JP2018510620A

JP2018510620A - 最適化されたｒｐｅ６５プロモーター及びコード配列

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Publication number: JP2018510620A
Application number: JP2017541749A
Authority: JP
Inventors: スミス，アレクサンダー; アリ，ロビン
Original assignee: UCL Biomedica PLC
Current assignee: UCL Business Ltd
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Filing date: 2016-02-08
Publication date: 2018-04-19
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Abstract

本発明は、レーバー先天性黒内障(LCA)を含む、患者における網膜ジストロフィーの予防及び/又は処置に関する。【選択図】図1

Description

本発明は、網膜ジストロフィー、特に網膜色素上皮の障害、例えば、レーバー先天性黒内障などを処置及び/又は予防するための遺伝子治療に関する。

遺伝性網膜ジストロフィー(IRD)を含む網膜ジストロフィーは、視細胞の進行性喪失及びそれに伴う視力喪失を特徴とする遺伝学的及び表現型的に不均一な疾患の大きなグループを形成する。IRDは、ヨーロッパ及び米国において、約3000人に1人が罹患している。現在まで、網膜ジストロフィーに関連した約200種の遺伝子及びさらに50種の遺伝子座が同定されている。これらの障害の大部分は、劣性遺伝又はX連鎖遺伝によって獲得された機能喪失変異によって引き起こされる。

発症、視力低下の速度、及び罹患した原発細胞型に関して、実質的な変動が存在する。遺伝性網膜変性の最も重篤な形態は、様々なタイプのレーバー先天性黒内障(LCA)であり、これは、誕生時に重症の視力障害があり、多くの場合、最初の20年間に完全に視力を喪失するものである。網膜変性において最も一般的に影響を受ける原発細胞型は視細胞であるが、網膜色素上皮(RPE)などの他の細胞型における欠陥は、光受容体の機能低下及びそれらのその後の喪失をもたらし得る。

RPEの欠陥に起因する遺伝性網膜ジストロフィーの一例は、LCA症例の6〜16％を占める、RPE優位型鉄依存性レチノイドイソメロヒドロラーゼRPE65の欠陥によって引き起こされるLCAの形態である。その欠如によって、桿体機能の欠如に至る視覚サイクルの破壊が生じ、結果的に光受容体の変性が起こる。

いくつかの臨床的及び前臨床的遺伝子置換治療試験からは、アデノウイルスAAV2ベクターの網膜下送達が安全であり、視覚機能の亢進(Bainbridge et al. 2008, Maguire et al. 2008, 2009, Hauswirth et al. 2008, Cideciyan et al 2008, 2009)、及び視覚野における活性の増強(Ashtari et al. 2011)が生じ得ることが明らかとなっている。

しかし、RPEにおけるRPE65の遺伝子治療置換の以前の研究において(Bainbridge et al. 2008)、著者らは、処置の際、ある患者の網膜感受性及び視覚誘導移動性に改善はあったが、視力及び周辺視野における有意な改善はなかったことを報告している。さらに、処置した別の患者における測定したすべてのパラメーターに有意な改善はなかった。網膜電図検査応答における改善は、未だいずれの研究においても報告されていない。AAV2/4ベクター介在治療法によって30か月RPE65-/-イヌを処置しても、視力又は網膜機能は回復しなかったことも確認されている(Le Meur et al. 2007)。

Bainbridge, J. W. B. et al., Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis, N. Engl. J. Med. 358, 2231-2239 (2008). Maguire, A. M. et al., Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis, N. Engl. J. Med. 358, 2240-2248 (2008). Maguire, A. M. et al., Age-dependent effects of RPE65 gene therapy for Leber's congenital amaurosis; a phase 1 dose-escalation trial. The Lancet 374, 1597-1605 (2009). Hauswirth, W. et al., Phase I Trial of Leber Congenital Amaurosis due to RPE65 Mutations by Ocular Subretinal Injection of Adeno-Associated Virus Gene Vector: Short-Term Results, Hum. Gene Ther. 19, 979-990 (2008). Cideciyan, A. V. et al., Human gene therapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of vision but with slow rod kinetics, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 15112-15117 (2008). Cideciyan, A. V. et al., Vision 1 year after gene therapy for Leber’s congenital amaurosis, N. Engl. J. Med. 361, 725-727 (2009). Ashtari, M. et al., The human visual cortex responds to gene therapy-mediated recovery of retinal function, J. Clin. Invest. 121, 2160-2168 (2011). Le Meur, G. et al., Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium, 14, 292-303 (2007).

したがって、網膜ジストロフィー、とりわけ遺伝性網膜ジストロフィー、特に網膜色素上皮(RPE)の障害、例えばレーバー先天性黒内障に対する遺伝子置換療法の改善が必要とされている。

本発明は、RPEにおいて遺伝子を発現させるための最適化プロモーターの作製に基づいている。この最適化プロモーターを配列番号2に示す。本プロモーターは、Bainbridge et al.(2008)において使用されているヒトRPE65プロモーターのヌクレオチド865〜1614を含み、それを配列番号1に示す。RPEにおいて制御遺伝子の発現を駆動するためのベクターにおいてこのプロモーターを使用すると、元のRPE65プロモーターを用いた場合よりも発現レベルは約20倍高く、効果的であった。最適化されたRPE65プロモーターは、元のRPE65プロモーターよりも有効であり、視細胞と関連してRPE細胞での発現の駆動においてよりストリンジェントであった。

さらに、配列番号3に示すRPE65の天然コード配列が最適化され、配列番号4に示す最適化された配列が得られた。この最適化されたRPE65配列は、ユビキタスCMVプロモーターを保有するAAV2/8発現プラスミドをトランスフェクションした後のRPE65タンパク質産生レベルに対する効果を判定するため、元のRPE65配列と並列してin vitroで(ヒト)293T細胞において試験した。RPE65コード配列の最適化後の293T細胞におけるin vitroでのタンパク質産生は、野生型コード配列と比べ、最適化されたコード配列を保有するベクターから産生されるRPE65タンパク質の量が7倍増加することを示した。

また、最適化されたプロモーター及び最適化されたRPE65配列はまた、ベクター内で組み合わせ、RPE65欠損マウスにおけるin vivoでのそれらの網膜機能回復能力を試験した。回復の効果は、Bainbridge et al(2008)において以前に使用された臨床グレードのベクターと比較した。低ベクター用量を投与し、制限状況下での処置効果を比較できるようにした。b波振幅を回復の尺度として使用した。驚いたことに、最適化されたベクターで処置した眼のb波振幅は、300倍高い用量の元のベクターを注射した眼の振幅と同じであるか、それよりも高かった。したがって、本発明によるプロモーター及び/又はコード配列の最適化は、天然配列を使用する場合と比べて非常に有利である。

したがって、本発明は、
(a)作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列にRPE特異的発現を付与する、配列番号1由来の連続したヌクレオチドの配列、又は、
(b)(a)の前記配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、RPE特異的プロモーター活性を保持する配列
を含む、網膜色素上皮(RPE)特異的プロモーターを提供する。

別の関連する態様において、本発明は、RPE特異的方法で発現される配列に作動可能に連結されている、本発明のプロモーターを含む発現構築物を提供する。

別の関連する態様において、本発明は、本発明のプロモーター又は本発明の発現カセットを含むベクターを提供する。

別の関連する態様において、本発明は、本発明のベクターを含有するか、又は本発明のウイルスベクターを産生する宿主細胞を提供する。

別の関連する態様において、本発明は、本発明のベクター及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。

別の関連する態様において、本発明は、網膜ジストロフィーを予防又は処置する方法における使用のための本発明のベクターを提供する。

別の関連する態様において、本発明は、網膜ジストロフィーの処置又は予防用の医薬品の製造における本発明のベクターの使用を提供する。

別の関連する態様において、本発明は、本発明のベクターの治療上有効な量を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における網膜ジストロフィーを処置又は予防する方法を提供する。

本発明はまた、本発明のプロモーターを含む発現構築物及びベクター、並びにそのようなベクターを含む医薬組成物、並びに網膜ジストロフィー、特に網膜色素上皮の障害、例えばレーバー先天性黒内障などの処置又は予防におけるそのようなベクターの使用を提供する。

網膜下注射後のマウス網膜における元のRPE65プロモーター及び新規RPE65プロモーター配置によって駆動されるGFP発現レベル及びパターンを示す図である。定量的PCR(A)及びタンパク質ブロット(B)を使用したプロモーター活性の評価。(C)AAV-RPE65-eGFP(上図)、又はAAV-NA-eGFP(下図)のいずれかを網膜下注射した4週間後の眼の凍結切片。 RPE65コード配列を最適化した後の293T細胞におけるin vitroでのRPE65タンパク質産生のウェスタンブロット評価(A)、及びその後の定量(B)を示す図である。白色の棒は最適化されていないRPE65コード配列を使用したRPE65タンパク質産生を示し、黒色の棒は最適化されたRPE65コード配列(配列番号4)を使用したRPE65タンパク質産生を示す。最適化されたベクター(AAV5-最適化RPE65)及び元のベクター(AAV2-hRPE65、Bainbridge et al 2008)の処置後4週間の処置効果の比較を示す図である。このグラフは、両ベクターがピーク発現に達した場合、処置後4週間での平均暗順応b波振幅(平均±SD)を示す。最適化されたベクターは、新規の(NA)RPE65プロモーター配置及び最適化されたRPE65コード配列を含む。

配列の簡潔な説明
配列番号1は、Bainbridge et al (2008)において使用された形態のヒトRPE65プロモーターのDNA配列を示す。
配列番号2は、最適化されたRPE65プロモーター断片のDNA配列を示す。
配列番号3は、ヒトRPE65遺伝子の天然cDNA配列を示す。
配列番号4は、最適化RPE65遺伝子のcDNA配列を示す(Kozak配列及びコード配列)。
配列番号5は、ヒトMERTK遺伝子のcDNA配列を示す。
配列番号6は、ヒトLRAT遺伝子のcDNA配列を示す。
配列番号7は、ヒトTYR遺伝子のcDNA配列を示す。
配列番号8は、ヒトGRP143遺伝子のcDNA配列を示す。
配列番号9及び10は、RPE65にハイブリダイズするプライマー配列を示す。
配列番号11及び12は、eGFPにハイブリダイズするプライマー配列を示す。
配列番号13及び14は、β-アクチンにハイブリダイズするプライマー配列を示す。

発明の詳細な説明
開示されたポリヌクレオチド配列の異なる適用は、当技術分野における特定のニーズに合わせて調整され得ることを理解されたい。また、本明細書で使用されている用語は、本発明の特定の実施形態を単に説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。

さらに本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、その内容が別段明白に指示しない限り、複数の言及を含んでいる。したがって、例えば、「ポリヌクレオチド」への言及は「複数のポリヌクレオチド」を含み、「プロモーター」への言及は「複数のプロモーター」を含み、「ベクター」への言及は2つ以上のそのようなベクターを含むなどである。

本明細書において引用されているすべての刊行物、特許及び特許出願は、上記又は下記にかかわらず、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、患者における網膜ジストロフィー、特に網膜色素上皮の障害、例えばレーバー先天性黒内障を処置及び/又は予防するための遺伝子治療に関する。

患者は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物は、商業的に飼育された動物、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ若しくはブタなど、実験動物、例えば、マウス若しくはラットなど、又はペット、例えば、ネコ、イヌ、ウサギ若しくはモルモットなどであり得る。患者は、より好ましくは、ヒトである。

本発明のプロモーターは、網膜ジストロフィーの処置に使用することができる。網膜ジストロフィーは、遺伝性網膜ジストロフィーであり得る。網膜ジストロフィーは、視細胞の進行性喪失及び付随する視力喪失を特徴とする網膜の疾患として定義することができる。

網膜
網膜は、網膜色素上皮(RPE)細胞層、及び3層の知覚神経細胞、すなわち(外部から内部へ)、外顆粒層(視細胞を含有する)、内顆粒層(双極細胞を含有する)、及び神経節細胞層から構成されている。

網膜色素上皮(RPE)
RPE細胞は、光受容体外節と互いに組み合わされている。光受容体とRPE細胞の間の空間は、レチノイドサイクルの化合物が移動するマトリックスを含有している。RPEは、網膜の機能及びレチノイドサイクルに対していくつかの注目すべき寄与がある。これには、光受容体外節ディスクの食作用、散光の低減、外部血液-網膜関門への寄与、ビタミンAの代謝、及び免疫抑制性微小環境の維持(眼部免疫の恩恵)が含まれる。

網膜ジストロフィー又は網膜変性は、レチノイドサイクルにおける異常と関係し得る。レチノイドサイクルは、視覚発色団(visual chromophore)が再生成されるプロセスである。発色団11-cis-レチナールの光異性化によってオール-trans-レチナールが生成され、次にこれは、ロドプシンから解離する。次いで、オール-trans-レチナールは、NADPH依存性酵素オール-trans-レチノールデヒドロゲナーゼによって、オール-trans-レチノールに還元される(Baehr et al. 2003)。続いて、オール-trans-レチノールは視細胞を離れ、細胞間マトリックスを通過して移動しRPEに入り、ここで、色素再生の最終段階が起こる。レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ(LRAT)は、オール-trans-レチノールをオール-trans-レチニルエステルにエステル化する。次いで、これは、RPE優位型鉄依存的レチノイドイソメロヒドロラーゼRPE65によって11-cis-レチノールに変換される(Jin et al. 2005; Moiseyev et al. 2005; Redmond et al. 2005)。NAD-及びNADP-依存的酵素11-cis-レチノールデヒドロゲナーゼは、最終的に、11-cis-レチノールの酸化によって11-cis-レチナールを再生成する。このように、RPE65タンパク質は、レチノイドサイクルの必須成分である。

RPEの遺伝性網膜ジストロフィー
RPEの遺伝性網膜ジストロフィーとしては、数ある中で、レーバー先天性黒内障、眼白子症及びMER癌原遺伝子チロシンキナーゼ(MERTK)欠損症を挙げることができる。

レーバー先天性黒内障(LCA)
レーバー先天性黒内障(LCA)は、遺伝性網膜変性の最も重篤な形態の1つであるが、多くの遺伝子の常染色体劣性変異によって引き起こされ、そのうちの1つはRPE65である(Gu et al., 1997; Marlhens et al. 1997; Morimura et al., 1998)。

レーバー先天性黒内障(LCA)は、1869年にTheodor Karl Gustav Leberによって最初に報告された。これは網膜変性の稀な形態であり、小児期失明のかなりの割合を占めている。LCAの発病率及び有病率の種々の推定値は、現在のデータから入手可能である。例えば、Alstrom及びOlsonは、LCAの世界的な有病率は、100,000人の新生児のうち3人であると推定した(1957)。より最近の解析では、LCAは、それほど流行はしてはおらず、80,000人に1人と推定されている(Stone 2007)。LCAはすべての遺伝性網膜症の5％超を占め、世界中の盲学校に通っている子供の約20％を占めているといわれている(Schappert-Kimmijser et al. 1959)。これらの統計は、LCAに罹患している病的状態の深刻な重荷を個人及び社会全体の両方に対して説明するのに役立つ。

1869年にLeberによって最初に記載されたLCAの臨床的特徴は、今日の診断における主要な判定基準のままである。すなわち、誕生時又は誕生時近くの重篤な視力喪失、眼振の遊走(不髄意の眼球運動の形態)、黒内障瞳孔(障害を受けた眼が光によって刺激された場合、障害を受けた眼への同側性無反応瞳孔)、及び色素性網膜症の4項目である(Ahmed and Loewenstein 2008; Koenekoop 2004; Leber 1869)。さらに、網膜電図検査(ERG)シグナルの欠如の実証は、LCA診断の絶対的判定基準を表す(den Hollander et al. 2008)。多くの場合(診断の遅れのために)遡って認識されるが、LCAの第1の臨床的症状の1つは、視覚的に追跡できない場合、乳児において起こる。これは言うまでもなく、重篤な視力障害の非特異的な挙動徴候である。

LCAに関与するRPE特異的遺伝子
RPE65
RPE65は、主としてRPE細胞に配置されている、レチニルエステル結合タンパク質である。RPE65は、RPE細胞の滑面小胞体に非常に優先的に局在しており、そこで、11-cis-レチナール発色団が形成される。RPE65の発現は、比較的組織特異的であるが、RPE65はまた錘体光受容体において発現される(Znoiko et al. 2002)。RPE65は、最初に、11-cis-レチノールがオール-trans-レチニルエステルから再生成される経路の必要成分であることが明らかにされた(Gollapalli et al. 2003; Mata et al. 2004)。RPE65がこの反応において基質シャペロンとして機能すると仮定された。

しかし、その後の研究において、RPE65は酵素的役割を有しており、オール-trans-レチノイドを11-cis-レチノイドに再利用する重要なイソメロヒドロラーゼを示すことが確認された(Jin et al. 2005; Moiseyev et al. 2005; Redmond et al. 2005)。また、RPE65イソメロヒドロラーゼ活性は、Fe²⁺結合残基における変異によってその酵素活性が停止するので、Fe²⁺に依存することも確認された(Moiseyev et al. 2006; Redmond et al. 2005)。重要な酵素性及び鉄結合性残基における変異がこのイソメロヒドロラーゼ活性を停止し、RPEにレチニルエステルの蓄積をもたらし、レチノイドサイクルを遮断した(Redmond et al. 1998; Redmond et al. 2005)。また、オール-trans-レチニルエステル(RPE65の酵素基質)の多量の蓄積もあり、これはマウスRPE65-/-ノックアウトモデルにおいて、脂質滴として出現している(Katz and Redmond 2001)。

RPE65変異は、LCAのサブタイプを担っている(Gu et al., 1997; Marlhens et al. 1997; Morimura et al., 1998)。RPE65の変異は、LCA症例の6〜16％の原因となっており、さらに、劣性色素性網膜炎(RP)症例の2％に関与している(Morimura et al. 1998; Hanein et al. 2004; Simonelli et al. 2007)。いくつかの研究において、地中海人口におけるLCA関連RPE65変異の有病率は、ヨーロッパの他の地域及び米国と比べて高いことが報告されている(Hanein et al. 2004; Simonelli et al. 2007; Yzer et al. 2006)。

RPE65の変異は、夜盲症及び人生の最初の10年における最小視覚機能保存を含む、いくつかの表現型の特徴に関連している(Simonelli et al. 2007)。また、RPE65変異は、特定の眼底検査上の外観、すなわち、点状(salt-and-pepper)網膜ジストロフィーに関連している(Stone 2007の図7を参照)。CRB1などにおける変異などの他のLCAに関連する変異とは対照的に、RPE65変異は、正常な網膜の厚み及び検出可能な自己蛍光シグナルに関連している(Simonelli et al. 2007; Van Hooser et al. 2000)。

Bainbridge et al. 2008において使用されたヒトRPE65プロモーター領域を配列番号1に示す。ヒトRPE65 cDNA配列は配列番号3に示す。

レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ(LRAT)
RPE65とは別に、光に暴露された際に視覚色素を再生成する生化学反応のセットである、視覚サイクルで機能するタンパク質をコードしている遺伝子の変異によって生じる重篤な網膜ジストロフィーの他の3つの形態がある。これらのうちの1つであるレシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ(LRAT)は、RPE65と同様にRPE特異的である。LRATは、RPE65の基質を生成する視覚サイクル酵素であり、いずれかの欠損は実質的には判別不可能な状態をもたらす。しかし、RPE65遺伝子は、LCAのすべての症例の約6％の原因となるが、LRATの変異は、LCAの単発的な症例のみを占める。ヒトLRATのcDNA配列を配列番号6に示す。

眼白子症
眼白子症に関与する遺伝子

チロシナーゼ(TYR)
チロシナーゼ(TYR)は、RPEにおいてメラニン生合成を担う律速酵素である。メラニンは、網膜の発達、機能及び光誘導型酸化ストレスに対する保護において重要な役割を果たし、メラニンレベルはAMDに関連している。AMDに関与する以外に、チロシナーゼの変異はまた、先天性色素沈着減少を特徴とする、眼皮膚白子症1型(OCA1)を引き起こす可能性がある。

メラニンは、いくつかの方法で、チロシナーゼ発現細胞において保護機能を働かせることができる。第1に、メラニンは、日光及び紫外線によって引き起こされる損傷からこれらの細胞を保護する。第2に、メラニンは、RPEにおける脂質過酸化反応生成物に由来するフリーラジカル及び蓄積された鉄によって生じる酸化ストレスを解消することができる。そのような酸化促進物質は、この組織の加齢性変性の一因となり得る。第3に、金属イオン及び外因性化学物質に対するメラニンの高結合能力はまた、眼におけるメラニンの保護的役割を支える。これらの知見と一致して、メラニン及びその前駆体は、哺乳動物における網膜の適切な発達にとって不可欠である。チロシナーゼの正常発現、その翻訳後修飾、又はメラノソームへの輸送における機能不全は、色素沈着、メラノソームの安定性、及びRPEの正常機能を低下させる可能性がある。研究者らは、おそらく一つには酸化分解により、RPE細胞の含量が年齢とともに減少することを示した。さらに、いくつかの年齢に関連した変化がメラニンに起こり、その機能低下の一因となっている。ヒトTYRのcDNA配列を配列番号7に示す。

Gタンパク質共役型受容体143(GRP143)
GRP143は、RPEにおいて発現される。ネトルシップ-ファルス型又は1型と呼ばれる、眼白子症の最も一般的な形態を有する人々において、60を超えるGタンパク質共役型受容体143(GPR143)変異が同定されている。ヒトGRP143のcDNA配列を配列番号8に示す。

MER癌原遺伝子チロシンキナーゼ(MERTK)欠損症
MERTKはRPE細胞において発現される膜チロシンキナーゼであり、視細胞外節の正常な食作用にとって不可欠である。機能するMERTKが欠如すると、必須代謝経路に悪影響を及ぼすデブリ(debris)がRPEと視細胞の間に蓄積する。

視細胞とは対照的に、RPEは、様々なウイルスベクターで効率的に形質導入することができ、多くの試験により、MERTK欠損症の自然発生モデル、Royal College of SurgeonsラットにおけるMERTKの遺伝子補充後の改善が示されている。これらの研究の第1の研究は、アデノウイルスベクターを使用してRPEにMertk遺伝子を導入し、ERGによって評価した場合、視細胞の構造及び機能における短期的な改善が得られた。その後の研究では、AAV2ベクター及びHIV1系レンチウイルスベクターを使用した遺伝子補充によって、デブリの沈着を低減し、視細胞の生存を延長し、Royal College of SurgeonsラットにおけるERG応答を、それぞれ3か月及び7か月まで維持することができることが証明された。しかし、試験した3つのベクターのうち最も有効な、レンチウイルスベクターを媒介した回復でさえ、長期的な視細胞喪失は予防されなかった。

Royal College of Surgeonsラットにおいて、MERTKが欠損すると重大な代謝サポートを損ない、細胞の喪失がより速くなる。ヒトMERTKのcDNA配列を配列番号5に示す。

加齢性黄斑変性症(AMD)
また本発明は、遺伝性網膜ジストロフィーと同様に、AMDの処置においても適用可能である。進行性網膜変性疾患、例えば、加齢性黄斑変性症(AMD)及び網膜色素変性症(RP)は、処置不可能な失明の主要原因であり、社会において多大な社会的及び経済的負担をもたらす。世界中で3000万人もの人がAMDに罹患しており、この診断は高齢人口のために今後数十年で大幅に増加することが予想されている。AMDは、黄斑の光受容体-RPE-脈絡膜の境界面に作用し、遺伝的感受性因子及び環境の相互作用によって引き起こされる、老化に関連する多因子疾患である。RPEは、多くの網膜変性疾患の原因及び標的であり、RPE機能の欠陥は、隣接する細胞-主要光受容体の完全性及び生存率に影響し得る。

AMDを処置する目的において、本発明のプロモーターに連結されているコード配列は、典型的には、抗血管新生ポリペプチド、例えば、sFlt1、sFlt-4、VEGF-捕捉タンパク質(sequestering protein)、例えば、VEGFに結合する抗体若しくは抗体フラグメント、VEGFに対する可溶性受容体、アンギオスタチン若しくはエンドスタチン;又はRPEにおいて抗アポトーシス作用を有するポリペプチド、例えば、Bcl2及び他のBcl2ファミリーメンバー、XIAP(BIRC4としても知られている)及び他のIAP/BIRCファミリーメンバーをコードしている。

本発明のベクターからの発現に適したさらなる遺伝子
また、一連の眼障害を矯正する目的で本発明のベクターから発現させることができる配列には、ニューロンの生存を支える神経栄養因子をコードしている遺伝子、例えば、GDNF、CNTF、PEDF、VEGF、EPO、IGF1及びRdCVF1;抗血管新生ポリペプチド、例えばsFlt1、sFlt-4;VEGF-捕捉タンパク質、例えば、VEGFに結合する抗体又は抗体フラグメント、VEGFに対する可溶性受容体、アンギオスタチン若しくはエンドスタチン;並びにRPEにおいて抗アポトーシス作用を有するポリペプチドをコードしている配列、例えば、Bcl2及び他のBcl2ファミリーメンバー、XIAP(BIRC4としても知られている)及び他のIAP/BIRCファミリーメンバーが含まれる。

ニューロンの生存を支える神経栄養因子、例えば、GDNF、CNTF、PEDF、VEGF、EPO、IGF1及びRdCVF1は、シュタルガルト病の処置において有用であり得る。

抗血管新生ポリペプチド、例えば、sFlt1、sFlt-4;VEGF-捕捉タンパク質、例えば、VEGFに結合する抗体又は抗体フラグメント、VEGFに対する可溶性受容体、アンギオスタチン若しくはエンドスタチン;並びに、RPEにおいて抗アポトーシス作用を有するポリペプチドをコードしている配列、例えば、Bcl2及び他のBcl2ファミリーメンバー、XIAP(BIRC4としても知られている)及び他のIAP/BIRCファミリーメンバーは、糖尿病性網膜症の処置において有用であり得る。

本発明のベクターから発現させることができる他の遺伝子はMYO7Aであり、これは疾患アッシャー1Bに関与しており、RPEにおけるMYO7Aによってコードされているタンパク質の欠如によって部分的に引き起こされると考えられる。

本発明のプロモーター
本発明のプロモーターは、ヒトRPE65プロモーターの断片及び/又は変異体であり、RPE特異的プロモーター活性を有している。これらは単離された形態であってもよい。

本発明のプロモーターは、作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列にRPE特異的発現を付与する配列番号1由来のヌクレオチド、典型的には連続ヌクレオチドの配列を含み得る。配列番号1の配列は長さが1614ヌクレオチドであり、RPE特異的活性を有していない。RPE特異的活性を有する配列番号1の任意の短縮型は、本発明の配列である。したがって、本発明のプロモーター配列は、例えば、配列番号1の1500又は1600以下のヌクレオチドを含み得るが、好ましくは、それらは配列番号1の1300以下、1200以下、1100以下、1000以下、900以下、800以下、775以下、750以下、700以下、650以下、600以下、又は500個以下のヌクレオチドを含む。しかし、好ましくは、本発明の配列は、配列番号1の少なくとも500、550、600、650、700、750、800、900、1000、1100又は1200個のヌクレオチドを含む。好ましくは、本発明の配列は、配列番号1の3'末端に由来し、配列番号1の3'の500、600、650、700、750、800、900、1000、1100又は1200個の連続ヌクレオチドを含むか、或いは配列番号1の10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100個以下のヌクレオチドのみを欠失している。

本発明の好ましいプロモーターは、配列番号2の配列又は配列番号2のヌクレオチド12〜761の配列(配列番号2のヌクレオチド1〜11は、配列番号1の対応する配列とは異なる。これは、存在がRPE特異的活性を損なうものでないが、それに必要ではない、クローン化人工産物である)を、典型的には、配列番号1の800以下、850以下、900以下、1000以下、1100以下又は1200個以下の連続ヌクレオチドの配列内に含む。さらに好ましいプロモーターは、配列番号2の少なくとも750、少なくとも700、少なくとも650、少なくとも600、少なくとも550又は少なくとも500個の連続ヌクレオチドを含み、好ましくは、配列番号2の3'末端にある少なくとも500、550、600、650、700若しくは750個のヌクレオチド、又は配列番号2のヌクレオチド12で始まる少なくとも550、600、650、700若しくは750個のヌクレオチドを含む。

本発明のさらなるプロモーターは、上記の配列とは配列が異なるが、RPE特異的プロモーター活性を保持するプロモーターである。そのような配列は、上記の配列番号1の連続ヌクレオチド配列と少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％又は少なくとも99％の配列同一性を有する。

変異体の配列同一性パーセンテージは、好ましくは、変異体配列と整列させた配列番号1の対応する部分の完全長にわたって測定されるか、又は配列番号1の500、600、700、800、900、1000、1100若しくは1200個のヌクレオチド部分にわたって測定される。

配列同一性は、任意の適切なアルゴリズムを使用して計算することができる。例えば、PILEUP及びBLASTアルゴリズムを使用して、例えば、Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に開示されているようにして、同一性を計算し、又は配列を整列することができる(例えば、同等の若しくは対応する配列の同定(典型的にはそれらのデフォルト設定上で))。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公的に入手することができる。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードを整列させた場合、いくつかの正の値の閾値スコアTに一致する、若しくは満たす、照会配列中の長さWのショートワードを同定することによって、ハイスコアの配列対(HSP)を同定することを含んでいる。Tは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる(Altschul et al、前掲)。これらの最初の近傍ワードのヒットは、それらを含有しているHSPを見つけるための検索を開始するシードとして働く。ワードヒットは、累積的なアラインメントスコアが増加され得る限り、それぞれの配列に沿って両方方向に延長される。それぞれの方向におけるワードヒットのための延長は、累積的なアラインメントスコアがその最大達成値から量Xだけ減少した場合;累積的なスコアが、1以上のネガティブなスコア残留アラインメントの蓄積によってゼロ以下になる場合;又は、いずれかの配列の末端に到達した場合に停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTプログラムは、デフォルトとして、ワード長(W)11、BLOSUM62スコアマトリックス(Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919を参照)アラインメント(B)50、期待値(E)10、M=5、N=4、及び両鎖の比較を用いる。

BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計解析を実施する。例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787を参照されたい。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の1つの尺度は、2つのポリヌクレオチド間又はアミノ酸配列間のマッチが偶然生じる確率の提示を提供する、最小合計確率(P(N))である。例えば、配列は、第1の配列の第2の配列に対する比較において、最小合計確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、より好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、他の配列に類似していると考えられる。或いは、UWGCGパッケージは、(例えば、そのデフォルト設定で使用される)同一性の計算に使用可能なBESTFITプログラムを提供する(Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395)。

本発明のプロモーターはまた、RPE65プロモーター領域において天然には見出されない追加のヌクレオチド配列を含み得る。本発明のプロモーター配列は、したがって、RPE65特異的プロモーター活性が保持されている限り、大きな配列内のいずれの場所にでも位置することができる。追加配列は、上記で定義されている配列の5'若しくは3'であり得るか、又はその両方であり得る。

本発明のプロモーターはまた、他の制御エレメント、例えば、1つ以上のさらなるプロモーター又はエンハンサー又は遺伝子座制御領域(LCR)などとタンデムで使用することができる。

本発明のプロモーターは、RPE特異的方法で、RPEにおいて遺伝子の発現を駆動するために使用することができる。RPE特異的発現は、RPEにのみ存在し、他の細胞型には存在しない発現として定義することができる。RPE特異的発現は、他の細胞型、特に視細胞の場合よりも、RPEにおいて約10倍、20倍、50倍又は100倍以上大きい発現として定義することができる。RPE及び別の細胞型における発現は、当業者に公知の任意の適切な標準技術によって測定することができる。例えば、RNA発現レベルは、定量的リアルタイムPCRによって測定することができる。タンパク質発現は、ウェスタンブロット又は免疫組織化学によって測定することができる。

本発明のプロモーターは、RPEにおいて遺伝子の有意に増加した発現を駆動するために使用することができる。有意に増加した発現は、元のRPE65プロモーターによって駆動されている発現と比較した場合(Bainbridge et al 2008)、RPEにおける遺伝子の発現が約10倍、20倍、50倍、100倍、200倍又は300倍超えると定義することができる。RPE及び他の細胞型における発現は、当業者に公知の任意の適切な標準技術によって測定することができる。例えば、RNA発現レベルは、定量的リアルタイムPCRによって測定することができる。タンパク質発現は、ウェスタンブロット又は免疫組織化学によって測定することができる。

本発明のプロモーターは、RPEにおける任意のタンパク質の発現の駆動に使用することができる。本発明のプロモーターは、RPEにおいて、通常RPEでは発現されないタンパク質、例えばGFPなどの発現を駆動するために使用することができる。

発現構築物
本発明はまた、RPE特異的方法で発現される配列に作動可能に連結されている本発明のプロモーターを含む発現構築物を提供する。

発現構築物は、コード配列を含有しているポリヌクレオチド配列からタンパク質発現を駆動することができるポリヌクレオチド配列として定義することができる。

したがって、本発現構築物は、例えば、RPE65、MERTK、LRAT、TYR又はGRP143コード配列、例えば、配列番号3〜8から選択されるポリヌクレオチド、又は、配列番号3〜8から選択される配列から翻訳されるタンパク質の機能性を保持する配列番号3〜8の変異体を含むことができる。

配列番号3〜8からなる群から選択されるポリヌクレオチドの変異体は、その核酸配列における天然の変異体を含む、配列番号3〜8の配列の任意の変異体として定義され得る。変異体は、配列番号3〜8のいずれか1つに対して少なくとも約60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有し、変異体配列から翻訳されるポリペプチドがその機能性を保持するものとして定義され得る。変異体は、配列番号3〜8のいずれか1つに対して少なくとも約60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有し、変異体配列から翻訳されるポリペプチドがRPE機能を回復する能力を有するものとして定義され得る。RPE機能の回復は、RPE機能の少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％を回復するものと定義され得る。RPE機能は、当業者に公知の任意の適切な標準技術によって、例えば、網膜応答の網膜電図検査分析によって、分析することができる。

本変異体は、配列番号3〜8のいずれか1つに対して少なくとも約60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有し、得られた変異体配列から翻訳されるポリペプチドが配列番号3〜8から翻訳されたポリペプチドと同じであると定義され得る。

「作動可能に連結されている」という用語は、記載されている成分が、それらの意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置を意味する。コード配列に「作動可能に連結されている」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結されている。同一の又は異なるポリヌクレオチドの多重コピーは、発現構築物に導入することができる。

本発現構築物は、配列番号4に作動可能に連結されている本発明のプロモーターを含み得る。

「コドン最適化」は、天然のポリヌクレオチド配列を改変し、標的生物、例えばヒトにおける発現を促進するプロセスに関する。本発明の一実施形態において、ヒトRPE65遺伝子、配列番号3は、配列番号4を作製するために最適化されている。配列番号4の最適化されたRPE65において、7つのレアコドン(タンデムでのペアを含む)は、高度に発現されるヒト遺伝子でより頻繁に生じるもの、及び/又は頻繁に見つかるものと置き換えられている。さらに、潜在的スプライス部位、4つの潜在的早期ポリアデニル化部位及び50塩基対の直接反復が除去された。

ベクター
本発明は、本発明のプロモーター及び発現構築物を含むベクターを提供する。ベクターは任意のタイプのものであってよく、例えば、プラスミドベクター又はミニサークルDNAであってもよい。

しかし、典型的には、本発明のベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス又はレンチウイルスに基づくものであってよい。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター又はその誘導体であってもよい。

ウイルスベクター誘導体は、キメラ、シャッフル又はキャプシド修飾誘導体であってもよい。

ウイルスベクターは、AAVの天然由来の血清型、単離物又はクレードから得たAAVゲノムを含んでいてもよい。

血清型は、例えば、AAV2、AAV5又はAAV8であってもよい。

遺伝子治療の効果は、一般に、提供されたDNAの適切かつ効果的な送達に依存する。このプロセスは、通常、ウイルスベクターによって媒介される。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、パルボウイルス科のメンバーであるが、遺伝子治療において一般に使用されている。ウイルス遺伝子を含有している野生型AAVは、宿主細胞の第19染色体にそれらのゲノム材料を挿入する(Kotin, et al. 1990)。AAV一本鎖DNAゲノムは、2つの逆方向末端反復(ITR)、並びに、構造(cap)遺伝子及びパッケージング(rep)遺伝子を含有する、2つのオープンリーディングフレームを含む(Hermonat et al. 1984)。

治療目的において、cisで必要とされる唯一の配列は、治療用遺伝子に加えて、ITRである。したがって、AAVウイルスは改変される。このウイルス遺伝子がゲノムから除去され、組換えAAV(rAAV)が産生される。これには、治療用遺伝子、2つのITRのみが含有されている。ウイルス遺伝子の除去によって、rAAVは宿主細胞DNAにそのゲノムを活発に挿入することができなくなる。代わりに、rAAVゲノムは、ITRを介して融合し、環状エピソーム構造を形成するか、又は既存の染色体切断に挿入する。ウイルス産生に関し、ここでrAAVから除去された構造遺伝子及びパッケージング遺伝子は、transで、ヘルパープラスミドの形態で供給される。

AAVは、一般に非病原性であるため、特に好ましいベクターである。多数の人々は、その生存期間中、悪影響を及ぼさないこのウイルスに感染している(Erles et al. 1999)。これにかかわらず、これらの大部分がrAAVの全身投与にのみ適用されているが、遺伝子治療におけるrAAVの使用にはいくつかの短所がある。しかしながら、rAAVの眼内投与に直接関係しなくとも、これらの潜在的な限界を認識することは重要である。感染症は、以下の免疫応答を誘発し得る。
ヒト集団の大部分がAAVに対して血清反応陽性であるので、rAAVに対する中和抗体は遺伝子送達を損なう可能性がある(Moskalenko et al. 2000; Sun et al. 2003)。
全身送達されたrAAVは、キャプシドタンパク質指向性T細胞応答を誘発し、形質導入された細胞のアポトーシスをもたらし得る(Manno et al. 2006)。
rAAVベクターは、補体活性化を誘発し得る(Zaiss et al. 2008)。
rAAV送達は一般に非特異的であるので、ベクターは肝臓に蓄積し得る(Michelfelder et al. 2009)。

眼部組織免疫の恩恵、解剖学上の障壁及び免疫調節因子の結果は、上記で列挙した有害な免疫応答から眼がほとんど免れるようにする(Taylor 2009)。

AAVベクターは、約4.8kbの比較的小さなパッケージング能力及び導入後の緩慢な発現の開始によって制限されている(Dong et al. 1996)。これらのわずかな欠点にもかかわらず、AAVは、網膜遺伝子治療用の最も一般的に使用されているウイルスベクターになっている。

ほとんどのベクター構築物は、AAV血清型2(AAV2)に基づいている。AAV2は、ヘパリン硫酸プロテオグリカン受容体を介して標的細胞に結合する(Summerford and and Samulski 1998)。AAV2ゲノムは、すべてのAAV血清型のゲノムと同様に、多くの異なるキャプシドタンパク質に封入することができる。AAV2は、その天然AAV2キャプシドにパッケージングすることができ(AAV2/2)、又は、別のキャプシドでシュードタイプ化することができる(例えば、AAV1キャプシド中のAAV2ゲノム;AAV2/1、AAV5キャプシド中のAAV2ゲノム;AAV2/5、及びAAV8キャプシド中のAAV2ゲノム;AAV2/8)。

rAAVは、血清型特異的受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞を形質導入する。rAAV導入遺伝子発現の反応速度論に影響を及ぼす主な要因は、エンドソーム内のウイルス粒子アンコーティングの速度である(Thomas et al. 2004)。次に、これは、遺伝物質を包んでいるキャプシドのタイプに依存する(同書)。アンコーティング後、直鎖状一本鎖rAAVゲノムは、相補鎖の新規合成によって二本鎖分子を形成することにより安定化される(Vincent-Lacaze et al. 1999)。自己相補的DNAの使用は、二本鎖導入遺伝子DNAを産生することによってこの段階を避けることができる。Natkunarajah et al.は、自己相補的AAV2/8遺伝子発現は、一本鎖AAV2/8と比べ、開始が速く、増幅が大きいことを見出した(2008)。したがって、第二鎖合成に関連したタイムラグを回避することによって、標準的な一本鎖構築物からの導入遺伝子発現と比べた場合、遺伝子発現レベルは増加する。別のAAVシュードタイプ(例えばAAV2/5)における自己相補的DNAの効果を調べたその後の試験も、同様の結果となっている(Kong et al. 2010; Petersen-Jones et al. 2009)。この技術に対する1つの注意点は、AAVが約4.8kbのパッケージング能力を有するため、自己相補的組換えゲノムは適切な大きさでなければならないということである(すなわち、2.3kb以下)。

パッケージング能力を変更することに加えて、AAV2ゲノムを別のAAVキャプシドでシュードタイプ化することにより、細胞特異性及び導入遺伝子発現の反応速度論を変化させることができる。例えば、AAV2をAAV4キャプシドでシュードタイプ化する場合、導入遺伝子発現は、RPE細胞に特異的に標的化される(Le Meur et al. 2007)。さらに、AAV2/8は、AAV2/2又はAAV2/5のいずれよりも効率的に光受容体を形質導入することが報告されている(Natkunarajah et al. 2008)。

AAVゲノム
本発明のベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)ゲノム又はその誘導体を含み得る。

AAVゲノムは、AAVウイルス粒子の生成に必とされる機能をコードするポリヌクレオチド配列である。これらの機能には、AAVゲノムのAAVウイルス粒子へのキャプシド形成を含む、宿主細胞におけるAAVの複製及びパッケージングサイクルにおいて作動するものが含まれる。天然のAAVウイルスは複製が不十分であり、複製及びパッケージングサイクルの完了に関して、transでのヘルパー機能の提供に依存する。したがってAAV rep遺伝子及びcap遺伝子のさらなる除去により、本発明のベクターのAAVゲノムは複製欠損である。

AAVゲノムは、ポジティブセンス若しくはネガティブセンスいずれかの一本鎖形態であってもよく、又は二本鎖の形態であってもよい。二本鎖形態を使用すると、標的細胞におけるDNA複製ステップのバイパスが可能となり、それによって導入遺伝子の発現を加速させることができる。

AAVゲノムは、AAVの任意の天然由来の血清型又は単離物又はクレードに由来してもよい。当業者に公知であるように、自然界に存在するAAVウイルスは、様々な生物系に従って分類することができる。

一般に、AAVウイルスはその血清型の点から言及される。血清型は、キャプシド表面抗原のその発現プロファイルのため、別の変異体亜種と区別するために使用することができる特有の反応性をが有するAAVの変異体亜種に対応する。典型的には、特定のAAV血清型を有するウイルスは、任意の別のAAV血清型に特異的な中和抗体と効率的に交差反応しない。AAV血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及びAAV11を含み、また霊長類の脳から最近同定された、Rec2及びRec3などの組換え血清型も含む。本発明のベクターにおいて、ゲノムは、任意のAAV血清型に由来し得る。キャプシドもまた、任意のAAV血清型に由来し得る。ゲノム及びキャプシドは、同一の血清型又は異なる血清型に由来し得る。

本発明のベクターにおいて、ゲノムは、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)又はAAV血清型8(AAV8)に由来するのが好ましい。ゲノムはAAV2に由来するのが最も好ましいが、本発明における使用に関して特に興味が持たれる他の血清型としては、網膜色素上皮などの眼における組織を効率的に形質導入する、AAV4、AAV5及びAAV8が挙げられる。キャプシドはAAV5又はAAV8に由来するのが好ましい。

AAV血清型の概説は、Choi et al (Curr Gene Ther. 2005; 5(3); 299-310)及びWu et al (Molecular Therapy. 2006; 14(3), 316-327)に見出すことができる。本発明において使用するためのAAVゲノム、又はITR配列、rep遺伝子若しくはcap遺伝子を含むAAVゲノムのエレメントの配列は、AAV全ゲノム配列に関する以下のアクセッション番号に由来し得る:アデノ随伴ウイルス1 NC_002077、AF063497;アデノ随伴ウイルス2 NC_001401;アデノ随伴ウイルス3 NC_001729;アデノ随伴ウイルス3B NC_001863;アデノ随伴ウイルス4 NC_001829;アデノ随伴ウイルス5 Y18065、AF085716;アデノ随伴ウイルス6 NC_001862;トリAAV ATCC VR-865 AY186198、AY629583、NC_004828;トリAAV DA-1株 NC_006263、AY629583;ウシAAV NC_005889、AY388617。

AAVウイルスはまた、クレード又はクローンの点からも言及することができる。これは、天然由来のAAVウイルスの系統発生関係を意味し、典型的には、共通祖先まで遡及することができ、その子孫をすべて含む、AAVウイルスの系統発生群を意味する。さらに、AAVウイルスは、特定の単離物、すなわち、自然界で確認されている特定のAAVウイルスの遺伝的単離物の点から言及することができる。遺伝的単離物という用語は、別の天然AAVウイルスとの限定された遺伝子混合を受けたAAVウイルスの個体群を説明しており、それによって遺伝子のレベルで認識可能な個別の個体群を定義する。

本発明において使用され得るAAVのクレード及び単離物の例としては、以下のものが挙げられる:
クレードA: AAV1 NC_002077、AF063497、AAV6 NC_001862、Hu. 48 AY530611、Hu 43 AY530606、Hu 44 AY530607、Hu 46 AY530609
クレードB: Hu. 19 AY530584、Hu. 20 AY530586、Hu 23 AY530589、Hu22 AY530588、Hu24 AY530590、Hu21 AY530587、Hu27 AY530592、Hu28 AY530593、Hu 29 AY530594、Hu63 AY530624、Hu64 AY530625、Hu13 AY530578、Hu56 AY530618、Hu57 AY530619、Hu49 AY530612、Hu58 AY530620、Hu34 AY530598、Hu35 AY530599、AAV2 NC_001401、Hu45 AY530608、Hu47 AY530610、Hu51 AY530613、Hu52 AY530614、Hu T41 AY695378、Hu S17 AY695376、Hu T88 AY695375、Hu T71 AY695374、Hu T70 AY695373、Hu T40 AY695372、Hu T32 AY695371、Hu T17 AY695370、Hu LG15 AY695377、
クレードC: Hu9 AY530629、Hu10 AY530576、Hu11 AY530577、Hu53 AY530615、Hu55 AY530617、Hu54 AY530616、Hu7 AY530628、Hu18 AY530583、Hu15 AY530580、Hu16 AY530581、Hu25 AY530591、Hu60 AY530622、Ch5 AY243021、Hu3 AY530595、Hu1 AY530575、Hu4 AY530602 Hu2、AY530585、Hu61 AY530623
クレードD: Rh62 AY530573、Rh48 AY530561、Rh54 AY530567、Rh55 AY530568、Cy2 AY243020、AAV7 AF513851、Rh35 AY243000、Rh37 AY242998、Rh36 AY242999、Cy6 AY243016、Cy4 AY243018、Cy3 AY243019、Cy5 AY243017、Rh13 AY243013
クレードE: Rh38 AY530558、Hu66 AY530626、Hu42 AY530605、Hu67 AY530627、Hu40 AY530603、Hu41 AY530604、Hu37 AY530600、Rh40 AY530559、Rh2 AY243007、Bb1 AY243023、Bb2 AY243022、Rh10 AY243015、Hu17 AY530582、Hu6 AY530621、Rh25 AY530557、Pi2 AY530554、Pi1 AY530553、Pi3 AY530555、Rh57 AY530569、Rh50 AY530563、Rh49 AY530562、Hu39 AY530601、Rh58 AY530570、Rh61 AY530572、Rh52 AY530565、Rh53 AY530566、Rh51 AY530564、Rh64 AY530574、Rh43 AY530560、AAV8 AF513852、Rh8 AY242997、Rh1 AY530556
クレードF: Hul4(AAV9)AY530579、Hu31 AY530596、Hu32 AY530597、Clonal Isolate AAV5 Y18065、AF085716、AAV 3 NC_001729、AAV 3B NC_001863、AAV4 NC_001829、Rh34 AY243001、Rh33 AY243002、Rh32 AY243003 /

当業者は、本発明で使用するための適切なAAVの血清型、クレード、クローン又は単離物を、それらの共通の一般知識に基づいて選択することができる。

しかし、本発明はまた、未だ同定又は特徴決定されていない他の血清型のAAVゲノムの使用も包含していることを理解されたい。AAV血清型は、AAVウイルスの感染症(又はトロピズム)の組織特異性を決定する。したがって、本発明に従って患者に投与されるAAVウイルスでの使用に好ましいAAV血清型は、RPE内の標的細胞に対し天然トロピズムを有するものであるか、又はRPE内の標的細胞の高効率感染性を有するものである。

典型的には、AAVの天然由来血清型又は単離物又はクレードのAAVゲノムは、少なくとも1つの逆方向末端反復配列(ITR)を含む。本発明のベクターは、典型的には、2つのITR、好ましくはゲノムの各末端に1つのITRを含む。ITR配列はcisで作用して機能的な複製開始点を提供し、細胞のゲノムからのベクターの組み込み及び切除を可能にする。好ましいITR配列は、AAV2及びその変異体のものである。AAVゲノムは、典型的には、AAVウイルス粒子のパッケージング機能をコードするパッケージング遺伝子、例えばrep遺伝子及び/又はcap遺伝子を含む。rep遺伝子は、1つ以上のタンパク質Rep78、Rep68、Rep52及びRep40又はその変異体をコードしている。cap遺伝子は、1つ以上のキャプシドタンパク質、例えばVP1、VP2及びVP3、又はその変異体をコードしている。これらのタンパク質は、AAVウイルス粒子のキャプシドを構成する。キャプシド変異体については以下で論じる。

好ましくは、AAVゲノムは、患者への投与を目的として誘導体化される。そのような誘導体化は当技術分野では標準的であり、本発明は、AAVゲノムの任意の公知の誘導体、及び当技術分野で公知の技術を適用することにより生成され得る誘導体の使用を包含する。AAVゲノム及びAAVキャプシドの誘導体化は、Coura and Nardi (Virology Journal, 2007, 4:99)、並びに上述したChoi et al及びWu et alにおいて概説されている。

AAVゲノムの誘導体は、in vivoにおいて本発明のベクターからRep-1導入遺伝子を発現させることができる、AAVゲノムのあらゆる切断形態又は修飾形態を含む。典型的には、上記の機能を保持しつつ、最小限のウイルスの配列を含むようにAAVゲノムを大幅に切断することができる。これは、ベクターの野生型ウイルスとの組換えのリスクを低減し、また標的細胞におけるウイルス遺伝子タンパク質の存在によって細胞性免疫反応が誘発されないように回避する安全上の理由から好ましい。

典型的には、誘導体は、少なくとも1つの逆方向末端反復配列(ITR)を含み、好ましくは複数のITR、例えば2つ以上のITRを含む。1つ以上のITRは、異なる血清型を有するAAVゲノムに由来していてもよく、又はキメラITR若しくは変異ITRであってもよい。好ましい変異ITRは、trs(末端解離部位)の欠失を有するものである。この欠失によって、ゲノムを連続複製して、コード配列及び相補配列の両方、すなわち、自己相補的AAVゲノムを含有する一本鎖ゲノムを生成させることができる。これにより、標的細胞におけるDNA複製のバイパスが可能になり、その結果、導入遺伝子の発現を加速させることができる。

1つ以上のITRは、好ましくは、本発明のプロモーター及び導入遺伝子を含有する発現構築物カセットに隣接する。1つ以上のITRの包含によって、本発明のベクターのウイルス粒子へのパッケージングを促進するのが好ましい。好ましい実施形態において、ITRエレメントは、誘導体において天然AAVゲノムから保持されている唯一の配列である。したがって、誘導体は、好ましくは、天然ゲノムのrep遺伝子及び/又はcap遺伝子、並びに天然ゲノムの他の任意の配列を含まない。これは、上記の理由のために、また宿主細胞ゲノムへのベクターの組み込みの可能性を低減させるために好まれる。さらに、AAVゲノムのサイズを小さくすることにより、導入遺伝子に加えて、ベクター内に別の配列エレメント(例えば制御エレメント)を組み込む際に柔軟性を高めることができる。

AAV2ゲノムに関しては、したがって、以下の部分を本発明の誘導体において除去することができる。すなわち1つの逆方向末端反復(ITR)配列、複製(rep)遺伝子及びキャプシド(cap)遺伝子である。しかし、in vitroでの実施形態を含むいくつかの実施形態においては、誘導体は、1つ以上のrep遺伝子及び/若しくはcap遺伝子又はAAVゲノムの他のウイルス配列をさらに含んでいてもよい。

誘導体は、1つ以上の天然AAVウイルスのキメラ、シャッフル又はキャプシド修飾誘導体であってよい。本発明は、同じベクター内のAAVの異なる血清型、クレード、クローン又は単離物由来のキャプシドタンパク質配列の提供を包含する。本発明は、ある血清型のゲノムを別の血清型のキャプシドにパッケージングすること、すなわちシュードタイプ化することを包含する。

キメラ、シャッフル又はキャプシド修飾誘導体は、典型的には、ウイルスベクターに1つ以上の所望の機能性を提供するように選択される。したがって、これらの誘導体は、天然AAVゲノム、例えばAAV2のゲノムを含むAAVウイルスベクターと比べ、遺伝子送達の効率の増加、免疫原性(体液性若しくは細胞性)の低減、トロピズム範囲の変化、及び/又は特定の細胞型の標的化の改善を示し得る。遺伝子送達の効率の増加は、細胞表面での受容体若しくは共受容体結合の改善、内在化の改善、細胞内及び核中への輸送の改善、ウイルス粒子のアンコーティングの改善、及び一本鎖ゲノムから二本鎖形態への変換の改善によって達成され得る。また、効率の増加は、必要とされない組織への投与によってベクター用量が希釈されないように、変化したトロピズム範囲又は特定細胞個体群の標的化にも関連し得る。

キメラキャプシドタンパク質は、天然AAV血清型の2つ以上のキャプシドコード配列間の組換えによって生成されるものを含む。これは、例えば、ある血清型の無感染キャプシド配列が異なる血清型のキャプシド配列と同時にトランスフェクションされ、指示された選択を使用して所望の特性を有するキャプシド配列を選択する、マーカーレスキュー手法によって実施することができる。異なる血清型のキャプシド配列は、細胞内の相同組換えによって改変され、新規のキメラキャプシドタンパク質を産生することができる。

また、キメラキャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質配列を操作し、2つ以上のキャプシドタンパク質間、例えば、異なる血清型の2つ以上のキャプシドタンパク質間に特定のキャプシドタンパク質ドメイン、表面ループ又は特定のアミノ酸残基を移入することによって生成されるものを含む。

シャッフル又はキメラキャプシドタンパク質はまた、DNAシャッフリング又はエラープローンPCRによっても生成され得る。ハイブリッドAAVキャプシド遺伝子は、関連するAAV遺伝子の配列、例えば、複数の異なる血清型のキャプシドタンパク質をコードしているものをランダムに断片化し、次に続いて、配列相同性の領域においてクロスオーバーを引き起こし得る自己プライミングポリメラーゼ反応でそれらの断片を再構築させることによって作製することができる。いくつかの血清型のキャプシド遺伝子をシャッフリングすることによってこのように作製されたハイブリッドAAV遺伝子のライブラリーをスクリーニングし、所望の機能性を有するウイルスクローンを同定することができる。同様に、エラープローンPCRを使用してAAVキャプシド遺伝子をランダムに変異させ、変異体の多様なライブラリーを作製する。その後、これは所望の特性について選択され得る。

また、キャプシド遺伝子の配列を遺伝的に改変し、天然野生型配列に関して特定の欠失、置換又は挿入を導入することもできる。特に、キャプシド遺伝子は、キャプシドコード配列のオープンリーディングフレーム内に、又はキャプシドコード配列のN末端及び/若しくはC末端で、非関連のタンパク質又はペプチドの配列を挿入することによって修飾され得る。

非関連のタンパク質又はペプチドは、有利には、特定の細胞型に対するリガンドとして作用し、それによって、標的細胞への結合が改善され、又は特定の細胞集団に対するベクターの標的化の特異性が改善されるものであり得る。

非関連のタンパク質はまた、生産プロセスの一部として、ウイルス粒子の精製を補助するもの、すなわち、エピトープ又はアフィニティータグであってもよい。挿入の部位は、典型的には、ウイルス粒子の他の機能、例えば、ウイルス粒子の内在化、輸送などに干渉しないように選択する。当業者は、それらの共通の一般知識に基づき、挿入に適した部位を同定することができる。特定の部位は、上述のChoi et alに開示されている。

本発明は、天然AAVゲノムの配列とは異なる順序及び配置でAAVゲノムの配列を提供することをさらに包含する。本発明はまた、1つ以上のAAV配列又は遺伝子を、別のウイルス由来の配列と、又は2つ以上のウイルス由来の配列から構成されているキメラ遺伝子と置き換えることも包含している。そのようなキメラ遺伝子は、異なるウイルス種の2つ以上の関連するウイルスタンパク質由来の配列から構成され得る。

本発明のベクターは、本発明のプロモーター及び発現構築物を含むウイルスベクターの形態をとる。

疑念を回避するため、本発明はまた、本発明のベクターを含むAAVウイルス粒子も提供する。本発明のAAV粒子は、AAVゲノム又はある血清型のITRを有する誘導体が異なる血清型のキャプシドにパッケージングされているトランスキャプシド化形態を含んでいる。本発明のAAV粒子はまた、2つ以上の異なる血清型由来の未修飾キャプシドタンパク質の混合物がウイルスエンベロープを構成する、モザイク形態を含んでいる。AAV粒子はまた、キャプシド表面に吸着されているリガンドを有する化学修飾した形態を含んでいる。例えば、そのようなリガンドは、特定の細胞表面受容体を標的とするための抗体を含み得る。

本発明は、本発明のベクター又はAAVウイルス粒子を含む宿主細胞をさらに提供する。

ベクターの調製
本発明のベクターは、遺伝子治療用ベクターを提供するための当技術分野で公知の標準的な手段によって調製することができる。したがって、十分に確立された公のトランスフェクション、パッケージング及び精製方法を用いて、適切なベクター調製物を調製することができる。

上記で論じたように、本発明のベクターは、本発明のプロモーター又はその変異体に加えて、天然AAVウイルスの完全ゲノムを含み得る。しかし、一般には、誘導体化されたゲノム、例えば、少なくとも1つの逆方向末端反復配列(ITR)を有するが、rep又はcapなどの任意のAAV遺伝子が欠失し得る誘導体が使用される。

そのような実施形態において、誘導体化されたゲノムのAAVウイルス粒子へのアセンブリを提供するため、AAV及び/又はヘルパーウイルス機能を提供するさらなる遺伝子構築物が、誘導体化されたゲノムと組み合わされて宿主細胞に提供される。これらのさらなる構築物は、典型的には、構造的AAVキャプシドタンパク質、すなわちcap、VP1、VP2、VP3をコードしている遺伝子、及びAAVライフサイクルに必要な他の機能をコードしている遺伝子、例えばrepを含有する。さらなる構築物に対して提供される構造的キャプシドタンパク質の選択は、パッケージングされたウイルスベクターの血清型を決定する。

本発明における使用のための特に好ましいパッケージングされたウイルスベクターは、AAV5又はAAV8キャプシドタンパク質と組み合わせたAAV2の誘導体化されたゲノムを含む。

上述のように、AAVウイルスは複製不全であり、したがって、ヘルパーウイルス機能、好ましくはアデノウイルスヘルパー機能は、典型的には、AAV複製を可能にするように1つ以上のさらなる構築物上に提供される。

上記のすべてのさらなる構築物は、宿主細胞中にプラスミド又は他のエピソームのエレメントとして提供され得るか、或いは1つ以上の構築物は、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。

本発明のプロモーター配列は、例えば、RPE65遺伝子内の変異によって生じ得る、RPE機能の喪失を回復する能力を有している。「回復」とは、一般に、網膜ジストロフィー表現型の進行のあらゆる改善又は遅延、例えば、RPEにおけるRPE65タンパク質の存在の回復、ERG活性の改善又はERG活性の喪失の遅延、網膜感度の改善又は網膜感度の進行性喪失の遅延/停止、視細胞の喪失の遅延又は停止、視力の改善、又は視力喪失の遅延/停止を意味する。

本発明のプロモーターの特性はまた、実施例におけるものに基づく技術を使用して試験することができる。特に、本発明の配列は、本発明のベクターにアセンブルされ、RPE65-欠陥試験動物、例えばマウスの網膜に送達され、効果を観察し、対照と比較することができる。好ましくは、その対照は、未処置であるか、本発明の配列とは対照的にレポーター遺伝子を含有しているような対照ベクターで処置されている同一動物の別の眼である。次いで、光に対する網膜応答の網膜電図検査分析を使用し、処置した眼の視細胞が、未処置の眼又は対照ベクターで処置した眼の光受容体よりも光に対して感受性であることを確認することができる。処置した眼の光に対する感受性は、例えば、未処置の眼又は対照処置した眼の感受性よりも少なくとも1.1、1.2、1.5、2、5、10、20、50、100、200、500又は1000倍高くてもよい。

治療方法及び医療用途
本発明のプロモーターは、網膜ジストロフィー、特にLCAを処置するために使用することができる。これは、それによってその疾患の変性過程を処置、阻止、緩和又は予防することができる手段を提供する。

したがって、本発明は、本発明のベクター及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。

本発明はまた、網膜ジストロフィーを予防又は処置する方法において使用するためのベクターを提供する。

本発明はまた、網膜ジストロフィーの処置又は予防用医薬品の製造における本発明のベクターの使用を提供する。

本発明はまた、本発明のベクターの治療上有効な量を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における網膜ジストロフィーを処置又は予防する方法を提供する。

本発明はまた、網膜ジストロフィーがレーバー先天性黒内障(LCA)、加齢性黄斑変性症(AMD)、眼皮膚症1型、ネトルシップ-ファルス型眼白子症、又はMERTK欠損症である、それを必要とする患者における網膜ジストロフィーを処置又は予防する方法を提供する。

本発明によれば、一般に、RPE65を用いた処置が好ましい。より詳細には、LCAは、RPE65又はLRATコード配列を発現するベクターで処置され、AMDは、発現されたタンパク質が血管増殖を抑制するか、RPEアポトーシスを低減若しくは予防する遺伝子を発現するベクターで処置され、眼白子症は、チロシナーゼ又はGRP143コード配列で処置され、MERTK欠損症は、MERTKコード配列で処置されるのが好ましい。

一般に、典型的には注射による本発明のベクターの直接的な網膜、網膜下又は硝子体内送達が好ましい。したがって、網膜、網膜下腔又は硝子体内腔への送達が好ましい。

したがって、本発明はまた、網膜、網膜下又は硝子体内への直接注射によって本発明のベクターの治療上有効な量を患者に投与することを含む、その必要のある患者における網膜ジストロフィーを処置又は予防する方法を提供する。したがって、網膜ジストロフィーは、それにより前記患者において処置又は予防される。

関連する態様において、本発明は、網膜、網膜下又は硝子体内への直接注射によりベクターを患者に投与することによって、網膜ジストロフィーを処置又は予防する方法における本発明のベクターの使用を提供する。さらに、本発明は、網膜、網膜下又は硝子体内への直接注射によって網膜ジストロフィーを処置又は予防するための医薬品の製造における本発明のベクターの使用を提供する。

本発明はまた、前記ベクターが網膜、網膜下腔又は硝子体内腔に直接投与される、使用のためのベクターを提供する。

これらのすべての実施形態において、本発明のベクターは、網膜ジストロフィーの1つ以上の症状の発症を予防するために投与することができる。患者は無症候性であってもよい。対象は、疾患に対して素因を有していてもよい。本方法又は使用は、対象が網膜ジストロフィーを発症するリスクを有するか否か、又は網膜ジストロフィーを有するか否かを同定するステップを含み得る。ベクターの予防上有効な量がそのような対象に投与される。予防上有効な量は、疾患の1つ以上の症状の発症を予防する量である。

或いは、その疾患の症状が対象に出現した場合、すなわち、その疾患の既存の症状を回復させるために、ベクターを投与することができる。アンタゴニストの治療上有効な量がそのような対象に投与される。治療上有効な量は、疾患の1つ以上の症状を改善するのに有効な量である。

対象は男性であっても女性であってもよい。対象は、好ましくは、疾患のリスクがある、又は疾患を有していると同定される。

ベクターの投与は、典型的には、網膜又は網膜下への直接注射による。これは、RPEの細胞への直接送達を含む。送達は、典型的には、網膜ジストロフィーに罹患している患者の変性網膜に、直接的に、又は網膜下的になされる。ベクターは、別の細胞集団に入ることなく、上記の標的細胞を形質導入することができる。硝子体内注射もまた、本発明のベクターを送達するために使用することができる。送達は、網膜下でなくてもよく、網膜下注射によらなくてもよい。送達は、経硝子体でなくてもよい。

本発明のベクターの用量は、様々なパラメーターによって、特に、処置しようとする患者の年齢、体重及び症状、投与経路、及び必要とされるレジメンに従って決定することができる。再度、医師は、任意の特定の患者にとって必要な投与経路及び用量を決定することができる。

典型的な単回用量は、形質導入を必要とする残りの網膜組織の量に応じて、10¹⁰〜10¹²ゲノム粒子である。ゲノム粒子は、本明細書においては、配列特異的方法(例えば、リアルタイムPCRなど)により定量することができる、一本鎖DNA分子を含有するAAVキャプシドとして定義される。その用量は単回用量として提供され得るが、他眼に対して、又はベクターが何らかの理由(例えば外科合併症など)で網膜の正確な領域を標的としなかった場合に繰り返すことができる。本処置は、好ましくは、各眼の単一維持療法であるが、例えば今後における反復注射、及び/又は異なるAAV血清型を用いる反復注射が考えられ得る。

宿主細胞
任意の適切な宿主細胞を用いて、本発明のベクターを作製することができる。一般に、そのような細胞はトランスフェクトされた哺乳動物細胞であるが、他の細胞型、例えば昆虫細胞も使用することができる。哺乳動物細胞産生系においては、AAVベクターに対しHEK293及びHEK293Tが好ましい。また、BHK細胞又はCHO細胞も使用することができる。

医薬組成物及び用量
本発明のベクターは、医薬組成物に製剤化することができる。これらの組成物は、ベクターに加えて、薬学的に許容可能な添加剤、担体、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の物質を含み得る。そのような物質は非毒性であり、活性成分の効果を妨げないべきである。担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路、すなわち、ここでは網膜、網膜下又は硝子体内直接注射に従い、当業者によって決定され得る。

医薬組成物は、典型的には、液体形態である。液体医薬組成物は、一般に、液体担体、例えば、水、石油、動物油又は植物油、鉱油又は合成油などを含んでいる。生理食塩液、塩化マグネシウム、デキストロース又は他のサッカライド溶液又はグリコール、例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールが含まれていてもよい。いくつかの場合において、界面活性剤、例えば、プルロニック酸(PF68)0.001％などを使用することができる。

罹患部位での注射に関して、活性成分は、発熱物質を含まず、適切なpH、等張性及び安定性を有する水溶液の形態である。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、乳酸リンガー注射液、ハルトマン溶液などの等張性ビヒクルを使用して適切な溶液を十分に調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤及び/又は他の添加剤を含んでいてもよい。

遅延放出に関しては、ベクターは、徐放用に製剤化される医薬組成物に、例えば、生体適合性ポリマーから形成されたマイクロカプセルに、又は当技術分野で公知の方法によるリポソーム担体系に含まれていてもよい。

用量及び投与計画は、組成物の投与に責任を負う医師の通常の技術の範囲内で決定することができる。

併用療法
本プロモーター、発現構築物、ベクター及び/又は医薬組成物は、網膜ジストロフィーの処置又は予防のための任意の他の治療方法と組み合わせて使用することができる。

キット
本プロモーター、発現構築物、ベクター及び/又は医薬組成物は、キットにパッケージングすることができる。

材料及び方法
プラスミド構築物
RPE65プロモーターの断片を作製するため、「完全長」ヒトRPE65プロモーター(bp 1556〜+23 -Nicolletti et al. 1998, Le Meur et al. 2007)を親プラスミドpD10.CMV.eGFPにクローニングし、pD10/RPE65prom.eGFPプラスミド構築物を作製した。制限部位はCloneManager(登録商標)を使用して同定した。NsiI、AccI及びBglIIを含む、3つの制限修飾が選択された。pD10/RPE65prom.eGFPを適切な温度で、少なくとも1時間、適切な緩衝剤中で消化した。次いで、生成物を40〜60分間0.8％ゲル上で泳動させ、NBS(登録商標) Spin Column Gel Extraction Kit (NBS Biological Ltd, Cambridgeshire, UK)を使用して正確なバンドを抽出し、(必要ならば平滑末端化した後に)連結させた。連結生成物を、Soc培地(Invitrogen)中で30〜60分間インキュベートした大腸菌(コンピテント細胞- Bioline)に形質転換し、次いで、37℃で一晩インキュベーションのために、LB/アガーアンピシリンプレートにプレーティングした。コロニーを選抜し、12.5％のLB培地(1/1000 アンピシリン)で一晩増殖させた。DNAを、GenElute(商標) Plasmid Miniprep kit (Sigma Aldrich)を使用して、これらの細菌調製物から抽出した。DNAを少なくとも2回消化し、正確なプラスミド構築物を確認した。新しいプラスミド構築物を作製するために使用した酵素は、「NA-RPE65.eGFP」に関してはNsi1及びAcc1、「BglII-RPE65.eGFP」に関してはBglIIであった。

最適化された遺伝子構築物を試験するため、pD10/CMV.SV40.kozak.RPE65optiを、pUC57プラスミド(GenScript社製)由来のコドン-、イントロン-及びKozak-最適化ヒトRPE65配列をCMVプロモーター含有pD10プラスミドのpD10.CMV.eGFP (Sunkel-Laing and Buch、論文未公開)にクローニングすることにより作製した。次いで、「完全長」RPE65プロモーターを、最適化された構築物を保有するプラスミドにクローニングした。

コドン最適化
コドン最適化は、GenScript所有権のOptimumGene(商標)コドン最適化ツールを使用して行った。

ウイルス産生プロトコルAAV2/8
組換えAAV2血清型8ウイルスは、前述(Gao et el. 2002)の293T細胞法のトリプルトランスフェクションを使用して産生した。293T細胞プレートの145cm²プレート(ウイルスバッチ当たり20プレート)を、10分間インキュベーションした後、目的のプラスミド:ウイルスキャプシドプラスミド:ヘルパープラスミドDNAを1:1:3の比で含むミックス、ポリエチレンイミン(PEI - Polysciences Inc., Eppelheim, Germany)及びDMEMでトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を24時間置いた。トランスフェクションの48時間後、細胞を回収し、遠心分離によって濃縮し、TD緩衝剤(140mM NaCl、5mM KCl、0.7mM K₂HPO₄、3.5mM MgCl₂、25mMトリス塩基[pH=7.5])に再懸濁した。次いで、これを3〜4回の凍結融解サイクルによって溶解させ、続いてベンゾナーゼ(Sigma Aldrich, Dorset, UK)処置を行い、次いで、細胞残屑を連続遠心分離ステップ及びシリンジ濾過ステップによって除去した。

精製は、イオン交換クロマトグラフィー(Davidoff et al. 2004による方法に基づいた方法を使用)によって実施した。溶出液をVivaspin 4 10kDa濃縮器チューブ(Sartorius Stedim Biotech, Fisher Scientific, Loughborough, UK)中で濃縮し、PBS-MKで洗浄し、次いで、100〜150μl容量まで濃縮し、次いで、-80℃(長期)又は+4℃(短期)保存用にアリコートした。

293Tのトランスフェクション
HEK-293T細胞の150cm³プレートを、16ウェルプレートに分けた。各ウェルを、所望のプラスミドDNA 0.5μg及びPEI 2μgを使用してトランスフェクトし、〜60時間置いた。次いで、細胞を、シリンジプランジャーを用いて回収し、その後、14,000rpmの遠心分離を行い、ペレット化した。

免疫組織化学
眼を角膜穿孔による固定のため調製し、次いで、1％パラホルムアルデヒド(PFA、pH7.4、微量の0.07Mのカコジル酸ナトリウム-HClを使用)に浸漬した。眼を、最大1時間、室温で固定するために置き、その後、溶液から取り出し、最適切断温度(OCT)包埋マトリックスに完全浸漬し、前後方向の眼を包埋チューブ内で水平-垂直軸に停止させた。次いで、これらは、切片化が必要になるまで、-20℃で凍結保存した。

Bright(登録商標) OTF5000 Cryostat (Bright Instrument Co Ltd, Cambridgeshire, UK)を使用し、13.5ミクロンの冠状切片を調製し、それにより、網膜の上面及び下面の両方を可視化させた。ポリリシン被覆顕微鏡用スライド上で切片化した後、切片を直ちに回収し、室温で空気乾燥させた。スライドは-20℃で保存するか、又は蛍光マウント剤(DAKO)にマウントするために調製した。スライドは、マウント剤(薬剤中0.1％ DAPI)に添加するか、又は0.2％ DAPIを含むTBSに浸漬し、マウント前にPBS洗浄することによって、DAPIで染色した。マウントしたスライドは、4℃で保存した。

マウントしたスライドは、Zeiss AxioObserver Z1 (Carl Zeiss Inc, Gottingen, Germany)を使用して画像化した。適切な蛍光フィルターを使用し、2.5×、10×及び20×倍率で写真撮影した。GFP画像は、10×及び20×倍率では200ms及び5000msで露光し、2.5×倍率では9000msで露光した。

組織解剖及びRNA/タンパク質抽出
マウスを頸椎脱臼により死亡させた。視神経を引っ張ることにより眼を摘出し、続いてPBSで洗浄した。網膜及びRPE脈絡膜は剥離することにより注意深く摘出し、直ちに、乾燥収集チューブに入れ氷上で最大1時間保管した。試料は、Qiagen(登録商標) All-Prep DNA/RNA/タンパク質キットを使用して処理した。注:ホモジナイゼーションのステップは、乳棒及び乳鉢の技術を用いて行った。

RNA抽出及び定量的リアルタイムPCR
RNAは、40μlのRNAse非含有H₂O中で溶出させ、直ちに氷上で、又は-20℃で保存した。RNA濃度は、Nanodrop(登録商標) ND-1000分光光度計を用いて定量した。1μg以下のRNA(各々の検査において、使用したRNAの量は、比較用の所定のグループの試料内の最低量RNAを含有している試料に対応)は、Qiagen(登録商標) Quantitect(登録商標)逆転写キットを使用して、cDNAに処理した。この1μlを、dH₂O中に50％ 2×Bioline(登録商標) Sensimix、1.67％プライマーミックス(フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方)を含有する29μl容量のRT-PCRマスターミックスと共に、各ウェルに装填した。各試料は、三連でロードした。関心のあるそれぞれの遺伝子を含有するプラスミド構築物の標準対数ラダーもまた、絶対定量のため並行してロードした。PCRは、標準条件を使用して実施した。使用したプライマーは次のものを含む:
RPE65:5'-AATTACCAAATATTGTAAACGGTTCCATC-3'(配列番号9)、
5'-TGTTTGAAACTGTGGAGGAACTGTC-3'(配列番号10)、
eGFP:5'-GAAGCGCGATCACATGGT-3'(配列番号11)及び
5'-CCATGCCGAGAGTGATCC-3'(配列番号12);
β-アクチン:5'-GTGGTACGACCAGAGGCATAC-3'(配列番号13)及び
5'-AAGGCCAACCGTGAAAAGAT-3'(配列番号14)。

すべての相対発現実験において、β-アクチンをローディング対照として使用した。データは、統計ソフトウェア(GraphPad, PRISM)を用いて、One-way ANOVAを使用して解析した。

タンパク質抽出及びウェスタンブロット
タンパク質抽出物は、Qiagen(登録商標) All-Prep DNA/RNA/タンパク質キットを使用して得たが、それを、100μl 5％SDSのプロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma Aldrich, Gillingham, UK)含有PBS中に再懸濁し、95℃で熱処理し、次いで、-20℃で保存した。SDS-PAGEの前に、タンパク質濃度をBio-Rad(登録商標) Protein Assay (DCタンパク質アッセイキット、Bio-Rad, Hemel Hempstead UK)を使用して定量した。タンパク質試料を希釈液で20μlに調製し、4μlのローディング染料で95℃にて熱ショック処理し、次いで、120Vで〜70分間SDS-PAGEのゲル上にロードし泳動させ、1×Tank緩衝液(1.64％トリス塩基、7.82％グリシン、0.54％ SDS)中に浸した。9％ゲル及び12％ゲルを、RPE65及びGFPブロットにそれぞれ使用した。次いで、電気泳動ゲルをPVDF膜(Millipore Watford UK)上に半乾燥転写し、その後、膜は、5％スキムミルク/1％ BSAを含むPBS+0.05％ Tween中で1時間ブロッキングした。次いで、膜を一次抗体(α-GFP又はα-RPE65)でブロッキングし、PBS+0.05％ Tweenで洗浄し、次いで、1:5000〜10,000希釈した二次(HRP接合型)抗体(Pierce Immunopureヤギ抗ウサギ及びヤギ抗マウスIgG、Perbio Science UK Ltd., Northumberland UK)でブロッキングした。次いで、洗浄したブロットをECL発光試薬(ECL plus GE Healthcare UK Ltd. Amersham, UK)に浸漬し、その後、化学発光検出(Fujifilm(登録商標) LAS-1000発光画像解析装置)を使用して画像化した。デンシトメトリー分析は、ImageJ(登録商標)ソフトウェアを使用してこれを実施し、ノンパラメトリックペアt検定を使用して統計的に解析した。

網膜下注射
網膜下注射は、Rd12(Pang et al. 2005)及びC57BL/6マウスに対し、生後少なくとも4週間で実施した。手術用顕微鏡を眼科手術の間、利用した。1.5cm、34ゲージの皮下注射針(Hamilton, Switzerland)を、強膜を通過させて接線方向に挿入し、自己シール形成性の強膜トンネル創傷を創った(Tan et al. 2009)。1.5〜2.0μlのウイルス懸濁液を網膜下腔の上半球及び下半球内に注射し、それぞれ検眼鏡で見ることができる胞状網膜剥離を創った。C57BL/6をプロモーター試験に利用し、1×10¹²ウイルス力価を注射した。Rd12マウスは、RPE65回復試験で使用した。マウスに、指定の眼に対しRPE65ウイルス構築物を注射し、反対の眼にはRPE65optiウイルス構築物を注射した。「低用量」(LD)実験に関する力価は、他のすべての回復実験については1×10⁹及び1×10¹⁰(2匹のマウスにぞれぞれの力価を注射)、及び1×10¹¹vg/mL(1ミリリットル当たりのウイルスゲノム)であった。すべてのマウスは左右相称で注射された。

In vivo処置効果
最適化されたベクター(AAV2/5-最適化RPE65)及び元のベクター(AAV2/2-hRPE65)の処置効果を比較するため、Rpe65^-/-マウスに、3×10⁷〜1×10⁹vg/mLの範囲の力価(最適化された構築物)、及び1×10¹⁰〜1×10¹²vg/mL(元の構築物)の力価で、AAV2/2-hRPE65又はAAV2/5-最適化RPE65を注射した。

網膜機能の回復は、網膜電図検査によって評価した。図3のグラフは、両ベクターがピーク発現に達した場合の処置後4週間での平均暗順応b波振幅(平均±SD)を示す。最適化されたベクターで処置した眼からのb波振幅は、元のベクターの300倍高い用量で注射された眼からの振幅と同じか、それ以上であった。これは、新規ベクターが元のベクターよりも少なくとも300倍有効であることを示している。この評価は、コドン最適化の効果を考慮に入れておらず、マウスにおけるより効果的なタンパク質翻訳には結びつかない。

[実施例1]
RPE発現を駆動するプロモーターの最適化
上記の「プラスミド構築物」のセクションで記載したように、「完全長」RPE65プロモーターをNsiI及びAccIの制限酵素で消化し、「NA」RPE65プロモーター断片を作製した。この断片を配列番号2に示す。また「完全長」RPE65プロモーターをBglII制限酵素で消化し、「Bgl」プロモーター断片も作製した。これらのプロモーター構造(RPE65転写開始部位周辺のゲノムDNAの断片)を、「完全長」プロモーターと一緒に試験し、相対発現レベル及び発現の組織特異性を決定した。評価は、導入遺伝子発現の局在化を促進するようにGFP発現を駆動するプロモーターを用いて行った(図1)。図1Aは、完全長RPE65プロモーター「RPE65」、又は「NA」断片若しくは「Bgl」断片を保有するAAV2/8ベクターの、RPE脈絡膜抽出物におけるGFP mRNA発現のリアルタイムPCR解析を示す。RPE65プロモーターの「NA」断片は、元のRPE65プロモーターよりも約20×高い発現レベルで有効であった(図1A)。「Bgl」断片は効果がなかった。すべての値において、p<0.05である。

図1Bは、GFP発現の代表的なウェスタンブロットを示す。「NA」試料は、レーン2で1/20に希釈した。

図1Cは、eGFPを駆動する異なるプロモーターを保有するAAV2/8ベクターが注射された眼の薄い凍結切片の蛍光画像を示す。左のパネルは20×倍率でのeGFP発現を示し、中央のパネルはDAPIによる同時染色を示し、右のパネルは2.5×倍率でのeGFP発現を示す。蛍光画像は、RPEにおけるeGFP強度及び光受容体の欠如によって示したように、最適化されたhRPE65プロモーターが、正常hRPE65プロモーターよりも有効であり、またRPE細胞における発現の駆動においてよりストリンジェントであることを示している。

[実施例2]
RPE65 cDNAの最適化
ヒトRPE65 mRNAの転写後プロセシングの効果(RNA安定性、核外輸送及び翻訳)を改善することを試みるため、RPE65 cDNAのコード配列に対していくつかの修飾を行った。これにより配列番号4に示した配列が得られた。Kozak配列が「CCACCATG」に最適化され(配列番号4のヌクレオチド1〜8を参照)、開始コドンのより良好な認識とその結果としての効果的な翻訳を達成しようと試みた。ヒトRPE65遺伝子の天然Kozak配列は、得られた最適なコンセンサス配列とは大幅に異なっていた。

さらに、RPE65のコード配列をコドン最適化に供し、コドン使用バイアス及びCG含量を改善することを試み、mRNA中の任意の潜在的なプロセッシング部位及び可能性のあるステム-ループ構造を除去した。RPE65コード配列を最適化している間、7つのレアコドン(タンデムの対を含む)、潜在的スプライス部位、4つの潜在的早期ポリアデニル化部位、及び50塩基対の直接反復が置き換えられた。これらの変化は、コドン利用頻度を大幅に改善した。これらの変化は、in vitroで(ヒト)293T細胞において一緒に試験され、ユビキタスCMVプロモーターを保有するAAV2/8発現プラスミドのトランスフェクション後のRPE65タンパク質産生レベルに対するそれらの効果を決定した(図2)。図2Aは、RPE65発現のウェスタンブロットを示す。図2Bは、ウェスタンブロットの定量を示す。RPE65コード配列の最適化後の293T細胞におけるin vitroでのタンパク質産生は、野生型コード配列(AAV2/8.RPE65)と比べ、最適化されたコード配列(AAV2/8.Optim)を保有するベクターから産生されたRPE65タンパク質の量において7倍の増加を示した(p<0.05)。

[実施例3]
処置効果のin vivoでの評価
最高レベルの発現をもたらすプロモーター、配列番号2で示した「NA」断片、及び配列番号4で示した最適化されたRPE65コード配列からなる構築物を、AAV5キャプシド及びAAV8キャプシドにパッケージングし、RPE65欠損マウスにおいてin vivoで網膜機能を回復させるその能力に関して試験した。回復の効果を、以前にBainbridge et al (2008)において使用された臨床グレードベクター、「AAV2-hRPE65」と比較した。このベクターは、ヒトRPE65プロモーターの1400bp断片によって駆動されるヒトRPE65コード配列を含有していた。以前のベクターが動物において既に回復を導いていたので、限定された状況下での処置効果が比較できるように、低いベクター用量が投与された(図3)。b波振幅を回復の尺度として使用した。驚いたことに、最適化されたベクターで処置した眼から得られたb波振幅は、元のベクターの300倍高い用量で注射された眼から得られた振幅と同じであるか、それよりも高かった。これは、新規ベクターが元のベクターよりも少なくとも300倍有効であることを示した。

引用文献

配列情報
配列番号1において囲まれた配列は、配列番号2において除去された配列番号1のヌクレオチド及びそれらの位置を示す。配列番号2において囲まれた配列は、配列番号1に示されたボックスから除去されたヌクレオチドの代わりに付加されたヌクレオチドを示す。配列番号1及び2における太字下線付文字は、配列番号2の開始の相対位置を示す。

配列番号1 RPE65プロモーター領域 Genbank番号NG_008472.1

配列番号2 最適化RPE65プロモーター断片

配列番号3 ヒトRPE65のcDNA Genbank番号NM_000329.2

配列番号4 最適化RPE65 cDNA (Kozak配列及びコード配列)

配列番号5 ヒトMERTKのcDNA Genbank番号NM_006343.2

配列番号6 ヒトLRATのcDNA Genbank番号NM_004744.3

配列番号7 ヒトTYRのcDNA Genbank番号NM_000372.4

配列番号8 ヒトGRP143のcDNA Genbank番号NM_000273.2

Claims

網膜色素上皮(RPE)特異的プロモーターであって、
(a)作動可能に連結されたポリヌクレオチド配列にRPE特異的発現を付与する、配列番号1由来の連続したヌクレオチドの配列、又は、
(b)(a)の前記配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、RPE特異的プロモーター活性を保持する配列
を含む、プロモーター。
前記配列が、(a)配列番号1由来の1300個以下の連続ヌクレオチドを含むか、又は前記配列が、(b)配列番号1由来の1300個以下の連続ヌクレオチドの前記配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、RPE特異的プロモーター活性を保持する、請求項１に記載のプロモーター。
前記配列が、(a)配列番号1由来の800個以下の連続ヌクレオチドを含むか、又は前記配列が、(b)配列番号1由来の800個以下の連続ヌクレオチドの前記配列に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、RPE特異的プロモーター活性を保持する、請求項２に記載のプロモーター。
前記配列が、(a)配列番号2の配列若しくは配列番号2のヌクレオチド12〜761の配列を含むか、又は前記配列が、(b)配列番号2の前記配列若しくは配列番号2のヌクレオチド12〜761に対して少なくとも90％の配列同一性を有し、RPE特異的プロモーター活性を保持する、請求項３に記載のプロモーター。
(a)又は(b)の前記配列が、少なくとも500ヌクレオチドの長さである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロモーター。
RPE特異的方法で発現される配列に作動可能に連結されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロモーターを含む発現構築物。
作動可能に連結されている配列が、RPE65、MERTK、LRAT、TYR、GRP143若しくはMYO7Aコード配列、又は神経栄養因子、抗血管新生ポリペプチド若しくはRPEにおいて抗アポトーシス作用を有するポリペプチドをコードしている配列である、請求項６に記載の発現構築物。
作動可能に連結されている配列が、配列番号3〜8から選択される配列、又は配列番号3〜8のいずれか1つに対して少なくとも80％の配列同一性を有し、RPE機能を回復する能力を有する配列を含む、請求項７に記載の発現構築物。
作動可能に連結されている配列が、配列番号4を含む、請求項７又は８に記載の発現構築物。
請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロモーター又は請求項６〜９のいずれか一項に記載の発現カセットを含む、ベクター。
ウイルスベクターである、請求項１０に記載のベクター。
アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであるか、又はAAVゲノム若しくはその誘導体を含む、請求項１１に記載のベクター。
前記誘導体が、キメラ、シャッフル又はキャプシド修飾誘導体である、請求項１２に記載のベクター。
前記AAVゲノムが、AAVの天然由来血清型又は単離物又はクレードに由来する、請求項１２又は１３に記載のベクター。
前記AAVゲノムが、AAV血清型2(AAV2)、AAV血清型4(AAV4)、AAV血清型5(AAV5)又はAAV血清型8(AAV8)に由来し、及び/又はキャプシドがAAV5又はAAV8に由来する、請求項１４に記載のベクター。
ゲノムがAAV2に由来し、キャプシドがAAV5又はAAV8に由来する、請求項１５に記載のベクター。
請求項１０に記載のベクターを含有するか、又は請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のウイルスベクターを産生する、宿主細胞。
HEK293又はHEK293T細胞である、請求項１７に記載の細胞。
請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のベクター及び薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
網膜ジストロフィーを予防又は処置する方法における使用のための、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のベクター。
網膜ジストロフィーの処置又は予防用の医薬品の製造における、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のベクターの使用。
それを必要とする患者における網膜ジストロフィーを処置又は予防する方法であって、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のベクターの治療上有効な量を患者に投与することを含む、方法。
網膜ジストロフィーが、レーバー先天性黒内障(LCA)、加齢性黄斑変性症(AMD)、眼皮膚症1型、又はネトルシップ-ファルス型眼白子症、又はMERTK欠損症である、請求項２０に記載の使用のためのベクター、又は請求項２１に記載の使用、又は請求項２２に記載の方法。
処置又は予防が、網膜、網膜下又は硝子体内への直接注射により、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載のベクターを患者に投与することによる、請求項２０若しくは２３に記載の使用のためのベクター、又は請求項２１、２２若しくは２３に記載の使用若しくは方法。
前記ベクターが、網膜、網膜下腔又は硝子体内腔に直接投与される、請求項２４に記載の使用のためのベクター、使用又は方法。