CN115737472B - 含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物及制备方法 - Google Patents
含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物及制备方法，按质量百分比计，原料包括：重组胶原蛋白0.01％~0.2％，海藻糖0.02％~2％，棕榈酰五肽‑4 3％~8％，棕榈酰三肽‑10.05％~2％，乙酰基六肽‑81％~5％，乙酰基八肽‑30.005％~0.05％，精氨酸0.001％~0.01％，乙酰基六肽‑10.01％~0.2％，泛醇0.05％~2％，透明质酸钠0.01％~0.5％，对羟基苯乙酮0.05％~1％，1，2‑己二醇0.05％~1％，甘油0.5％~5％，丁二醇0.5％~6％，余量为水。本发明组合物协同可以调控肌细胞和神经细胞，共同起到舒缓肌肉，快速减轻、消除面部动态皱纹的目的。
Description
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体地，本发明涉及含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物及制备方法。
背景技术
从组织学上分析，衰老的本质是皮肤内胶原蛋白的流逝，皮肤组织弹力网破裂，萎缩、塌陷，外在表现为皮肤会出现干燥、粗糙、松弛、皱纹毛孔粗大暗淡等衰老现象。尤其是III型胶原蛋白，只有骨髓来源干细胞分化的成纤维细胞才能重新合成Ⅲ型胶原蛋白，而真皮自身的成纤维细胞只能合成Ⅰ型胶原蛋白不能合成Ⅲ型胶原，Ⅲ型胶与皮肤的细腻紧致、弹性光滑有密切相关，III型胶原一旦流逝就得不到充分的补充，这也解释了随着年龄的增长，成年人的皮肤逐渐不如婴幼儿皮肤中那样光滑细腻有弹性的原因。
表情纹或动态性皱纹是面部较早出现的一类皱纹，微观上皮肤组织密度降低，弹性蛋白减少、功能缺失，宏观表现为皮肤松弛，支撑能力下降，再加上面部习惯性动作，固定、反复牵拉收缩某些肌肉组织，当肌肉松弛后，该类周围减轻或消失，故称之为表情纹，这不仅影响皮肤的外观与功能，还有可能影响人们的心理、生活和工作。如何快速减缓或消除皱纹成为爱美者受到爱美者的广泛关注。及时补充胶原蛋白，并舒缓表情肌是快速舒缓皱纹的根本所在。
胶原蛋白由多种氨基酸组成，是组成皮肤的主要成分，维持皮肤完整和弹性。胶原蛋白具有广泛的生物活性和较好的生物相容性，如可通过影响细胞膜、增强细胞内外物质传递，从而影响细胞贴壁功能，参与调节细胞迁移、分化、繁殖等生理过程，基于胶原蛋白良好的生物相容性，胶原蛋白在烧烫伤、组织修复、药物递送等医疗领域和美容护肤、整形填充等美容领域都有广泛应用。
传统的胶原蛋白来源是通过酸、碱、酶解法从动物组织(如牛、猪)中提取，虽工艺日趋成熟，但因材料本身的来源等原因存在一些缺陷，首先，动物源胶原有携带病毒、人蓄共患疾病风险有关，如TSE(传染性海绵状脑病)、BSE(牛海绵状脑病)、FMD(口蹄疫)；其次，动物胶原蛋白提取难度高、时间长、成本高、成分复杂，由于个体差异而引起的批间差异大；最后，动物来源的胶原蛋白难溶于水或中性液体，尤其不利于制备成水、乳、膏等形式的美容护肤品。
重组人源胶原蛋白的制备是利用基因工程技术，以人胶原原始基因序列为模板，经过优化修饰重组表达得到与人胶原蛋白高度一致具有高生物相容性、高活性的重组人源胶原蛋白。目前，随着对重组胶原的研究，已经在利用细菌、真菌、昆虫和哺乳动物、植物等多种方法进行制备重组人源胶原蛋白的制备，如将人的基因植入到小鼠乳腺细胞中，通过乳汁分泌获取人胶原蛋白，但哺乳动物、植物生长周期长、表达量低，后期处理复杂，不利于产业化发展，随着发酵技术的进步，以细菌、真菌作为表达载体的技术日趋成熟，目前市场的出现的重组胶原蛋白多是通过微生物发酵、分离、纯化制备的。
经过重组制备的胶原成分单一、纯度高、水溶性和生物相容性好、无病毒隐患、免疫原性更低、水溶性更佳、更利于、运输和储存等多种优势，是一种相对更安全、更适合美丽与健康产品的材料，在生物医学、组织工程、美容保健等领域的应用具有巨大潜力。目前多类文献报道了将重组胶原蛋白作为生物医用材料(口腔科、普外科、皮肤科、整形科、眼科等)、专业皮肤护理材料(滋养皮肤、延缓衰老、美容消皱等)等用于医疗、美容场景。
重组胶原蛋白在其具备优势的同时，也存在一些问题，目前市场上能提供含有重组胶原蛋白的产品厂家还不是很多，且产品多存在重组胶原蛋白不稳定，在货架放置时间就已经降解失去结构完整性，从而影响重组胶原蛋白的生物功能。此外且市场上以重组III型胶原蛋白为主的除皱类产品，不论是注射形式的或者外用，都是需要按照疗程注射或使用一段时间后才能有效果，且多数是针对静态纹，很少有能达到即时减少减轻表情纹的效果。
有鉴于此，提供一种性能稳定、即时减少减轻表情纹功效优异的含有重组胶原蛋白的护肤组合物变得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种性能稳定、即时减少减轻表情纹功效优异的含有重组胶原蛋白的组合物，并提供其制备方法。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明一方面提供了一种含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物，按质量百分比计，原料包括：
重组胶原蛋白0.01％～0.2％，
海藻糖0.02％～2％，
棕榈酰五肽-4 3％～8％，
棕榈酰三肽-1 0.05％～2％，
乙酰基六肽-8 1％～5％，
乙酰基八肽-3 0.005％～0.05％，
精氨酸0.001％～0.01％，
乙酰基六肽-1 0.01％～0.2％，
泛醇0.05％～2％，
透明质酸钠0.01％～0.5％，
对羟基苯乙酮0.05％～1％，
1，2-己二醇0.05％～1％，
甘油0.5％～5％，
丁二醇0.5％～6％
余量为水。
作为本发明的一些优选实施方案，所述重组胶原蛋白的分子量为30kDa～100kDa；所述透明质酸钠的分子量为50KDa～250KDa。
作为本发明的一些优选实施方案，所述重组胶原蛋白采用基因重组技术及微生物发酵法获得。
本发明另一方面提供了一种上述含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的制备方法，具体包括制备溶媒的步骤和制备冻干固体的步骤。
作为本发明的一些优选实施方案，所述冻干固体的制备方法包括如下步骤：
①将对羟基苯乙酮加入80℃的热水中搅拌，得到对羟基苯乙酮溶液；
②步骤①中的对羟基苯乙酮溶液降温至40℃以下将1，2-己二醇加入搅拌，得到混合液体a1；
③将海藻糖加入上步骤②混合液体a1中搅拌，得到混合液体a2；
④将重组胶原蛋白加入步骤③混合液体a2中搅拌，得到预冻干液；
⑤将预冻干液进行冻干，即可得到冻干固体；
冻干条件：-20℃预冻4～8小时，然后在-40℃～-55℃预冻3～6h，一次干燥时间10～15h，一次干燥温度-32℃，解析干燥温度为20℃～25℃，解析干燥时间是60h～90h。
作为本发明的一些优选实施方案，所述溶媒的制备方法如下：
A、甘油、丁二醇混合，搅拌，得到相a；
B、透明质酸钠加入水中，加热至60℃～80℃，保温5～10分钟，然后降温至30℃以下，再依次加入棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-1、乙酰基六肽-8、乙酰基八肽-3、乙酰基六肽-1、对羟基苯乙酮，加入后搅拌，得到相b；
C、将相a和相b混合并搅拌，加入泛醇并搅拌，再将精氨酸分2～3次加入，边加入边搅拌，纯化水将余量补足并搅拌，测定pH值在5.5～7.5；将得到的溶液过滤除菌，即得。
作为本发明的一些优选实施方案，所述溶媒的制备方法中，步骤A搅拌速度100转/分～500转/分，搅拌时间是4-10分钟；
步骤C的搅拌速度500转/分～1500转/分，搅拌时间是8-12分钟。
作为本发明的一些优选实施方案，所述步骤B依次加入棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-1、乙酰基六肽-8、乙酰基八肽-3、乙酰基六肽-1、对羟基苯乙酮时，每次加完一种物料后搅拌8-12分钟，再加下一个物料，直至加完，每次加料搅拌速度500转/分～1500转/分。
本发明再一方面提供了一种上述含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物用于即时除皱的用途。
作为本发明的一些优选实施方案，具体方法如下：取出冻干固体加到溶媒中，使其充分溶解，摇晃2-5分钟即可。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明所提供的含有重组胶原蛋白的组合物，包含重组胶原蛋白和多肽类物质，相辅相成，相互协调，不仅能增加真皮层组织的容量，调控肌细胞和神经细胞，共同起到舒缓肌肉，快速减轻、消除面部动态皱纹的功效。其中棕榈酰五肽-4和乙酰基六肽-1的加入，可以协同III型胶原蛋白，快速即时除皱。
冻干品中海藻糖、对羟基苯乙酮、1，2-己二醇作为重组胶原蛋白的稳定剂、赋形剂，三者协同，可保证重组胶原保持结构稳定，在冻干干燥后形态疏松、很容易溶解，不结块，解决了含生物活性成分化妆品不易运输，容易变质、降解，不能长期储存等问题。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1即时除皱液样品与对比例1-4即时除皱液样品24个月稳定性对比电泳图。M-蛋白分子量maker。
图2为实施例1、对比例2、对比例3、对比例4的即时除皱液样品图，其中实施例1、对比例2、对比例3、对比例4的冻干固体加入溶媒，摇晃溶解3分钟，得到的即时除皱液。
图3为对比例8、对比例9、对比例10、对比例11的即时除皱液样品图，其中对比例8、对比例9、对比例10、对比例11的冻干固体加入溶媒，摇晃溶解3分钟，得到的即时除皱液。
图4为实施例1、对比例5、对比例6、对比例7的即时除皱液样品清除自由基功效对比图。
图5为实施例1、对比例5、对比例6、对比例7、某市售产品的即时除皱液样品促进内源性1型胶原蛋白产生的实验电泳图。
图6为实施例1即时除皱液的使用15min后的右侧脸效果前后比对图，左边为使用前，右边为使用后。
图7为实施例1即时除皱液的使用15min后的左侧脸效果前后比对图，左边为使用前，右边为使用后。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对发明进行清楚、完整的描述。
本实施方式中，重组胶原蛋白采用中国专利202011366731.X、名称为“一种重组人III型胶原蛋白及其制备方法和用途”的发明专利中公开的方法制备获得。下述实施例采用的重组胶原蛋白的分子量为30kDa～100kDa；透明质酸钠的分子量为50KDa～250KDa。
实施例1
本实施例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
溶媒的制备方法如下：
A、甘油、丁二醇混合，搅拌，搅拌速度300转/分，搅拌时间是5分钟，得到相a；
B、透明质酸钠加入水中，加热至80℃，保温8分钟，然后降温至30℃以下，再依次加入棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-1、乙酰基六肽-8、乙酰基八肽-3、乙酰基六肽-1、对羟基苯乙酮，加入后搅拌，每次加完一种物料后搅拌10分钟，再加下一个物料，直至加完，每次加料搅拌速度1000转/分，得到相b；
C、将相a和相b混合并搅拌，再加入泛醇并搅拌，再将精氨酸分3次加入，边加入边搅拌，纯化水将余量补足并搅拌，搅拌速度1000转/分，搅拌时间是10分钟，测定pH值为6；将得到的溶液过滤除菌，即得。
冻干固体的制备包括如下步骤：
①将对羟基苯乙酮加入80℃的热水中搅拌均匀至完全溶解，得到对羟基苯乙酮溶液；
②步骤①中的对羟基苯乙酮溶液降温至40℃以下将1，2-己二醇加入搅拌至完全溶解，得到混合液体a1；
③将海藻糖加入上步骤②混合液体a1中搅拌至完全溶解，得到混合液体a2；
④将重组胶原蛋白加入步骤③混合液体a2中搅拌至完全溶解，得到预冻干液；
⑤将预冻干液进行冻干，即可得到冻干固体；所得冻干固体为结构疏松、易于溶解的网状结构。
冻干条件：在-20℃预冻6小时，然后用冻干机在-50℃预冻5h，一次干燥时间12h，一次干燥温度-32℃，解析干燥温度为23℃，解析干燥时间是70h。
将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
实施例2
本实施例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
溶媒的制备方法如下：
A、甘油、丁二醇混合，搅拌，搅拌速度100转/分，搅拌时间是10分钟，得到相a；
B、透明质酸钠加入水中，加热至60℃，保温10分钟，然后降温至30℃以下，再依次加入棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-1、乙酰基六肽-8、乙酰基八肽-3、乙酰基六肽-1、对羟基苯乙酮，加入后搅拌，每次加完一种物料后搅拌12分钟，再加下一个物料，直至加完，每次加料搅拌速度500转/分，得到相b；
C、将相a和相b混合并搅拌，再加入泛醇并搅拌，再将精氨酸分2次加入，边加入边搅拌，纯化水将余量补足并搅拌，搅拌速度1500转/分，搅拌时间是8分钟，测定pH值在5.5～7.5之间；将得到的溶液过滤除菌，即得。
冻干固体的制备包括如下步骤：
①将对羟基苯乙酮加入80℃的热水中搅拌均匀至完全溶解，得到对羟基苯乙酮溶液；
②步骤①中的对羟基苯乙酮溶液降温至40℃以下将1，2-己二醇加入搅拌至完全溶解，得到混合液体a1；
③将海藻糖加入上步骤②混合液体a1中搅拌至完全溶解，得到混合液体a2；
④将重组胶原蛋白加入步骤③混合液体a2中搅拌至完全溶解，得到预冻干液；
⑤将预冻干液进行冻干，即可得到冻干固体；所得冻干固体为结构疏松、易于溶解的网状结构。
冻干条件：在-20℃预冻4小时，然后用冻干机在-55℃预冻3h，一次干燥时间15h，一次干燥温度-32℃，解析干燥温度为20℃，解析干燥时间是90h。
将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
实施例3
本实施例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
溶媒的制备方法如下：
A、甘油、丁二醇混合，搅拌，搅拌速度500转/分，搅拌时间是4分钟，得到相a；
B、透明质酸钠加入水中，加热至70℃，保温5分钟，然后降温至30℃以下，再依次加入棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-1、乙酰基六肽-8、乙酰基八肽-3、乙酰基六肽-1、对羟基苯乙酮，加入后搅拌，每次加完一种物料后搅拌8分钟，再加下一个物料，直至加完，每次加料搅拌速度1500转/分，得到相b；
C、将相a和相b混合并搅拌，再加入泛醇并搅拌，再将精氨酸分3次加入，边加入边搅拌，纯化水将余量补足并搅拌，搅拌速度500转/分，搅拌时间是12分钟，测定pH值在5.5～7.5之间；将得到的溶液过滤除菌，即得。
冻干固体的制备包括如下步骤：
①将对羟基苯乙酮加入80℃的热水中搅拌均匀至完全溶解，得到对羟基苯乙酮溶液；
②步骤①中的对羟基苯乙酮溶液降温至40℃以下将1，2-己二醇加入搅拌至完全溶解，得到混合液体a1；
③将海藻糖加入上步骤②混合液体a1中搅拌至完全溶解，得到混合液体a2；
④将重组胶原蛋白加入步骤③混合液体a2中搅拌至完全溶解，得到预冻干液；
⑤将预冻干液进行冻干，即可得到冻干固体；所得冻干固体为结构疏松、易于溶解的网状结构。
冻干条件：在-20℃预冻8小时，然后用冻干机在-40℃℃预冻6h，一次干燥时间10h，一次干燥温度-32℃，解析干燥温度为25℃，解析干燥时间是60h。
将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
对比例1
同实施例1，不同之处在于，制备方法未将重组胶原蛋白、海藻糖、对羟基苯乙酮、1，2-己二醇冻干。
制备方法如下：
A、甘油、丁二醇混合，搅拌，搅拌速度300转/分，搅拌时间是5分钟，得到相a；
B、透明质酸钠加入水中，加热至80℃，保温8分钟，然后降温至30℃以下，再依次加入棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-1、乙酰基六肽-8、乙酰基八肽-3、乙酰基六肽-1、对羟基苯乙酮，加入后搅拌，每次加完一种物料后搅拌10分钟，再加下一个物料，直至加完，每次加料搅拌速度1000转/分，得到相b；
C、将相a和相b、重组胶原蛋白、海藻糖、对羟基苯乙酮、1，2-己二醇混合并搅拌，再加入泛醇并搅拌，再将精氨酸分2～3次加入，边加入边搅拌，纯化水将余量补足并搅拌，搅拌速度1000转/分，搅拌时间是10分钟，测定pH值在5.5～7.5之间；将得到的溶液过滤除菌，即得，得到即时除皱液。
对比例2
本对比例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
溶媒的制备方法同实施例1。
冻干固体的制备包括如下步骤：
将海藻糖和重组胶原蛋白混合溶解于水中，得到预冻干液；将预冻干液进行冻干，即可得到冻干固体；所得冻干固体为不易溶解的蜂窝状。
冻干条件：在-20℃预冻6小时，然后用冻干机在-50℃预冻5h，一次干燥时间12h，一次干燥温度-32℃，解析干燥温度为23℃，解析干燥时间是70h。
将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
对比例3
本对比例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
溶媒的制备方法同实施例1。
冻干固体的制备包括如下步骤：
①将1，2-己二醇加入40℃以下的水，搅拌至完全溶解，得到混合液体a1；
②将海藻糖加入上步骤①混合液体a1中搅拌至完全溶解，得到混合液体a2；
③将重组胶原蛋白加入步骤②混合液体a2中搅拌至完全溶解，得到预冻干液；
④将预冻干液进行冻干，即可得到冻干固体；所得冻干固体为不易溶解的蜂窝状。
冻干条件：在-20℃预冻6小时，然后用冻干机在-50℃预冻5h，一次干燥时间12h，一次干燥温度-32℃，解析干燥温度为23℃，解析干燥时间是70h。
将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
对比例4
本对比例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
溶媒的制备方法同实施例1。
冻干固体的制备包括如下步骤：
①将对羟基苯乙酮加入80℃的热水中搅拌均匀至完全溶解，得到对羟基苯乙酮溶液；
②步骤①中的对羟基苯乙酮溶液降温至40℃以下将海藻糖加入搅拌至完全溶解，得到混合液体a1；
③将重组胶原蛋白加入步骤②混合液体a2中搅拌至完全溶解，得到预冻干液；
④将预冻干液进行冻干，即可得到冻干固体；所得冻干固体为不易溶解的蜂窝状。
冻干条件：在-20℃预冻6小时，然后用冻干机在-50℃预冻5h，一次干燥时间12h，一次干燥温度-32℃，解析干燥时间为23℃，解析干燥时间是70h。
将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
对比例5
本对比例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
溶媒和冻干固体的制备方法同实施例1。将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
对比例6
本对比例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
/>
溶媒和冻干固体的制备方法同实施例1。将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
对比例7
本对比例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
溶媒和冻干固体的制备方法同实施例1。将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
对比例8
本对比例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
制备方法同实施例1。所得冻干固体为不易溶解的蜂窝状。将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
对比例9
本对比例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
制备方法同实施例1。所得冻干固体为不易溶解的蜂窝状。将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
对比例10
本对比例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
/>
制备方法同实施例1。所得冻干固体为不易溶解的蜂窝状。将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
对比例11
本对比例的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的组成如下(％表示质量百分比)：
/>
制备方法同实施例1。所得冻干固体为不易溶解的蜂窝状或粉状。将冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
考察例1稳定性实验
实验样品：将实施例1和对比例2-4制备得到的冻干固体放置24个月后，加入到溶媒中，摇晃3分钟，配制成即时除皱液；将对比例1制备得到的即时除皱液放置24个月；
然后将实施例1和对比例1-4的即时除皱液进行稳定性实验，包括：电泳分析、灰度、蛋白量、降解率的试验，电泳分析稳定性结果见图1，灰度、蛋白量、降解率的具体结果见表1所示。
由图1，可见实施例1得到的即时除皱液稳定性明显优于对比例1-4。
其中蛋白含量测定方法：用灭菌注射用水将供试品稀释成1mg/mL后，精密称取样品10ul，按照《中华人民共和国药典》(2020年版)四部(0541电泳法第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE法))规定的方法进行。
表1
| 样品 | 灰度 | 蛋白量/ug | 降解率 |
| 实施例1 | 100143 | 5.755 | 8.6％ |
| 对比例4 | 39206 | 0.402 | 64.21％ |
| 对比例3 | 45609 | 0.505 | 58.37％ |
| 对比例2 | 1320 | 0.002 | 98.8％ |
| 对比例1 | 1007 | 0.000 | 99.1％ |
考察例2溶解性实验
实验样品：现用现配，实施例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例8、对比例9、对比例10、对比例11的冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。
由图2可知，实施例1样品可完全溶解形成清澈透明的液体，对比例2和对比例3样品有不溶解颗粒物，对比例4样品管底有白色絮状物；由图3可知，对比例8和对比例10样品管底有白色絮状物，对比例9样品有白色未溶解晶体，对比例11样品有一层白色薄膜状未溶解物。
考察例3安全性评价
送某省药品医疗器械检验研究院检验，报告编号HBQX202202349。对实施例1样品进行细胞毒性试验、皮肤致敏试验，结果如下：
细胞毒性试验：检验结果为在3mg/ml的浓度下，细胞存活率110％；在4mg/ml的浓度下，细胞存活率99％；合格。
皮肤致敏试验：检验结果为敷贴试验反应0级，合格。
考察例4功效评价
1、清除自由基功效评价
实验样品：现用现配，分别将实施例1和对比例5-7制备得到的冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，配制成即时除皱液。
自由基具有极强的氧化能力，是引起皮肤损伤的重要因素之一，在皮肤外观上表现为老化，皱纹等。当试验样品有自由基清除剂存在时，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)试剂(一种稳定的长寿命自由基)光吸收减弱。根据这个原理，常用DPPH评价化妆品清除自由基的能力。结果见图4。
结果显示，与对比例5-7组样品相比，实施例1组样品清除自由基效率更高，更有利于抵抗组织氧化。
2、促进内源性1型胶原蛋白产生实验
实验样品：现用现配，分别将实施例1和对比例5-7制备得到的冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，配制成即时除皱液。
以SD大鼠为动物模型，动物背部皮肤脱毛后在UVA(315～400nm，峰值360nm)、UVB(280～315nm)光源下照射20分钟/次，3次/周，共照射14周制备动物皮肤光老化模型，待动物皮肤产生明显皱纹后，实验样品以涂抹方式均匀涂抹在背部皮肤皱纹处，涂抹量0.2ml，涂抹背部皮肤面积约5*5cm，3次/周，1周后取背部皮肤组织样品进行电泳分析组织内I型胶原蛋白的表达量，电泳结果见图5，表达量结果见表2。
表2
| 实施例1 | 某市售产品 | 对比例5 | 对比例6 | 对比例7 | |
| Collagen Type I表达量 | 0.077 | 0.005 | 0.024 | 0.011 | 0.008 |
可见实施例1能够有效促进老化组织内的胶原蛋白再生，发挥基质重塑功能。
3、抗皱效果评价
实验样品：现用现配，实施例1～3和对比例2-11的冻干固体加到溶媒中，使其溶解，摇晃3分钟，得到即时除皱液。并按照对比例1方法制备得到即时除皱液。
(1)即时除皱效果评价
将实施例1～3和对比例1-11制得的即时除皱液分别发给测试人员测试使用。每组随机选择10位40-55岁的测试人员，测试人员洗净面部后在恒温恒湿环境(温度25±2℃，湿度60±3％)待30min后，利用VISA进行面部拍照，随后在距离面部15CM喷约2ml上述即时除皱液，轻拍使其吸收后，静待15min后用VISA进行面部拍照，随后以仪器软件(面部图像分析系统)计算出使用前后面部皱纹改善率，结果见表3。
其中，实施例1测试人员使用15min后，皱纹即可看出有明显变化，如图6-7。
表3
(2)长效除皱效果评价
测试人员每天早晚各一次，每次喷2ml，测试部位：脸颊(每日早晚各一次喷在固定半侧脸，另外一侧作为空白对照，不使用功效护肤品)；使用4周后，记录每个测试人员的皱纹面积减少量、皱纹深度减少量以及皱纹数量减少量指标，并得出每组对应的平均值，相应指标如下表4：
表4
| 皱纹面积减少量 | 皱纹深度减少量 | 皱纹数量减少量 | |
| 实施例1 | 30％ | 30％ | 33％ |
| 实施例2 | 28％ | 25％ | 26％ |
| 实施例3 | 25％ | 30％ | 30％ |
| 对比例1 | 8％ | 10％ | 9％ |
| 对比例2 | 7％ | 10％ | 5％ |
| 对比例3 | 15％ | 17％ | 19％ |
| 对比例4 | 16％ | 15％ | 15％ |
| 对比例5 | 15％ | 15％ | 15％ |
| 对比例6 | 10％ | 17％ | 18％ |
| 对比例7 | 7％ | 10％ | 9％ |
| 对比例8 | 28％ | 20％ | 29％ |
| 对比例9 | 25％ | 27％ | 25％ |
| 对比例10 | 18％ | 20％ | 15％ |
| 对比例11 | 15％ | 19％ | 18％ |
从上表的数据可知，本发明制备的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物，各成分之间功效相互促进，起到了舒缓肌肉，快速减轻、消除面部动态皱纹作用。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物，其特征在于，按质量百分比计，原料包括：
重组胶原蛋白0.01％~0.2％，
海藻糖0.02％~2％，
棕榈酰五肽-4 3％~8％，
棕榈酰三肽-1 0.05％~2％，
乙酰基六肽-8 1％~5％，
乙酰基八肽-3 0.005％~0.05％，
精氨酸 0.001％~0.01％，
乙酰基六肽-1 0.01％~0.2％，
泛醇0.05％~2％，
透明质酸钠0.01％~0.5％ ，
对羟基苯乙酮0.05％、0.6%、1％ ，
1，2-己二醇0.05％~1％，
甘油0.5％~5％ ，
丁二醇0.5％~6％，
余量为水；
所述含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物的制备方法，具体包括制备溶媒的步骤和制备冻干固体的步骤；
所述冻干固体的制备方法包括如下步骤：
①将对羟基苯乙酮加入80℃的热水中搅拌，得到对羟基苯乙酮溶液；
②步骤①中的对羟基苯乙酮溶液降温至40℃以下将1，2-己二醇加入搅拌，得到混合液体a1；
③将海藻糖加入上步骤②混合液体a1中搅拌，得到混合液体a2；
④将重组胶原蛋白加入步骤③混合液体a2中搅拌，得到预冻干液；
⑤将预冻干液进行冻干，即可得到冻干固体；
冻干条件：-20℃预冻4~8小时，然后在-40℃~-55℃预冻3~6h，一次干燥时间10~15h，一次干燥温度-32℃，解析干燥温度为20℃~25℃，解析干燥时间是60h~90h；
所述溶媒的制备方法如下：
A、甘油、丁二醇混合，搅拌，得到相a；
B、透明质酸钠加入水中，加热至60℃~80℃，保温5~10分钟，然后降温至30℃以下，再依次加入棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-1、乙酰基六肽-8、乙酰基八肽-3、乙酰基六肽-1、对羟基苯乙酮，加入后搅拌，得到相b；
C、将相a和相b混合并搅拌，再加入泛醇并搅拌，再将精氨酸分2~3次加入，边加入边搅拌，纯化水将余量补足并搅拌，测定pH值在5.5~7.5；将得到的溶液过滤除菌，即得；
其中，当对羟基苯乙酮质量百分比为0.05％时，冻干固体中对羟基苯乙酮的质量百分比为0.01％，溶媒中对羟基苯乙酮的质量百分比为0.04％；当对羟基苯乙酮质量百分比为0.6％时，冻干固体中对羟基苯乙酮的质量百分比为0.3％，溶媒中对羟基苯乙酮的质量百分比为0.3％；当对羟基苯乙酮质量百分比为1％时，冻干固体中对羟基苯乙酮的质量百分比为0.5％，溶媒中对羟基苯乙酮的质量百分比为0.5％。
2.根据权利要求1所述的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物，其特征在于，所述重组胶原蛋白的分子量为30kDa~100kDa；所述透明质酸钠的分子量为50KDa~250KDa。
3.根据权利要求1所述的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物，其特征在于，所述重组胶原蛋白采用基因重组技术及微生物发酵法获得。
4.根据权利要求1所述的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物，其特征在于，所述溶媒的制备方法中，步骤A搅拌速度100转/分~500转/分，搅拌时间是4-10分钟；
步骤C的搅拌速度500转/分~1500转/分，搅拌时间是8-12分钟。
5.根据权利要求1所述的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物，其特征在于，所述步骤B依次加入棕榈酰五肽-4、棕榈酰三肽-1、乙酰基六肽-8、乙酰基八肽-3、乙酰基六肽-1、对羟基苯乙酮时，每次加完一种物料后搅拌8-12分钟，再加下一个物料，直至加完，每次加料搅拌速度500转/分~1500转/分。
6.一种如权利要求1-3任一项所述的含重组胶原蛋白的可即时减轻表情纹的组合物用于即时除皱的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，具体方法如下：取出冻干固体加到溶媒中，使其充分溶解，摇晃2-5分钟即可。
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