CN109666648A - 条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用 - Google Patents

条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明具体涉及一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用。所述条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系及其构建方法，包括：分别以pLX‑sgRNA‑EGFP载体为模板，扩增得到hU6和Aqp11靶向sgRNA序列；以hU6和Aqp11靶向sgRNA序列为模板，SEQIDNo:3和SEQIDNo:6为引物进行重叠PCR扩增，得到hU6‑Aqp11‑sgRNA片段；XhoI和NheI两个酶双酶切pLX‑sgRNA‑EGFP载体和hU6‑Aqp11‑sgRNA片段，得到pLX‑sgRNA‑EGFP载体骨架和hU6‑Aqp11‑sgRNA粘性末端片段，连接、转化，构建得到pLX‑Aqp11‑sgRNA‑EGFP质粒；pLX‑Aqp11‑sgRNA‑EGFP质粒进行纯化、包装得到携带靶向Aqp11‑sgRNA‑EGFP的慢病毒，利用该慢病毒侵染条件性表达Cas9的猪滋养层细胞系，即构建得到所述条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系。

Description

条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及 应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用。
背景技术
规律成簇间隔短回文重复系统(CRISPR-CAS9系统)是一种具有核酸内切酶活性的复合体，作为第三代基因编辑技术，它能有效的识别特定的DNA序列，并在该特定位点进行切割，导致DNA双链断裂，在缺少特定模板的条件下，基因组修复依靠非同源重组末端连接，结果造成该基因的移码突变，导致基因表达破坏，相应蛋白功能的缺失，引起相应生物学的改变，成为基因功能研究及药物开发和疾病治疗潜在应用技术。
水分占成年哺乳动物体重的65%以上，水分转运在动物新陈代谢和正常生命活动中发挥非常重要作用。水通道蛋白（Aquaporins，AQPs）是一类可以高效选择性转运水分子的细胞膜通道蛋白，主要参与转运水和小分子溶质（如甘油、尿素等），同时可能还参与一些气体（CO2、O2、NO和NH3）的转运。目前，在哺乳动物上已发现了13种水通道蛋白亚型（AQP0-AQP12），其中AQP11近年来被证实具有运输水分的功能且效率与AQP1相当。研究发现，Aqp11基因的缺失会提高小鼠发生早期肾脏病变的可能性，而Aqp11基因表达异常则会影响孕妇的羊水量，此外Aqp11在胚胎着床和早期发育过程中其表达量和定位会发生改变，这提示Aqp11基因可能在胚胎发育和疾病中发挥着重要作用。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用。
本发明条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法，包括：
分别以pLX-sgRNA-EGFP载体为模板，SEQIDNo:3~4和SEQIDNo:5~6为引物，扩增得到hU6和Aqp11靶向sgRNA序列；以hU6和Aqp11靶向sgRNA序列为模板，SEQIDNo:3和SEQIDNo:6为引物进行重叠PCR扩增，得到hU6-Aqp11-sgRNA片段；
XhoI和NheI两个酶双酶切pLX-sgRNA-EGFP载体和hU6-Aqp11-sgRNA片段，得到pLX-sgRNA-EGFP载体骨架和hU6-Aqp11-sgRNA粘性末端片段，连接、转化，构建得到pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒；
pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒进行纯化、包装得到携带靶向Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒，利用该慢病毒侵染条件性表达Cas9的猪滋养层细胞系，即构建得到所述条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系。
进一步地，所述pLX-sgRNA-EGFP质粒进行钝化，包括：
步骤201，加入质粒体积的1/10体积的3M醋酸钠，混匀；
步骤202，加入步骤201溶液体积的2.5倍体积的的预冷无水乙醇，混匀，-20℃静置30-60min；
步骤203，4℃，12000rpm离心10min，回收沉淀，用5-10倍体积预冷的75%乙醇溶解；4℃，12000rpm离心10min，吸走上清；
步骤205，真空或室温干燥，无菌水50-100μL溶解沉淀，-20℃保存。
进一步地，所述包装得到携带靶向Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒包括：
步骤301，293FT细胞铺板：提前一天在10cm2培养皿中培养293FT细胞，10%293FT细胞培养基培养，当细胞接触达到70-80%时进行侵染；
步骤302，侵染时，取干净的1.5mL离心管，加入100-300μLDMEM以及慢病毒包装质粒pSPAX2、pMD2.G和pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP穿梭质粒，各质粒使用量分别为3-4μg、10-12μg和9-11μg，加入60-80μL转染试剂，用移液枪混合均匀，15-25℃静置10-15min；
步骤303，用PBS清洗293FT细胞两次并加入5-8mL2-10%293FT细胞培养基，滴加混合液；
步骤304，将上述293FT细胞放置37℃细胞培养箱培养，4-6h后弃去培养液，继续用2-10%293FT细胞培养基培养，37℃、5%CO2培养箱内培养；
步骤305，经过48h后和经过72h后分别收集病毒液，用慢速离心机以2000rpm离心3min取上清液用0.45μm滤器过滤并标注好放进冰箱4℃保存。
进一步地，所述慢病毒侵染包括：
步骤401，复苏液氮保存的条件性表达Cas9的猪滋养层细胞，接种至卡式瓶内，用猪滋养层细胞培养基培养，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养；待细胞长至卡式瓶底面约60-80%时，准备进行病毒侵染；
步骤402，将100-100μL过滤后的慢病毒液和5μL浓度为10μg/mL的Polyberen等加入到5mL猪滋养层细胞培养液中，混匀后加到步骤401中培养猪滋养层细胞的卡式瓶中，进行病毒侵染4-6h后换液；
步骤403，24h后用滋养层细胞培养基替换病毒液继续培养；每天全量换液；
步骤404，细胞系筛选稳定后，荧光显微镜观察，冻存细胞，并进一步检测转基因的结果。
进一步地，还包括：Aqp11基因敲除结果分析，所述结果分析方法包括：
步骤501，采用添加Dox培养滋养层细胞，培养48-72h后，将其中一部分抽提基因组，并以基因组为模板，以设计敲除Aqp11基因两侧的引物进行扩增，扩增长度489bp，并经测序，进行初步分析，看是否测序结果是否有套峰出现；
步骤502，将PCR产物进行分子克隆，分析基因敲除效率。主要步骤参照TAKARA公司TA试剂盒（pMD18-TVector，D101A）。
步骤503，在PCR管中配制加入总体积为5μL的pMD18-T载体和PCR片段和水，然后将5µL的Solution加入上述溶液中；
将PCR管置于恒温仪，16℃反应3h；
步骤505，取100µL感受态细胞DH5α，冰上融解后，将上述的10μL载体连接产物加入，轻轻混匀后冰上放置30min；
步骤506，42℃热激42-60s，迅速置于冰中放1-2min；
步骤507，加入300µLLB培养基，37℃、150rpm培养1h；
步骤508，取100µL菌液滴至有抗性氨苄的培养基平板上，并涂抹均匀，放入37℃中培养；
步骤509，12h后，用移液枪头轻轻挑24个单克隆菌体并分别加至24管装有加入抗性氨苄的1mLLB培养基的离心管中，在摇床中固定好后，37℃、150rpm培养3h；然后使用M13上、下游引物，空载扩增长度为140bp，进行菌液PCR检测，将条带长度正确的剩余菌液送至生工测序，根据测序结果计算基因敲除效率。
本发明上述的条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系应用，该SgRNA导向序列具有如SEQIDNo:1所示的碱基序列；所述敲除猪Aqp11基因的SgRNA导向序列在建立条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系中的应用。
借由上述方案，本发明条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用至少具有以下优点：
本发明以猪胎盘滋养层细胞为研究对象，结合运用CRISPR/Cas9系统，构建了通过强力霉素(Doxycycline,Dox)诱导敲除Aqp11基因的猪胎盘滋养层细胞系。结果显示诱导后，猪胎盘滋养层细胞的基因组内Aqp11基因可以100%发生切割，Dox诱导前不发生切割。该Aqp11基因敲除的猪胎盘滋养层细胞系可作为研究猪早期胚胎发育中水分转运及代谢的重要细胞模型，将可应用到相关科学研究领域，尤其对人和动物的胚胎发育机制具有重要的参考价值。因该细胞系敲除效果好，重复性高，还能为临床上相关药物研发提供科学依据。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1为本发明实施例1中条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系的建立方法的流程图；
图2为本发明实施例1中Aqp11SgRNA的设计及扩增结果，其中，A：Aqp11基因结构及SgRNA设计位点模式图；B：hU6启动子加靶向sgRNA序列；C：扩增hU6和Aqp11靶向sgRNA序列；M指Marker；1为第一段hU6片段；2为第二段Aqp11靶向sgRNA序列；
图3为本发明实施例1中pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒构建结果，其中，A:pLX-sgRNA-EGFP载体模式图；B：pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒构建结果，M指marker；1：酶切后的hU6-Aqp11-sgRNA片段；2：酶切后的pLX-sgRNA-EGFP质粒；3：连接成功的pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒；4：XhoI和NheI双酶切后的pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒；
图4为本发明实施例1中慢病毒包装荧光检测结果，其中，A：在显微镜白光下观察的293FT细胞；B：在显微镜荧光下观察的293FT细胞；C：Merge结果；
图5为本发明实施例1中表达Aqp11-sgRNA猪滋养层细胞的筛选，其中，A：在显微镜白光下观察的猪滋养层细胞；B：在显微镜荧光下观察的猪滋养层细胞；C：Merge结果；
图6为本发明实施例1中Aqp11敲除结果分析，其中，A：敲除结果测序分析；B：敲除效率分析。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下面给出本发明的具体实施例，但实施例仅是为了进一步详细叙述本说明，并不限制本发明的权利要求。以下实施例中所使用的试剂或原料，如无特殊说明，均来源于市售。
实施例1
参阅图1，为本发明的条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系的建立方法的流程图，具体包括以下步骤：
步骤1，Aqp11SgRNA设计及扩增。
参考Ensembl数据库Aqp11基因序列(ENSSSCG00000014880)，根据网页SgRNA靶点预测工具：
http://www.broadinstitute.org/rnai/public/analysis-tools/sgrna-design-v1，预测靶点序列为（5’-GGAACCTCCAGCAATCCGTG-3’）(SEQIDNo：1)即敲除猪Aqp11基因的SgRNA导向序列；设计引物分别扩取hU6和Aqp11靶向sgRNA序列，第一段hU6长度为337bp；第二段Aqp11靶向sgRNA的长度为171bp(该段序列GAAAGGACGAAACACCGGGAACCTCCAGCAATCCGTGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTCTAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTAGCTAGCGCTAACCGGTG)(SEQIDNo:2)，然后进行重叠PCR，拼合序列得到hU6-Aqp11-sgRNA序列，进行载体构建。
步骤101，以抽提的pLX-sgRNA-EGFP质粒（pLX-sgRNA，Addgene-50662基础上添加T2A-EGFP序列改造，引入荧光蛋白标记）(在超净工作台中，无菌取30μL实验室保存的pLX-sgRNA-EGFP甘油菌至30mL添加了30μL抗性氨苄的LB中，摇菌12-16h。使用MagenHiPurePlasmidEFMiniKit无内毒素质粒DNA小提试剂盒（P1112-03）对菌液进行抽提)为模板，用hU6第一段上游、U6第一段下游和Aqp11-sgRNA第二段上游、Aqp11-sgRNA第二段下游（表1）分别扩增U6片段和Aqp11-sgRNA片段，PCR体系（表2）和PCR反应程序（表3）如下：
表1hU6启动子片段和Aqp11-sgRNA片段扩增引物
表2第一、二段片段扩增反应体系
表3PCR反应程序
步骤102，通过重叠PCR方法获得启动子hU6-Aqp11-sgRNA序列，以SEQIDNo:3和SEQIDNo:6为扩增引物。反应体系如表4所示，反应程序如表3。获得的PCR产物进行1.3％琼脂糖凝胶电泳后使用MagenHipureGelPureDNAMiniKit试剂盒（D2111-03）进行凝胶回收。
表4重叠PCR反应体系
根据要求设置PCR反应条件，反应结束后PCR产物进行1.3%琼脂糖凝胶电泳，胶回收得到融合PCR产物U6-Aqp11-sgRNA片段，紫外分光光度计测定其浓度，-20℃保存。
步骤2，构建pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒。
pLX-sgRNA-EGFP载体和重叠PCR获得hU6+Aqp11-sgRNA片段时进行XhoI和NheI两个酶的双酶切，37℃反应2h，然后回收长度为7781bp的pLX-sgRNA-EGFP载体骨架和hU6-Aqp11-sgRNA粘性末端片段，然后使用TaKaRaT4DNALigase连接试剂盒（D2011A），16℃连接3h，转化、菌液PCR确定阳性菌并测序后，结果成功构建pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒（如图B）。
步骤3，pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒慢病毒包装结果 。
pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP载体携带荧光蛋白基因EGFP，因此在慢病毒包装24h-48h期间，通过使用荧光显微镜观察，可以初步衡量慢病毒包装质量。结果显示293FT细胞荧光比例高，说明pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP慢病毒载体抽提和转入率高。
由于抽提质粒浓度无法达到慢病毒包装中质粒浓度需要，需要进一步纯化，具体步骤如下：
（1）加入1/10体积的3M醋酸钠，混匀。
（2）加入2.5倍体积的的预冷无水乙醇，混匀，-20℃静置30-60min。
（3）4℃，12000rpm离心10min，回收沉淀，用0.5-1mL预冷的75%乙醇溶解；
（4）4℃，12000rpm离心10min，轻轻地吸走上清。
（5）真空或室温干燥，无菌水50-100μL溶解沉淀，-20℃保存。
慢病毒包装步骤为：
（1）293FT细胞铺板：提前一天在10cm2培养皿中培养293FT细胞，10%293FT细胞培养基培养，当细胞接触达到70-80%时进行侵染；
（2）侵染时，取干净的1.5mL离心管，加入300μLDMEM以及慢病毒包装质粒pSPAX2、pMD2.G和穿梭质粒(pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP)，各质粒使用量分别为3.5μg、10.4μg和10μg。加入60μL转染试剂AttracteneTransfectionReagent，用移液枪混合均匀，15-25℃静置10-15min；
（3）用PBS清洗细胞两次并加入6mL2%293FT细胞培养基，滴加混合液；
（4）放置37℃细胞培养箱培养，6h后弃去培养液，继续用2%293FT细胞培养基培养，以维持细胞活性，37℃、5%CO2培养箱内培养；
（5）48h和72h分别收集病毒原液，用慢速离心机以2000rpm离心3min取上清液用0.45μm滤器过滤并标注好放进冰箱4℃保存。
步骤4，表达Aqp11-sgRNA猪滋养层细胞的筛选。
条件性表达Cas9的猪滋养层细胞系已建立（申请号为201610087909.4，专利名称为：一种条件性诱导Cas9表达的猪滋养层细胞系的建立方法），利用携带Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒侵染条件性表达Cas9的猪滋养层后，结果显示95%以上的滋养层细胞表达荧光，表明猪滋养层细胞已表达Aqp11-sgRNA。
其中，慢病毒侵染步骤为：
（1）复苏液氮保存的条件性表达Cas9的猪滋养层细胞，接种至卡式瓶内，用滋养层细胞培养基培养，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养；
（2）待猪滋养层细胞生长稳定后进行传代，接种适量细胞至新的卡式瓶内；
（3）待细胞长至卡式瓶底面约60-80%时，用PBS清洗2次；
（4）用5mL过滤后的慢病毒原液加5μL浓度为10μg/mL的Polyberen以及500μLFBS培养滋养层细胞培养滋养层细胞，12h后换液；
（5）24h后用滋养层细胞培养基替换病毒液继续培养；
（6）每天全量换液，需注意换液过程中要轻敲并用PBS清洗；
（7）细胞系筛选稳定后，荧光显微镜观察，冻存细胞，并进一步检测转基因的结果。
步骤5，Aqp11基因敲除结果分析。
①采用添加Dox培养滋养层细胞，培养48-72h后，将其中一部分抽提基因组。并以基因组为模板，以设计敲除Aqp11基因两侧的引物进行扩增，扩增长度489bp，并经生工生物工程(上海)股份有限公司测序，进行初步分析，看是否测序结果是否有套峰出现。
表6Aqp11基因敲除检测上、下游序列
强力霉素（Dox）可以调控猪滋养层细胞Cas9蛋白表达，通过提取Dox诱导以及未诱导48h后的猪滋养层细胞基因组，扩增获取含靶点的DNA片段，进行测序比对，结果显示在Dox诱导组的敲除位点（5’-GGAACCTCCAGCAATCCGT
G-3’）出现套峰，而未进行Dox诱导的基因组扩增产物未出现套峰，表明成功构建了一种条件性诱导Aqp11基因敲除猪滋养层细胞系。
②为了进一步了解Aqp11基因敲除效率，将上述扩增的片段与T载体（pMDTM18-TVector）连接。操作方法如下：
（1）在PCR管中配制溶液（表7）；
表7配置溶液试剂使用量
（2）加入5µL的Solution；
（3）将PCR管置于恒温仪，16℃反应3h；
（4）取100µL感受态细胞DH5α，冰上融解后加入3h后的溶液，轻轻混匀后冰上放置30min；
（5）42℃热激42-60s，迅速置于冰中放1-2min；
（6）加入300µLLB培养基，37℃、150rpm培养1h；
（7）取100µL菌液滴至有抗性氨苄的培养基平板上，并涂抹均匀，放入37℃中培养。
约12h后，用移液枪头轻轻挑24个单克隆菌体并分别加至24管装有加入抗性氨苄的1mLLB培养基的离心管中，在摇床中固定好后，37℃、150rpm培养3h。然后使用M13上、下游引物（表8），空载扩增长度为140bp，进行菌液PCR检测，将条带长度正确的剩余菌液送至生工测序，根据测序结果计算基因敲除效率。
表8M13上、下游序列
将测序PCR产物连接PMD18-T载体，进行质粒转化，挑取单克隆菌落进行测序，分析敲除效率，结果显示敲除效率100%。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 广东省农业科学院农业生物基因研究中心
<120> 一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法及应用
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 851
<212> DNA
<213> 人工合成(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
atgaccgcgc tacaggtgct ctggcccgag atgcaggaca cctgcacctc gctggggctg 60
atgctgtcga tcgtgctgtt cacggggctg gcccgcgtgg tcacccggca gcagctgaac 120
aggcccatgg cccacgcttt cgtcttggag tttctggcta ccttccagct ctgcttctgc 180
acccatgaac tgcaactgct gagcgagcag gaaccccggc accccacctg gccgctgaca 240
ctaatctact tcttctcctt ggtgcatggc ctgactctgg tgggaacctc cagcaatccg 300
tgcggagtga tgatgcaaat gatgctgggg gggatgtccg ctgagatagg tggaatgagg 360
ctgttggctc aactgatggg cgccctgtgc agcaggtact gcgtgggtgc cttgtggagt 420
ctggagctga ccaagtatca cgtcagggac aggagcttcg cttgcaggaa tcccatccaa 480
gtggacttgc ccaaagcggt catcatagag gccatctgct cctttatctt ccacagcgct 540
ttgctgcact tccaggaggt ccgaactcag cttcgtatcc acctgctgtc agcactcatc 600
acctttttgg tctatgcagg aggaagtcta acaggagcgg tatttaatcc agctttggca 660
ctttcactac atttcaagtg ttttgatgaa gcattccttc aattttttat agtatattgg 720
ctggctcctt ctttaggtat attgctgatg attttgatgt tcagcttttt ccttccatgg 780
ctgcataaca ataatacaat taacaaaaag gaataactat tccaaaagac tcggactaag 840
ttacaggacg g 851

Claims (6)

1.一种条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系构建方法，其特征在于，包括：
分别以pLX-sgRNA-EGFP载体为模板，SEQIDNo:3~4和SEQIDNo:5~6为引物，扩增得到hU6和Aqp11靶向sgRNA序列；以hU6和Aqp11靶向sgRNA序列为模板，SEQIDNo:3和SEQIDNo:6为引物进行重叠PCR扩增，得到hU6-Aqp11-sgRNA片段；
XhoI和NheI两个酶双酶切pLX-sgRNA-EGFP载体和hU6-Aqp11-sgRNA片段，得到pLX-sgRNA-EGFP载体骨架和hU6-Aqp11-sgRNA粘性末端片段，连接、转化，构建得到pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒；
pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP质粒进行纯化、包装得到携带靶向Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒，利用该慢病毒侵染条件性表达Cas9的猪滋养层细胞系，即构建得到所述条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系。
2.根据权利要求1所述的条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系的建立方法，其特征在于，所述pLX-sgRNA-EGFP质粒进行钝化，包括：
步骤201，加入质粒体积的1/10体积的3M醋酸钠，混匀；
步骤202，加入步骤201溶液体积的2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃静置30-60min；
步骤203，4℃，12000rpm离心10min，回收沉淀，用5-10倍体积预冷的75%乙醇溶解；4℃，12000rpm离心10min，吸走上清；
步骤205，真空或室温干燥，无菌水50-100μL溶解沉淀，-20℃保存。
3.根据权利要求2所述的条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系的建立方法，其特征在于，所述包装得到携带靶向Aqp11-sgRNA-EGFP的慢病毒包括：
步骤301，293FT细胞铺板：提前一天在10cm2培养皿中培养293FT细胞，10%293FT细胞培养基培养，当细胞接触达到70-80%时进行侵染；
步骤302，侵染时，取干净的1.5mL离心管，加入100-300μLDMEM以及慢病毒包装质粒pSPAX2、pMD2.G和pLX-Aqp11-sgRNA-EGFP穿梭质粒，各质粒使用量分别为3-4μg、10-12μg和9-11μg，加入60-80μL转染试剂，用移液枪混合均匀，15-25℃静置10-15min；
步骤303，用PBS清洗293FT细胞两次并加入5-8mL2-10%293FT细胞培养基，滴加混合液；
步骤304，将上述293FT细胞放置37℃细胞培养箱培养，4-6h后弃去培养液，继续用2-10%293FT细胞培养基培养，37℃、5%CO2培养箱内培养；
步骤305，经过48h后和经过72h后分别收集病毒液，用慢速离心机以2000rpm离心3min取上清液用0.45μm滤器过滤并标注好放进冰箱4℃保存。
4.根据权利要求3所述的条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系的建立方法，其特征在于，所述慢病毒侵染包括：
步骤401，复苏液氮保存的条件性表达Cas9的猪滋养层细胞，接种至卡式瓶内，用猪滋养层细胞培养基培养，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养；待细胞长至卡式瓶底面约60-80%时，准备进行病毒侵染；
步骤402，将100-100μL过滤后的慢病毒液和5μL浓度为10μg/mL的Polyberen加入到5mL猪滋养层细胞培养液中，混匀后加到步骤401中培养猪滋养层细胞的卡式瓶中，进行病毒侵染4-6h后换液；
步骤403，24h后用滋养层细胞培养基替换病毒液继续培养；每天全量换液；
步骤404，细胞系筛选稳定后，荧光显微镜观察，冻存细胞，并进一步检测转基因的结果。
5.根据权利要求4所述的条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系的建立方法，其特征在于，还包括：Aqp11基因敲除结果分析，所述结果分析方法包括：
步骤501，采用添加Dox培养滋养层细胞，培养48-72h后，将其中一部分抽提基因组，并以基因组为模板，以设计敲除Aqp11基因两侧的引物进行扩增，扩增长度489bp，并经测序，进行初步分析，看是否测序结果是否有套峰出现；
步骤502，将PCR产物进行分子克隆，分析基因敲除效率，
主要步骤参照TAKARA公司TA试剂盒（pMD18-TVector，D101A）；
步骤503，在PCR管中配制加入总体积为5μL的pMD18-T载体和PCR片段和水，然后将5µL的Solution加入上述溶液中；
将PCR管置于恒温仪，16℃反应3h；
步骤505，取100µL感受态细胞DH5α，冰上融解后，将上述的10μL载体连接产物加入，轻轻混匀后冰上放置30min；
步骤506，42℃热激42-60s，迅速置于冰中放1-2min；
步骤507，加入300µLLB培养基，37℃、150rpm培养1h；
步骤508，取100µL菌液滴至有抗性氨苄的培养基平板上，并涂抹均匀，放入37℃中培养；
步骤509，12h后，用移液枪头轻轻挑24个单克隆菌体并分别加至24管装有加入抗性氨苄的1mLLB培养基的离心管中，在摇床中固定好后，37℃、150rpm培养3h；然后使用M13上、下游引物，空载扩增长度为140bp，进行菌液PCR检测，将条带长度正确的剩余菌液送至生工测序，根据测序结果计算基因敲除效率。
6.一种权利要求1至5任一所述的条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系应用，其特征在于，该SgRNA导向序列具有如SEQIDNo:1所示的碱基序列；所述敲除猪Aqp11基因的SgRNA导向序列在建立条件性诱导猪滋养层细胞Aqp11基因敲除细胞系中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2012109326A2 (en) * 2011-02-09 2012-08-16 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Determination of oocyte quality
CN105624194A (zh) * 2016-02-16 2016-06-01 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种条件性诱导Cas9表达的猪滋养层细胞系及其建立方法和应用
CN108359712A (zh) * 2018-02-09 2018-08-03 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种快速高效筛选SgRNA靶向DNA序列的方法

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