KR101132413B1 - Ｓａｒｓ 백신 나노전달체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome; SARS) 코로나바이러스(coronavirus; CoV)(SARS-CoV)에서 스파이크 단백질을 발현시키는 DNA 백신인 pci-S 유전자 DNA가 중합체에 복합된 SARS 백신 나노입자전달체에 관한 것으로, 본 발명에 따른 PEI/pci-S 나노입자 복합체는 pci-S를 세포내로 효과적으로 전달되는 과정이, in vitro에서 이들로 처리된 세포들이 S 단백질을 효율적으로 발현시킬 수 있음을 확인되었고, 이들 S유전자 담지-DNA백신/나노복합체를 이용하여 비강에 전달하였을 때 SARS CoV S-특이적 체액성 및 점막성 항체 반응을 유발시켰으며, 이들로 처리된 마우스의 폐에서 B220+ 세포는 SARS 단백질을 이용한 in vitro 재 자극 후 유의적인 증식 반응을 나타내었고, MHC II 군 및 공동자극성 분자의 발현이 상향 조절되었고, TNF-α (단일 사이토카인) 뿐만 아니라 TNF-α 및 IL-2 (두개의 사이토카인이 동시에 발현)의 탁월한 생산능을 갖는 T세포를 포함한 사이토카인-생산 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 유발시키는 효과가 있다.
SARS 백신, 폴리에틸렌이민, PEI, pci-S

Description

ＳＡＲＳ 백신 나노전달체{SARS Vaccine Nano-Delivery System}
본 발명은 SARS 백신 나노전달체에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome; SARS) 코로나바이러스(coronavirus; CoV)(SARS-CoV)에서 스파이크 단백질을 발현시키는 DNA 백신인 pci-S 유전자 DNA가 중합체에 복합된 SARS 백신 나노입자전달체에 관한 것이다.
중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome; SARS) 코로나바이러스(coronavirus; CoV)(이하 SARS-CoV'라 칭함)의 스파이크 단백질(spike protein) (S)는 ~180-kDa의 당단백질이며, 숙주 수용체를 인지하여 그에 결합한다고 알려져 있다. 스파이크 단백질의 수용체-결합 모티프는 중화항체를 생성시켜 SARS-CoV에 의한 감염을 예방할 수 있다는 사실이 보고된 바 있다(Emerging Infectious Diseases, Vol.11, No.7, 1016-1020).
또, 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine; PEI)(이하 'PEI'로 칭함)은 가장 널리 사용되고 있는 유용한 고분자들 중 하나로서, 국내공개특허공보 제10-2007-85500호 등에 DNA 백신을 포함하는 약물 전달 시스템으로서 양이온성 다중-블록 공중합체와 그의 용도가 시험된 바 있다.
이 밖에도, 고분자물질 PEI와 관련하여 대한민국 등록특허 제10-0401022호에도 항암제-폴리에틸렌이민 복합체 및 그의 제조방법에 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민에 단일 또는 복수의 소수성 항암제를 결합시켜 소수성 항암제를 수용화시키고 복수 항암제를 단일 제제화시킬 수 있는 항암제-폴리에틸렌이민 복합체 및 그의 제조방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-0860416호 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민을 기초로 한 생분해성 폴리에스텔아민을 이용한 새로운 유전자 전달체에 폴리카프로락톤 다이아크릴레이트와 폴리에틸렌이민을 기초로 한 생분해성 폴리에스텔아민으로 구성되어 낮은 세포독성, 생분해성 및 높은 유전자 전달효율로 유전자를 효율적으로 전달하는 유전자전달체가 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 상기와 같은 공지된 등록특허와 전혀 달리, 지금까지 시도된 바 없는 SARS DNA 백신을 체내에 효과적으로 전달시킬 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구를 거듭하여, SARS DNA 백신을 폴리에틸렌이민(PEI)에 결합시키되, 트랜스 멤브레인 도메인(아미노산 14-1154)이 제거된 당단백질인 SARS CoV 스파이크(S) 단백질을 코딩하는 DNA(PSi-S)를 합성하여 제공하는 데 있다.
따라서 본 발명의 목적은 신규한 SARS 백신 나노전달체를 제공하는 것이다.
본 발명의 상기 목적은 SARS-CoV의 스파이크 단백질을 발현시키는 DNA 백신으로써, pci-S DNA를 PEI에 교차연결시켜 PEI/pci-S DNA 나노입자 복합체를 제조하고, 상기 PEI/pci-S 나노입자 복합체가 pci-S 유전자를 세포 내로 효과적으로 전달시킴을 확인함으로써 달성하였다.
본 발명은 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome; SARS) 코로나바이러스(coronavirus; CoV)(SARS-CoV)에서 스파이크 단백질을 발현시키는 DNA 백신인 pci-S 유전자 DNA가 중합체에 복합된 SARS 백신 나노입자전달체를 제공한다.
본 발명에 있어서, 바람직한 상기 중합체는 폴리에틸렌이민(PEI)이다.
본 발명에서는 SARS 바이러스에 대한 백신 후보자로서 당단백질인 스파이크 단백질을 발현하는 DNA 백신으로 pci-S 유전자 DNA를 국내외 최초로 제조하고 이어서, 상기 pci-S 유전자 DNA를 PEI에 결합시켜 PEI/pci-S 나노입자 복합체를 제조하는데 성공하였다.
PEI/pci-S 나노입자는 입도 약 194.7±99.3nm의 구형 형태를 나타내었다.
상기 PEI/pci-S 나노입자 복합체를 사용하여 비강내 경로(intranasal (i.n.) route)를 통해 면역성을 부여한 BALB/c 마우스에서의 면역 반응을 조사하였다.
COS7 세포에서 S mRNA 및 단백질의 발현을 확인하였다. 비강내 경로로 PEI/pci-S 나노입자로 면역성이 부여된 마우스는 폐 점액 중 혈청 및 점막 분비 IgA에서 pci-S 단독으로 처리한 마우스 보다 유의적으로(P<0.05) 높은 S-특이적 IgG1을 생산하였고, 주요 IgG 하위군은 IgG1이었다.
비강 SARS-CoV S DNA 및 PEI로 처리된 마우스 유래 폐 중의 B220+ 세포는 SARS 단백질을 이용한 in vitro 재자극 후 유의적인 증식 반응을 나타내었다. 증가된 B220+ 세포 수가 pci-S 단독으로 자극된 마우스에서와 비교할 때 PEI/pci-S 예방 접종된 마우스에서 발견되었다.
Co-자극성 분자(CD80 및 CD86) 및 II 군 주요 조직 적합 유전자 복합체(Major histocompatibility complex; MHC) 분자들(I-Ad)이 예방접종 후 폐 수지상세포(CD11c+) 상에서 증가하였다. Co-자극성(CD80, CD86) 및 MHC II 군 분자들(I-Ad)이 in vivo에서 PEI/ pci-S 처리로 증가하였다. IFN-gamma, TNF-alpha, 및 IL-2 생산 세포의 비율 또한 pci-S 또는 pci-mock 처리 마우스에서 보다 PEI/pci-S 예방접종 마우스에서 보다 높았다.
SARS-CoV는 TNF-α (단일) 뿐만 아니라 TNF-α 및 IL-2 (이중)의 탁월한 생산능을 갖는 T세포를 포함한 사이토카인-생산 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 유발시켰다. SARS-CoV S DNA 백신 및 점막보조제로서 PEI을 사용한 비강내 면역화가 SARS CoV S-특이적 체액성 및 점막성 항체 반응을 유발시켰다. SARS CoV DNA 단독에서와 비교할 때 SARS-CoV DNA 백신과 PEI 군의 조합에서 MHC II 군 및 공동자극성 분자의 발현이 상향조절되었다.
이러한 결과는 PEI/pci-S를 사용한 면역화가 항원 특이적 체액성 및 세포성 면역 반응을 유발시킨다는 사실을 나타내었다.
본 발명에 따른 PEI/pci-S 나노입자 복합체는 pci-S를 세포내로 효과적으로 전달함으로써, in vitro에서 이들로 처리된 세포들이 S 단백질을 발현시킬 수 있음을 확인되었고, 이를 사용한 비강내 면역화가 SARS CoV S-특이적 체액성 및 점막성 항체 반응을 유발시켰으며, 이들로 처리된 마우스 유래 폐 중의 B220+ 세포는 SARS 단백질을 이용한 in vitro 재자극 후 유의적인 증식 반응을 나타내었고, MHC II 군 및 공동자극성 분자의 발현이 상향조절되었고, TNF-α (단일) 뿐만 아니라 TNF-α 및 IL-2 (이중)의 탁월한 생산능을 갖는 T세포를 포함한 사이토카인-생산 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 유발시키는 효과가 있다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시 예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: SARS 바이러스 백신으로 스파이크 단백질을 발현하는 DNA 백신 제조
본 실시예에서는 SARS 바이러스에 대한 백신 후보자로서 당단백질인 스파이크 단백질을 발현하는 DNA 백신을 제조하기 위하여, 트랜스멤브레인 도메인(아미노산 14-1154) 없이 SARS CoV 스파이크(S) 단백질을 코딩하는 유전자(psi-S)를 합성하였다, 서열은 포유류 세포 발현에 대하여 최적화된 코돈이었고, 자연 신호 서열(natural signal sequence)을 S 단백질의 발현을 증가시키는 리더인 인체 조직 플라스미노겐 활성자(tissue plasminogen activator; tPA)로 교체하였다(도 2A 참조).
실시예 2 : PEI/pci-S 나노입자 복합체의 제조
상기 실시예 1에서 합성한 SARS 바이러스 DNA 백신을 효율적으로 전달시키기 위하여 DNA 백신과 PEI의 복합체를 제조하였다. pci-S 유전자 DNA 용액을 N/P 비율 10으로 폴리에틸렌이민(PEI) 중합체 용액과 혼합하여 PEI/pci-S 나노입자 복합체를 제조하였다. 90 산란 고리 각으로 전기영동 광 산란 분광광도계(electrophoretic light scattering spectrophotometer)(ELS8000, Otsuka Electronice, Osaka, Japan)를 이용하여 상기 나노입자 복합체의 입도를 측정하였다. 에너지-필터링 투과 전자 현미경(energy-filtering transmission electron microscopy (EF-TEM) (LIBRA 120, Carl Zeiss, Germany)으로 PEI/pci-S 나노입자 복합체의 형태를 관찰하였다(도 1 참조).
형태 관찰 결과, PEI/pci-S 나노입자 복합체의 형성이 입증되었다. EF-TEM 이미지는 PEI/pci-S 나노입자 복합체의 입도분포가 예상한 바와 같이 N/P 비 약 10이었다는 사실을 보여주었다. 상기 나노입자 복합체는 EF-TEM 이미지로부터 관찰한 바와 같이 구형이며, 200 nm 크기에 근접하였다.
실시예 3 : 세포 흡수
상기 실시예 2에서 제조한 PEI/pci-S 나노입자 복합체가 세포 내로 잘 전달되는 지 여부에 대한 조사로서 세포 흡수를 관찰하였다. pci-S DNA를 공급자의 지시에 따라 Lable IT(상표명) TrackerTM CX-로다민 키트를 이용하여 로다민으로 표지하였다. 세포 흡수 이미지를 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope)(Carl Zeiss-LSM510)으로 관찰하였다. 그 결과 도 2B에 나타낸 바와 같이, PEI/pci-S 나노입자 복합체가 사스 DNA 백신인 pci-S 유전자를 세포 내로 잘 전달시킴을 확인하였다.
실시예 4 : RAW 264.7 세포에서 SARS-CoV S 유전자 및 단백질의 발현
RAW 264.7 세포에서 각각 전사 수준 및 단백질 수준으로 SARS-CoV S 단백질의 발현을 관찰하였다,
웨스턴 블롯 분석으로 in vitro에서 PEI/pci-S 나노입자 복합체로 처리된 세포들이 S 단백질을 발현시킬 수 있음을 확인하였다.
도 2C 및 2D에 나타낸 바와 같이, RAW 264.7 세포에서 SARS-CoV S 유전자의 RNA 수준(도 2C)과 단백질 수준(도 2D)에서 발현이 잘 됨을 확인하였다.
실시예 5 : 마우스의 면역화 및 항체 형성 조사
6- 내지 8-주령 암컷 BALB/c 마우스(Orient, Korea)를 케타민(Yuhan corporation, Seoul, Korea) 복강내주사로 마취시켰다. 그룹 당 다섯 마리의 마우스를 0, 14, 28, 및 42일 째.에 순수 총 25 uL 중 pci-mock, pci-S, 또는 PEI/pci- S 나노입자 복합체 20ug으로 비강을 통해 면역화시켰다.
효소 면역 측정법(enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)으로 SARS CoV S-특이적 항체 반응을 측정하였다. 마이크로타이터 플레이트(Nunc, Denmark)를 50 mM 중탄산나트륨 완충액(pH 9.6)중에서 2 mg/mL로 S 단백질(Protein Sciences Corporation, Meriden, CT) 100 μL로 코팅하고, 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 플레이트를 PBS로 세척하고, 실온에서 1 시간 동안 PBS 중에서 5% 탈지유로 블록킹시켰다. 폐 점액(희석하지 않음)을 제외하고 혈청(1:20) 또는 점막 시료(1:2)를 상기 블록킹 완충액으로 희석하였다. 시료 100 μL를 각 웰에 도말하고 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 기질 TMB 용액 100 μL로 암중에서 20 분 동안 색상을 발현시켰다. 450 nm에서의 흡수능을 마이크로플레이트 리더기(Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA)에서 측정하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 PEI/pci-S 나노입자 복합체로 면역화시킨 마우스의 혈청에서 항원 특히 IgG 아형(subtype)(도 3A)과 폐 점액에서 항원 특이 IgG(도 3B)가 유도되었다.
실시예 6 : B 세포 증식 여부 조사
DNA 백신과 PEI의 복합체로 면역시킨 위의 비장에서 단일세포를 분리하여 항원으로 재자극을 가했을 때 이에 대한 반응으로 B 세포가 증식되는 지를 알아보기 위하여, BALB/c 마우스를 0, 14, 28 및 42 일째 pci-mock, pci-S, 또는 PEI/pci-S 나노입자 복합체로 면역화시켰다. 최종 예방접종 후 7일 째에 마우스를 살처분하 였다. 비장세포를 CFSE로 표지하고, SARS-S 단백질 2 mg/mL로 5일 동안 자극하였다. B 세포를 B220 (BD Biosciences)으로 염색하였다. CellQuest (BD Biosciences)을 이용하는 FACScalibur로 증식도를 검출하였다. FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA)를 이용하여 모든 세포측정 데이터를 분석하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 PEI/pci-S 나노입자 복합체로 면역화시킨 마우스에서 두 배 이상의 B 세포가 증식되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 7 : in vivo DC 성숙
면역반응을 유도하는데 있어 중요한 수지상 세포가 활성화되어 있는지를 확인하기 위하여, BALB/c 마우스를 0 및 14일 째 pci-mock, pci-S, 또는 PEI/pci-S 나노입자 복합체로 면역화시켰다. 최종 예방접종 후 3일 째에 경부 림프절(Cervical lymph nodes; CLN)을 면역화 마우스로부터 제거하였다. 세포를 CFSE로 표지하고, 5일 동안 SARS-S 단백질 2 mg/mL로 자극하였다. 세포를 CD11c 및 CD80, CD83, CD86, 또는 I-Ad로 염색하고, CellQuest (BD Biosciences)을 이용하는 FACScalibur로 발현도를 검출하였다. FlowJo (Tree Star, San Carlos, CA)를 이용하여 모든 세포측정 데이터를 분석하였다. 데이터는 MFI (평균 형광강도; mean fluorescence intensity)로 표현하였다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 보조자극분자인 CD80, CD86과 주조직적 복합체II(MHC class II)인 I-Ad의 발현정도가 PEI/pci-S 나노입자 복합체로 면역화시킨 마 우스에서 대조군에 비해 현저히 증가하였음을 확인하였다.
실시예 9 : 세포 내 사이토카인 염색
면역된 마우스의 폐에서 단일 세포를 분리하여 유세포분석기를 이용하여 T 세포에서 면역반응을 유도하는데 있어서 중요한 여러 가지 사이토카인의 분비 정도를 측정하기 위하여, 최종 예방접종 후 7일 째 마우스에서 폐를 수집하였다. 세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 2 x 105 세포로 식재하고, SARS로 5 μg/mL로 16 시간 동안 재자극하였다. 단백질 운반 저해제인 GolgiPlug (BD Biosciences)를 가하여 세포질에 사이토카인을 집적시키고, 6 시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 제조자의 지시에 따라 BD Cytofix/cytoperm 키트(BD Biosciences)에 통과시켰다. 세포를 항-CD4, CD8, IFN-gamma, IL-17, TNF-alpha, 및 IL-2 (BD Biosciences)로 염색하였다. FACS 캘리버를 이용하여 세포 관련 형광도의 수준을 측정하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 PEI/pci-S 나노입자 복합체로 면역화시킨 마우스에서 사이토카인을 분비하는 세포가 현저하게 증가된 것을 확인하였다.
도 1은 SARS-CoV S DNA 백신-PEI 나노입자 복합체의 특성화 결과를 나타낸 도로서, (A) N/P 비 10에서 PEI/pci-S 나노입자 복합체의 투과 전자 현미경 사진이며, (B)는 N/P 비 10에서 제조된 복합체의 입도 분포를 나타낸 그래프이다.
도 2A는 SARS 바이러스 백신 후보자로 당단백질인 스파이크 단백질을 발현하는 DNA 백신을 나타낸 도이고, 2B는 DNA 백신-PEI 나노입자복합체의 세포내 DNA백신 전달 결과를 나타낸 도이며, 2C는 RNA 수준을 나타낸 도이고, 2D는 단백질 수준을 나타난 도이다.
도 3은 DNA 백신-PEI 나노입자복합체로 쥐에 면역시킨 후, 항체 형성을 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 DNA 백신-PEI 나노입자 복합체로 면역시킨 위의 비장에서 단일세포를 분리하여 항원으로 재자극을 가했을 때 이에 대한 반응으로 B 세포가 증식되는 지를 유세포분석기를 이용하여 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 면역반응을 유도하는데 있어 중요한 수지상 세포가 활성화되어 있는지를 확인하기 위하여 유세포 분석기를 이용하여 다양한 활성인자를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 면역된 쥐의 폐에서 단일 세포를 분리하여 유세포분석기를 이용하여 T 세포에서 면역반응을 유도하는데 있어서 중요한 여러 가지 사이토카인의 분비 정도를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

Claims (3)

  1. 중증 급성 호흡기 증후군(severe acute respiratory syndrome; SARS) 코로나바이러스(coronavirus; CoV)(SARS-CoV)에서 스파이크 단백질을 발현시키는 DNA 백신 pci-S 유전자 DNA용액을 N/P비율 10으로 폴리에틸렌이민(PEI) 중합체 용액과 혼합하여 194.7±99.3nm크기의 구형 PEI/Pci-S 나노입자 복합체인 것을 특징으로 하는 SARS 백신 나노입자전달체.
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