CN112921037B - 一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与鉴定的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与鉴定的方法，利用Cas9蛋白，基因组靶向特异性导向RNA，辅以一条两端带有短同源臂，中间插入在斑马鱼基因组中无相似序列的通用型终止翻译序列，来实现高效、精确、定点和定向的斑马鱼基因组插入式敲除。同时，提供特异的插入片段检测用的引物，帮助实现基因敲除的快速检测。该方法克服了目前已有的随机敲除方法效率偏低、突变的随机性以及阳性鉴定难等问题。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与快速鉴定的方法。
背景技术
模式生物斑马鱼与人类基因具有很高的同源性，素有水中小白鼠的美誉。斑马鱼是发育生物学研究的理想模式生物，具有体外发育，发育速度快，胚胎透明，产卵量大等诸多优点。在利用斑马鱼进行基因功能研究时，我们需要对斑马鱼的特定基因实现高效快捷的敲除。近年来，基于斑马鱼基因编辑技术的开发和应用的需求日益迫切。
CRISPR-Cas9是目前在斑马鱼上运用最多的用于基因敲除的系统，该系统具有切割效率高，设计容易，成本较低等优点。然而，在实际的基因敲除运用过程中，我们通常会碰到Cas9靶向切割目的序列之后突变的随机性以及检测的困难。因此，在斑马鱼中建立一种高效且能方便快速阳性鉴定的方法迫在眉睫。
目前利用CRISPR-Cas9进行斑马鱼基因敲除，主要是采用CRISPR-Cas9蛋白加上特异导向的sgRNA，利用生物体内自身的双链断裂（double-strand break, DSB）引起的非同源重组末端连接（non-homologous end joining, NHEJ）修复方式产生突变（indels）。传统的方法，引起的突变可能是碱基缺失，也有可能是碱基插入，在外显子区域引入的突变或插入缺失很可能是3或3的倍数，达不到针对目的基因进行突变的效果。另外一个问题就是，这种突变的检测方式通常都只能够针对靶向切割区域的两端设计一对引物，将该区域的DNA序列通过PCR的方法进行扩增之后测序，检测过程费时，且费用高昂。
因此，本领域亟待提出一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与快速鉴定的方法，能够快速、高效且易于检测的构建斑马鱼基因突变型的遗传病模型。
依此，特提出本发明。
发明内容
本发明提供了一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与快速鉴定的方法，利用Cas9蛋白，基因组靶向特异性导向RNA，辅以一条两端带有短同源臂，中间插入在斑马鱼基因组中无相似序列的通用型终止翻译序列，来实现高效、精确、定点和定向的斑马鱼基因组插入式敲除。同时，提供特异的插入片段检测用的引物，帮助实现基因敲除的快速检测。该方法克服了目前已有的随机敲除方法效率偏低、突变的随机性以及阳性鉴定难等问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与快速鉴定的方法，包括以下方法：
A、通用型特异终止翻译插入序列的设计和特异性分析；
B、同源臂长度的确定；
C、插入式敲除单链DNA模板（donor）的设计方法；
D、显微注射组分的配方；
E、插入式敲除阳性鉴定的引物设计方法；
F、插入式敲除快速阳性鉴定的方法。
具体包括以下方法：
（1） 通用型特异终止翻译插入序列的设计和特异性分析
小片段插入式敲除需要满足其在斑马鱼基因组中序列的特异性，这样我们可以利用插入序列的特异性，设计特异引物，与插入区域基因组引物搭配可以进行阳性鉴定，同时，还要满足能够实现不同的插入方式都能引入终止密码子序列，需要很高的设计要求，本方法提供的序列为：gcagtcgctcactaactgagctaggcgaccgtgc，该序列命名为He Fragment，该序列在斑马鱼基因组中无相似序列，含有三个间隔一个和两个碱基相搭配的终止密码子taactgagctag，此序列能够实现插入式终止翻译突变，与该序列相似的位置变化排列都属于该发明的权利要求范畴；
（2）同源臂合适长度的确定
同源臂的引入能够提高目的区域的准确插入，过短的同源臂长度造成效率低下，过长的同源臂将会引起编辑成本的增加，确定一个合适的同源臂长度将能够大大提高敲除效率和控制成本，本方法提供的方法要求左臂的同源臂长度为18~50 nt，左臂的同源臂长度为18~22 nt，；
（3）插入式敲除单链DNA模板的设计方法
除了确定同源臂的长度之外，在哪个区域设计同源臂也非常重要，本方法利用Cas9蛋白在PAM附近引入固定切点，设计出以切割处5’端为左臂，以切割处3’端为右臂的模板设计方法，具体为：NNNNNNNNNNNNNNNNN（切割处）NNNNGG（如图1所示）；
（4）显微注射组分的配方
合适的组分配比是一个基因编辑能够成功的关键，本方法将提供各个组分最优的配比组合和注射剂量，具体如下：
将Cas9蛋白、Donor和已经制备好的sgRNA，以合适的浓度配比混合成注射样品，用于打靶鱼胚胎注射，可储藏于-80℃冰箱中。
Cas9蛋白孵育液：20 μM NEB Cas9蛋白0.5μL，sgRNA 100 ng/μL，Buffer 0.3 μL，Nuclease-free H2O补足至3 μL；
37℃放置15min。
注射样品为：Cas9蛋白孵育液3μL，Donor 75 ng/μL，Nuclease-free H2O补足至5μL；
每颗受精卵注射体积：3nL。
（5）插入式敲除阳性鉴定的引物设计方法
通用的插入序列，方便我们设计特异性的引物，我们将在引入的插入片段上设计并提供基于PCR的阳性鉴定方法，该引物搭配一条基因组特异的引物（如图2所示），具体如下：
第一对鉴定引物，目的片段长度控制在200 bp-800 bp之间：
Genome F primer: 5’- 根据不同基因进行特异性设计-3’
He R primer:5’- GCACGGTCGCCTAGCTCAGTTAGT-3’
第二对鉴定引物，目的片段长度控制在200 bp-800 bp之间：
He F primer: 5’-CTCACTAACTGAGCTAGGCGACCG-3’
Genome R primer:5’-根据不同基因进行特异性设计-3’。
（6）插入式敲除快速阳性鉴定的方法
提取发育至48 hpf的斑马鱼胚胎的基因组，采用（5）中设计的两对引物，分别进行PCR扩增（推荐采用但不局限于Takara Ex Tag酶），扩增体系为：
PCR扩增程序为：94 ℃ 预变性4 分钟，94 ℃ 变性30秒，55 -60 ℃退火30秒，72℃ 延伸1分钟，共35个循环，72 ℃延伸10分钟，12 ℃ 放置10分钟，结束。
本发明的优点在于：
a.本发明提供通用的插入片段，能够提高基因敲除的可控性和确定性；
b.本发明采用的单链小donor可被快速设计并由核酸合成公司合成，速度快且代价低；
c.本发明提供通用的鉴定引物，实现基因敲除的快速鉴定，大大降低基因型鉴定费用。
附图说明
图1 单链DNA模板（donor）设计示意图。
图2 插入式敲除验证方法示意图。
图3 gnas基因敲除第一对鉴定引物PCR胶图（1-10为斑马鱼gnas基因敲除样本；WT为野生型；B为空白组。）。
图4 gnas基因敲除第二对鉴定引物PCR胶图（1-10为斑马鱼gnas基因敲除样本；WT为野生型；B为空白组。）。
图5 gnas基因敲除第一对鉴定引物PCR测序峰图（红色箭头：插入序列起始插入位置；黑色方框：PAM位点。）。
图6 gnas基因敲除第二对鉴定引物PCR测序峰图（红色箭头：插入序列起始插入位置；黑色方框：切割处下游三个碱基。）。
图7 izumo1基因敲除第一对鉴定引物PCR胶图（1和2为斑马鱼izumo1基因敲除样本；WT为野生型。）。
图8 izumo1基因敲除第二对鉴定引物PCR胶图（1和2为斑马鱼izumo1基因敲除样本；WT为野生型；B为空白组。）。
图9 izumo1基因敲除第一对鉴定引物PCR测序峰图（红色箭头：插入起始位置；黑色方框：PAM位点。）。
图10 izumo1基因敲除第二对鉴定引物PCR测序峰图（红色箭头：插入起始位置；黑色方框：切割处下游三个碱基。）。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1斑马鱼Gnas基因特异性敲除
1.1 Gnas基因sgRNA靶向位点选择
选择斑马鱼Gnas基因（Gene ID: 557353）第4号外显子进行基因敲除。将Gnas基因第4号外显子的序列于CRISPOR网站（http://crispor.tefor.net/crispor.py）上进行PAM位点分析，选取评分较高的PAM位点，序列信息如下：
ATTGACTACATCCT（PAM）CAACTTAGCCAATCAAAAGG（sgRNA）ACTTTGAGTTC。
体外转录Gnas sgRNA序列：GGCCUUUUGAUUGGCUAAGUUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUCACAA。
1.2 Gnas基因插入式敲除单链DNA模板设计
根据1.1选定的sgRNA靶向位点，进行插入式敲除donor的设计，获得Gnas基因插入式敲除单链DNA模板序列信息如下：
Gnas donor：GAATTGACTACATCCTCAA（左臂）+gcagtcgctcactaactgagctaggcgaccgtgc（He Fragment）+CTTAGCCAATCAAAAGGAC（右臂）。
1.3 Gnas基因插入式敲除组分配方和显微注射
显微注射配方如下：
Cas9蛋白孵育准备：
37℃放置15min；
5μL的注射体系：
每颗受精卵注射体积：~3nL；
1.4 Gnas基因插入式敲除的鉴定引物设计
设计的引物序列信息如下：
第一对鉴定引物，目的片段长度为366bp：
Genome F primer: 5’-CTACATTTTACAACGCTGGACAC-3’
He R primer:5’-GCACGGTCGCCTAGCTCAGTTAGT-3’
第二对鉴定引物，目的片段长度为286bp：
He F primer:5’-CTCACTAACTGAGCTAGGCGACCG-3’
Genome R primer:5’-GCACAAAAGGCACTACAACTGA-3’。
1.5 Gnas基因插入式敲除的鉴定方法
在进行阳性鉴定过程中，提取发育至48 hpf的斑马鱼胚胎的基因组，采用（1.4）中设计的两对引物，分别进行PCR扩增，扩增体系为：
PCR扩增程序为：
结束。
1.6 Gnas基因插入式敲除的鉴定结果展示
鉴定结果如下：
显微注射后，取出10尾斑马鱼，提取每一尾斑马鱼的基因组，进行PCR，结果展示两对鉴定引物PCR电泳图（图3和图4）；
设计的引物一端为插入序列，只有当外源He Fragment插入到斑马鱼gnas基因序列内，才能扩增得到目的片段，通过两对鉴定引物PCR胶图可知，gnas基因敲除组样本1、2、3、4、7均可扩增得到目的片段，测序结果见图5及图6。结果表示，通过cas9系统，外源HeFragment能很好的插入到Gnas基因的基因序列内，其结果造成斑马鱼gnas基因插入式敲除，且取得50%的阳性率（表1）。
实施例2斑马鱼izumo1基因特异性敲除
1.1 izumo1基因sgRNA靶向位点选择
选择斑马鱼izumo1基因（Gene ID: 100329365）第2号外显子进行基因敲除。将izumo1基因第2号外显子的序列于CRISPOR网站（http://crispor.tefor.net/crispor.py）上进行PAM位点分析，选取评分较高的PAM位点，序列信息如下：
CAAGAACAGAATACCA（PAM）GAGTGAATTCAAGAGGCATT（sgRNA）GG。
体外转录izumo1 sgRNA序列：
GGAAUGCCUCUUGAAUUCACUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUCACAA。
1.2 izumo1基因插入式敲除单链DNA模板的设计
根据1.1选定的sgRNA靶向位点，进行插入式敲除donor的设计，获得izumo1基因插入式敲除单链DNA模板序列信息如下：
izumo1 donor：CAAGAACAGAATACCAGAG（左臂）+GCAGTCGCTCACTAACTGAGCTAGGCGACCGTGC（He Fragment）+TGAATTCAAGAGGCATTGG（右臂）。
1.3 izumo1基因插入式敲除组分配方和显微注射
显微注射配方如下：
Cas9蛋白孵育准备：
37℃放置15min；
5μL的注射体系：
每颗受精卵注射体积：~3nL；
1.4 izumo1基因插入式敲除的鉴定引物设计
设计的引物序列信息如下：
第一对鉴定引物，目的片段长度为 607 bp：
Genome F primer: 5’-AGGACAAAATTATTAGCCCAAGCTG-3’，
He R primer:5’-GCACGGTCGCCTAGCTCAGTTAGT-3’；
第二对鉴定引物，目的片段长度为244 bp：
He F primer: 5’-CTCACTAACTGAGCTAGGCGACCG-3’，
Genome R primer:5’-ACCTTCAGCAATGAAAATCTCCAAG-3’。
1.5 izumo1基因插入式敲除的鉴定方法
在进行阳性鉴定过程中，提取发育至48 hpf的斑马鱼胚胎的基因组，采用（1.4）中设计的两对引物，分别进行PCR扩增，扩增体系为：
PCR扩增程序为：
结束。
1.5 izumo1基因插入式敲除的鉴定结果展示
鉴定结果如下：
显微注射后，提取斑马鱼基因组DNA，进行PCR，结果展示两对鉴定引物PCR电泳图（图7和图8）；
设计的引物一端为插入序列，只有当外源He Fragment插入到斑马鱼izumo1基因序列内，才能扩增得到目的片段，通过两对鉴定引物PCR胶图可知，izumo1基因编辑组样本具有阳性扩增，测序结果见图9及图10。结果表示，通过cas9系统，外源He Fragment能很好的插入到izumo1基因的基因序列内，其结果造成斑马鱼izumo1基因插入式敲除，且取得70%的阳性率（表1）。
表1 定点插入式敲除的效率
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州百维斯生物科技有限公司
<120> 一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与鉴定的方法
<130> 13
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcagtcgctc actaactgag ctaggcgacc gtgc 34
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcacggtcgc ctagctcagt tagt 24
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctcactaact gagctaggcg accg 24
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attgactaca tcctcaactt agccaatcaa aaggactttg agttc 45
<210> 5
<211> 107
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggccuuuuga uuggcuaagu ugguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcuu uucacaa 107
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaattgacta catcctcaag cagtcgctca ctaactgagc taggcgaccg tgccttagcc 60
aatcaaaagg ac 72
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctacatttta caacgctgga cac 23
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctcactaact gagctaggcg accg 24
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caagaacaga ataccagagt gaattcaaga ggcattgg 38
<210> 10
<211> 107
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggaaugccuc uugaauucac ucguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcuu uucacaa 107
<210> 11
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
caagaacaga ataccagagg cagtcgctca ctaactgagc taggcgaccg tgctgaattc 60
aagaggcatt gg 72
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aggacaaaat tattagccca agctg 25
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ctcactaact gagctaggcg accg 24
Claims (2)
1.一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与鉴定的方法，其特征在于：利用Cas9蛋白，基因组靶向特异性导向RNA，辅以一条两端带有短同源臂、中间插入在斑马鱼基因组中无相似序列的通用型终止翻译序列，来实现定点和定向的斑马鱼基因组插入式敲除；同时，提供特异的插入片段检测用引物，实现基因敲除的检测；
具体包括以下步骤：
（1）通用型特异终止翻译插入序列的设计和特异性分析
小片段插入式敲除需要满足其在斑马鱼基因组中序列的特异性，利用插入序列的特异性，设计特异引物，与插入区域基因组引物搭配进行阳性鉴定，同时，还要满足实现不同的插入方式都能引入终止密码子序列；
（2）同源臂长度的确定
左臂的同源臂长度为18~50nt，左臂的同源臂长度为18~22nt；
（3）插入式敲除单链DNA模板的设计方法
利用Cas9蛋白在PAM附近引入固定的切点，设计出以切割处5’端为左臂，以切割处3’端为右臂的模板设计方法，具体为：NNNNNNNNNNNNNNNNN（切割处）NNNNGG；
（4）显微注射组分的配方
（5）插入式敲除阳性鉴定的引物设计方法
在引入的插入片段上设计并提供基于PCR的阳性鉴定方法，该引物搭配一条基因组特异的引物；
（6）插入式敲除快速阳性鉴定的方法
利用（5）设计的引物，提供一套插入式敲除快速鉴定的体系和PCR程序；
其中，步骤（1）中所述的通用型特异终止翻译插入序列为gcagtcgctcactaactgagctaggcgaccgtgc，该序列命名为He Fragment；
其中，第一对鉴定引物，目的片段长度控制在200bp~800bp之间：
Genome F primer：5’-根据不同基因进行特异性设计-3’，
He R primer：5’-GCACGGTCGCCTAGCTCAGTTAGT-3’；
第二对鉴定引物，目的片段长度控制在200bp~800bp之间：
He F primer：5’-CTCACTAACTGAGCTAGGCGACCG-3’，
Genome R primer：5’-根据不同基因进行特异性设计-3’。
2.根据权利要求1所述的一种在斑马鱼基因组中实现定点插入式敲除与鉴定的方法，其特征在于：所述步骤（4）为将Cas9蛋白、sgRNA和donor，以合适的浓度配比混合成注射样品，储藏于-80℃冰箱中备用，用于打靶鱼胚胎注射。
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|---|---|---|---|---|
| CN107881200A (zh) * | 2017-11-20 | 2018-04-06 | 扬州大学 | 一种应用于模式动物斑马鱼转基因的快速筛选方法 |
| CN108949756A (zh) * | 2018-08-17 | 2018-12-07 | 扬州大学 | 一种斑马鱼心脏特异表达模型的构建方法及相关载体 |
| CN112111530A (zh) * | 2020-07-23 | 2020-12-22 | 南京歆佳医药科技有限公司 | 一种斑马鱼中条件性诱导tcf3a基因敲除用于研究肌肉生长的方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN111094573A (zh) * | 2017-07-12 | 2020-05-01 | 梅约医学教育与研究基金会 | 有效靶向敲入或基因置换的材料和方法 |
-
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