JP7371083B2 - 遺伝子治療発現ベクターの眼内送達 - Google Patents
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Description
本出願は、2018年7月20日に出願された米国仮特許出願第62/701,267号、2018年8月29日に出願された米国仮特許出願第62/724,480号及び2018年11月16日に出願された米国仮特許出願第62/768,590号の恩典を主張し、これらの特許出願は、引用することにより本明細書の一部をなす。
[項1]
治療用タンパク質をコードする発現ベクターを被験体の眼に送達する方法であって、前記眼に電流を印加することを含む、方法。
[項2]
前記被験体が、任意の単一遺伝子又は多遺伝子の網膜疾患の治療を受けている、項1に記載の方法。
[項3]
前記被験体が、シュタルガルト病、X連鎖性網膜分離症、加齢性黄斑変性症(AMD)、糖尿病性網膜症、レーバー先天黒内障(LCA)、網膜剥離(疾患、傷害、又は自然剥離による)、嚢胞、嚢胞様黄斑浮腫、網膜色素変性症、老人性スキーシス、フックス角膜ジストロフィー及び他の角膜ジストロフィー、緑内障、並びに白内障からなる群から選択される眼の状態の治療を受けている、項1又は2に記載の方法。
[項4]
前記被験体がX染色体性若年網膜分離症(XLRS)の治療を受けている、項1に記載の方法。
[項5]
注射の方法が、前房内注射、角膜内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、網膜下注射、硝子体内注射、脈絡膜上注射、及び前眼房への注射からなる群から選択される、項1~4のいずれか一項に記載の方法。
[項6]
注射の方法が硝子体内注射である、項1に記載の方法。
[項7]
前記硝子体内注射が、前記眼の後部硝子体腔内の網膜の表面から0mm~13mmの傍網膜注射である、項6に記載の方法。
[項8]
前記硝子体内注射が、前記眼の後部硝子体腔内の網膜の表面から0mm~10mmである、項7に記載の方法。
[項9]
前記硝子体内注射が、前記眼の後部硝子体腔内の網膜の表面から0mm~5mmである、項7に記載の方法。
[項10]
前記硝子体内注射が、前記眼の後部硝子体腔内の網膜の表面から0mm~3mmである、項7に記載の方法。
[項11]
前記硝子体内注射が前記網膜の中心窩領域で又はその近くである、項7~10のいずれか一項に記載の方法。
[項12]
前記眼に印加される電流が、約1.0マイクロアンペア(μA)~約15ミリアンペア(mA)である、項1~11のいずれか一項に記載の方法。
[項13]
前記電流が、約1ミリ秒(ms)~約24時間の期間で眼に印加される、項1~12のいずれか一項に記載の方法。
[項14]
前記眼に印加される電流が固定電流として印加される、項1~13のいずれか一項に記載の方法。
[項15]
前記眼に印加される電流が可変電流として印加される、項1~13のいずれか一項に記載の方法。
[項16]
前記眼に印加される電流がパルス電流として印加される、項1~13のいずれか一項に記載の方法。
[項17]
前記眼に印加される電流が二相性電流として印加される、項1~13のいずれか一項に記載の方法。
[項18]
前記眼に印加される電流が1回の印加で印加される、項1~13のいずれか一項に記載の方法。
[項19]
前記眼に印加される電流が反復印加で印加される、項1~13のいずれか一項に記載の方法。
[項20]
前記電流が、前記発現ベクターの注入と同時に眼に印加される、項1~19のいずれか一項に記載の方法。
[項21]
前記電流が、前記発現ベクターの注入前60秒から注入後60秒までの期間に眼に印加される、項1~19のいずれか一項に記載の方法。
[項22]
前記電流が、前記発現ベクターの注入前に眼に印加される、項1~19のいずれか一項に記載の方法。
[項23]
前記電流が、前記発現ベクターの注入の最大48時間前までに眼に印加される、項22に記載の方法。
[項24]
前記電流が、前記発現ベクターの注入前24時間~48時間の期間に眼に印加される、項22に記載の方法。
[項25]
前記電流が、前記発現ベクターの注入前12時間~24時間の期間に眼に印加される、項22に記載の方法。
[項26]
前記電流が、前記発現ベクターの注入前6時間~12時間の期間に眼に印加される、項22に記載の方法。
[項27]
前記電流が、前記発現ベクターの注入前1時間~6時間の期間に眼に印加される、項22に記載の方法。
[項28]
前記電流が、前記発現ベクターの注入前1分~60分の期間に眼に印加される、項22に記載の方法。
[項29]
前記電流が、前記発現ベクターの注入後に眼に印加される、項1~19のいずれか一項に記載の方法。
[項30]
前記電流が、前記発現ベクターの注入の最大48時間後までに眼に印加される、項29に記載の方法。
[項31]
前記電流が、前記発現ベクターの注入後24時間~48時間の期間に眼に印加される、項29に記載の方法。
[項32]
前記電流が、前記発現ベクターの注入後12時間~24時間の期間に眼に印加される、項29に記載の方法。
[項33]
前記電流が、前記発現ベクターの注入後6時間~12時間の期間に眼に印加される、項29に記載の方法。
[項34]
前記電流が、前記発現ベクターの注入後1時間~6時間の期間に眼に印加される、項29に記載の方法。
[項35]
前記電流が、前記発現ベクターの注入後1分~60分の期間に眼に印加される、項29に記載の方法。
[項36]
前記被験体を少なくとも第1及び第2の電極と接触させることによって、前記電流が眼に印加され、ここで、前記第1の電極は、前記被験体の眼の角膜と接触して設置され、前記第2の電極は前記被験体の身体の一部と接触して設置される、項1~35のいずれか一項に記載の方法。
[項37]
前記被験体を少なくとも第1及び第2の電極と接触させることによって、前記電流が眼に印加され、ここで、前記第1の電極は、前記被験体の眼の角膜と接触して設置され、前記第2の電極は前記被験体の眼の別の部分と接触して設置される、項1~35のいずれか一項に記載の方法。
[項38]
前記第2の電極が、前記被験体の角膜の外側の眼の一部と接触して設置される、項37に記載の方法。
[項39]
前記第1の電極が、前記眼の内側の眼の一部又は硝子体と接触して設置される、項37又は38に記載の方法。
[項40]
前記被験体を少なくとも第1及び第2の電極と接触させることによって、前記電流が眼に印加され、ここで、前記第1及び第2の両方の電極が前記被験体の眼と接触して設置され、且ついずれの電極も前記被験体の眼の角膜と接触して設置されていない、項1~35のいずれか一項に記載の方法。
[項41]
前記角膜に正の電圧を印加することによって、前記発現ベクターが眼の前眼部に送達され、前記発現ベクターが眼の水晶体、虹彩、毛様体、及び角膜の少なくとも1つに入ることを可能にする、項1~40のいずれか一項に記載の方法。
[項42]
前記角膜に負の電圧を印加することによって、前記発現ベクターが眼の後眼部に送達され、それによって前記発現ベクターが網膜に入ることを可能にする、項1~40のいずれか一項に記載の方法。
[項43]
前記発現ベクターが、光受容体、並びに網膜色素上皮(RPE)、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、水平細胞、双極細胞、神経線維層構造物、及び無軸索細胞からなる群から選択される眼の細胞において発現される、項1~42のいずれか一項に記載の方法。
[項44]
前記発現ベクターが、ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、そのゲノムに対して異種の核酸分子を含む組換えウイルス、複製欠損ウイルス、被験体の細胞の核内で複製するウイルス、非分裂細胞又は分裂細胞に感染するウイルス、及び眼の組織に指向性を示すウイルスに由来する1つ以上の核酸配列を含む、項1~43のいずれか一項に記載の方法。
[項45]
前記発現ベクターがDNAプラスミドである、項1~44のいずれか一項に記載の方法。
[項46]
前記発現ベクターがウイルスゲノムである、項1~44のいずれか一項に記載の方法。
[項47]
前記発現ベクターが、プラスミド由来の核酸配列及びウイルスゲノム由来の核酸配列を含み、核酸分子の送達及びコードされた治療用分子の高レベルの発現を可能にする、直鎖又は環状のDNA分子である、項1~46のいずれか一項に記載の方法。
[項48]
前記発現ベクターがAAV発現ベクターである、項1~47のいずれか一項に記載の方法。
[項49]
前記発現ベクターが、レチノスキシン遺伝子をコードする核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む、項48に記載の方法。
[項50]
前記レチノスキシン遺伝子をコードする核酸配列が、前記レチノスキシン遺伝子の第1のイントロンの少なくとも300塩基対の部分を含む、項49に記載の方法。
[項51]
前記発現ベクターが、光受容体、網膜色素上皮(RPE)、双極細胞、ミュラー細胞、及び網膜神経節細胞からなる群から選択される眼の細胞において発現される、項48~50のいずれか一項に記載の方法。
[項52]
前記プロモーターが眼特異的プロモーターである、項49に記載の方法。
[項53]
前記プロモーターが、CMVプロモーター、レチノスキシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、CRXプロモーター、及び細胞における発現を制御する任意の他のプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、項52に記載の方法。
[項54]
前記発現ベクターが、前記プロモーターの活性を増強するエンハンサー配列を含む、項48~53のいずれか一項に記載の方法。
[項55]
前記エンハンサー配列が、光受容体間レチノイド結合タンパク質エンハンサー配列である、項54に記載の方法。
[項56]
光受容体間レチノイド結合遺伝子エンハンサーエレメントが、レチノスキシン遺伝子プロモーター内のAluリピート配列を置換する、項55に記載の方法。
[項57]
前記発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス逆位末端反復配列(ITR)に隣接している、項48~56のいずれか一項に記載の方法。
[項58]
前記ITRの少なくとも1つが、repニッキング部位又はD領域内で修飾されている、項57に記載の方法。
[項59]
発現カセットの5’側のITRが、野生型ITR配列のパリンドロームのA領域におけるITR配列の15塩基対の欠失を含む、項58に記載の方法。
[項60]
前記5’ITRが、野生型ITR配列中の前記repニッキング部位を含む前記D領域の除去によって更に修飾される、項59に記載の方法。
[項61]
発現カセットの3’側のITRが完全長の野生型ITR配列である、項58に記載の方法。
[項62]
前記発現ベクターが自己相補的アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、項48に記載の方法。
[項63]
前記発現ベクターが、ヒトβ-グロビン3’非翻訳領域及びポリアデニル化部位を含む、項48~62のいずれか一項に記載の方法。
[項64]
前記発現ベクターがナノ粒子に会合している、項1~63のいずれか一項に記載の方法。
[項65]
前記ナノ粒子が標的化された又は放射性標識されたナノ粒子である、項64に記載の方法。
本発明はその具体的な実施形態を参照して説明されるが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく様々な変更を行ってもよく、等価物を置換することができることが当業者によって理解される。さらに、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセス工程(単数又は複数)を本発明の目的、趣旨及び範囲に適合させるために多くの修正を行ってよい。かかる修飾は全て、特許請求の範囲に含まれることが意図される。
マウスにおける眼送達後の形質導入効率及び網膜発現
予備研究では、20分間の10μAの直流電流は、眼の構造又は機能に悪影響を及ぼさないことが示された(図4A~図4H及び図5A、図5Bを参照されたい)。次いで、本発明者らは、1×109ベクターゲノム(vg)をマウスの眼の硝子体に注入した直後に印加した場合に、これがAAV8-CMV-GFPの網膜形質導入効率を高めるかどうかを評価した。対照眼にはGFPベクターを注射したが、電流を印加しなかった。GFP発現を、注射後(PI)6週間目にin vivo眼底画像化によって評価した。GFP発現を示す網膜面積の広さ(パーセントで表される、図1A)を、AAV8ベクター形質導入の効率を示すために使用した。
マウスにおける形質導入効率及び網膜発現に対する用量及び投与時間の効果
本発明者らはまた、5×108vg/眼のより少ない用量で結果を評価し、硝子体内注射後の4.5週間目のより早期に分析を行った(図2A~図2D)。これにより、ECVMで処理した眼と処理していない眼との間の格差が拡大した。ECVMを適用していない眼のうち、82%(11個のうち9個)が中心網膜全体でGFP発現を示さなかった(図2A及び図2B)。比較すると、ECVMを受けた眼のほぼ半数が中心網膜の20%超でGFP発現を示し、処理した11個の眼のうち2個で中心網膜の50%超が形質導入されていた。GFP発現の平均網膜面積は、電流を受けずに注射された対照(2.3%;p<0.0001、マンホイットニー検定;図2B)と比較して、ECVM処理された眼において有意に大きかった(22%)。本発明者らは、ECVM処理を受けた残りの9個の眼よりも2個の眼がより多くの発現を示したことに注目した。十分な注意を払って、本発明者らは、異常に大きな網膜領域が形質導入された可能性があると想定して、最初にこれら2つのサンプルを除いた後に再び分析を行った。ECVM処理(n=9)対対照(n=11)の眼の差は、依然として非常に有意であった(p=0.0003、マンホイットニー検定;図2C)。
マウスにおける眼送達後の遺伝子発現強度の評価
次いで、本発明者らは、この5×108vg/眼の低用量群の眼を収集し、注射後5週目の網膜組織学的凍結切片に対する免疫蛍光法によるGFP発現強度を比較した。ECVM適用を受けた注射した眼は、対照の眼と比較して約6倍(5.9±1.2)高い強度を示した(p=0.0007;マンホイットニー検定;図2D)。これらのデータは、経眼ECVMが硝子体内投与後のAAVベクターの網膜形質導入効果を高めたという知見を更に支持する。
マウスにおける眼送達後の遺伝子発現分布の評価
本発明者らはまた、ECVMで処理した眼においてAAV8-EGFPによって形質導入された網膜細胞の分布を評価した。GFPは、ECVMで処理された眼の全ての網膜層で観察された(図3A~図3E)。ほとんどの網膜切片は、より深い網膜細胞によって、RPE及び光受容体で最大のGFP蛍光を示した(図3A)。幾つかの切片は更に神経節細胞の形質導入を示した(図3B)。これは、GFP強度の網膜分布プロファイルによって確認された。
ウサギ網膜におけるベクター形質導入の経眼微小電流増強の評価
マウス(上記実施例1~実施例4)で実証されたように、硝子体内AAVベクター投与後の内境界膜(ILM)を横切るAAV媒介ベクターの浸透に対する電流ベクター移動(ECVM)の効果を、ウサギモデルまで広げた。この研究は、実験概念を第2の種としてウサギに拡大し、経眼的電流が野生型ウサギにおいて電流ベクター移動(ECVM)によって硝子体内に投与されたAAV-CMV-EGFPの網膜形質導入効率を増大するかどうかを評価した。
アカゲザル網膜におけるベクター形質導入の経眼微小電流増強の評価
マウス(実施例1~4、上記)及びウサギ(実施例5)で実証されているように、硝子体内AAVベクター投与後の内境界膜(ILM)を横切るAAV媒介ベクターの浸透に対する電流ベクター移動(ECVM)の効果をアカゲザルモデルまで広げた。
ウサギの網膜表面を覆っている深部硝子体への適用(傍網膜送達)後のAAV8ベクターの硝子体分布の評価
硝子体は非常に粘性が高く、硝子体全体への遺伝子治療ベクターの急速な拡散及び分布を妨げる。そのため、硝子体内注射後にベクターが網膜の表面に到達するためには、ベクターを網膜に近接して留置する必要がある。これらの研究を、ウサギの眼の網膜表面を覆う深部硝子体内の注射から1時間後及び20時間後の硝子体後部対前部におけるAAV8ベクターの分配及び分布を評価するために行った。
ニュージーランドのウサギの眼への傍網膜送達の効果
この研究は、AAV8-CMV-EGFPベクターを用いた傍網膜遺伝子送達が、前眼部と比較してウサギ眼の後眼部においてより高い局所濃度のベクターを提供するかどうかを更に評定するために行われた。
非ヒト霊長類における眼への傍網膜送達及び中部硝子体送達の比較
非ヒト霊長類における発現ベクターの網膜送達の改善可能性を評価するため、眼ごとのベクターゲノムが3×1011ベクターゲノム(vg)の同じ用量のmycでタグ付けされているヒトレチノスキシン遺伝子(RS1)を持つAAV8ベクター(scAAV8-HRSP/IRBP-hRS/myc)を2匹のサルに注入した。1匹目のサルはウイルスベクターで右(OD)と左(OS)の両方の眼に傍網膜送達を受けた。2匹目のサルは、右(OD)眼へのウイルスベクターによる典型的な中部硝子体注射を受け、反対側の眼すなわち左(OS)眼にはビヒクル(陰性対照)の中部硝子体送達を受けた。注射の9.5週間後にウイルスのmycタグ付きヒトレチノスキシン(hRS1)の発現を評価するためにサルの眼を摘出した。
Claims (23)
- 被験体において眼の状態を眼内送達により治療する方法に使用するための組成物であって、前記組成物が、治療用タンパク質をコードするアデノ随伴ウイルス(AAV)ウイルス発現ベクターを含み、前記送達が、前記被験体の眼に電流を印加すること、及び前記眼に前記AAVウイルス発現ベクターを送達することを含む、組成物。
- 前記眼の状態が、シュタルガルト病、X連鎖性網膜分離症、加齢性黄斑変性症(AMD)、糖尿病性網膜症、レーバー先天黒内障(LCA)、網膜剥離(疾患、傷害、又は自然剥離による)、嚢胞、嚢胞様黄斑浮腫、網膜色素変性症、老人性スキーシス、フックス角膜ジストロフィー、別の角膜ジストロフィー、緑内障、若しくは白内障、又はこれらの組合せを含む、請求項1に記載の組成物。
- 前記眼内送達が、前記AAVウイルス発現ベクターを、眼の後部硝子体腔内の網膜の表面から0mm~13mmに傍網膜注射することを含む、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記眼内送達が、前記AAVウイルス発現ベクターを、眼の後部硝子体腔内の網膜の表面から0mm~3mmに傍網膜注射することを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
- (a)前記眼に印加される電流が、1.0マイクロアンペア(μA)~15ミリアンペア(mA)である、及び/又は
(b)前記電流が、1ミリ秒(ms)~24時間の期間、眼に印加される、
請求項1~4のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記眼に印加される電流が、(a)固定電流として印加される、又は(b)連続直流として印加される、請求項1~5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記電流が、
(a)前記AAVウイルス発現ベクターの送達と同時に、又は
(b)前記AAVウイルス発現ベクターの送達後に、
眼に印加される、請求項1~6のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記電流が、
(a)前記AAVウイルス発現ベクターの送達の最大48時間後までに、
(b)前記AAVウイルス発現ベクターの送達後24時間~48時間の期間に、
(c)前記AAVウイルス発現ベクターの送達後12時間~24時間の期間に、
(d)前記AAVウイルス発現ベクターの送達後6時間~12時間の期間に、
(e)前記AAVウイルス発現ベクターの送達後1時間~6時間の期間に、又は
(f)前記AAVウイルス発現ベクターの送達後1分~60分の期間に、
眼に印加される、請求項1~7のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記被験体を少なくとも第1及び第2の電極と接触させることによって、前記電流が眼に印加され、
(a)前記第1の電極は、前記被験体の眼の角膜と接触して設置され、前記第2の電極は、前記被験体の眼の別の部分と接触して設置される、或いは
(b)前記第1及び第2の両方の電極が前記被験体の眼と接触して設置され、且ついずれの電極も前記被験体の眼の角膜と接触して設置されていない、
請求項1~8のいずれか一項に記載の組成物。 - (i)前記第2の電極は、前記被験体の角膜の外側の眼の一部と接触して設置される、及び/又は
(ii)前記第1の電極は、眼の内側の眼の一部又は硝子体と接触して設置される、請求項9に記載の組成物。 - 前記AAVウイルス発現ベクターが、
(a)角膜に正の電圧を印加することによって、眼の前眼部に送達され、眼の水晶体、虹彩、毛様体、及び角膜の少なくとも1つに入ることが可能になる、又は
(b)角膜に負の電圧を印加することによって、眼の後眼部に送達され、それによって網膜に入ることが可能になる、
請求項1~10のいずれか一項に記載の組成物。 - 前記AAVウイルス発現ベクターが、光受容体、並びに網膜色素上皮(RPE)、網膜神経節細胞、水平細胞、双極細胞、神経線維層構造物、及び無軸索細胞からなる群から選択される眼の細胞において発現される、請求項1~11のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記AAVウイルス発現ベクターが、ウイルスゲノムを含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記AAVウイルス発現ベクターが、AAV8発現ベクターである、請求項1~13のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記AAVウイルス発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス逆位末端反復(ITR)を含む、請求項1~14のいずれか一項に記載の組成物。
- (a)前記AAVウイルス発現ベクターが、レチノスキシン遺伝子をコードする核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターを含む
、及び/又は
(b)前記AAVウイルス発現ベクターが、光受容体、網膜色素上皮(RPE)、双極細胞、及び網膜神経節細胞からなる群から選択される眼の細胞において発現される、及び/又は
(c)前記AAVウイルス発現ベクターが、プロモーターの活性を増強するエンハンサー配列を含む、及び/又は
(d)前記AAVウイルス発現ベクターが、アデノ随伴ウイルス逆位末端反復配列(ITR)に隣接している、及び/又は
(e)前記AAVウイルス発現ベクターが、自己相補的アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターである、及び/又は
(f)前記AAVウイルス発現ベクターが、ヒトβ-グロビン3’非翻訳領域及びポリアデニル化部位を含む、請求項1~15のいずれか一項に記載の組成物。 - (i)前記レチノスキシン遺伝子をコードする核酸配列が、レチノスキシン遺伝子の第1のイントロンの少なくとも300塩基対の部分を含む、又は(ii)前記プロモーターが、眼特異的プロモーターである、請求項16に記載の組成物。
- 前記プロモーターがCMVプロモーター、レチノスキシンプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、CRXプロモーター、及び細胞における発現を制御する他のプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、請求項16又は17に記載の組成物。
- 前記エンハンサー配列が、光受容体間レチノイド結合タンパク質エンハンサー配列である、請求項16~18のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記光受容体間レチノイド結合遺伝子エンハンサーエレメントが、レチノスキシン遺伝子プロモーター内のAluリピート配列を置換する、請求項19に記載の組成物。
- 前記ITRの少なくとも1つが、repニッキング部位又はD領域内で修飾されている、請求項15~20のいずれか一項に記載の組成物。
- (i)発現カセットの5’側のITRが、野生型ITR配列のパリンドロームのA領域におけるITR配列の15塩基対の欠失を含む、又は(ii)発現カセットの3’側のITRが完全長の野生型ITR配列である、請求項15~21のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記5’ITRが、野生型ITR配列中の前記repニッキング部位を含む前記D領域の除去によって更に修飾されている、請求項22に記載の組成物。
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