CN117327170B - 一种类人胶原蛋白制备方法及其在化妆品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种类人胶原蛋白制备方法及其在化妆品中的应用。本发明首次提供了一种类人胶原蛋白，其能有效促进成纤维细胞增殖活性，具备润滑角质层，修护砖墙结构，促进上皮细胞及成纤维细胞增长。本发明的类人胶原蛋白能够很好的促进成纤维细胞生成Elastin，增加皮肤紧密度，令皮肤紧致，赋予弹性嫩滑。本发明的类人胶原蛋白具有保护肌肤涵水屏障，改善肌肤微环境，滋润清透不粘腻。呵护肌肤屏障，抗微生物及酶，调节细胞生长微环境，抵御外界刺激。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白技术领域，更具体地，涉及一种类人胶原蛋白制备方法及其在化妆品中的应用。
背景技术
胶原蛋白最主要的基本结构单位是原胶原，是由三条相互缠绕的a链的多肽链组成的三重螺旋结构，长度大约为1000个氨基酸残基，该结构是所有胶原蛋白的典型特征结构，胶原蛋白含有包括人体生长所必须的七种氨基酸在内的二十多种氨基酸。胶原蛋白因其具有独特的结构特征，良好的物理性能、生物降解性和生物相容性，在医药、食品、化妆品、组织工程和材料工程等领域有广泛应用。
目前胶原蛋白主要从动物组织中提取和利用基因工程改造的微生物菌株表达两种途径获得。前者由于天然胶原蛋白由多种不同分子量的胶原蛋白组成的混合物，结构多样，不能溶于水，可加工性较弱，限制了许多开发用途。天然胶原蛋白主要来源于动物源的胶原蛋白，对动物源疾病或者人传染病有交叉传染的危险。异体来源的胶原蛋白会产生异体排斥反应，使胶原蛋白在人体中应用存在困难。原料短缺，随着人们对健康和美容的要求越来越高，动物来源的胶原蛋白远远不能满足人们日常需要。后者通常是采用大肠杆菌作为表达宿主进行异源表达，但是其表达量会受到限制，无论是胞内表达还是分泌到胞外表达，其蛋白组分复杂，纯化过程较久。因此如何保证纯化过程的快速，减少纯化步骤和总时长，对于维持胶原蛋白结构的完整性很重要，同时更容易满足工业需求。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种类人胶原蛋白制备方法及其在化妆品中的应用。所述类人胶原蛋白具备润滑角质层，修护砖墙结构，促进上皮细胞及成纤维细胞增长，增加皮肤紧密度，令皮肤紧致，赋予弹性嫩滑，保护肌肤涵水屏障，改善肌肤微环境，滋润清透不粘腻。呵护肌肤屏障，抗微生物及酶，调节细胞生长微环境，抵御外界刺激。
具体而言，本发明提供了一种类人胶原蛋白，其特征在于，类人胶原蛋白单体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述编码所述类人胶原蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，本发明还提供了一种包含所述的类人胶原蛋白编码基因的重组表达载体。
进一步地，本发明还提供了一种包含所述的类人胶原蛋白编码基因的重组菌株。
进一步地，本发明还提供了一种制备所述类人胶原蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤，
1)构建包括编码所述类人胶原蛋白的基因的重组表达载体；
2)将获得的重组表达载体导入宿主细胞，并诱导培养；
3)分离纯化获得重组人源胶原蛋白。
优选地，步骤1)中编码所述类人胶原蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步优选地，步骤1)合成的编码所述类人胶原蛋白的基因通过酶切连接方式克隆至质粒pUC57，构建成重组质粒形式，并通过酶切电泳鉴定；
进一步优选地，步骤2)是通过电击转化方式导入宿主细胞。
进一步优选地，步骤2)中的宿主细胞包括酿酒酵母、毕赤酵母等。
进一步优选地，步骤2)中还包括通过菌落PCR筛选重组酿酒酵母，并结合测序分析进行鉴定的步骤。
进一步优选地，步骤2)中的诱导培养为摇瓶发酵培养，发酵培养条件为：挑选单菌落接种于诱导发酵培养基进行摇瓶培养，培养条件为30℃、200rpm震荡72h。
进一步优选地，所述诱导发酵培养基为蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油20g/L，K2HPO43 g/L,KH2PO412g/L、甲醇10g/L，生物素5×10-4g/L，采用去离子水配制而成。
进一步优选地，步骤3)包括收集发酵液，经硫酸铵盐析沉淀提取类人胶原蛋白，再利用透析袋进行过滤透析去除残留硫酸铵盐，纯化得到类人胶原蛋白，最后经冷冻干燥机冻干，备用。
进一步地，本发明还提供了上述类人胶原蛋白在制备皮肤抗皱、紧致、修复、保湿产品中的用途。
优选地，所述产品包括化妆品。
本发明的优点如下：本发明首次提供了一种类人胶原蛋白，其能有效促进成纤维细胞增殖活性，具备润滑角质层，修护砖墙结构，促进上皮细胞及成纤维细胞增长。本发明的类人胶原蛋白能够很好的促进成纤维细胞生成Elastin，增加皮肤紧密度，令皮肤紧致，赋予弹性嫩滑。本发明的类人胶原蛋白具有保护肌肤涵水屏障，改善肌肤微环境，滋润清透不粘腻。呵护肌肤屏障，抗微生物及酶，调节细胞生长微环境，抵御外界刺激。
附图说明
图1是本发明所述类人胶原蛋白对成纤维细胞的增殖分析；
图2是本发明所述类人胶原蛋白对成纤维细胞Elastin含量分析；
图3是本发明所述类人胶原蛋白对3D表皮模型组织形态学结构变化；
图4是本发明所述类人胶原蛋白对3D表皮模型FLG含量分析；
图5是本发明所述类人胶原蛋白对3D表皮模型皮肤含水含测试。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1类人胶原蛋白
类人胶原蛋白活性单体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示，其来源于GenBank:BAA04809.1，经过计算机模拟分析可知，该活性单体具能在酿酒酵母中可折叠成局部螺旋结构，保留其原有活性。为便于重组表达，对该活性单体的密码子进行优化，经优化后的编码序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2类人胶原蛋白的制备方法
类人胶原蛋白的制备方法，其包括如下步骤：
1)人工合成经密码子优化的编码序列SEQ ID NO.2；
2)将步骤1)合成的编码序列通过酶切连接方式克隆至质粒pUC57，构建成重组质粒形式，并通过酶切电泳鉴定；
3)将步骤2)鉴定的重组质粒通过电击转化方式导致酿酒酵母；
4)通过菌落PCR筛选重组酿酒酵母，并结合测序分析进行鉴定；
5)将步骤4)中的重组酿酒酵母进行药瓶发酵培养，发酵培养条件为：挑选单菌落接种于诱导发酵培养基进行摇瓶培养，培养条件为30℃、200rpm震荡72h；其中所述诱导发酵培养基为蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油20g/L，K2HPO43 g/L,KH2PO412g/L、甲醇10g/L，生物素5×10-4g/L，采用去离子水配制而成；
6)收集步骤5)的发酵液，经硫酸铵盐析沉淀提取类人胶原蛋白，再利用透析袋进行过滤透析去除残留硫酸铵盐，纯化得到类人胶原蛋白，最后经冷冻干燥机冻干，备用。
实施例3类人胶原蛋白的皮肤抗皱测试
采用MTT细胞增殖检测试剂盒(型号M1020，购自北京百奥创新科技有限公司)检测实施例2制备得到的类人胶原蛋白对成纤维细胞HFF-1(货号ZB063，购自上海致备生物科技有限公司)的增殖影响。具体检测步骤可根据试剂盒说明书进行常规调整，其中，空白组为DMEM完全培养基，实验组含有10ng/mL实施例2类人胶原蛋白的DMEM完全培养基，阳性对照组为100ng/mL TGF-β1的DMEM完全培养基。各组中的细胞用量均在5×103个。
检测结果如图1所示，10ng/mL类人胶原蛋白可以有效促进成纤维细胞的增殖，在给药24h、48h和72h后对成纤维细胞均表现出细胞活力增长趋势，证实本发明的类人胶原蛋白具备润滑角质层，修护砖墙结构，促进上皮细胞及成纤维细胞增长。
实施例4类人胶原蛋白的皮肤紧致测试
采用Elastin ELISA试剂盒(Human Elastin ELISA Kit，Abcam公司)操作说明书进行检测分析实施例2制备得到的类人胶原蛋白对成纤维细胞HFF-1(货号ZB063，购自上海致备生物科技有限公司)的Elastin含量影响，Elastin含量结果表示为Mean±SD。具体检测步骤可根据试剂盒说明书进行常规调整，其中，空白组为DMEM完全培养基，实验组含有10ng/mL实施例2类人胶原蛋白的DMEM完全培养基，阳性对照组为100ng/mL TGF-β1的DMEM完全培养基。各组中的细胞用量均在5×103个。
由图2可知，与空白组相比，经类人胶原蛋白作用后，成纤维细胞Elastin含量提高至1590.78±45pg/mL。说明类人胶原蛋白能够很好的促进成纤维细胞生成Elastin，增加皮肤紧密度，令皮肤紧致，赋予弹性嫩滑。
实施例5类人胶原蛋白的3D表皮模型测试
通过3D表皮皮肤模型(，批号：ES221203，由广东博溪生物科技有限公司提供)分析实施例2制备得到的类人胶原蛋白修复皮肤屏障的能力。采用典型的表面活性剂十二烷基硫酸钠(SLS)刺激3D皮肤模型/>模拟人体斑贴实验构建“SLS-Epikutis”皮肤屏障损伤模型。同时采用表面给药的方式，将样品模拟人体使用过程，均匀涂布于实验构建的“SLS-Epikutis”皮肤损伤模型表面，通过检测组织形态学结构变化、FLG含量、皮肤含水含测试，评估待测原料的屏障损伤修复功效。
结果如图3所示，空白组表皮模型角质层疏松增厚，活细胞层数量减少，说明SLS刺激条件有效。与空白组相比，阳性对照组活细胞层受损情况明显改善，角质层疏松增厚现象也有一定改善，说明本次检测体系有效。与空白组相比，10ng/mL类人胶原蛋白活细胞层受损情况得到明显改善，角质层疏松增厚现象也有一定改善。通过图4可知，10ng/mL类人胶原蛋白可以明显提升FLG蛋白含量；通过图5可知，与空白组相比，10ng/mL类人胶原蛋白皮肤含水量显著上升，提升率为277.92％。通过以上实施例的测试结果可知，本发明的类人胶原蛋白具有保护肌肤涵水屏障，改善肌肤微环境，滋润清透不粘腻。呵护肌肤屏障，抗微生物及酶，调节细胞生长微环境，抵御外界刺激。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一种类人胶原蛋白，其特征在于，类人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2. 如权利要求1所述的类人胶原蛋白，其特征在于，编码所述类人胶原蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种包含权利要求1或2任一项所述的类人胶原蛋白编码基因的重组表达载体。
4.一种包含权利要求1或2任一项所述的类人胶原蛋白编码基因的重组菌株。
5.一种制备权利要求1或2任一项所述类人胶原蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤，
1）构建包括编码所述类人胶原蛋白的基因的重组表达载体；
2）将获得的重组表达载体导入宿主细胞，并诱导培养；
3）分离纯化获得重组人源胶原蛋白。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1）中编码所述类人胶原蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1）合成的编码所述类人胶原蛋白的基因通过酶切连接方式克隆至质粒pUC57，构建成重组质粒形式，并通过酶切电泳鉴定。
8. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2）中的诱导培养为摇瓶发酵培养，发酵培养条件为：挑选单菌落接种于诱导发酵培养基进行摇瓶培养，培养条件为30℃、200 rpm震荡72h。
9. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导发酵培养基为蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，甘油20g/L，K2HPO4 3 g/L, KH2PO4 12g/L、甲醇10g/ L，生物素5×10-4g/L，采用去离子水配制而成。
10.权利要求1或2任一项类人胶原蛋白在制备皮肤抗皱、紧致、修复、保湿产品中的用途。
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| CN112980865A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-06-18 | 可孚医疗科技股份有限公司 | 一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN102146135A (zh) * | 2010-12-23 | 2011-08-10 | 陕西九州生物医药科技园发展有限公司 | 一种重组类人胶原蛋白及其生产方法 |
| CN104098701A (zh) * | 2014-07-23 | 2014-10-15 | 广州市暨鹏生物科技有限公司 | 重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白及其制备方法与应用 |
| CN112745394A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-05-04 | 肽源（广州）生物科技有限公司 | 一种重组类人胶原蛋白及其制备方法和应用 |
| CN112980865A (zh) * | 2021-03-22 | 2021-06-18 | 可孚医疗科技股份有限公司 | 一种重组类人胶原蛋白工程菌的构建方法 |
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