CN110624114B - Crygd蛋白的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了CRYGD蛋白的应用及一种CRYGD蛋白的重组质粒。本发明所述CRYGD蛋白的重组质粒，为含有编码所述CRYGD蛋白核苷酸序列的基因载体转化宿主细胞后提取获得。CRYGD过表达质粒表达的CRYGD蛋白能够抑制视网膜祖细胞(RPC)及视网膜色素上皮细胞(RPE)的凋亡，可以作为视网膜祖细胞及视网膜色素上皮细胞凋亡的抑制剂，用于预防或治疗视网膜色素变性、黄斑变性、糖尿病视网膜病变等疾病。

Description

CRYGD蛋白的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及CRYGD蛋白的应用，尤其是涉及CRYGD蛋白在制备预防或治疗视网膜退行性病变的药物中的应用。
背景技术
视网膜退行性病变(Retinal degeneration)是由于视网膜细胞死亡引发的一系列眼睛疾病的统称，包括视网膜色素变性(Retinitis Pigmentosa，RP)和年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration，ARMD)、糖尿病视网膜病变等疾病。其中视网膜色素变性是一组由于视网膜光感受器(视锥细胞和视杆细胞)退化及视网膜色素上皮变性为主要特征的进行性可致盲的遗传性视网膜疾病，世界范围内发病率约为1/3 500。RP的临床特点主要有进行性视野缩小、夜盲、后极部或赤道部出现骨细胞样色素沉着、视神经乳头蜡黄、视网膜电流图(electrore-tinogram，ERG)显著异常或无波形等。因其发病机制主要为细胞凋亡，目前该类疾病尚无有效的预防和治疗方法，多年来各国科学家努力探索尝试各种方法治疗视网膜退行性病变，到目前为止方法有以下三种：
(1)神经营养因子注射法。试验证明神经营养因子可以推迟或控制感光细胞的凋亡，从而达到治疗视网膜退行性病变的目的。但是，绝大多数的营养因子只有通过眼内注射起到治疗作用，而由于该方法不能长效供应营养，需要多次注射，易造成感染和视网膜脱离等并发症，其风险远远大于所获得的收益，所以该类方法仍需要进一步探索和研究。
(2)细胞治疗方式。将细胞通过各种途径运输到眼内，通过细胞持续释放神经保护因子或细胞替代等方式治疗视网膜退行性病变。常用于治疗的细胞主要有：①胚胎干细胞(ES)：它具有分化成多种细胞的能力，但是这种细胞存在伦理、免疫排斥和畸胎瘤等问题，不适合临床应用；②多能诱导干细胞(iPS)：指将正常的成熟细胞在体外重编程为多能诱导干细胞，从理论上具有多向分化能力，但是它存在病毒整合和表达异常等问题；③间充质干细胞(MSC)：这种细胞具有有限的分化能力，取材方便，可以自体治疗，但是由于它有限的分化能力，因此在视网膜疾病治疗中的成功率并不高。
(3)基因治疗方式：主要指利用病毒或非病毒载体将目的基因或功能基因转运到眼内，使载体遗传信息与受体遗传信息进行重新整合，从而从基因水平修复错配、突变等基因，达到治疗目的。
基因治疗RP取得了较大的进展。研究发现能够引起视网膜感光细胞变性相关的基因有140余种，其中32个基因已被克隆。目前已建立了多种RP的动物模型，包括视网膜变性小鼠、慢性视网膜变性(retinal degen-eration slow，rds)小鼠、皇家外科学院(RoyalCollegeof Surgeons，RCS)大鼠，为RP发病机制及治疗研究提供了帮助。与RP相关的基因所编码的蛋白质主要与光级酶联反应或视紫质光代谢、光感受器结构蛋白、光感受器细胞转录因子有关，目前研究表明RP病理变化均以细胞凋亡为共同途径。目前治疗Leber先天性黑矇(leber congenital amaurosis，LCA)的一期临床研究已经取得初步成功，这也为基因治疗RP带来了新的希望。
Crystallin gamma(CRYG)基因表达开始于最早的晶状体纤维细胞，在晶状体核中表达丰富，是晶状体核的主要构成部分，对晶状体的发育、细胞分化以及保持透明性有重要作用。Gamma晶状体蛋白有四个特征性的“Greek-key”基序。人类的gamma crystallin(crystallin gamma)蛋白的编码基因包括一组只在晶状体表达的多基因家族成员，位于染色体2q33-q35，估计有7个密切相关基因家族成员CRYGA-CRYGF和小片段基因CRYGG。其中CRYGE和CRYGF是假基因，只有CRYGC和CRYGD编码丰富的蛋白质产物。CRYGD是gamma-crystallin(crystallin gamma)的一个亚基，目前其生物学功能主要与视觉感知，细胞对氧活性的反应，晶状体纤维细胞的分化有关，未见CRYGD与视网膜色素变性相关的报道。
发明内容
申请人构建了人CRYGD表达载体以及视网膜祖细胞(RPC)及视网膜色素上皮细胞ARPE-19的H2O2诱导损伤模型，然后采用MTT检测不同处理组的细胞相对细胞活力，结果显示H2O2能够诱导视网膜祖细胞及ARPE-19人视网膜色素上皮的细胞氧化应激损伤，而转染CRYGD过表达质粒具有保护视网膜祖细胞和ARPE-19人视网膜色素上皮细胞的氧化应激损伤的作用。
因此本发明提供了CRYGD蛋白在制备视网膜祖细胞或视网膜色素上皮细胞的凋亡抑制剂中的应用。尤其是在制备H2O2诱导的视网膜祖细胞或视网膜色素上皮细胞的凋亡抑制剂中的应用。
目前研究表明，视网膜色素变性等视网膜退行性病变病理变化均以细胞凋亡为共同途径，因此抑制视网膜祖细胞或视网膜色素上皮细胞的凋亡可以有效改善视网膜色素变性病理变化。因此本发明提供了CRYGD蛋白在制备预防或治疗视网膜退行性病变的药物中的应用。
其中，所述视网膜退行性病变包括视网膜色素变性、黄斑变性、糖尿病视网膜病变。
作为优选，所述的CRYGD蛋白为含有编码所述CRYGD蛋白核苷酸序列的基因载体转化宿主细胞后表达获得。
作为优选，所述编码所述的CRYGD蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
基因载体包括病毒载体和非病毒载体，病毒载体主要有腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体、慢病毒载体、腺病毒载体、重组腺相关病毒载体等。因为AAV载体其本身并不会被整合入人体基因组，而是作为循环载体，降低了引起其他基因病的风险，且只引起较小的免疫反应，并能在多种视网膜细胞中长期转基因表达，使其成为基因治疗眼部疾病的一个重要载体。病毒载体的缺点是所携带的基因大小有限，如AAV载体所携带的基因要小于4.7kb；非病毒载体对转移基因的大小没有限制，非病毒载体具备无传染性，没有载体容量限制，材料来源广泛，化学结构可控制，比病毒载体更安全，且易于大量制备，在表达质粒、反义寡核苷酸或反义表达质粒真核细胞的靶向转移中，有着病毒载体不可替代的作用。
作为优选，所述基因载体为非病毒载体。
在一些实施方案中，所述基因载体为真核表达载体pIRES2-EGFP。
作为优选，所述宿主细胞可以为昆虫细胞、细菌、酵母或哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为293T细胞。
本发明还提供了一种CRYGD的重组质粒，含有编码所述CRYGD蛋白核苷酸序列的基因载体转化宿主细胞后提取获得。
作为优选，所述重组质粒中所述编码所述的CRYGD蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
在一些实施方案中，所述重组质粒中所述基因载体为真核表达载体pIRES2-EGFP。
作为优选，所述重组质粒中所述宿主细胞可以为昆虫细胞、细菌、酵母或哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，所述重组质粒中所述宿主细胞为293T细胞。
由上述技术方案可知，本发明公开了CRYGD蛋白的应用及一种CRYGD蛋白的重组质粒。本发明所述CRYGD的重组质粒，为含有编码所述CRYGD蛋白核苷酸序列的基因载体转化宿主细胞后提取获得。CRYGD的重组质粒表达的CRYGD蛋白能够抑制视网膜祖细胞(RPC)及视网膜色素上皮细胞(RPE)的凋亡，可以作为视网膜祖细胞或视网膜色素上皮细胞的凋亡的抑制剂，用于预防或治疗视网膜色素变性、黄斑变性、糖尿病视网膜病变等视网膜退行性病变。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示真核表达载体图谱；
图2示CRYGD扩增胶回收电泳图；
图3示CRYGD和pIRES2-EGFP载体酶切胶回收电泳图；
图4示实施例2H2O2诱导损伤模型的建立，其中图A为视网膜祖细胞(RPC)H2O2造模浓度、图B为ARPE19细胞H2O2造模浓度；
图5示CRYGD过表达质粒对氧化应激损伤的视网膜祖细胞(RPC)的抗凋亡作用；
图6示CRYGD过表达质粒对氧化应激损伤的ARPE-19细胞的抗凋亡作用。
具体实施方式
本发明公开了CRYGD蛋白的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1、人CRYGD表达载体的构建
分析CRYGD的基因序列，人CRYGD基因已在GenBank注册，注册号NM_006891.3，定位于001013649.3，定位于2q33.3，全长724bp，编码174个氨基酸，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述。
人CRYGD基因序列：(SEQ ID NO：1)：
Figure BDA0001706611080000051
人CRYGD基因的组织表达谱分析显示：该基因在人眼、卵巢和骨髓中高表达，在肝癌细胞HepG2、人红细胞白血病细胞HEL中高表达。本发明所述的真核重组质粒，由序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列中的CRYGD片段与真核载体构建而成。
根据GenBank上提供的基因序列，设计CRYGD的扩增引物，并设计酶切位点，便于后续构建质粒，真核表达载体选择pIRES2-EGFP(图1)。引物信息如下(表1)。
表1引物信息
Primer names Sequences(5’-3’)
CRYGD-F acgCTCGAG Atggggaagatcaccctc
CRYGD-R tgc ggatcc TCAGGAGAAATCTATGACTCTCC
从人干细胞来源的cDNA中PCR扩增CRYGD基因片段，具体反应体系与程序如下：
反应体系：
Figure BDA0001706611080000061
PCR程序：
Figure BDA0001706611080000062
Figure BDA0001706611080000071
回收得到扩增的基因片段，具体的回收步骤见试剂盒实验步骤(图2)；
质粒和目的片段酶切：用XhoI、BamHI内切酶分别回收上步骤所得的基因片段以及pIRES2-EGFP载体，反应体系如下：
Figure BDA0001706611080000072
37℃酶切3h。
分别回收上步骤所得的酶切后的样品(图3)，具体实验步骤见于试剂盒实验步骤。
基因片段与线性化的载体连接，反应如下：
Figure BDA0001706611080000073
16℃连接过夜。
转化感受态细胞：从-80℃冰箱取出1管100μl E coli XL1-BLUE MRF’感受态细胞，放冰上解冻后取10μl连接产物加到感受态中混匀，静置30min，42℃水浴热激1min，冰上静置2min。加预先复温的SOC培养液500μl，37℃振荡培养1h，涂板过夜37℃培养。
挑取数个菌落，做菌落PCR检测转化子；
挑取检测阳性的菌落摇菌，抽提质粒，抽提质粒的试剂盒具体见于试剂盒的实验步骤；
阳性克隆送测序验证，结果正确。
实施例2、视网膜祖细胞(RPC)、视网膜色素上皮细胞ARPE-19的H2O2诱导损伤模型的建立
RPC及ARPE-19细胞传代培养，按照2×105cell/ml的密度铺至96孔板内，每孔100μl。24h后采用不同浓度的H2O2(0mM，0.25mM，0.5mM，0.75mM，1mM，1.5mM，2mM)分别作用RPC及ARPE-19细胞24h。每孔加MTT溶液20μl，继续孵育2-4h。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以不同浓度H2O2为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。MTT法检测细胞存活率在50％左右时的H2O2浓度做为氧化损伤模型的造模浓度。
由图4A可见，当H2O2浓度在0.75mM时，RPC细胞存活率为56.35％，所以0.75mM H2O2确定为后续实验的氧化损伤模型的造模浓度。
图4B可见，当H2O2浓度在1mM时，ARPE-19细胞存活率为53.23％，所以1mM H2O2确定为后续实验的氧化损伤模型的造模浓度。
实施例3、CRYGD过表达质粒对氧化应激损伤的RPC细胞的抗凋亡作用
实验分4组：正常细胞组，H2O2损伤模型组，实验对照组，实验组。每组处理方式如下表2。
表2每组处理方式
Figure BDA0001706611080000081
MTT检测各实验组细胞相对细胞活力，结果如图5。
结果显示，H2O2损伤模型组和实验对照组细胞相对细胞活力低于正常细胞组(P＜0.01)，二者之间没有差别。实验组细胞相对细胞活力高于实验对照组(P＜0.05)，说明H2O2能够诱导RPC细胞的氧化应激损伤，转染空质粒pIRES2-EGFP对RPC细胞的氧化应激损伤没有保护作用，而转染CRYGD过表达质粒具有保护RPC细胞的氧化应激损伤的作用。
实施例4、CRYGD过表达质粒对氧化应激损伤的ARPE-19细胞的抗凋亡作用
实验分4组：正常细胞组，H2O2损伤模型组，实验对照组，实验组。每组处理方式如下表3。
表3每组处理方式
Figure BDA0001706611080000091
MTT检测各实验组细胞相对细胞活力，结果如图6。
结果显示，H2O2损伤模型组和实验对照组细胞相对细胞活力低于正常细胞组(P＜0.01)，二者之间没有差别。实验组细胞相对细胞活力高于实验对照组(P＜0.05)，说明H2O2能够诱导ARPE-19人视网膜色素上皮细胞氧化应激损伤，转染空质粒pIRES2-EGFP对ARPE-19人视网膜色素上皮细胞的氧化应激损伤没有保护作用，而转染CRYGD过表达质粒具有保护ARPE-19人视网膜色素上皮细胞的氧化应激损伤的作用。
序列表
<110> 何伟
<120> CRYGD蛋白的应用
<130> MP1805347
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 724
<212> DNA
<213> 人(human)
<400> 1
ttgtgcggtt cttgccaacg cagcagccct cctgctatat agcccgccgc gccgcagccc 60
cacccgctca gcgccgccgc cccaccagct cagcaccgcc gtgcgcccag ccagccatgg 120
ggaagatcac cctctacgag gaccggggct tccagggccg ccactatgaa tgcagcagcg 180
accaccccaa cctgcagccc tacttgagcc gctgcaactc ggcgcgcgtg gacagcggct 240
gctggatgct ctatgagcag cccaactact cgggcctcca gtacttcctg cgccgcggcg 300
actatgccga ccaccagcag tggatgggcc tcagcgactc ggtccgctcc tgccgcctca 360
tcccccactc tggctctcac aggatcagac tctatgagag agaggactac agaggccaga 420
tgatagagtt cactgaggac tgctcctgtc ttcaggaccg cttccgcttc aatgaaatcc 480
actccctcaa cgtgctggag ggctcctggg tcctctacga gctgtccaac taccgaggac 540
ggcagtacct gctgatgcca ggggactata ggcgctacca ggactggggg gccacgaatg 600
ccagagtggg ctctctgagg agagtcatag atttctcctg aaatatgtcc tcttttgttg 660
tttcttaatt tggaaactaa taaaatattt tctgtgtgtt cctggcaaaa aaaaaaaaaa 720
aaaa 724

Claims (4)

1.CRYGD蛋白在制备视网膜祖细胞及视网膜色素上皮细胞凋亡抑制剂中的应用，所述编码CRYGD蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.CRYGD蛋白在制备预防或治疗视网膜退行性病变的药物中的应用；
所述视网膜退行性病变为视网膜色素变性、黄斑变性；
所述编码CRYGD蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的CRYGD蛋白为含有编码所述CRYGD蛋白核苷酸序列的基因载体转化宿主细胞后表达获得。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述基因载体为真核表达载体pIRES2-EGFP。
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