 14940
tgttcacttt aggttgcaca acatgcccaa tagcaaatat accacctcca tttactccat 15000
ttaagcaatg agcaaacatc tttttcactt tgccagaaga agcaagttgt gaaatcattg 15060
atgaattagc ttttccaaat ccaagtattc caccaagtgc ctcttcattc gaagaactta 15120
gatctccaga ttgtctagca ccacaactac aaaacagcaa aaaactcatt ttaaatataa 15180
aaagagggag aaatatgaac caaaagatgc atgcaataga caacattaaa ttatcataca 15240
caataagaat caccgagaaa ccattataac ctgaatgcct ccaaaatcac atcaagctgt 15300
ttgagtatta gaaaaaggta tttctaggag tgttccatat gataaggtgt tctattcact 15360
gcctcaatat ttactaaacc atgttattta cagcatgttt ggtaaaactg aaaactttag 15420
cattggaaga ttataaattc aagcgctgat attgtgctaa aggaagctat tagcatttaa 15480
catacctaac aaagataaaa caaacgaaat tattgtccag gaaatagttc ctgttgatac 15540
atcactgact gcacaaatgc tgaattattc aatatttttt ttacataaat ttatttttca 15600
gattgagtag ggttcaagct tggaacacaa caaaaggagg actgcaagaa gtacaagcct 15660
atatcaatat caacgtcagc agtctcactc tcaatcttac tcaaattggt agctgaccca 15720
aaccaatatc aaaatcaagt attttttcag gctccaatat tagttttggt gaggagttgg 15780
acgcaattta tatacttcat aatgaaataa aaagcatact cgacagtttt tgaaaagcaa 15840
tgcctgcaca ccagtgcacc cactttatgt taatatcata tgcagatatg agaaattatg 15900
ctattgcaag tttgcaacta aagcaacagg ttaaattact atgaacaaac atgcatggta 15960
ttggtatctg agttcatgac ttatgagaaa ttaatgtcca ctaacagcaa cagatcaaaa 16020
gtaatagaca tacacaatac ataatagcac acattactgc caaaagaaaa ctcacccaaa 16080
tacaatactt ccatttgctg aatcagtttt aaggtcccca gacacttgat cataaagtac 16140
gatatccttt acaaagtaac cagcagtcga gctcccatca ccatatatct ccagatatgg 16200
acaggaaata ttagcagtgc atccggtcag cagaccccca ttgatctctt tgcaaaactc 16260
ttgatcacag ggaacaaatt taccagagga ggattccttt atgtcgtaga gtgtaaggtc 16320
catcttcgat acacagaaaa agaaattcaa atgaataaaa acatcaaatg ttgaaatgag 16380
aaggctgtac atgattcagc catgtgagaa ttgtcttgca agggatggtc taccatggta 16440
cacgccctga tagtgtaaag gattttatac actctcaacc aatcagaaac tcccatgtaa 16500
ggtaattatg ttgaatttta tcataactca tttaaaagtc acccctagca tgatttccga 16560
ttagttgaca gtgcaaaaga tcgctacaca atgcataaat tttaaactca ggttgtaatc 16620
catcctaatt ttaaaatgca tacacaaagc acaaaaaaaa aaaaaaaaaa ctaagcaagc 16680
acgtttggca agtaatgaag ataataaggg tagcttaaac taaaaagatg agaagcattc 16740
accaaggttg cttctggtgg ggcattcttt gcactgaatg caattcaccc acataatgtc 16800
actaccttac taattatcag gcaccgatgg tattcttctt gatattggca ggggagagtt 16860
cccgcaactt caagtgcttc atatgagggg aatatatgta agaaaatgga gattaaagaa 16920
agatacaatg cctcgtcttc gacgtctggt cattgacagt tgtgagttgc ctgagcttcc 16980
agaagagctt tggtcattga ctgccttact aatggtgcat gtttcgtcgc cctcccaaga 17040
attggctaac agtctaaaaa atgtggtgct gaggaatggc tgtaagctca taatctctaa 17100
aagttgtgtt gatgaatggt tttaagctca caatcatcta gtgcttcata actgttggaa 17160
taatggcaat gcaagtgggc attgctgggt tttgttatgg tctttctata tccatcatga 17220
taacgtgcag tggttcttat cattctgtat ctttctaact ttctaatctc attgccacac 17280
gtgttgtgat tgctagattt ccattttaat ctcagttttt gtctaatttc tttttctttc 17340
ttggaccttt gttctgaagt tgtaacttta tttacatgtt gattgtaaaa ggatatttat 17400
tctggcagtg tttgattaaa tgatttgtaa ttcctctgct tctgtctatt cacttttcta 17460
ctttcttttc ttagatgacc cgatatttct gttagcttag cattgaggca tgagttacat 17520
atatgcatta tttcattcat ttgttgttca gtgtgctcaa ctatatttga ttgtgcgtta 17580
attttccctc ttttcccctt cttttcccat ccaaagtaag tgtttcgtct ggtccctaat 17640
ataaagtatt taactttttt ccattattta tcctattaaa tactctaact atatgtactt 17700
ttaggtaatt atgcataata ttgttattta tgacaagtta actatcatta ataagagtaa 17760
aattgataca ttaatttatt tatttttatt ggtatgtgta attttgttat ttttatttat 17820
tggttttggt gttgtctcac gagatgtctt tttcctggtt gaggtgtgtt tctcttctca 17880
tttcttagat ggaatagtta cttgataaca taattaattg tataatggga gataaatggt 17940
tttcatcttc tcttctcatt tctttttttc ccattcattt ttctggccga gtgatacaga 18000
ggagtaaagg aatgaggact tgtttcaagt aagagtaact ccaaaatagc aaagagactg 18060
aaaagggaat ttctgagtaa taatttctct gccttctttc attccgtgct tggatacata 18120
taggatagat ttttccccta ataacctgag gatacgagta ataaattcaa acagaattca 18180
gattctaata acaatatgaa aatgatcaat tttaggtgat aaaagtaatt actcttaaaa 18240
ctaaatggca gagctagtgt ccaacctagt ccttcgtaga catggcaatg gggcggatcg 18300
ggtacagata ttgtctcccc aatctcttac cccgactcct caacatatcc ccatacccga 18360
tacccgacag gtttgagttt attgtctcat ccccgtaccc gtcgggtatc gggtatcccc 18420
aaccccaatc cacacaccat ttagaaaaat attttttttt ttgtaaaaaa atattaaaaa 18480
tttgatttta gaaaaaaata aattgattgt taaacattta tttttaacta cttatatatc 18540
aataaattta ttataacgcg tgtgtctaca taaatagtta aaaaaataat attaaattat 18600
gtaaaaattt taaaataaaa ttaactagta ataaaaatta tgtcttttga ttaaattatg 18660
caaaaattct aaagatttta agtggcaggg cgggtttggg ttcggggtcg gaacgggtct 18720
agtaatccca tacccgtacc cgtacccgac ttttggttat tgaaaaaaac ccgaattcat 18780
actcataccc ggtcaactcg gatattaccc gtcaaagttg ggacggacac tcatttcttg 18840
tgtccttgtg tcactcttct caagcttggg tctcttttta ttgggcccaa cacttatttc 18900
ttgtgtcctt gtgtcacttg ggccaactgg cctatagtga taagacatat ttgttatgtt 18960
cgtaacacta acacccagtt tctattagaa tgctgttact tggaatttga gaaggaattg 19020
gagtgaaaaa atcttacaga aagcagcaat gacattgctt ttgatgatat tttggtagtt 19080
tctatgtcaa aattcttttt ttttctcttt ccttaccatt tgtatccttt tatagtattt 19140
ttttttcact ccatttaaca tttgttacat aaaagacatg acaggaccaa tatattacat 19200
catcagatgt ttgatagtgg ataatcaact aaagaaagaa ctaaaataat tgattttgaa 19260
aaaaaaaaac taattatttt aatttaagaa ttaaaaaaaa tcaaaatttg cattatacga 19320
aactaaaact aaattttaag cctaataata taatgttcac aaggtgacta aacgaccagg 19380
gtaagtggta actcctcctt tttggtcctc tactatcata aattaatgag cttataacta 19440
gttctcatat ggtaacaaaa agacgtaaaa aatgtttacc tttaaagctg catacatcag 19500
acggtattca acaagaaata gaaatattag cagcaacaga tttgaagtgg aatgttttga 19560
tttcttatat attcagaaga gttgaaatta aacaacttaa agcagagttc aagctcactg 19620
aatactgata ctttgtcctc tgagaagtta atctccggat gctacgcact ccttattttt 19680
ctttcacttt atgcaattta aatacctctc catttcaatg gcataattct aaaatgttca 19740
tcagataagt cctaaaagat ttcccaaatt attcttgatt cgttttcccc ggcaactagt 19800
ttattacaaa aaaaatcaca gaaggaaaag gaagacacgt gtgaatgcta ggactaaaga 19860
gtgtttgacc gttgacgtca aggtgaagtt tctcttgact tgcctcgcag cttctcaata 19920
atatcacagc tcgaaaaaga agacacaatc ggtaaggtga agtttctctt gccttgcctg 19980
gcagcttccc aactactacc aatatgtgct tatgtacttt ggtctcagta taggatatat 20040
gtgctcagtg cctcctccaa agcattaata tactttcact taccaaatca aatggatact 20100
gaaattgatg agagcattga cgaggccgat atcagatttg atgcaaggag ttatagttcc 20160
agactgaaca gtatgataag gagtgagact gagtcaattt tgggagcatc ccctgtccat 20220
gagggagcag ctgcagaaga ggtgcgccaa atcagagatg tcgcccacaa agctgaagat 20280
gtggttgaca cttacgttgc caacatcgcc aaatcagaca tggtgcttca ccaagtcaac 20340
tctgacatag agaagatcag gagtgtgctc aatgagatct atgagaacag cattggagaa 20400
ggtgaattcc gaagcgaaga agctgctgca gaagcagaat cactcctcaa gagaaggagg 20460
gaggtggagg aagaagatgt agtgggctta gtgcatgact caagccatgt aattcaggaa 20520
ctcatggaaa gtgagtcacg tcttaaagtt gtgtccataa ttggaatggg agggttgggt 20580
aagaccactc ttgcccgtaa gatctataac aacaatcaag tgcagctgtg gtttccttgc 20640
cttgcatggg tttctgtgtc caacgattac agacccatgg tatttcttct cagccttctc 20700
aaatgttcaa tgtcatccat atctgaattt gaagaattaa gtgaggcaga actgaagaag 20760
gtagcagaat ggttgaaagg gaagaagtat ctggtagtgc ttgatgacat ctgggaaacc 20820
caagtatggg atgaggttaa aggagccttt ccagatgacc aaacaggtag tagaattctc 20880
ataacaagtc gcaacaaaga ggtggcacac tatgctggaa ctgcgtctcc ctactacctt 20940
cccatcctca atgaagatga aagctgggaa ctcttcacaa agaagatttt tcgaggtgaa 21000
gaatgcccat ctgatttaga tcctctgggt agatccattg tgaaaacttg tgggggttta 21060
ccacttgcta tcgtgatttt agcaggactc gttgtcaaga aggagaagtc acaaagagag 21120
tggtcaagaa tcaaggaagt gagtaggcat cttatagagg ataagactgg agtgatggat 21180
atactgaagc ttagctataa caacttgcct ggaagattaa agccttgctt tctgtatttt 21240
ggaatctatc cagaagacta tgacatcagt gcaaagcaat tgatccaata ttggatcgca 21300
gaaggtttca tacaaccaca aaaaactgga attgcagata caacagaact ggaagatgta 21360
gctgactttt acttggatga gctagtggat cgcagcttgg tgcaagtggc aaaaaggagg 21420
agtgatgggg tgtcaagaca tgtcggattc atgatcttct acgtgttctt tgcatgtcag 21480
aaagcaagtc tgataagttt ctggaggttt gcacaaactc caacattgat accgtcacta 21540
ataccaatcc ccgtagaatt tccatccact ggaaacgaga cttggatgtc tctgcaaaca 21600
tatttcacaa atcatgcact cgttctatgt tcatctttgg tgaaaatcgt agcatgaatc 21660
tagttcctgt tttgaaaaac ttcaagttgg ctcgtgtgct tggttgtgat atgatgcaag 21720
gggtttggtc tgattcagtc tccagagatt tgaagaggat gatccatcta agatacttga 21780
gaatagaagt ggagcacctt ccagattgtg taagcagcct ttggaatcta gaaacactgc 21840
atgtaagata tcgtgggaca gtatccagta aaatttggac gttgaagcgg ctgagacatc 21900
tttatttgat agggggaaag ataccagtcg tcctgccaaa agcaaataga atggagaatc 21960
tccaaaccct tttgttatcg ggtaattatt cacaacaaac tctttcccgg ttgaacagtg 22020
gcatatttcc caggttgcga aaattagctt tacgctttgg atttcaattc gccatgttac 22080
caagtctaca ccacctcaac aatcttcata gcctaaatgt aatgtaccct tttgaacttc 22140
catcagacac caatgcgttt ccatcaaatc ttaccaagat aaccttgaag ctagatgcag 22200
actgtgaccg tgatctccaa cctttaatga agacactagg gcgacttacc aaccttcaaa 22260
tcttgaaact tattaatttt ggtttattgt cctatggggt agagcttctt gatattggca 22320
ggggagagtt cccgcaactt caattgcttc atatgggtaa aataaatgta agacaatgga 22380
gattagagaa agatgcaatg cctcgacttc gacgtctggt cattgacagt tgtgagttgc 22440
ctgagcttcg agaagagctt tggtcattga ctgccttaat aatggtgcat gttgttagaa 22500
aaataaaata aaaaaatgaa ggaaaataaa tatgaagaag atgcacagtc ttgaattaaa 22560
taacaaaata gcagtaacaa attaaattta attgacaaca cataaataat gcattatatc 22620
ataatgagca caaggaaaaa ttaaataaag ggaaagaatt aaatagcctg ggttgaagcg 22680
tgtaaacgct attcttagag agaaaacgcc cccactgcac gggtaagaaa ttctgattgc 22740
gctcttctcc caagttacga caacccgttg gttccgatcg tgtgcagcga aaggatcccc 22800
gaaccttatg aacaccaatg ctcttgctct cacaaaaatt aaggaaaaga aagagataaa 22860
tttttggcag aaagaaacca gagctctcag tctgtcattt ctaggaaaga ggaaagagat 22920
atatataggc attttgcaac aacaaaatat taccgttaga aatataaccg ttggaaaacc 22980
aacctacagt tgttgttaag actttggcaa gtgcaccaaa tcgtgacaag tagtaaagct 23040
cggaagtccg agtatcgtgt ccacatggat tttattgcac ttattcaata cctctcaatt 23100
tgtaagtggg agtaaaatag taaaaataag aatgaaagta ggaatagagt gctattacta 23160
aaacaaataa ggaaaaaggg aaacaattaa tagaaatgcc aagaccagac aaacccaatt 23220
ggcctacgat gcatgtaaat aggatattca ttatcaatga aatggtatta gttctaccca 23280
catctgttaa ctacttgccc ctgatgcctc acgttggcaa gcctatttta actaactatc 23340
tcccaaatgc ctttgtgaag attcaataat taaaatgcat taagattaag ttctagatgt 23400
tgcttaaatg catgggcagt gagttatcat tttatgccta gcaatgctaa cccaatgatt 23460
cttttcttta gatgttctat taggtgttac cctttcccaa gcgtataacc cctaaaactg 23520
atgcatgcat tgaatcttaa atattattga gaattaccct ctctcgagcg aataaaaccc 23580
aaaaagagat ctaagaatga atgcaagaat aaaaaaaaaa gaaatggaac agaaaaatct 23640
ggaataaatt cccttgtatt gataactctt gaagctcatt gtacatcgtt ggctttttag 23700
gcctgccagg ccctagctag gggtttagcc actcatggcc attgagggct tacaactggg 23760
gatgaaagaa agaataggct aataaaacaa agaatatata gagagaaaag aaactcaggc 23820
ttgaggaact gagagtagtg ctctgagacg ggatgatgtt tccttgggac tacctctcta 23880
tttatagctg ctgaagtggg cttatgggcc ttcgtaatag cgctcagcgc cacacctcgc 23940
gcttagcgcg ttcagatcac gcgctgggcg ccccacgcac gctggacctg tgcttctgtt 24000
ggatcgggcg ctgggcgcct agctgggctt agcgcgcgta acggtttcca ccttcgtgct 24060
taacgccacg ctcagcgtct gcagttagtt gatcgcttag cgccagatgc gcgctcagcg 24120
cccctattgg attgggcctg cttcagaatt tcttcttttt ttcttccttt ctgtgccact 24180
tttgctaaat gcaaccttat tttttgtatc tgcaaccaga aattcaatta aattaatttt 24240
ctcactttta attacaaata actgctaaat aattaatttt aagccaaaat ttgactattt 24300
aactcctata aattcacaat tatttagcag ttatcagttg tcacaacaaa tataacaaac 24360
tagtttgact cattaaaaca aaatcttaag agaatctaaa ataaatatta ttttataaaa 24420
tagaattaat atatatttat aaattttaaa ttaaaacaca aatatttacc aacattcccc 24480
cacataattt aaaattttaa aatatatttt ctaaaagata atttgtataa aaacataaga 24540
gaaagagcat gtgatattgt atttcggtat aaggaacctt ctgggtttga gccttatacc 24600
tagggtttat gaattttcat ccgagaaaaa tgtagtgatt tgattgtctt gaactacata 24660
ttctttaacc ggactttagt acacaacccc tacaatattg gtgttcaatt aggttctaat 24720
cagtggtagc gcgttacacg gccttgcgct tgtatcttgt ttcgtaagtg tcccttagag 24780
attagcccat atctcacagt ggcggcccca ccaccacact cactaggtga atcctcaaag 24840
agtgggttgt gaccccaccc ctacaaaaat tgtcatcgga ttcattaaga ggtatttttt 24900
tttccaccaa aaatacacat atataaatac ctcaacctta atattgtcac aatttataat 24960
acacctcgtc ataggaatga gaaacggaac agctccgtca aatttcattt tggtgtactt 25020
tagtcaacaa acaatttcgt tgttacccgt tgaactccat tcatgggatc accaatcaca 25080
cggagacggg tgtccattgt tgtaactaaa taatgggctt tagtctcatt cccctcgacg 25140
actcaagtac ttgttgacgc gccaaccctt ttgtaagcgg atccgcaata ttattttctg 25200
acctgacaaa gtcaagagaa atgacaccat gagaaatcaa atttctgata gacttattca 25260
acaatgtttt agatactgct actagtgaga ctgagtttct taaaaatttg ttatgtgctc 25320
taccattgtt gaataagcct atacctccaa ttccaatggg ttgtgatagt ccaatgggtt 25380
gtgatagtta agagaatcta aaataaatat tattttataa aaaaattaat atatatttat 25440
aaattttaaa ttaaaacaca aatatttaga gaaagatgca atgcctcgac ttcgacgtct 25500
ggtcattgac agttgtgagt tgcctgagct tccagaagag ctttggtcat tgactgcctt 25560
actaatggtg catgtttcgt cgccctccca agaattggcc aacagtctca aaaatgtgga 25620
gccgaggaat ggctgtaagc tcataatctc taattaatgc ttcacaactg ttggagtaag 25680
gcaaatgcaa gtgggtctgt catcttaaat tgcagacata agttgtagtc attcaatatc 25740
cttcatcata acttaacttg gctggcagac aatctgtaat gttcggtgct tcttgtcatc 25800
tctatttttc taatattaac gtcactcttc acggttatat tttcatttta atctcagttt 25860
ttgtgtaatt tcttttatca ctgtaattgc aattgcttta ccccacacca caactaacct 25920
tgctctcata acgcaccctc ttcctagacc gaaagaatct gagagaaata aacatttttt 25980
atataatatt tgttttttaa tcccgacccc atttcgattt tctttgccaa ataaatttcc 26040
aatttaaaat agcggaaatt caaattgaga atggatgttg cttccttgcc gtgtatggag 26100
ttgtgtctca tgattacata tctataatac ctagagtttc ttatccattt atgaataata 26160
tattaaatgt ctatttttct aatattaatg tcacccttca ctgttatatt ttcatttttc 26220
gaaaatattt ttaatcaatt tatcatgaaa acttgaatat ttaagtatat gtatatatat 26280
agtttaacta tatttaattt tgaattacta atcattcctc agaattatta tacactacaa 26340
aagtaatcct acgattaatt aactttccca tagccattgg aaattaacca tattccttta 26400
catccaatca aaagaagaag aaaaaaaaaa caaattcatt tagcacgttt aattgttaaa 26460
gctaattatt caaatgacta agaagaaaaa ttataagctc caaagtaaaa cattgattat 26520
caaattatcc tatctaaaac tctaaaaagg ttatgttaat gttaaatgaa atattcattc 26580
ggcccatttg ttaaaaaaaa ttatagctgt acaaattaga gaaataagat ggaaagggag 26640
agaaatatga aataaaatag ttaatgcaat acaaagataa agaaaaaata tgaatcgtaa 26700
aaaatgtaat aagtatttgt tgtaacaata ttataactct tgctaaaaat aggtcaaaca 26760
aatggagtca accagcacag aaatgctcta caataactaa tgttaaatat ttgcaactat 26820
aacttcaatt ccgtgcatga gttgtatatg ttaattatac atttggcgtt gaaatccaag 26880
ctaagtcaaa aataaaagtc taataacata tacaattggt ggtaagattt tgcaatttac 26940
atattcacca cgggaattca gaagaaaaat tttacccacg gcgaaggttc ccaatggtca 27000
gtgtcctagt tttccttgaa gattacattt ataaatcatg gaagttcctg aaaagtcaat 27060
ttctcactta gcattttttt catgttcttt ctattttcaa atcctttgac cataattttg 27120
actttggtat atgtatttgt tgcttcattt caatataccc atttatgaag tagagcaagt 27180
agagacaaaa tcatcaccca gttgatgttt aaaccacaag caaaagaaat gtagtgaaaa 27240
ccaactaaat ggactgttcc cgttcgctca tccctcactt taatgcttga agaacctgtg 27300
agatacagca tagaaaatat tattaaatga gcaattatgc aaaattaaag gaaataatgc 27360
aagtcatttg aaaaatcatt ttaaaactac tgcgagtatc taaaattaca aaaagaataa 27420
cggttaataa ggtttgaaaa taccaaaaga taatatttgg tgcatttgca aattcaaact 27480
ccagaatcca ttctggaact caaaactaat ttgaagcaga tgggatacaa aaggttttta 27540
atatgcattg tgggcacttt gggcagaagc aactttttgt tactttagcc cagaatacag 27600
ttaggccatg atgcagttgg gtctaatata tatatatata gagcggaggg atcaagttac 27660
tttactgtct atcctcacac attcttgaaa tctaatagtt gtaatgaata tttaatctta 27720
atcattagat tgtaagagaa tgaatgatga agatgaggag taactctata tatatatata 27780
tatatatata tgacatagaa ggcaaccaac aggtcccaaa caagccaaat aaaactctgc 27840
taatcataac aaaacacaaa gatataatga gatttgcaat atacttacag agggaaataa 27900
ataatcatgt ggataaacaa tcatctagtg cttcataact tcttgataat ggcaatgcaa 27960
gtgggcattg ttgggttttg ttatggtctt ttatatccat cacgataacg ggcagtggtt 28020
cttatcattc tgtatctttc taatctcatt gccacacgtg ttgtgactgc tagatttcca 28080
ttttaatctc agtttttgtc taatttcttt ttctttcttg gtcctttgtt ctgagtttgt 28140
aactttattt acatgttgat tgtaaaagga tctttgttct ggcagtgttt gattaaatga 28200
tttgtaagaa tggcagtgtt tgattaaatg atttgtaaga atgtttatca cttactatga 28260
agtaggaaca aacgacttgc atattagacc tactacattc accttatctt ttataaaatg 28320
cctgataatt tctacatatt tcgcgggtca tgttgaatgt tacggaaaat actactatat 28380
attgtcttgt tttctcgtac aatatataca atttcttgga gagagtttta ggaagttgca 28440
actctttaga attctcttaa gccataaaat ttcacaaatt ttttgggtgt ttgccgtata 28500
tttacttctc taagtaacca aaatttcccc atcaaaagtg ccagatgtta actgatccct 28560
gctcttatgc atgtatatag ataatcatct ggttcccaaa ctctaattgg cgcacaacca 28620
cagaacagaa ctctactttc ctgtgttcca cgaccacttt accagatttt tctgataggt 28680
tagcattgaa gcctgagaga aattatgcat catttcattt gcttgttgta caaccatctt 28740
taattttgca ttaattaatt taaacctttc tcccttgttt ttcgattcta aacatggatc 28800
acgtttttgt ttattggttt aaagtgttgt ttcatgttat ttttctttcc cttttcccga 28860
ttgatggtcc tttcatgatt tagttaggat agatacctga taacacaatt agttcgaaag 28920
gaagatgtta gagtgtatat agatagtggg agacaaatca taatgatcag ttttataatt 28980
ggagtgaaag cagacagata ttgcttttgt gccatgtctc tataactcaa cccaaacctt 29040
tgctggtttt accatggata agaaaattgt gctgcaacag tccaagagat atagttcatt 29100
attttatgat ctttttggta gatttctgcc aaattcattt cttcttttca gcgatgctat 29160
atagtacgaa ttagttttgc accaagaaat acgaatccac ttggcaaaat attgttggac 29220
aaatattaat ttgaaagaat aaaatctaga catgcaagtt ctaactaccc tctctcaaac 29280
tggtgttaga gtacaggtgt aaagtgaaag taaaaaggtt gaacacgtga acaaataact 29340
tataaacctg agtttaaggt gttgggttag agtgtggtgt cagaccataa cggtaaaatt 29400
gttggaaatt taattagatc aactattcat aaaaatttaa atatattttt tatccttata 29460
atttaatatt ttttttgttt ctaattaatg taaagttttt tttttagttt tggtaaatta 29520
tgtttgatac tttagataat attttgacaa gtgtaaaaat tattatctaa aacatcacaa 29580
gaacaaaaaa gaaaattaaa aaaatataat ttgtaagaaa aaaataattt aataaacact 29640
aaaaaatcac taaattataa gcagtaaaaa atatttaaac ctttgataaa aaagaaaaaa 29700
agaagagtac atttaataaa atttgctgaa ccctgcagaa agattggtta gaacacaata 29760
acgatgttta aagattactg ttaaagactc tgcattttat aattctaact aattgttgtt 29820
tctaaactat ggacgacttt gatttcagaa acacgataac aattcaacaa aactaacaat 29880
ctaaaaagaa aatcagagtc ataacatata ttaatattta aaagaaagaa aaaaaggcta 29940
cgcagttaaa gttgaaaagt caaattataa ataaaaaagg ttgataaaaa cgtgggtcca 30000
agaatattcg cgcccttttc ctgtattggc gtccacttgt tatcgttcgt tgtctactcg 30060
gcatactatc tgtccacaaa ctctctagag tttccacgca agatttcctg tattacaaaa 30120
atggctgata gtgttgttgc ttttgtgcta gataacttgt ctcggctgct tgaagatgag 30180
cacaagttgc tttctggcgt ggaggacaaa atcaactctc tttgcaatga gctcaagttt 30240
atacacatct tcctcaagaa ttctgagggc aagcgcagtc atgagatcgt gaaagaagtg 30300
gtgagccaaa tcagagatgt cgcccacaaa gctgaagatg tggttgacac ctacgttacc 30360
aacatcacca ggcataaaca gagaagcaaa ctgagcaagt tattccacct caaagaacaa 30420
gtcatggtgc ttcaccaagt caactctgac atagagaaga tcaggagtca gatcgatgac 30480
atctataaga acagggacag atatggcatt ggagaaggtg aattccgaag cgaagaagct 30540
gctgcagaag cagaatcact cctcaaaaga aggagggagg tggaggaaga agatgtagtg 30600
ggcttagtgc atgactcaag ccatgtaatt caagaactca tggaaagtga gtcacgtctt 30660
aaagttgttt ccataattgg aatgggaggg ttgggtaaga ccactcttgc ccgtaagatc 30720
tataacaaca atcaagtgca gctgtggttt ccttgccttg catgggtttc tgtgtccaac 30780
gattacagac tcaaggaatt tcttctcagc cttctcaaat gtttaatgtc atccacctct 30840
aaatttaaaa aattaagtga ggaagaactg aagaagaagg tagcagaatg gttgaaatta 30900
agtgaggaag aactgaagaa gaaggtagca aaactgttca aagggaagaa gtatctggta 30960
gtgcttgatg acatctggac aacccaagta tggtatgagg ttaaaggagc ctttccagat 31020
gaccaaacag gtagtagaat tctcataaca agtcgcatca aagaggtggc acactatgct 31080
ggagctgtgt ctccctacga ccttcccatc ctcgatgaag ataaaagctg ggaactcttc 31140
acaaagaaga tttttcgagg tgaagaatgc ccgtctgatt tagagcctct gggtagatcc 31200
attgtgaaaa cttgtggggg tttaccactt gccattgtgg ttttagcagg actcgttgcc 31260
aagaaggaga agtcacaaag agagtggtca agaatcaagg aagtgagttg gcatctttct 31320
gaggataaga ctgaagtgat ggatatactg aaacttagct ataacaactt gcctggaaga 31380
ttaaagcctt gctttctgta ttttggaatc tatccagaag actatgagat caaagcaagg 31440
caattgatca aatattggat cgcagaaggg ttcatacaag cacaaaaaac tggaattgca 31500
gatacaacag aactggaaga tgtagctgac ttttacttgg atgagctggt ggatcgcagc 31560
ttggtgcaag tggcaaaaag gaggagtgat gggggtgtca agacatgtcg gattcatgat 31620
cttctacgcg atctttgctt gtcagaaagc aagtttgata agtttctgga ggtttgcaca 31680
aattccaaca ttcataccgt cagtaatacc aatccccgta gaatgtccat ccactggaaa 31740
cgagactcaa atgtgtctgc aaacacattt aataaatcat gcactcgttc tatgttcatc 31800
tttggtagta atactacggt cctagttcct gttttgaaaa acttcaagtt ggcccgtgtg 31860
cttggttgtg gtgtgtatca agggttttgg tcttattcag tccccagata tttgaagagg 31920
atgatccatc taagatactt gagaatagaa gtcaagcacc ttccagatag tgtatgcagc 31980
ctttggaatc tagaaacact ggatgtaaca tatgaaacca cagtatccag taaaatttgg 32040
acgttgaagc gactgagaca tctttatttg agtgggggag ggaagctacc agtcgtcctg 32100
ccaaaagcaa atagaatgga gaatctccaa acccttttgt tatcgggtaa ttattcacaa 32160
caaactcttt cccggttgaa cagtggcata tttccgaggt tgcgaaaatt agctttgcgc 32220
tatgctgttg aatcagacat gttaccaatt ctacaccacc tcaacaatct tcatagccta 32280
aaagtaatgt acgcaattga acttctatca gacagcaatg cgtttccatc aatcttcata 32340
gtcttaagag tggtgcatgt ttcacggccc tccgaagaat tggctaacag tcttaaaaat 32400
gtggagccca ggaatggctg taagctcata gtctctaatt aatgcttcac aactgttgga 32460
gtaaggcaaa tgcaagtggg tctgtactct tacattacag acataagttg tagcttttct 32520
atatccttca tcataactta atttggcttt taggcaatgg taatgttcgg tgcttcttgt 32580
cattctgtat ttttctaata ttaatgtcac ccttcactgt tatattttca ttttactctg 32640
tttttgtcta atttctttta tcattgtaat tacaatcgct ttaccccaca ccccaactaa 32700
ccttgctatc gtaacctttc ttttatcatt gtctaatatt tgttttttaa tcccgacccc 32760
atttcca 32767
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 14
gtatatttat atatatatat atata 25
<210> 15
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 15
aatatgcttt 10
<210> 16
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 16
tgggtcaacc tgaatgagtc agggttgacc caaa 34
<210> 17
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 17
ctttctttaa tt 12
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 18
attcaaaaat atttttttaa taatt 25
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 19
attaaattta aattgattgt taat 24
<210> 20
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 20
ctattataca ccga 14
<210> 21
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 21
cattaaggcc t 11
<210> 22
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 22
ttaagtatat g 11
<210> 23
<211> 6262
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 23
atttcttctt taattgtttt tttttttttt ttgctcagca aaattaaata tattatagat 60
gagtaccaga ggtactaaaa tatacagatt tagagccata ttacaagtag ttttggacag 120
acaatgatac agtagctgaa atatcccaaa aactactcaa ataagacttg gagctatact 180
ctaaacctat gatgctgtcc taagaaaagc atctttgaga tttgaagacc attgattgaa 240
atgtagagag aaatcttttt caaaacatct gagccatgtc cataaaataa acactgcatc 300
atccattaat ttatgagtgt caaaattagc attggagaaa atgatgctgt tcctatgctt 360
ccaaatcgag taagtgagag cgaaccacca ccactgccat cttttttccc tgcaacccta 420
cggaagctcc aaagatatgc tgactaaaat gctgatccgg ctgataaggg aaaacaccca 480
tcatatttac ccaagactgt gactcccacc atagaggact aactttactg cagtggaaaa 540
ataagtgact tgcagtctct tccacagatc tgcataaggg gcacaagtac tcttgtaact 600
caacccgctt ctttctcaaa ttggctttag ttggcagttt gtcttgaatc aacctccacg 660
cgaagatagc cactttcaat gggaccctaa gcttccataa ttccttgaac tttccatcct 720
gctcttctcc cactgtgaca tgatgtattg ccttatatgc actcttagtc gaataacagc 780
cactaggctc tgctgcccac ttccattggt cacttaattc cggcctgatt gtgaaccctt 840
ccagctgttg gaggaaagct accgccatat ctatctcgct atcaaacaaa ggtctcctcc 900
acttaagact ccattcccac ccaccttctt tcgcagcacc tatttgatga atgaaatgat 960
gtttttgagc tgatatggta tacaatctag gatatttatc agctaagcag ttgtctccgc 1020
ctatccacct atcctcccaa aacttaaact tgtccccaca tccgaccctc cacaatatca 1080
acctattcag ctgttgacct tgattcatgc tttgatttac tatctttaga tccctccacc 1140
atgatgattc agtactagcc ctcgaagctc catcaagact cctccatcct ccatactttg 1200
attcaaggac tctagcccaa gtctcctcct gattctgaaa catctcccat ttccattttc 1260
ctaataatga tgtgttgaac gagatgatat ccttgactcc caacccacct tgttcctttg 1320
gcaaacacac cttttcccac ttgatccaag ggatcttatt ttgatcagct gcaccacccc 1380
ataagaagtt cctttgtaat ctggttatct tgctaatcac ctgcctaggg accctgaaaa 1440
aagatagaaa ataaattgga atagatgtta gcactgaatt tatgagaatc actctccccc 1500
caaaagacaa gtgtctctgt ttccatcctg ccagttttct ctcacactta ttgattaaag 1560
gttcccacgt ctgacatctt ctaggattag caccaatagg tatgccaaga tatgtgaaag 1620
gaaaagacat caatccacag ttgagataac tggatgcacc ataagtccac tgctcaggca 1680
ccccaaaggc cccacaacta ctcttggcga aatttatctt taaccccgat gacatctcaa 1740
aagcacgaag tattgcattg attgttctta cattcgctaa tgttgcctct cccaaaaata 1800
gtgtcatctg catactgaag caggctaatc tccaccttct ttgagcccac taaaaatccc 1860
ttatagaatc ctccctcaat tgctttggtc attagaccgc tcaaaccttc tgcaacaata 1920
ttaaacaaaa ggggtgataa tggatccccc tgtctaagac ctttctgtgg atagaactcc 1980
ttcgtagggc ttccatttac caagactgag atggaagctg attttaaaca tctctgtatc 2040
cactgaatcc acttcggtcc aaaacccaat ctcctcatca tgtatatcaa aaaatcccaa 2100
gacactaagt catacgcctt ctcatagtcc accttgaaaa ccatgcatgg tttttgacat 2160
cttttggcct cttcaactac ctcatttgca atcaccacac tatgaagcat gtgcctacct 2220
tgtatgaatg ctgactgacg atcactaatt atgaggggca taactctctt cagtctatta 2280
ggcaacactt tagcgaggat tttataggta catccgatga gtgaaatagg tctatattca 2340
ttcaaccctt gagggtccgc caccttcggg attaaagcta tgaatgatgc gttcaagccc 2400
ctcgggaaga ctccgttgac atagaactcg tcaaagaatc taagaaaatc tggtttgatg 2460
acctcccaaa attgcttgat gaatttgaaa ttgaacccgt ctgggcccgg acttttatca 2520
cttccacaac tccaaacagc cctccttatc tcctcttcct gaaagtgctc gactaacatg 2580
gcattctgat gggaatcaat ggtattgaag ctgatcccat tcagagttgg cctatcaaaa 2640
tctgtttcct ggaacctctg tgaaaaaaat ctcctaactt cctctttgac ttcagccggc 2700
tcctccttcc acatcccatc aaccatcagt ccatttaggc tattggatcg cctcctggaa 2760
tttatcagca aatgttaata cctcgaatta caatcaccct ccttaatcca cctggatctt 2820
gccttctgac gtaacagcga ctcatgagtt tgggctgcct cccaaacctt ctgctgcaac 2880
ttctttttga gtatccgctc attatcatcc agtggtctgt ctgctgattc ctcttctagt 2940
ttgttcaact cttcctctat cctcttgaaa cggcttaaag tgtctccaaa gtgatcttta 3000
ttccacgcct ttatcttctg tttgagggcc ttgaatttgt tttttaaaac atgacccccc 3060
catccactct gagtattgga tgaccaggtt tcggacacca acttcttaaa agatacatca 3120
gataaccaac aatccaatag tctgaaaggt tttgggcccc aatcaatggt tttagatcta 3180
agcaatatgg gacaatggtc cgaaaaattc ctggctagcg gtgtttggac cgatccgggc 3240
catttggaaa gccactctgg ggaaacgaag gctctatcca acttgctttt agctgtaccg 3300
ttcggtctaa accatgtaaa tctctttccc acccaaggcg cttcttctaa ttccaactcc 3360
tcaatccagc tattaaaatc ccgtatgctt ccatccacca tccccctctg cgaagacccc 3420
actctttctc cacttatcct gatgttgtta aagtccccta taatacacca ataaccattt 3480
ggattctgga ttttcagctg agtgacttta tcccataaca cccttttgtc ctgcaggtta 3540
catggggagt atatatttac aacatgcact gctatggatt cttgacccca ctttcctgac 3600
agtagtatga agcccgatcc agctgatttg ctctccacct tcagagactt ttgattccaa 3660
atacagagaa taccaccagc tgtatttacg gctggaacct cctcccagca gaaatcagaa 3720
ttcccccata gagccctgca catactctta ttgaccgttt ccttctttgt ttcttgtaag 3780
cataaaaggt caatatgata ctctttgacc atacgtctaa ttgctggcca tttaaccccc 3840
ctccccaacc cccttacatt ataagagatg atattcatga gtcccttccc cttcctccca 3900
agctatctgc ctcttttcca tctctatctt ccatttctgt caactgttga acataatctc 3960
tttgagtttt tcctgttgtc agtcccaact ccttgatcat tctccataga ctttcttcgt 4020
gcgagtcaaa agtttcctcc tggagctgat tttcctgcct attgtgagtt gatgatgttt 4080
ctgtttgtat ttgggggttg gctgatccac gtccctcgtt atctcgctgg aatagtccat 4140
tttgaacatg ctctgggctt gaaagcactt ggttcgaaac aacctcacct atttgggctt 4200
taactctctt cattttccct ttacgggaat acgttaacaa aggggttagg agaggtgttg 4260
tttttaaaac tgggccattt ttgggagaag gacataattt aggtggggtg ttaatagctt 4320
ggcccaaatc cagcagcccc atcatctcct tgtcacgtga cttgggtgag ggggattcaa 4380
aattatgttt gtcttcctcg tacaccatgc ctccaacgtt tcttgtctgc ctcctcatac 4440
tattttcata caaattgccc aaaccgtcag ggccgacatc ccccccgagg ttatcttctt 4500
cccctaaatc ggtcttccct tcttcctgcg acactggtag ctcacggtcc ctggtctgca 4560
cgcatttatc acctgtcagt gcattatctg cttgcttcac gacccatcgg acaatagctt 4620
tgtcctttgg gtcatgtccg ctcttcgtcc cgatcgcctt tccgttttgg tccgcaccgg 4680
ccgcgactgt cgccggtcct tctgaccgag agacctgcct gagtcgccct tcttccacac 4740
cacgcggcga cctctcctcg tcgccacccc tatcctctgt gtcatccacc gtctccgact 4800
gggctggagc tcccctttgg gttttaaatg gcacgatttc acttctccct ctgcggttat 4860
cttcctcgcc ccccaccact ccctccgtcg ccatatcctc catggcttct gcctccaagg 4920
tccctccctt cgctactgtt cgtatttcct ccgccacgct ctctattcgc gctttgtacc 4980
gccacccctg cagctcacta ccagaccacg cgtcatcgtt acattcgtca gaaaggattt 5040
cctctgatga gctgaagtca cgttcccttt ttggctgcca cctagctcca aacaacccac 5100
tctcctccgc tatgtgcacc ggaaaaatct ccccctgtat atgaatattt accgtgtgct 5160
gaatcagcgg tttccatggc gttttgacca gtatcctcgc gacgtcgaac ctcctttgat 5220
cttctaagct ctcctcagcc tccaccatct cacctattcc cgcgactatc tgcttgatac 5280
agttcatgtc ccatgcaacc aaaggtattc cccaacattg gatccaagtt agtctaaaac 5340
cagggcgtag acttggattc cacttctcta tggagtagaa caggtcgccc catccttcat 5400
cttcttcatt caccattttc tctgcgttct cttctgtgag ccccagtaac aaaaccatgt 5460
catcaccgat gtactttggt gatatgtttt gtccgctatc ccaccatatg gcttcttcta 5520
tgctatcaaa gctagccaag tttttcagtc tacccaccca ggcctccttg agccattgtt 5580
tacccgtcat cgaaatgtcc aggttcactt ccgatgtggc attggaactt atgtattgga 5640
gtttggctgt tgttctcctc tgtgctggtt tcgggatatt cgtgttgacc acctccgcat 5700
acgaccgtcc ttggattccc atattcgctt ctggtaacct gctcaggtac acttctgttc 5760
ttcccttttg tgtttgtcct gtctctgctg tccccctctc gactgtttgt gattctccct 5820
tctttggtct cccatattta gggatattaa cattcatctt cattcctccg aagaacctat 5880
tgtccaaatg ctgctgaagt tgatgcacat ctctcacccc cttatacctc acaaaaccat 5940
atctccttcc ttggttgttt cttttcctgg gtatgaaaac ctctctcacg tctccttgct 6000
gtttaaaatg gaaccacaaa tcctttgctg ttgcgtcttc cgggaacctc gtaaagtaaa 6060
aggatataac gtccttatgg tctctccagt tcgctcgcgt gtaggattga cgctgtcctg 6120
tggctaaccc ttcgatggtc agatgggaac cctctgactc tcgaaatctg actctagctc 6180
tcctctcttt cctagtccta actctctccc acccactgtt tctctctcta ctctctctct 6240
ctctccatga ttggattgtt ct 6262
<210> 24
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 24
acagctcgag ttaatat 17
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 25
agaaatggag aaagtg 16
<210> 26
<211> 12
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 26
ccttcttcag tt 12
<210> 27
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 27
ttttatcatg aaa 13
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 28
atatatatat atatat 16
<210> 29
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 29
aaggggggaa tgg 13
<210> 30
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 30
aaatatatat atatatatat atatatatat atatatatat at 42
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 31
ataaataaat aataatagt 19
<210> 32
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 32
cttcttactt gtaactaagt ctttga 26
<210> 33
<211> 289
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 33
tatatttttt gtgtttggtc tttgataaat ttttctttcg aatttggatt ctaatgtttt 60
aaatttttta tcttaaagtc tctatcatta atatgtaatc ctacatgact cttaattaga 120
cacgtagaag tgtgatgtgt catgtcaaat ataacctttg tgatttctat ttatacatat 180
tggattatta aaaaaaaata ttttctttgt taaaaaataa taaaatccaa cttatataaa 240
caataatccg acataataca tcacattttt acgtgtgtcc agttcatac 289
<210> 34
<211> 13
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 34
ttttgacaaa aac 13
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 35
caacactaac aaatttta 18
<210> 36
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 36
caagtatgca ggcttttgta cccatagtac cactggtact atttcaatct ataatatata 60
tatttttgct gagcaaaaaa aaaa 84
<210> 37
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 37
aaacccatga taactggttt taattgtggg ctgtctccat actctacaca agct 54
<210> 38
<211> 332
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 38
ctgtccagcc aagatcttga ctgttgtagt tgaacttagt agctgaagag gaaagagaat 60
gtgatgggtg gttgagattt gggaaggaga gaaaccttgc tgggagaggc tgcagaggat 120
ccagattcct gctatatatt gtcatgataa ctgtcaagtg tgaaattgag agcttgctaa 180
tcttgtagaa tatataaacc atttttgact tttttttttt aaaaaaatga tttgatcata 240
tggcattcat gtttgtttga gttgtagcag tttctttctg ttcccataaa ttgttatcat 300
tcttttttga gagttggatt tactggtttg ag 332
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 39
aatagcccca cccttaatt 19
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 40
tcatcatgct aaaactgagt a 21
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 41
ttgaggaaga actgaagaag gtagc 25
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 42
attgaaaatt gttcctgtac 20
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 43
tggcttagga agaaagctc 19
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 44
atctctgatc tggctcac 18
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 45
caacaaatac atataccaaa gtc 23
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 46
acaaaatcat caccaagttg a 21
<210> 47
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 47
atctgcatgc taatcctg 18
<210> 48
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 48
ttcgatctga ctcctgat 18
<210> 49
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 49
caatagcccc atccttaa 18
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 50
ctcatcatgc taaaattgag ta 22
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 51
acggattgag gaaggtagca gaa 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 52
cctattgaaa attgttcttg tac 23
<210> 53
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 53
tggcttagga cgaaagct 18
<210> 54
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 54
tctctgattt ggctcac 17
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 55
agcaacaaat acatatatca aagtc 25
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 56
caaaatcatc acccagttg 19
<210> 57
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 57
ctgcatgctc atcctg 16
<210> 58
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 58
cgatctgagt cctgatc 17
<210> 59
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 59
ggatggaatg ggaaagtctt gataa 25
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 60
aaaacctgcg aagctccttt acta 24
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 61
gtttgttgtc cacgcctgaa 20
<210> 62
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 62
ttacgtcaat gctcttaagg tctaa 25
<210> 63
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 63
gccttgacct catccattga tagag 25
<210> 64
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 64
ggtgtcaacc acatcttcag cttt 24
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 65
acttgctcta cttcataaat gggta 25
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 66
acccatttat gaagtagagc aagta 25
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 67
tccgagaaag gaatagttct gtg 23
<210> 68
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 68
caccttctcc aatgccatat ctgt 24
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 69
gcaagcaaac ctcgaaccta 20
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 70
cccacccgtt tatcatttgc actt 24
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 71
tgtcatcaag catcaccagg ta 22
<210> 72
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 72
actaataaca aggaggtggc atac 24
<210> 73
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 73
actaataaca aggaggtggc atac 24
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 74
ttctggcgtg gaggacaaa 19
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 75
gtcagtgtcc tagttttcct tga 23
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 76
agcgaacggg aacagtccat 20
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 77
ggacgacact tttacatcaa acac 24
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 78
gcttcaccaa gtcaactctg a 21
<210> 79
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 79
tttccctgta ttggcgtcca cttgtta 27
<210> 80
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 80
atcgtcaacc actacatcg 19
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 81
tttaacaaat gggacgaatg aatattt 27
<210> 82
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 82
atgtgtgtgt g 11
<210> 83
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 83
gaaaggtgga 10
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的
<400> 84
taatataatt tatttattaa 20

Claims (72)

1.一种优良大豆植物，其基因组中具有来自第二大豆属植物的染色体区间，其中与不包含所述染色体区间的对照植物相比，所述染色体区间赋予了增加的亚洲大豆锈病(ASR)抗性。
2.如权利要求1所述的植物，其中所述染色体区间衍生自大豆株系SX6907。
3.如权利要求1或2所述的植物，其中所述染色体区间包含SEQ ID NO:2或其任何部分，其中所述部分在所述植物中赋予了增加的ASR抗性。
4.如权利要求3所述的植物，其中所述染色体区间包含与SEQ ID NO:2至少85％、至少90％或至少95％相同的核酸序列。
5.如权利要求1或2所述的植物，其中所述染色体区间编码SEQ ID NO:1的蛋白质，并且其中蛋白质在所述植物中赋予了增加的ASR抗性。
6.如权利要求1或2所述的植物，其中来自所述第二大豆属植物的所述染色体区间插入所述植物的第18号染色体。
7.如权利要求6所述的植物，其中来自所述第二大豆属植物的所述染色体区间插入大豆株系Williams 82的第18号染色体上在约碱基对56,680,416处开始并且在约碱基对56,677,361处结束的区域或其他大豆株系中的等效区域。
8.如权利要求1或2所述的植物，其中所述染色体区间包含SEQ ID NO:11-13或其任何部分，其中所述部分在所述植物中赋予了增加的ASR抗性。
9.如权利要求1或2所述的植物，其中所述染色体区间包含与增加的ASR抗性相关联的SNP标志，其中所述SNP标志与如表1中所列出的有利SNP标志中任一个对应。
10.如权利要求1-9中任一项所述的植物，其中所述区间衍生自所述第二植物的第18号染色体。
11.如权利要求1-10中任一项所述的植物，其中通过分子标志选择来选择或鉴定所述植物的至少一个亲本品系，其中基于位于所述染色体区间内或与其紧密连锁的分子标志的存在来选择或鉴定所述亲本品系，所述染色体区间对应于SEQ ID NO:11-13中任一个，其中所述分子标志与增加的ASR抗性相关联。
12.如权利要求11所述的植物，其中所述分子标志是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状基因座(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
13.如权利要求11或12所述的植物，其中所述分子标志是SNP标志，并且所述分子标志是如表1中所示的任何有利标志。
14.如权利要求1-11中任一项所述的植物，其中所述植物是农艺学上优良的大豆植物，所述大豆植物具有商业上显著的产量和/或商业上易感的活力、结实、可立性或脱粒性。
15.如权利要求1-11中任一项所述的植物，其中所述区间通过对应于以及包含SEQ IDNO:2或11中任一个的序列的基因组编辑而引入所述植物基因组中。
16.如权利要求15所述的植物，其中所述区间通过以下而引入：与对应于SEQ ID NO:11-13的任一个的区间同源的大豆基因组区域的基因组编辑或对应于SEQ ID NO:11-13的任一个的区间的直系同源物的基因组编辑，并且进一步对所述大豆基因组区域进行至少一个基因组编辑以包括对应于如表1中描述的任何有利等位基因的至少1个等位基因改变，其中所述大豆基因组区域在基因组编辑之前不包含所述等位基因改变，并且进一步地其中所述基因组编辑在植物中赋予了增加的ASR抗性。
17.如权利要求16所述的植物，其中所述基因组编辑通过CRISPR、TALEN、大范围核酸酶或通过基因组核酸的修饰来完成。
18.如权利要求1-16中任一项所述的植物，其中所述区间通过对应于以及包含SEQ IDNO:11-13中任一个的序列的转基因表达而引入所述植物基因组中。
19.如权利要求1或2所述的植物，其中所述染色体区间包含SEQ ID NO:11，或其赋予ASR抗性的部分。
20.如权利要求1或2所述的植物，其中所述染色体区间包含SEQ ID NO:12，或其赋予ASR抗性的部分。
21.如权利要求1或2所述的植物，其中所述染色体区间包含SEQ ID NO:13，或其赋予ASR抗性的部分。
22.一种具有商业上显著的产量的农艺学上优良的大豆植物，所述大豆植物包含衍生自大豆SX6907的染色体区间、包含SEQ ID NO:2的染色体区间、包含SEQ ID NO:11-13的染色体区间、编码SEQ ID NO:1的蛋白质的染色体区间、或其部分，其中与不包含所述染色体区间的对照植物相比，所述染色体区间或其部分在所述植物中赋予了增加的ASR抗性。
23.一种衍生自如权利要求1-22中任一项所述的植物的植物细胞、种子或植物部分。
24.一种来自如权利要求1-23中任一项所述的植物的子代植物。
25.一种产生对亚洲大豆锈病(ASR)具有增加的抗性的大豆植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供第一大豆植物，其在其基因组中包含对应于SEQ ID NO:11、12或13的染色体区间、或编码SEQ ID NO:1的蛋白质的染色体区间或包含SEQ ID NO:2的染色体区间，其中所述第一大豆植物对ASR具有增加的抗性；
b)将a)的大豆植物与不包含所述染色体区间的第二大豆植物杂交；以及
c)通过从所述子代植物中分离核酸并在所述核酸内检测与增加的ASR抗性相关联的等位基因，从b)的杂交中选择子代植物，并且进一步地其中所述等位基因与对应于SEQ IDNO:11、12或13的染色体区间或编码SEQ ID NO:1的蛋白质的染色体区间或包含SEQ ID NO:2的染色体紧密连锁或位于其内，从而产生对ASR具有增加的抗性的大豆植物。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述等位基因对应于如表1中描述的有利等位基因中任一个。
27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述第一或第二大豆植物是优良大豆植物。
28.一种产生对亚洲大豆锈病(ASR)具有增加的抗性的大豆植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)从大豆植物中分离核酸；
b)在a)的核酸中检测与增加的ASR相关联的至少一个分子标志，其中所述分子标志位于20cM、10cM、5cM、1cM 0.5cM内，或与跟来自大豆第18号染色体的包含SEQ ID NO:2或SEQID NO:11或其部分的基因组区域对应的染色体区间紧密连锁，其中所述部分赋予植物增加的ASR抗性；
c)基于b)中检测的分子标志的存在，选择植物；以及
d)从c)的鉴定为具有与增加的ASR抗性相关联的所述等位基因的植物产生大豆子代植物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述分子标志与如表1中描述的有利等位基因中任一个紧密连锁或由其组成。
30.一种鉴定或选择具有增加的ASR抗性的大豆植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)从大豆植物中分离核酸；
b)在所述核酸中检测与增加的ASR抗性相关联的分子标志的存在，其中所述分子标志位于如表1中描述的标志的20cM、10cM、5cM、1cM、0.5cM内；以及
c)基于在b)中检测的分子标志，鉴定或选择具有增加的ASR抗性的大豆植物。
31.如权利要求30所述的方法，其中在b)中检测的等位基因由如表1中描述的任何有利标志组成。
32.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述分子标志是单核苷酸多态性(SNP)、数量性状基因座(QTL)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、限制性片段长度多态性(RFLP)或微卫星。
33.如权利要求28-31中任一项所述的方法，其中所述检测包括扩增标志基因座或所述标志基因座的一部分，并检测得到的经扩增的标志扩增子。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述扩增包括：a)将扩增引物或扩增引物对与从第一大豆植物或种质分离的核酸混合，其中所述引物或引物对与所述标志基因座的至少一部分互补或部分互补，并且能够使用所述大豆核酸作为模板通过DNA聚合酶启动DNA聚合；以及b)在包含DNA聚合酶和模板核酸的DNA聚合反应中延伸所述引物或引物对以产生至少一个扩增子。
35.如权利要求33或34所述的方法，其中所述扩增包括采用聚合酶链式反应(PCR)或连接酶链式反应(LCR)，使用分离自大豆植物或种质的核酸作为所述PCR或LCR中的模板。
36.如权利要求25-28中任一项所述的方法，其中所述核酸选自DNA或RNA。
37.一种诊断ASR抗性的引物，其中所述引物可用于PCR反应以指示与ASR抗性相关联的等位基因的存在，其中所述等位基因是如表1中描述的任何有利等位基因。
38.一种赋予大豆植物ASR抗性的方法，所述方法包括：
a)提供来自具有ASR抗性的大豆植物的第18号染色体的核酸分子，其中所述核酸编码ASR抗性；以及
b)将所述核酸分子插入缺乏ASR抗性的大豆株系的第18号染色体，从而产生与不包含所述核酸的对照植物相比具有增加的ASR抗性的植物，
其中所述核酸分子选自由以下组成的组：
编码SEQ ID NO:1的蛋白质的核酸；
包含SEQ ID NO:2的核酸序列的核酸或其任何部分，其中所述部分在所述植物中赋予了增加的ASR抗性；以及
包含SEQ ID NO:11的染色体区间。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述核酸分子衍生自大豆株系SX6907。
40.如权利要求38或39所述的方法，其中所述核酸分子插入大豆植物的第18号染色体。
41.如权利要求38所述的方法，其中所述核酸分子插入在约碱基对56,680,416处开始并且在约碱基对56,677,361处结束的区域。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述方法包括Cas12a介导的基因替换。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述方法包括2种gRNA。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述方法包括SEQ ID NO:79和/或SEQ ID NO:81的gRNA。
45.如权利要求38-44中任一项所述的方法，其中所述方法包括用PCR和/或测序来筛选靶向的插入。
46.一种蛋白质，其选自：
(A1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的蛋白质；
(A2)与以下相比具有一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加并且与以下具有相同功能的蛋白质：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列；
(A3)与以下具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性并且与以下具有相同功能的蛋白质：(A1)或(A2)中定义的氨基酸序列；或
(A4)通过在(A1)至(A3)中任一项中定义的蛋白质的N末端和/或C末端加标签而获得的融合蛋白。
47.一种核酸分子，其编码如权利要求46所述的蛋白质。
48.如权利要求47所述的核酸分子，其中所述核酸分子是以下中的任一个：
(B1)SEQ ID NO:2中所示的DNA分子；
(B2)与(B1)中定义的DNA分子在严格条件下杂交并编码所述蛋白质的DNA分子；或
(B3)与(B1)和(B2)中定义的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或80％以上同源性并编码所述蛋白质的DNA分子。
49.一种表达盒、重组载体、重组细菌或转基因细胞系，其包含如权利要求47或48所述的核酸分子。
50.如权利要求49所述的表达盒，其特征在于启动所述表达盒中所述核酸分子转录的启动子是原始内源启动子，并且所述原始内源启动子的核苷酸序列在SEQ ID NO:7中显示，或者，是另一种能够在植物中启动所述核酸分子转录的启动子。
51.如权利要求49所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是通过以下获得的重组质粒：在pB2GW7载体的attR1和attR2位点之间克隆所述核酸分子并且用SEQ ID NO:7所示的RppRC1基因的内源启动子替换SacI和SpeI酶消化位点之间的35S启动子。
52.如权利要求46所述的蛋白质或如权利要求47或48所述的核酸分子、或如权利要求49-51中任一项所述的重组载体、重组细菌或转基因细胞系在调节植物对锈病的抗性中的用途。
53.如权利要求51所述的载体的用途，其中所述蛋白质或其编码基因在所述植物中的表达水平和/或活性增加，并且所述植物对锈病的抗性增强。
54.一种改善植物对锈病的抗性的方法，所述方法包括增加如权利要求46所述的蛋白质在所述植物中的表达水平和/或活性。
55.一种繁育具有改善的对锈病的抗性的植物品种的方法，所述方法包括增加如权利要求46所述的蛋白质在受体植物中的表达水平和/或活性。
56.如权利要求54或55所述的方法，其中增加所述植物中所述蛋白质的表达水平和/或活性可以通过转基因方式或通过有性杂交来实现。
57.一种繁育具有改善的对锈病的抗性的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：将如权利要求47或48所述的核酸分子引入受体植物以获得转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物具有改善的对锈病的抗性。
58.如权利要求57所述的方法，其中将所述核酸分子引入所述受体植物是通过将如权利要求49-51中任一项所述的表达盒或重组载体引入所述受体植物来实现。
59.一种用于扩增如权利要求47或48所述的核酸分子的引物对。
60.如权利要求59所述的引物对，其中所述引物对是分别由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的两条单链DNA构成的引物对1，或分别由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的两条单链DNA构成的引物对2。
61.一种用于扩增如权利要求47或48所述的核酸分子的探针。
62.一种试剂盒，其包含如权利要求59或60所述的引物对和/或如权利要求61所述的探针。
63.一种植物，其包含如权利要求47或58所述的核酸分子。
64.如权利要求63所述的植物，其中所述植物是通过使用如权利要求54或55所述的方法繁育获得的具有改善的对锈病的抗性的转基因植物，或者是大豆SX6907，或使用所述大豆SX6907作为亲本有性杂交后获得的包含如权利要求47或48所述的核酸分子的子代植物；所述大豆SX6907在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登录号为CGMCCNo.17575。
65.如权利要求59或60所述的引物对或如权利要求61所述的探针或如权利要求62所述的试剂盒在鉴定待测植物是否包含如权利要求47或48所述的核酸分子中的用途。
66.如权利要求59或60所述的引物对或如权利要求61所述的探针或如权利要求62所述的试剂盒在鉴定待测植物是否具有如权利要求47或48所述的核酸分子赋予的对锈病的抗性中的用途。
67.如权利要求52-66中任一项所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其中所述锈病是豆科植物锈病。
68.如权利要求67所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其中所述豆科植物锈病是大豆锈病。
69.如权利要求68所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其中大豆锈病的病原菌是豆薯层锈菌或山马蝗层锈菌。
70.如权利要求69所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其中所述豆薯层锈菌是豆薯层锈菌的生理小种SS4。
71.如权利要求52-70中任一项所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其中所述植物是豆科植物。
72.如权利要求71所述的用途或方法或引物对或探针或试剂盒或植物，其中所述豆科植物是以下中的任一个：大豆、苜蓿、三叶草、豌豆、菜豆、扁豆、羽扇豆、牧豆树、角豆、大豆、花生或罗望子。
CN202080059267.1A 2019-07-01 2020-07-01 与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座 Active CN115175556B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202311040417.6A CN117904170A (zh) 2019-07-01 2020-07-01 与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2019105844201 2019-07-01
CN201910584420.1A CN112239491A (zh) 2019-07-01 2019-07-01 与抗锈病相关的蛋白及其编码基因与应用
PCT/CN2020/099619 WO2021000878A1 (en) 2019-07-01 2020-07-01 Novel genetic loci associated with rust resistance in soybeans

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202311040417.6A Division CN117904170A (zh) 2019-07-01 2020-07-01 与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座
CN202410346906.2A Division CN118271412A (zh) 2019-07-01 2020-07-01 与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115175556A true CN115175556A (zh) 2022-10-11
CN115175556B CN115175556B (zh) 2024-04-16

Family

ID=74100883

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910584420.1A Pending CN112239491A (zh) 2019-07-01 2019-07-01 与抗锈病相关的蛋白及其编码基因与应用
CN202311040417.6A Pending CN117904170A (zh) 2019-07-01 2020-07-01 与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座
CN202080059267.1A Active CN115175556B (zh) 2019-07-01 2020-07-01 与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910584420.1A Pending CN112239491A (zh) 2019-07-01 2019-07-01 与抗锈病相关的蛋白及其编码基因与应用
CN202311040417.6A Pending CN117904170A (zh) 2019-07-01 2020-07-01 与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20220380796A1 (zh)
EP (1) EP3993610A4 (zh)
CN (3) CN112239491A (zh)
AR (1) AR119313A1 (zh)
BR (1) BR112021026888A2 (zh)
CA (1) CA3144285A1 (zh)
CL (1) CL2021003558A1 (zh)
CO (1) CO2022000810A2 (zh)
MX (1) MX2022000075A (zh)
UY (1) UY38772A (zh)
WO (1) WO2021000878A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY39283A (es) * 2020-06-22 2022-01-31 Syngenta Crop Protection Ag Nuevos genes de resistencia asociados a resistencia a enfermedades en soja
CN113287512A (zh) * 2021-06-30 2021-08-24 毕节市农业科学研究所 一种早代选择与改良回交的蚕豆育种方法
CN114480397B (zh) * 2022-03-10 2023-09-08 佛山科学技术学院 特异性识别猪Wip1基因的sgRNA及其应用和产品
WO2024018016A1 (en) 2022-07-21 2024-01-25 Syngenta Crop Protection Ag Crystalline forms of 1,2,4-oxadiazole fungicides
GB202214202D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Agricultural methods
GB202214203D0 (en) 2022-09-28 2022-11-09 Syngenta Crop Protection Ag Fungicidal compositions
WO2024100069A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Syngenta Crop Protection Ag Microbiocidal pyridine derivatives

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104293922A (zh) * 2014-09-18 2015-01-21 中国农业科学院油料作物研究所 与大豆抗锈病基因紧密连锁的分子标记GmSSR18-24及应用
CN104388568A (zh) * 2008-04-24 2015-03-04 孟山都技术有限公司 鉴定大豆中亚洲大豆锈病抗性数量性状基因座的方法和其组合物
CN107873057A (zh) * 2015-05-11 2018-04-03 双刃基金会 用于转移对亚洲大豆锈病抗性的多核苷酸和方法
CN109714951A (zh) * 2016-06-09 2019-05-03 先正达参股股份有限公司 与大豆中疾病抗性相关联的新颖的遗传基因座

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9416368B2 (en) * 2013-03-13 2016-08-16 E I Du Pont De Nemours And Company Identification of P. pachyrhizi protein effectors and their use in producing Asian soybean rust (ASR) resistant plants
CN104164501B (zh) * 2014-08-04 2016-05-25 中国农业科学院油料作物研究所 一个大豆抗锈病基因位点及应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104388568A (zh) * 2008-04-24 2015-03-04 孟山都技术有限公司 鉴定大豆中亚洲大豆锈病抗性数量性状基因座的方法和其组合物
CN104293922A (zh) * 2014-09-18 2015-01-21 中国农业科学院油料作物研究所 与大豆抗锈病基因紧密连锁的分子标记GmSSR18-24及应用
CN107873057A (zh) * 2015-05-11 2018-04-03 双刃基金会 用于转移对亚洲大豆锈病抗性的多核苷酸和方法
CN109714951A (zh) * 2016-06-09 2019-05-03 先正达参股股份有限公司 与大豆中疾病抗性相关联的新颖的遗传基因座

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B.B.RHODES: "Intersubgeneric hybridization between Glycine max and G. tomentella: production of F1, amphidiploid, BC1, BC2, BC3,and fertile soybean plants" *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022000075A (es) 2022-05-30
EP3993610A1 (en) 2022-05-11
US20220380796A1 (en) 2022-12-01
BR112021026888A2 (pt) 2022-03-15
AR119313A1 (es) 2021-12-09
EP3993610A4 (en) 2023-08-23
CN112239491A (zh) 2021-01-19
CN115175556B (zh) 2024-04-16
CA3144285A1 (en) 2021-01-07
CO2022000810A2 (es) 2022-06-21
CN117904170A (zh) 2024-04-19
CL2021003558A1 (es) 2022-08-19
WO2021000878A1 (en) 2021-01-07
UY38772A (es) 2021-11-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN115175556B (zh) 与大豆中锈病抗性相关联的新颖的遗传基因座
AU2016355682A1 (en) Haploid induction compositions and methods for use therefor
CN106687594A (zh) 用于产生对草甘膦除草剂具有抗性的植物的组合物和方法
CN111263810A (zh) 使用多核苷酸指导的核酸内切酶的细胞器基因组修饰
WO2016057515A9 (en) Genetic control of axillary bud growth in tobacco plants
CN113430295A (zh) 微肽及其用于调节基因表达的用途
CN113121664A (zh) 鉴定、选择和产生疾病抗性作物的方法
KR20170032317A (ko) 담배 프로테아제 유전자
CN111542610A (zh) 精确基因组编辑的新策略
CN103443292B (zh) 与对核盘菌属的全植株大田抗性相关联的qtl和鉴定对核盘菌属的全植株大田抗性的方法
KR20150096765A (ko) 식물 조절 요소 및 그의 용도
CN113874388A (zh) 孤雌生殖基因
CN111295447A (zh) 玉米优良事件mzir098
CN113646326A (zh) 用于抗植物病害的基因
CN110818784B (zh) 水稻基因OsATL15在调节农药的吸收转运中的应用
KR20140135719A (ko) 종자 활력의 조절
KR20170106314A (ko) 노린재류 해충을 방제하기 위한 염색질 재형성 유전자의 모 RNAi 억제
KR101760932B1 (ko) 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법
CN111154770B (zh) 水稻基因OsABCC2在调节农药的吸收转运中的应用
CN115867565A (zh) 用于改善对大豆锈病的抗性的方法
KR101760935B1 (ko) 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법
KR101760934B1 (ko) 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법
KR101760931B1 (ko) 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법
RU2820183C2 (ru) Устойчивость к растрескиванию стручков у растений рода brassica
KR101760933B1 (ko) 양파의 임성회복 관련 분자 마커 및 웅성-가임 또는 웅성-불임의 선별방법

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant