CN116064673A - 表达rs1的重组腺相关病毒载体及其应用 - Google Patents

表达rs1的重组腺相关病毒载体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116064673A
CN116064673A CN202211282719.XA CN202211282719A CN116064673A CN 116064673 A CN116064673 A CN 116064673A CN 202211282719 A CN202211282719 A CN 202211282719A CN 116064673 A CN116064673 A CN 116064673A
Authority
CN
China
Prior art keywords
tag
protein
recombinant adeno
gene
expressing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202211282719.XA
Other languages
English (en)
Inventor
雷博
刘婧阳
王卫萍
靳秀秀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Provincial Peoples Hospital
Original Assignee
Henan Provincial Peoples Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Provincial Peoples Hospital filed Critical Henan Provincial Peoples Hospital
Priority to CN202211282719.XA priority Critical patent/CN116064673A/zh
Publication of CN116064673A publication Critical patent/CN116064673A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种表达RS1的重组腺相关病毒载体及其应用，涉及基因治疗的技术领域。该表达RS1的重组腺相关病毒载体以CAG启动子作为RS1基因的启动子，能够显著提高RS1的表达量。将该表达RS1的重组腺相关病毒载体导入具有基因缺陷的XLRS视网膜中，能够改善视网膜形态和功能，缓解了现有技术中存在的缺乏一种有效的用于XLRS基因治疗的产品的问题。

Description

表达RS1的重组腺相关病毒载体及其应用
技术领域
本发明涉及基因治疗技术领域，尤其是涉及一种表达RS1的重组腺相关病毒载体及其应用。
背景技术
X染色体连锁先天性视网膜劈裂症(X-LinkedRetinoschisis，XLRS)是一种较常见的早发型中央视网膜退行性疾病，全世界发病率为1/5000～1/25000，是男性青少年黄斑变性的最主要原因之一。XLRS主要累及双眼，临床特征包括渐进性中央视力丧失、中心凹劈裂诱发放射状条纹、周围视网膜层间劈裂、视网膜脱离和玻璃体出血。XLRS患者的电生理信号(Electroretinogram，ERG)通常出现负波型，b波和a波的比值下降。目前，对XLRS尚无有效的治疗方法，仍以临床观察及治疗并发症为主。
基因突变是XLRS的主要原因，其致病基因为XLRS1。XLRS1编码在视网膜发育及维持结构中起重要作用的视网膜劈裂蛋白1(Retinoschisin1，RS1)。RS1是一种分泌蛋白，其分子结构是一对背靠背的八聚体环，通过分支网络桥连相邻细胞，在视网膜细胞间粘附和磷脂结合方面起重要作用。目前，至少有193种XLRS疾病相关的XLRS1突变类型(http://www.dmd.nl/)，这些突变大多数为点突变，也有缺失、插入和剪切位点突变。XLRS1突变导致RS1蛋白功能异常，如RS1的合成与分泌受阻等，进而引起Müller细胞纤维功能异常，从而导致视网膜劈裂。基因治疗可将外源正常基因导入靶细胞以纠正或补偿缺陷及异常基因引起的疾病，在多种遗传性疾病，尤其是遗传性眼病中有着广阔的应用前景。因此提供一种用于基因治疗XLRS的产品，是目前亟待解决的问题。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达RS1的重组腺相关病毒载体，并将其应用于制备XLRS基因治疗的产品，以缓解现有技术中存在的缺乏一种有效的用于XLRS基因治疗的产品的问题。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种表达RS1的重组腺相关病毒载体，该重组腺相关病毒载体含有RS1基因，所述RS1基因的启动子为CAG启动子。
优选地，RS1基因的下游包括标记蛋白；
优选地，所述标记蛋白包括蛋白标签和/或荧光蛋白；
优选地，所述蛋白标签包括Flag标签、3×Flag标签、His标签、GST标签、HA标签、Sumo标签、Avi标签、MBP标签、NusA标签、SNAP标签和C-Myc标签中的一种或几种；
优选地，所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白GFP、增强型绿色荧光白EGFP、黄色荧光蛋白YFP、红色荧光蛋白mCherry、别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、藻红青蛋白或藻红蛋白R；
优选地，所述标记蛋白自上游至下游依次包括蛋白标签和荧光蛋白；
优选地，所述蛋白标签和所述荧光蛋白之间含有自剪切多肽序列；
优选地，所述自剪切多肽选自F2A、P2A、E2A或T2A，优选为P2A。
优选地，所述RS1基因的核苷酸序列如Seq_1所示。
优选地，出发载体为pAAV-MCS-CW3SL载体。
优选地，上游至下游依次包括CAG启动子、RS1基因、3×FLAG、P2A、EGFP和CW3SL；所述RS1基因的核苷酸序列如Seq_1所示。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种RS1蛋白的制备方法，包括使用上述重组腺相关病毒载体表达RS1蛋白。
优选地，在293T细胞中表达所述重组腺相关病毒载体。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述表达RS1的重组腺相关病毒载体在制备XLRS基因治疗的产品中的应用。
优选地，所述产品应用于RS1基因敲除的小鼠。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于XLRS基因治疗的产品，该产品含有上述表达RS1的重组腺相关病毒载体，以及药学上可接受的任选的辅料。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
基因治疗可将外源正常基因导入靶细胞以纠正或补偿缺陷及异常基因引起的疾病，在多种遗传性疾病，尤其是遗传性眼病中有着广阔的应用前景。其中，腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)载体介导的基因治疗是眼病优选的传递系统。本发明筛选出了能够高表达RS1基因的启动子CAG，能够使整合有RS1基因的腺相关病毒载体高表达RS1基因。经试验证实，将整合有RS1基因的腺相关病毒载体导入具有基因缺陷的XLRS视网膜中，OCT检测证实视网膜形态明显改善，未见明显劈裂腔；ERG证实能够改善视网膜功能。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Rs1敲除鼠的构建模拟图；
图2为XLRS模型鼠免疫荧光检测结果；
图3A；实施例1构建的Rs1-KO小鼠模型暗适应视网膜电图；
图3B；实施例1构建的Rs1-KO小鼠模型明适应视网膜电图；
图3C实施例1构建的Rs1-KO小鼠模型暗适应ERG-a波振幅-刺激强度曲线；
图3D实施例1构建的Rs1-KO小鼠暗适应ERG-b波振幅-刺激强度曲线；
图3E实施例1构建的Rs1-KO小鼠明适应ERG-b波振幅-刺激强度曲线；
图4为pAAV-CAG-RS1-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL载体图谱；
图5为实施例2、对比例1和对比例2分别构建的载体转染293T细胞后RS1蛋白表达的免疫印记检测结果；
图6为Rs1-KO小鼠玻璃体腔注射AAV8-RS1后的OCT检测结果；
图7为Rs1-KO小鼠玻璃体腔注射AAV8-RS1后的ERG检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
需要说明的是：
本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案；本文所提到的所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案；所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种表达RS1的重组腺相关病毒载体，该重组腺相关病毒载体整合有RS1基因，且RS1基因以CAG启动子作为启动子。
发明人经实验发现，不同的启动子会导致RS1基因表达量的差异。发明人比较了分别采用CAG启动子、EF1α启动子和PGK启动子表达RS1基因，发现采用CAG启动子能够显著提高RS1的表达量，与采用PGK启动子相比，RS1的表达量显著提高。
腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)载体具有基因传递效率高，致病性低和安全性的优点。病毒载体进入机体后较易引起宿主的免疫反应，降低载体的用量是一种减少机体免疫反应的手段，但是载体的使用量降低，势必会使得目的基因的表达量降低，因此需要通过提高目的基因的表达效率来补偿由此带来的影响。本发明提供的表达RS1的重组腺相关病毒载体采用CAG启动子，能够显著提高宿主中外源RS1基因的表达量，在机体中表达相同量的RS1蛋白，能够通过施用更少的重组腺相关病毒载体实现，能够在一定程度上降低机体对重组腺相关病毒的免疫反应；或者，在施用同样含量的重组腺相关病毒载体，本发明提供的重组腺相关病毒载体能够产生更多的RS1蛋白，在基因治疗中能够取得更好的治疗效果。
在一些可选的实施方式中，表达RS1的重组腺相关病毒载体中，RS1基因的下游还包括标记蛋白。
在一些可选的实施方式中，标记蛋白包括蛋白标签和/或荧光蛋白。蛋白标签的实例包括但不限于Flag标签、3×Flag标签、His标签、GST标签、HA标签、Sumo标签、Avi标签、MBP标签、NusA标签、SNAP标签和C-Myc标签中的一种或几种。荧光蛋白的实例包括但不限于绿色荧光蛋白GFP、增强型绿色荧光白EGFP、黄色荧光蛋白YFP、红色荧光蛋白mCherry、别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、藻红青蛋白或藻红蛋白R。
在一些可选的实施方式中，标记蛋白自上游至下游依次包括蛋白标签和荧光蛋白，所述蛋白标签和所述荧光蛋白之间优选含有自剪切多肽序列，自剪切多肽序列能诱导细胞内含有其的重组蛋白自我剪切，若干病毒使用自剪切多肽通过核糖体跳跃由一种转录物产生两种蛋白质，使得正常肽键在自剪切多肽处削弱，导致由一个翻译事件产生两种不连续的蛋白质。在蛋白标签和荧光蛋白之间添加自剪切多肽序列，能够使表达后的RS1蛋白为含有蛋白标签的融合蛋白，同时还产生一个独立的荧光蛋白。自剪切多肽的序列来源包括但不限于口蹄疫病毒F2A、猪捷申病毒-1P2A、马鼻炎A病毒E2A或明脉扁刺蛾病毒T2A，优选为猪捷申病毒-1P2A。
当所述表达RS1的重组腺相关病毒载体包含上述多种组件时，各组件可以直接连接，即相邻两个组件不含有碱基；也可以间隔连接，即相邻两个组件之间含有至少一个碱基，或者含有其他组件。所述表达RS1的重组腺相关病毒载体还可选地包括本领域可接受的其他用于构建重组载体的组件，包括但不限于非编码区、抗性基因和增强子中的一种或多种等。本领域技术人员可以根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的教材、参考文献、工艺手册、商品说明和标准文件等中记载的方法来选择功能组件，本发明对此不做限制。
在一些优选的实施方式中，出发载体为pAAV-MCS-CW3SL载体。实验证实以该载体作为出发载体，将CAG启动子和RS1基因整合其中，能够实现RS1基因的高表达。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种RS1蛋白的制备方法，该制备方法包括使用重组腺相关病毒载体表达RS1蛋白。该技术方案的构思是基于CAG启动子能够实现RS1高表达，采用上述重组腺相关病毒载体制备RS1蛋白，可以提高RS1蛋白产量。在一些优选的实施方式中，在293T细胞中表达上述重组腺相关病毒载体。
可以理解的是，本发明提供的RS1蛋白的制备方法还可以包含本领域一般用于生产外源蛋白的步骤，包括但不限于细胞培养复苏、蛋白分离、纯化、鉴定、浓缩和保存等步骤，本领域技术人员可以根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的教材、参考文献、工艺手册、商品说明和标准文件等中记载的方法来进行，本发明对此不做限制。
基因治疗可将外源正常基因导入靶细胞以纠正或补偿缺陷及异常基因引起的疾病，在多种遗传性疾病，尤其是遗传性眼病中有着广阔的应用前景。基于此，本发明还提供了将上述表达RS1的重组腺相关病毒载体应用于制备XLRS基因治疗的产品。腺相关病毒载体介导的基因治疗具有转导效率高、能持续表达目的基因的优点。经试验证实，将上述整合有RS1基因的腺相关病毒载体导入具有基因缺陷的XLRS视网膜中，OCT(ptical coherencetomography光学相干断层扫描技术)检测证实视网膜形态明显改善，未见明显劈裂腔；ERG(electroretinogram，视网膜电图)证实能够改善视网膜功能。
在一些可选的实施方式中，XLRS基因治疗的产品应用于RS1基因敲除的小鼠。
基于上述将表达RS1的重组腺相关病毒载体应用于制备XLRS基因治疗的产品的发明构思，本发明还提供了一种用于XLRS基因治疗的产品，该产品含有上述表达RS1的重组腺相关病毒载体。
需要说明的是，所述用于XLRS基因治疗的产品还可选地包括药学上可接受的辅料，所述辅料的实例例如可以为但不限于为溶剂、缓冲物质、防腐剂、pH调节剂、稀释剂和渗透压调节剂中的一种或多种。
下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和技术效果。
实施例1
利用CRISPR/Cas9技术构建XLRS小鼠模型，以Rs1-201为模板设计sgRNA，删除Rs1编码区，达到敲除目的。
(1)如图1模拟图所示，制备sgRNA及Cas9-mRNA：Rs1-gRNA1序列为GTTAACTGTAAGGCGAGTAAT(5'to3'，Seq_2)，Rs1-gRNA2序列为GAGACTCGTGGGCCATACGCC(5'to3'，Seq_3)。以sgRNA-Vector为模板PCR扩增出Rs1-sgRNA的DNA片段，然后回收作为sgRNA体外转录的模板。再经过sgRNA体外转录与纯化回收，分装保存于-80℃冰箱备用。将Cas9转录载体线性化，再经过体外转录与纯化回收分装保存于-80℃冰箱备用。
(2)显微注射：将Cas9-mRNA、Rs1-sgRNA共同显微注射到C57小鼠胚胎中，注射后将胚胎移植到代孕受体小鼠的输卵管内。
(3)胚胎移植及F0小鼠鉴定与繁殖：将显微注射后的受精卵送回到代孕母鼠输卵管中，胚胎移植后约21天小鼠出生，出生2周左右完成基因型鉴定。
(4)Rs1-KO小鼠表型鉴定：通过Founder鼠序列比对及免疫荧光研究发现野生小鼠视网膜可见Rs1蛋白(绿色荧光)，而Rs1-KO小鼠视网膜无Rs1蛋白表达(图2)，证明XLRS模型鼠成功构建。
ERG结果显示(参见图3A～图3E)，五周龄野生C57BL/6J小鼠(n＝3)暗、明适应a波和b波正常。与同龄野生小鼠相比，Rs1-KO(n＝3)小鼠b波重度下降，b/a比值明显下降。Rs1-KO小鼠明适应b波为熄灭型。T-test分析，Bonferroni校准，**p<0.01，***p<0.001，证明XLRS模型鼠成功构建。
实施例2、对比例1和对比例2中使用的pAAV-CAG-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL质粒、pAAV-EF1α-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL质粒和pAAV-PGK-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL质粒购自和元生物。
实施例2
构建pAAV-CAG-RS1-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL载体，载体图谱如图4所示。
(1)扩增RS1模版：
设计引物：
前引物F：ATGTCACGCAAGATAGAAGGCT(5'to3'，Seq_4)；
后引物R：GGCACACTTGCTGACGCA(5'to3'，Seq_5)。
以人源的RPE细胞的DNA为模板，通过PCR扩增出RS1编码区(NM_000330.3，目的片段核苷酸序列如Seq_1所示)，退火温度为60℃。
Seq_1：
ATGTCACGCAAGATAGAAGGCTTTTTGTTATTACTTCTCTTTGGCTATGAAGCCACATTGGGATTATCGTCTACCGAGGATGAAGGCGAGGACCCCTGGTACCAAAAAGCATGCAAGTGCGATTGCCAAGGAGGACCCAATGCTCTGTGGTCTGCAGGTGCCACCTCCTTGGACTGTATACCAGAATGCCCATATCACAAGCCTCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACACCGGACCAGATCACCTGCTCTAACCCGGAGCAGTATGTGGGCTGGTATTCTTCGTGGACTGCAAACAAGGCCCGGCTCAACAGTCAAGGCTTTGGGTGTGCCTGGCTCTCCAAGTTCCAGGACAGTAGCCAGTGGTTACAGATAGATCTGAAGGAGATCAAAGTGATTTCAGGGATCCTCACCCAGGGGCGCTGTGACATCGATGAGTGGATGACCAAGTACAGCGTGCAGTACAGGACCGATGAGCGCCTGAACTGGATTTACTACAAGGACCAGACTGGAAACAACCGGGTCTTCTATGGCAACTCGGACCGCACCTCCACGGTTCAGAACCTGCTGCGGCCCCCCATCATCTCCCGCTTCATCCGCCTCATCCCGCTGGGCTGGCACGTCCGCATTGCCATCCGGATGGAGCTGCTGGAGTGCGTCAGCAAGTGTGCCTGA。
(2)NheI酶和BamHI酶双酶载体：酶切体系为：浓度150～200ng/μL的pAAV-CAG-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL质粒溶液4μL、NheI酶1μL、BamHI酶1μL、10×Buffer溶液4μL，补水至总体系20μL；酶切条件为：37℃16～18h，70～80℃5～10min。
(3)同源重组构建载体：TSINGKE TSV-S1
Figure BDA0003898667160000101
SoSoo Cloning Kit试剂盒货号为TSV-S1。
体系如下：
浓度150-200ng/μL的线性pAAV-CAG-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL质粒溶液1～2μL、浓度30～50ng/μL的靶基因cDNA溶液2～5μL、2×SoSoo溶液3～5μL，补水至总体系10μL；构建条件为：50℃15～20min；2～4℃∞。
(4)质粒转化：通过同源重组法将RS1 cds区链接到pAAV-CAG-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL的质粒中(如图4)。取100μL冰浴上融化的感受态细胞，加入目的DNA重组产物，轻轻混匀，冰上静置25min。42℃水浴热激45～60s，迅速转移至冰浴中，静置2min。向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌液体培养基(SOB)后37℃，200rpm复苏1h。吸取100ul的复苏液均匀涂布到含相应抗生素的LB培养基上，将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
(5)抽提质粒：通过无内毒素质粒大提试剂盒提取pAAV-CAG-RS1-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL质粒。
(6)质粒转染：将pAAV-CAG-RS1-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL质粒转染293T细胞。6孔板铺8×105每孔细胞，每孔2μg DNA、6ul lip3000和4μl P3000转染试剂，转染48h，收取细胞，提取蛋白。
对比例1
对比例1构建pAAV-EF1α-RS1-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL载体，与实施例1提供的载体的构建方法区别仅在于，通过同源重组法将RS1 cds区链接到pAAV-EF1α-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL的质粒中。
对比例2
对比例2构建pAAV-PGK-RS1-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL载体，与实施例1提供的载体的构建方法区别仅在于，通过同源重组法将RS1 cds区链接到pAAV-PGK-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL的质粒中。
效果例1
免疫印迹法证实pAAV-CAG-RS1-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL载体转染293T细胞能高表达RS1蛋白，结果如图5所示，pAAV-CAG-RS1-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL表达的RS1蛋白量高于pAAV-EF1α-RS1-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL载体，显著高于pAAV-PGK-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL载体。
效果例2
AAV8-RS1(pAAV-CAG-RS1-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL载体)介导的基因治疗能改善Rs1-KO小鼠视网膜形态和功能。(1)OCT(ptical coherence tomography光学相干断层扫描技术)证实AAV8-RS1改善Rs1-KO小鼠视网膜形态：在Rs1-KO小鼠在出生21天时随机分为三组，每组10～20只，玻璃体腔分别注射1μl PBS、1μl 1×1012v.g./eye AAV8-EGFP和1μl 1×1012v.g./eye AAV8-RS1，1.5M和2.5M后，观察视网膜形态。图6为野生型小鼠与Rs1-KO小鼠视网膜形态，与野生型小鼠相比，Rs1-KO小鼠可见明显劈裂腔。与AAV8-EGFP组相比，AAV8-RS1组治疗后的小鼠视网膜形态明显改善，未见明显劈裂腔。OCT结果证实玻璃体腔注射AAV8-RS1(pAAV-CAG-RS1-3FLAG-P2A-EGFP-CW3SL)后可明显改善Rs1-KO小鼠的视网膜形态。(2)ERG(electroretinogram，视网膜电图)证实AAV8-RS1改善Rs1-KO小鼠视网膜功能。在Rs1-KO小鼠在出生21天时随机分为三组，每组10～20只，玻璃体腔分别注射1μl PBS、1μl1×1012v.g./eye AAV8-EGFP和1μl 1×1012v.g./eye AAV8-RS1，1.5M和2.5M后，观察视网膜形态。检测Rs1基因敲除小鼠和野生型小鼠在-3，-2，-1，0，1log cd·s/m2五个刺激强度下的暗适应和0，1log cd·s/m2两个刺激强度下明适应ERG结果，观察视网膜功能。如图7所示，ERG结果证实玻璃体腔注射AAV8-RS1后可明显改善Rs1-KO小鼠的视网膜功能。与AAV8-EGFP组相比，AAV8-RS1组小鼠b波明显上升，b/a比值明显上升，1.5个月疗效更明显。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.表达RS1的重组腺相关病毒载体，其特征在于，含有RS1基因，所述RS1基因的启动子为CAG启动子。
2.根据权利要求1所述的表达RS1的重组腺相关病毒载体，其特征在于，RS1基因的下游包括标记蛋白；
优选地，所述标记蛋白包括蛋白标签和/或荧光蛋白；
优选地，所述蛋白标签包括Flag标签、3×Flag标签、His标签、GST标签、HA标签、Sumo标签、Avi标签、MBP标签、NusA标签、SNAP标签和C-Myc标签中的一种或几种；
优选地，所述荧光蛋白包括绿色荧光蛋白GFP、增强型绿色荧光白EGFP、黄色荧光蛋白YFP、红色荧光蛋白mCherry、别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、藻红青蛋白或藻红蛋白R；
优选地，所述标记蛋白自上游至下游依次包括蛋白标签和荧光蛋白；
优选地，所述蛋白标签和所述荧光蛋白之间含有自剪切多肽序列；
优选地，所述自剪切多肽选自F2A、P2A、E2A或T2A，优选为P2A。
3.根据权利要求1所述的表达RS1的重组腺相关病毒载体，其特征在于，所述RS1基因的核苷酸序列如Seq_1所示。
4.根据权利要求1所述的表达RS1的重组腺相关病毒载体，其特征在于，出发载体为pAAV-MCS-CW3SL载体。
5.根据权利要求1-4任一项所述的表达RS1的重组腺相关病毒载体，其特征在于，上游至下游依次包括CAG启动子、RS1基因、3×FLAG、P2A、EGFP和CW3SL；所述RS1基因的核苷酸序列如Seq_1所示。
6.一种RS1蛋白的制备方法，其特征在于，包括使用权利要求1-5任一项所述的重组腺相关病毒载体表达RS1蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，在293T细胞中表达所述重组腺相关病毒载体。
8.权利要求1-5任一项所述的表达RS1的重组腺相关病毒载体在制备XLRS基因治疗的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品应用于RS1基因敲除的小鼠。
10.一种用于XLRS基因治疗的产品，其特征在于，含有权利要求1-5任一项所述的表达RS1的重组腺相关病毒载体，以及药学上可接受的任选的辅料。
CN202211282719.XA 2022-10-19 2022-10-19 表达rs1的重组腺相关病毒载体及其应用 Pending CN116064673A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211282719.XA CN116064673A (zh) 2022-10-19 2022-10-19 表达rs1的重组腺相关病毒载体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202211282719.XA CN116064673A (zh) 2022-10-19 2022-10-19 表达rs1的重组腺相关病毒载体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116064673A true CN116064673A (zh) 2023-05-05

Family

ID=86179255

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202211282719.XA Pending CN116064673A (zh) 2022-10-19 2022-10-19 表达rs1的重组腺相关病毒载体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116064673A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020033863A1 (en) * 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
CN111621502A (zh) * 2019-02-28 2020-09-04 武汉纽福斯生物科技有限公司 视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用
CN113025618A (zh) * 2019-12-24 2021-06-25 上海市第一人民医院 一种x连锁遗传性视网膜劈裂症的基因治疗方案与应用
CN113648432A (zh) * 2021-03-31 2021-11-16 中山大学中山眼科中心 rAAV2/Retro作为针对视网膜感光细胞的递送系统及其在制备治疗视网膜疾病药物中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020033863A1 (en) * 2018-08-09 2020-02-13 Bioverativ Therapeutics Inc. Nucleic acid molecules and uses thereof for non-viral gene therapy
CN111621502A (zh) * 2019-02-28 2020-09-04 武汉纽福斯生物科技有限公司 视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用
CN113025618A (zh) * 2019-12-24 2021-06-25 上海市第一人民医院 一种x连锁遗传性视网膜劈裂症的基因治疗方案与应用
CN113648432A (zh) * 2021-03-31 2021-11-16 中山大学中山眼科中心 rAAV2/Retro作为针对视网膜感光细胞的递送系统及其在制备治疗视网膜疾病药物中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230067480A1 (en) Method for treating usher syndrome and composition thereof
US11591614B2 (en) Gene therapy for ceroid lipofuscinoses
WO2023207672A1 (zh) Rs1基因在制备xlrs治疗剂中的应用及治疗剂
AU2024202693A1 (en) Gene Therapy For Ocular Disorders
WO2023231778A1 (zh) 用于治疗粘多糖贮积症iiia型的转基因表达盒
CA3128660A1 (en) Compositions and methods for the prevention and/or treatment of covid-19
KR20210039495A (ko) 피드백이 가능한 합성 유전자, 표적 시드 매치 카세트, 및 그 용도
Jia et al. AAV-mediated gene-replacement therapy restores viability of BCD patient iPSC derived RPE cells and vision of Cyp4v3 knockout mice
CN116064673A (zh) 表达rs1的重组腺相关病毒载体及其应用
ES2719691T3 (es) Procedimiento de restauración de tolerancia inmunitaria in vivo
CA3118329A1 (en) Compositions and methods for the prevention and/or treatment of covid-19
Owen IV et al. Approaches and limitations to gene therapy for mitochondrial diseases
CN114931652B (zh) 一种Hmga2基因在修复受损视网膜中的应用
CN118222631B (zh) 用于靶向治疗遗传性视网膜变性的病毒载体组合
CN110624114B (zh) Crygd蛋白的应用
WO2024212185A1 (zh) 高效可控rna递送系统
Loan et al. Treatment options in motor neuron disease: Amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy
Kumar et al. Characterisation of RNA editing and gene therapy with a compact CRISPR-Cas13 in the retina
CA3215970A1 (en) Gene therapy for neuroprotection
CA3146392A1 (en) Compositions and methods for the prevention and/or treatment of covid-19
CN117165630A (zh) Sparc基因修饰间充质干细胞的设计方法和制备方法及其应用
CA3096009A1 (en) Compositions and methods for the prevention and/or treatment of covid-19
CA3128078A1 (en) Compositions and methods for the prevention and/or treatment of covid-19
CN116444685A (zh) 高效可控rna递送系统
CN118772248A (zh) 一种外泌体富集多肽及其基因工程化外泌体和其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination