CN116024216A - 一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用。利用本发明设计的sgRNA组，对绵羊DYA基因进行编辑，发生基因编辑后可造成大片段缺失并导致移码突变，对DYA基因编码的蛋白质结构和功能造成较大破坏。实验结果表明：在目标区域可造成不同片段长度的基因编辑，1号外显子总体编辑效率达到76.4％，2号外显子总体编辑效率达到84.09％。基因组中的两套染色体上均发生编辑(即纯合子)：1号外显子纯合子编辑效率为30.9％；2号外显子纯合子编辑效率为9.1％。本发明提供的sgRNA组在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。

Description

一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas9技术为目前最常用的基因编辑技术，此前所用的同源重组、ZFN(锌指核酸酶)、TANLEN(转录激活样效应核酸酶)等技术也可以实现目的基因的大片段精确敲除，但细胞内自然发生同源重组的效率极低。ZFN、TALEN技术的设计繁琐，成本更高且效率较低，而CRISPR/Cas9技术的基因编辑效率较高，并可以介导同源重组，相比于ZFN和TALEN，Cas9系统更具优势。利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，需要首先根据基因组序列设计Sg(single-guide，单链引导)序列，目标基因中一般可设计多个sg序列，但序列的位置碱基顺序会对其编辑靶基因的效率有影响，使用高编辑效率的sg序列更容易获得目标基因编辑的细胞或受精卵，减少获得基因编辑细胞或动物个体的实验时间及成本。

DYA(MHCclassIIantigenDYalpha)基因即MHCII类抗原DYα。DYA基因仅在反刍类动物淋巴组织，皮肤组织和脾脏等组织中表达，DYA表达的蛋白主要位于树突状细胞表面，在免疫应答过程中发挥重要作用。DYA在反刍动物中表达的特异性及其功能，在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。现有报导中，没有针对绵羊DYA基因进行编辑的报道，没有针对DYA基因使用CRISPR/Cas9系统实现编辑的实例。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用。本发明提供的sgRNA组可以利用CRISPR/Cas9技术对绵羊DYA基因进行编辑，在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种靶向DYA基因的sgRNA组，所述sgRNA组包括Exon1-sgRNA和/或Exon2-sgRNA；

所述Exon1-sgRNA包括Exon1-sgRNA1和Exon1-sgRNA2；

所述Exon1-sgRNA1包括Exon1-sgRNA1-F和Exon1-sgRNA1-R；所述Exon1-sgRNA2包括Exon1-sgRNA2-F和Exon1-sgRNA2-R；

所述Exon1-sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述Exon1-sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述Exon1-sgRNA2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述Exon1-sgRNA2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述Exon2-sgRNA包括Exon2-sgRNA1和Exon2-sgRNA2，所述Exon2-sgRNA1包括Exon2-sgRNA1-F和Exon2-sgRNA1-R；所述Exon2-sgRNA2包括Exon2-sgRNA2-F和Exon2-sgRNA2-R；

所述Exon2-sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Exon2-sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

所述Exon2-sgRNA2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述Exon2-sgRNA2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

本发明还提供了扩增上述方案所述sgRNA组的靶标序列的引物对，所述引物对包括引物对1和/或引物对2；

所述引物对1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

所述引物对2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述引物对2的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

本发明还提供了一种敲除DYA基因的质粒组，所述质粒组包括Exon1-sgRNA质粒组和/或Exon2-sgRNA质粒组；

所述Exon1-sgRNA质粒组包括Exon1-sgRNA1质粒和Exon1-sgRNA2质粒；所述Exon1-sgRNA1质粒包括权利要求1所述sgRNA组中的Exon1-sgRNA1和px330质粒；所述Exon1-sgRNA2质粒包括权利要求1所述sgRNA组中的Exon1-sgRNA2和px330质粒；

所述Exon2-sgRNA质粒组包括Exon2-sgRNA1质粒和Exon2-sgRNA2质粒；所述Exon2-sgRNA1质粒包括权利要求1所述sgRNA组中的Exon2-sgRNA1和px330质粒；所述Exon2-sgRNA2质粒包括权利要求1所述sgRNA组中的Exon2-sgRNA2和px330质粒。

优选的，所述px330质粒包括经BbsⅠ酶后的px330大片段质粒。

本发明还提供了上述方案所述sgRNA组或上述方案所述的引物对或上述方案所述的质粒组在编辑DYA基因中的应用。

优选的，所述DYA基因包括绵羊的DYA基因。

优选的，所述绵羊包括湖羊。

本发明还提供了上述方案所述sgRNA组或上述方案所述的引物对或上述方案所述的质粒组在鉴定DYA基因功能中的应用。

本发明还提供了一种编辑绵羊细胞中DYA基因的方法，包括：将上述方案所述质粒组导入绵羊细胞中，得到基因编辑的绵羊细胞。

优选的，所述绵羊细胞包括绵羊成纤维细胞。

有益效果：

本发明提供了一种靶向DYA基因的sgRNA组，所述sgRNA组包括Exon1-sgRNA和/或Exon2-sgRNA；所述Exon1-sgRNA包括Exon1-sgRNA1和Exon1-sgRNA2；所述Exon1-sgRNA1包括Exon1-sgRNA1-F和Exon1-sgRNA1-R；所述Exon1-sgRNA2包括Exon1-sgRNA2-F和Exon1-sgRNA2-R；所述Exon1-sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述Exon1-sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述Exon1-sgRNA2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述Exon1-sgRNA2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述Exon2-sgRNA包括Exon2-sgRNA1和Exon2-sgRNA2，所述Exon2-sgRNA1包括Exon2-sgRNA1-F和Exon2-sgRNA1-R；所述Exon2-sgRNA2包括Exon2-sgRNA2-F和Exon2-sgRNA2-R；所述Exon2-sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Exon2-sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；所述Exon2-sgRNA2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述Exon2-sgRNA2-R的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示。本发明针对DYA基因的1号和2号外显子分别设计2个sg序列(即本发明中的sgRNA组)，利用本发明设计的sgRNA组，对绵羊DYA基因进行编辑，发生基因编辑后可造成大片段缺失并导致移码突变，对DYA基因编码的蛋白质结构和功能造成较大破坏。通过在胎儿成纤维细胞中的转染和测序验证，证明在目标区域可造成不同片段长度的基因编辑，1号外显子总体编辑效率达到76.4％，2号外显子总体编辑效率达到84.09％。基因组中的两套染色体上均发生编辑(即纯合子)：1号外显子纯合子编辑效率为30.9％；2号外显子纯合子编辑效率为9.1％。本发明提供的sgRNA组在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为序列设计和实验实施过程；

图2为引物扩增和测序结果；其中A为扩增产物电泳结果，外显子1扩增获得960bp；外显子2扩增获得648bp；B为测序获得的DYA外显子1的部分序列；C为测序获得的DYA外显子2的部分序列；D为DYA外显子1和外显子2设计的sg序列及位置示意图；

图3为获得的单克隆细胞DYA基因部分测序结果；其中A为针对DYA外显子1编辑获得的单克隆基因型；B为针对DYA外显子2编辑获得的单克隆基因型；

图4为对比例1中不同重组载体组合转染后的酶切产物电泳检测结果图；其中A为外显子1的检测结果，sg1+2为pX330DYA-Exon1-sg1和pX330DYA-Exon1-sg2的组合转染结果；B为外显子2的检测结果，sg1+2为pX330DYA-Exon2-sg1和pX330DYA-Exon2-sg2的组合转染结果，sg1+3为pX330DYA-Exon2-sg1和pX330DYA-Exon2-sg3的组合转染结果，sg2+3为pX330DYA-Exon2-sg2和pX330DYA-Exon2-sg3的组合转染结果；NC为未转染任何sgRNA的绵羊成纤维细胞。

具体实施方式

本发明提供了一种靶向DYA基因的sgRNA组，所述sgRNA组包括Exon1-sgRNA和/或Exon2-sgRNA；所述Exon1-sgRNA包括Exon1-sgRNA1和Exon1-sgRNA2；所述Exon1-sgRNA1包括Exon1-sgRNA1-F和Exon1-sgRNA1-R；所述Exon1-sgRNA2包括Exon2-sgRNA1和Exon2-sgRNA2，所述Exon2-sgRNA1包括Exon1-sgRNA2-F和Exon1-sgRNA2-R；所述Exon2-sgRNA包括Exon2-sgRNA1-F和Exon2-sgRNA1-R；所述Exon2-sgRNA2包括Exon2-sgRNA2-F和Exon2-sgRNA2-R；

所述Exon1-sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，具体为：CACCGGAAGAAAGCTCTGATTCTGA；

所述Exon1-sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，具体为：AAACTCAGAATCAGAGCTTTCTTCC；

所述Exon1-sgRNA2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：CACCGTGTGGAGGTGAAGACATCGT；

所述Exon1-sgRNA2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体为：AAACACGATGTCTTCACCTCCACAC；

所述Exon2-sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，具体为：CACCGTTGTGCCGTAAGTGCCCACG；

所述Exon2-sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，具体为：AAACCGTGGGCACTTACGGCACAAC；

所述Exon2-sgRNA2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，具体为：CACCGTGGAGACGAGCTCTTCTACG；

所述Exon2-sgRNA2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，具体为：AAACCGTAGAAGAGCTCGTCTCCAC；所述核苷酸序列SEQ ID No.1～8中下划线处为BbsⅠ酶的酶切位点的核苷酸序列。

本发明针对DYA基因的1号和2号外显子序列设计了高效的基因编辑靶向sg序列，从而利于后续在体细胞或个体中进行基因编辑，其中Exon1-sgRNA1和Exon1-sgRNA2可以特异性的编辑DYA基因的1号外显子，Exon1-sgRNA2-F和Exon1-sgRNA2-R可以特异性的编辑DYA基因的2号外显子。

本发明还提供了扩增上述方案中所述sgRNA组的靶标序列的引物对，所述引物对包括引物对1和/或引物对2；

所述引物对1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，具体为：AGCTTTACTCTTTGATGATTCCTC；

所述引物对1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示，具体为：CATGCTATACTTGGGCATTACG；

所述引物对2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，具体为：AGGAAGTGGTGTAGGACCAG；

所述引物对2的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示，具体为：GGCTGAGGTACTACTTGGCTAC。

本发明所述引物对1可以特异性扩增DYA基因的1号外显子，扩增得到的序列优选如SEQ ID No.13所示，具体如下：agctttactctttgatgattcctcctatgtatgatatccttctgctcccgtttgaatctatgtatgcc cttagataattcaaaacaagggagttttccaggcttcttacaggtctcttcctaaaaatgcttcagctggcaactgagatgtcagctcagggaatttctctgatgggctgaaacacgatagagcagggtgaggcgtgggctgctccaacatgacttctccagcagttctctttagaccaccttcctggtgaggcaccacttggaacagccactcctgaggaaacccttggaggaggaggaggatgaagaaagctctgattctgagggctctcgctctggccgccatgatgagcctgtgtggaggtgaagacatcgtgggtgagtgtacagttgaggggtgggggtttacaattgtgaagaatttcttaatttttattttatattggagtatggtggctcaggtggtaaagaatctgcctgcaatgcaggagacccagatttgatccctggattgggaagatcccctggagaagggaatggctacccacttcagtattcttgcctgaagaattccatgggcagaggagcctggcaggctgcagtccatgaggtcacaaaaagtctgacatgacttagcaactaaacaactatatatatacatcttctttatccattcatttgtcagtagacatttaggttgtttccatgtcttggctcttataagtagcactgctgtgaaataaaggtgcatttatctttttgcattatagttctttccggatatatacccaggagtgggattgctggaccatatggcaactctattttcagatgtgcattctaaataacaaagagttgtgtgtatgtgtatgtgtgtgaaagtcactcagttctgtccaactctttgagaccccatggactaaaaagcaacgtaatgcccaagtatagcatg。

本发明所述引物对2可以特异性扩增DYA基因的2号外显子，扩增得到的序列优选如SEQ ID No.14所示，具体如下：aggaagtggtgtaggaccaggccaaatatgaacccacactcctagacagaccacttctcat ctgtttttatttaatccaattctttcccctcccctgtatcccgcttccctgttcttaccttcctgctttggcatggccacgcaccagcggaccacgtgggcacttacggcacaaatgtctaccagacgtacggcgcctctggccagttcacgtttgaatttgatggagacgagctcttctacgtggacctgaggaaaaaagagactgtctggaggctgcccgagtttaacaatatcacaatgtttgaaattcagagtgccctgagaaacattgttatgtcaaaaagaaatttggacatcttgatgaaaaattccaactttacacctgccaccaacggtaagtgtggtctctcttcacggtatctatctcctgttcctggtctctttttcctccccaaggtagctagtcttccccccaacactctaaattgttccccctttctattccatttcctggcaaatacccagtcctcagctacagatttaatcttgaaatatccctccccaagttccaagaaccactccttgaagttctaaaagaggatattcccaagctcttggcctaagtagccaagtagtacctcagcc。

本发明还提供了一种敲除DYA基因的质粒组，所述质粒组包括Exon1-sgRNA质粒组和/或Exon2-sgRNA质粒组；

所述Exon1-sgRNA质粒组包括Exon1-sgRNA1质粒和Exon1-sgRNA2质粒；所述Exon1-sgRNA1质粒包括上述方案中所述的Exon1-sgRNA1和px330质粒；所述Exon1-sgRNA2质粒包括上述方案中所述的Exon1-sgRNA2和px330质粒；

所述Exon2-sgRNA质粒组包括Exon2-sgRNA1质粒和Exon2-sgRNA2质粒；所述Exon2-sgRNA1质粒包括上述方案中所述的Exon2-sgRNA1和px330质粒；所述Exon2-sgRNA2质粒包括上述方案中所述的Exon2-sgRNA2和px330质粒。

在本发明中，所述px330质粒优选包括经BbsⅠ酶后的px330大片段质粒。

本发明提供的Exon1-sgRNA质粒组可以特异性的编辑DYA基因的1号外显子，Exon2-sgRNA质粒组可以特异性的编辑DYA基因的2号外显子。

本发明还提供了上述方案中所述的sgRNA或上述方案中所述的引物对或上述方案中所述的质粒组在编辑DYA基因中的应用。在本发明中，所述编辑优选包括敲除DYA基因；所述DYA基因优选包括绵羊的DYA基因；所述绵羊优选包括湖羊。

本发明还提供了上述方案中所述的sgRNA或上述方案中所述的引物对或上述方案中所述的质粒组在鉴定DYA基因功能中的应用。

本发明还提供了一种高效编辑绵羊细胞中DYA基因的方法，包括：将上述方案中所述质粒组导入绵羊细胞中，得到基因编辑的绵羊细胞。

在本发明中，所述绵羊细胞优选包括绵羊成纤维细胞，进一步优选为湖羊成纤维细胞，更优选包括湖羊胎儿成纤维细胞。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例和附图对本发明提供的一种靶向DYA基因的sgRNA组、扩增靶标序列的引物对、质粒组及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

根据NCBI公布的绵羊(版本号Oar_v4.0(GCF_000298735.2))的DYA基因(序列号：NC_019477.2)提供的参考序列设计针对1号和2号外显子的PCR引物，以湖羊基因组为模板，利用设计的引物进PCR扩增，扩增产物测序后(扩增产物电泳结果见图2中的A，测序结果见图2中的B和C)，将测序结果与参考序列比对，确认为湖羊的DYA序列。

针对1号外显子的扩增引物(片段长度960bp，如SEQ ID No.13所示)：

上游引物DYA-Exon1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

下游引物DYA-Exon1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

针对2号外显子的扩增引物(片段长度648bp，如SEQ ID No.14所示)：

上游引物DYA-Exon2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示；

下游引物DYA-Exon2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

1号外显子和2号外显子的PCR扩增程序均为：95℃预变性5min，34×[95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s]，72℃延伸5min，4℃保存。

1号外显子和2号外显子的扩增体系均为(使用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的扩增酶PhantaMaxmix，货号P525-03)：上游引物和下游引物各1μL、DNA模板1μL、DNA聚合酶2×mix12.5μL和ddH₂O补足至25μL。

实施例2

1、根据实施例1测序结果的湖羊的DYA外显子的序列，设计sg(见图2中的D)，并合成单链寡核苷酸序列。序列如下(5’-3’)：

上游序列Exon1-sgRNA1-F：CACCGGAAGAAAGCTCTGATTCTGA，SEQ ID No.1；

下游序列Exon1-sgRNA1-R：AAACTCAGAATCAGAGCTTTCTTCC，SEQ ID No.2；

上游序列Exon1-sgRNA2-F：CACCGTGTGGAGGTGAAGACATCGT，SEQ ID No.3；

下游序列Exon1-sgRNA2-R：AAACACGATGTCTTCACCTCCACAC，SEQ ID No.4；

上游序列Exon2-sgRNA1-F：CACCGTTGTGCCGTAAGTGCCCACG，SEQ ID No.5；

下游序列Exon2-sgRNA1-R：AAACCGTGGGCACTTACGGCACAAC，SEQ ID No.6；

上游序列Exon2-sgRNA2-F：CACCGTGGAGACGAGCTCTTCTACG，SEQ ID No.7；

下游序列Exon2-sgRNA2-R：AAACCGTAGAAGAGCTCGTCTCCAC，SEQ ID No.8；

SEQ ID No.1～8中下划线处为BbsⅠ酶的酶切位点的核苷酸序列。

2、将合成的sg的寡核苷酸序列退火，得到双链sg序列，其中双链sg序列分别为：上游序列Exon1-sgRNA1-F和下游序列Exon1-sgRNA1-R退火得到Exon1-sgRNA1，上游序列Exon1-sgRNA2-F和下游序列Exon1-sgRNA2-R退火得到Exon1-sgRNA2，上游序列Exon2-sgRNA1-F和下游序列Exon2-sgRNA1-R退火得到Exon2-sgRNA1，上游序列Exon2-sgRNA2-F和下游序列Exon2-sgRNA2-R退火得到Exon2-sgRNA2；退火程序均为95℃、5min，37℃、10min，4℃保存；退火体系均为：上游序列和下游序列各2.5μL、10×PCRbuffer1.0μL和ddH₂O补足至10μL。

退火的同时，对Cas9表达载体pX330(出发载体)使用BbsⅠ(NEB，货号：R3539S)进行酶切，将酶切产物通过琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收(湖南艾科瑞生物工程有限公司，货号：AG21004)。

酶切的反应程序为：pX330载体10μg、NEBCutsmart10μL、BbsⅠ3.0μL和ddH₂O补足至100μL；酶切的反应体系为：37℃酶切4h。

3、将酶切后的pX330载体与退火后的双链sg序列通过T4DNA连接酶(NEB，货号：M0202S)进行连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(使用北京天根生化科技有限公司试剂，货号CB101：中提供的方法进行转化培养)，获得的菌体克隆进行测序，测序结果若包含设计的sg序列，表明连接正确。

将包含正确载体的菌落大量培养并提取质粒(根据天根生化科技有限公司试剂盒，货号：DP118-02中提供的方法进行培养和提取质粒)，获得重组载体pX330DYA-Exon1-sg1(Exon1-sgRNA1质粒)、pX330DYA-Exon1-sg2(Exon1-sgRNA2质粒)和pX330DYA-Exon2-sg1(Exon2-sgRNA1质粒)、pX330DYA-Exon2-sg2(Exon2-sgRNA2质粒)。

连接体系均为：pX330载体回收产物100ng、退火产物(sg)6.5μL、T4DNA连接酶0.5μL和ddH₂O补足至10μL；连接程序均为：16℃连接3h。

4、细胞转染：针对外显子1，使用pX330DYA-Exon1-sg1、pX330DYA-Exon1-sg2、g418(遗传霉素)抗性载体pl452(武汉淼灵生物科技有限公司：L3065)；针对外显子2，使用pX330DYA-Exon2-sg1、pX330DYA-Exon2-sg2、g418(遗传霉素)抗性载体pl452，将上述两种组合分别通过脂质体转染法(Invitrogen:LIPOFECTAMINE3000L3000015)共转湖羊胎儿成纤维细胞，每个六孔板孔转染质粒的总量为9μg。转染体系由体系1和体系2组成。

针对外显子1的体系1为脂质体7.5μL和DMEM/F12125μL，体系2为pl452载体3μg、pX330DYA-Exon1-sg13μg、pX330DYA-Exon1-sg23μg、P3000reagent10μL和DMEM/F12125μL。

针对外显子2的体系1为脂质体7.5μL和DMEM/F12125μL，体系2为pl452载体3μg、pX330DYA-Exon2-sg13μg、pX330DYA-Exon2-sg23μg、P3000reagent10μL和DMEM/F12125μL。

5、将体系1和体系2混合后室温下孵育20min，然后将其加入含有湖羊胎儿成纤维细胞的六孔板孔(细胞接种量为2×10⁶个/孔)中进行转染，补充培养基(体积粉碎为85％的DMEM/F12(Hyclone：SH30023.01)和15％的胎牛血清(gibco：10091148))至2mL。转染后48h，将细胞消化并分配至20个10cm培养皿中，并加入350μg/mlg418进行筛选培养。

6、细胞培养第10天，培养皿中形成细胞克隆，挑取单克隆细胞于48孔板中培养，细胞长满后收集细胞并提取基因组(基因组提取试剂盒：(天根生化科技(北京)有限公司)，DP304-03)。

7、将针对DYA2个外显子编辑的单克隆基因组分别以实施例1中的2对扩增引物进行PCR扩增，扩增产物进行测序(测序结果见图3)，测序结果与DYA的1号或2号外显子进行比对，检测序列是否发生编辑。PCR扩增程序和体系与实施例1相同。

经过以上步骤，载体转染后，对于1号外显子编辑，筛选获得55个单克隆细胞株，测序后，发生基因编辑阳性克隆为42个，阳性率为76.4％，在基因组两套染色体上(等位基因)均发生编辑的克隆的个数为17，双等位基因均发生编辑的概率为30.9％。

对于2号外显子编辑，筛选获得44个单克隆细胞株，测序后，发生基因编辑阳性克隆为37个，阳性率为84.1％，在基因组两套染色体上(等位基因)均发生编辑的克隆的个数为4，双等位基因均发生编辑的概率为9.1％。

对比例1

根据实施例1测序结果的湖羊的DYA外显子2的序列，设计sg，并合成单链寡核苷酸序列。序列如下(5’-3’)：

上游序列Exon2-sgRNA3-F：CACCGGGCCAGAGGCGCCGTACGTC，SEQ ID No.15；

下游序列Exon2-sgRNA3-R：AAACGACGTACGGCGCCTCTGGCCC，SEQ ID No.16；

下划线处为BbsⅠ酶的酶切位点的核苷酸序列。

将合成的sg的寡核苷酸序列退火，得到双链sg序列Exon2-sgRNA3，退火程序为95℃、5min，37℃、10min，4℃保存；退火体系为：上游序列和下游序列各2.5μL、10×PCRbuffer1.0μL和ddH₂O补足至10μL。

按实施例2的方法，将双链sg序列Exon2-sgRNA3插入到px330-cas9载体中，得到重组载体pX330DYA-Exon2-sg3；

将实施例2构建得到的得到重组载体pX330DYA-Exon1-sg1和pX330DYA-Exon1-sg2、pX330DYA-Exon2-sg1和pX330DYA-Exon2-sg2与pX330DYA-Exon2-sg3组合后，按实施例2步骤4记载的方法分别转染绵羊成纤维细胞，另设置未转染重组载体的绵羊成纤维细胞为对照组记为NC，48h后提取细胞基因组；其中针对外显子1的组合如下：pX330DYA-Exon1-sg1和pX330DYA-Exon1-sg2的组合记为sg1+2；针对外显子2的组合如下：pX330DYA-Exon2-sg1和pX330DYA-Exon2-sg2的组合记为sg1+2，pX330DYA-Exon2-sg1和pX330DYA-Exon2-sg3的组合记为sg1+3，pX330DYA-Exon2-sg2和pX330DYA-Exon2-sg3的组合记为sg2+3；

将不同组合转染后提取的细胞基因组和对照组的细胞基因组分别以实施例1中的2对扩增引物进行PCR扩增，PCR扩增程序和体系与实施例1相同。

随后回收PCR扩增产物，具体回收步骤参照琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化回收(湖南艾科瑞生物工程有限公司，货号：AG21004)。

将回收产物取1μg进行退火，退火程序为95℃退火至85℃，每秒降温2℃，85℃退火至25℃，每秒降温0.3℃。随后在1μg退火产物中加入T7核酸外切酶，37℃孵育1h后，取部分酶切产物进行电泳检测，结果见图4，其中NC为未转染任何sgRNA的绵羊成纤维细胞。

由图4可知，通过体外T7核酸外切酶酶切实验证明，本发明实施例2设计的sgRNA相较于对比例1的sgRNA具有良好的编辑作用。

综上所述，本发明提供的sgRNA组可以利用CRISPR/Cas9系统对绵羊DYA基因进行编辑，在反刍动物进化及相关免疫机制研究中具有重要意义。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种靶向DYA基因的sgRNA组，其特征在于，所述sgRNA组包括Exon1-sgRNA和/或Exon2-sgRNA；

所述Exon1-sgRNA包括Exon1-sgRNA1和Exon1-sgRNA2；

所述Exon1-sgRNA1包括Exon1-sgRNA1-F和Exon1-sgRNA1-R；所述Exon1-sgRNA2包括Exon1-sgRNA2-F和Exon1-sgRNA2-R；

所述Exon1-sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述Exon1-sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述Exon1-sgRNA2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述Exon1-sgRNA2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；

所述Exon2-sgRNA包括Exon2-sgRNA1和Exon2-sgRNA2，所述Exon2-sgRNA1包括Exon2-sgRNA1-F和Exon2-sgRNA1-R；所述Exon2-sgRNA2包括Exon2-sgRNA2-F和Exon2-sgRNA2-R；

所述Exon2-sgRNA1-F的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述Exon2-sgRNA1-R的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

所述Exon2-sgRNA2-F的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述Exon2-sgRNA2-R的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

2.扩增权利要求1所述sgRNA组的靶标序列的引物对，其特征在于，所述引物对包括引物对1和/或引物对2；

所述引物对1的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述引物对1的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示；

所述引物对2的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示，所述引物对2的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.12所示。

3.一种敲除DYA基因的质粒组，其特征在于，所述质粒组包括Exon1-sgRNA质粒组和/或Exon2-sgRNA质粒组；

所述Exon1-sgRNA质粒组包括Exon1-sgRNA1质粒和Exon1-sgRNA2质粒；所述Exon1-sgRNA1质粒包括权利要求1所述sgRNA组中的Exon1-sgRNA1和px330质粒；所述Exon1-sgRNA2质粒包括权利要求1所述sgRNA组中的Exon1-sgRNA2和px330质粒；

所述Exon2-sgRNA质粒组包括Exon2-sgRNA1质粒和Exon2-sgRNA2质粒；所述Exon2-sgRNA1质粒包括权利要求1所述sgRNA组中的Exon2-sgRNA1和px330质粒；所述Exon2-sgRNA2质粒包括权利要求1所述sgRNA组中的Exon2-sgRNA2和px330质粒。

4.根据权利要求3所述的质粒组，其特征在于，所述px330质粒包括经BbsⅠ酶后的px330大片段质粒。

5.权利要求1所述sgRNA组或权利要求2所述的引物对或权利要求3或4所述的质粒组在编辑DYA基因中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述DYA基因包括绵羊的DYA基因。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述绵羊包括湖羊。

8.权利要求1所述sgRNA组或权利要求2所述的引物对或权利要求3或4所述的质粒组在鉴定DYA基因功能中的应用。

9.一种编辑绵羊细胞中DYA基因的方法，其特征在于，包括：将权利要求3或4所述质粒组导入绵羊细胞中，得到基因编辑的绵羊细胞。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述绵羊细胞包括绵羊成纤维细胞。

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