CN106333966A

CN106333966A - 鹿茸提取物的制备方法及其相关产品

Info

Publication number: CN106333966A
Application number: CN201510408556.9A
Authority: CN
Inventors: 王毅; 孙娅楠; 李超华; 张倩; 马淑骅; 欧阳竞锋
Original assignee: EXPERIMENTAL RESEARCH CENTER CHINA ACADEMY OF CHINESE MEDICAL SCIENCES
Current assignee: EXPERIMENTAL RESEARCH CENTER CHINA ACADEMY OF CHINESE MEDICAL SCIENCES
Priority date: 2015-07-13
Filing date: 2015-07-13
Publication date: 2017-01-18

Abstract

本发明公开了鹿茸提取物的制备方法及其相关产品。采用本发明的方法制备的鹿茸蛋白质提取物能够缓解模型组大鼠的帕金森病的症状，增加脑组织纹状体中的神经元细胞的数量。采用鹿茸蛋白质提取物对模型组大鼠进行治疗后，能够增加大鼠脑脊液中DA、DOPAC和HVA和脑组织中DA和5-HT，降低大鼠脑脊液中谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量和脑组织中谷氨酸的含量，降低大鼠脑脊液和脑组织中HAV/DA、DOPAC/DA、5-HIAA/5-HT和谷氨酸/γ-氨基丁酸的比值。通过药理实验证明，鹿茸蛋白质提取物对帕金森病动物模型具有很好的治疗作用，为治疗帕金森病的新药研发提供实验依据。

Description

鹿茸提取物的制备方法及其相关产品

技术领域

本发明涉及鹿茸提取物的制备方法及其相关产品。

背景技术

鹿茸是中药里的名贵药材，和人参、阿胶被称为中药三宝，已有2000多年的入药历史。《本草纲目》中记载鹿茸“生精补髓，养血益阳，强健筋骨”，味甘咸，性温，入肝、肾经，补肾阳、益精血、强筋骨、调冲任、托疮毒，性温而不燥，具有振奋和提高机体功能的作用，对全身虚弱、久病之后的患者，有较好的强身作用。

现代药理研究证实，鹿茸中的化学成分较复杂，其中蛋白类成分高达55.26％，对心血管系统、神经系统、性功能均有正向调节作用。但由于分析方法的限制，对其中的蛋白类成分的药理作用知之甚少。目前已有报道表明，鹿茸中提取出的小分子多肽物质可明显促进体外神经干细胞向神经元分化的作用,并可促进外周神经再生，这些结果为鹿茸多肽应用于神经系统损伤性疾病的治疗提供了可靠的实验依据，但鹿茸大分子蛋白类物质对中枢退行性病变治疗作用还未见报道。

帕金森病(Parkinson disease,PD)是人类第二大中枢神经退行性疾病，多见于老年人，平均发病年龄为55岁，70岁及以上人群发病率达120/10万。临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌肉强直和步态障碍为主要特征。其病理学特点包括黑质-纹状体多巴胺(dopamine,DA)能神经元缺失和胞质内路易小体(Lewy bodies,LB)的形成，导致多巴胺神经元变性的原因迄今不明。目前，对帕金森病的治疗药物多侧重于对运动症状的控制，而很少关注非运动症状和整个疾病的发展过程，不能预防多巴胺能神经元的退变，且长期应用有严重的毒副作用，因此安全有效的治疗药物是整个人类社会的共同需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何预防和/或治疗帕金森病。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了鹿茸蛋白质提取物的制备方法。

本发明所提供的鹿茸蛋白质提取物的制备方法，包括：

1)将鹿茸进行粉碎，得到鹿茸粉碎物；用水浸提所述鹿茸粉碎物，收集水溶性物质得到鹿茸水溶性提取物；

2)对所述鹿茸水溶性提取物用水进行透析至pH值为6.5-8.5(如7.0)，结束透析，得到所述鹿茸蛋白质提取物。

上述方法中，所述鹿茸粉碎物的粒径可为50μm-100μm，具体可为75μm。

上述方法中，所述用水浸提时水的pH值为3-4(如3.5)，所述水的pH值可通过向水中加入冰醋酸进行调节。

上述方法中，所述用水浸提为在2-6℃(如4℃)进行20-26h(如24h)。

上述方法中，所述鹿茸粉碎物和水的质量比可为1：(4-6)，具体可为1：5，所述鹿茸的质量为鲜重。

上述方法中，所述鹿茸可为新鲜的鹿茸。

上述方法中，可采用离心收集所述水溶性物质。所述离心采用的离心力可为3000g-5000g(如4000g)，离心时间可为10-20min(如10min)。

上述方法中，所述透析采用截留分子量为1kDa的半透膜进行。所述透析可在水中进行10-12h，每4h更换水一次。

上述方法中，所述方法还包括将结束透析后得到的液体在50-60℃(如55℃)进行浓缩，得到浓缩液；将所述浓缩液在3000g-5000g(如4000g)进行离心10-20min(如10min)，收集上清液，将所述上清液进行冷冻干燥，得到鹿茸蛋白质提取物干粉的步骤。

上述方法中，所述鹿茸蛋白质提取物含有蛋白质，所述蛋白质的分子量可为10kDa-250kDa。

上述方法中，所述鹿茸蛋白质提取物中含有表1-表27中的157种蛋白质。

本发明所提供的利用所述鹿茸蛋白质提取物的制备方法制备的鹿茸蛋白质提取物也属于本发明保护的范围。

本发明还提供了鹿茸蛋白质，所述鹿茸蛋白质含有表1-表27中的157种蛋白质。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种预防和/或治疗帕金森病的产品，其活性成分为所述鹿茸蛋白质提取物或所述鹿茸蛋白质。

为解决上述技术问题，本发明还提供了活性成分为所述鹿茸蛋白质提取物或所述鹿茸蛋白质的产品，所述产品具有下述17种功能：

1)增加脑组织中的神经元细胞数量；

2)增加脑脊液中多巴胺的含量；

3)增加脑脊液中二羟苯乙酸的含量；

4)增加脑脊液中高香单酸的含量；

5)降低脑脊液中谷氨酸含量；

6)降低脑脊液中γ-氨基丁酸的含量；

7)降低脑脊液中高香单酸/多巴胺比值；

8)降低脑脊液中二羟苯乙酸/多巴胺比值；

9)降低脑脊液中5-羟吲哚乙酸/5-羟色胺比值；

10)降低脑脊液中谷氨酸/γ-氨基丁酸比值；

11)增加脑组织中多巴胺的含量；

12)增加脑组织中5-羟色胺的含量；

13)降低脑组织中谷氨酸含量；

14)降低脑组织中高香单酸/多巴胺比值；

15)降低脑组织中二羟苯乙酸/多巴胺比值；

16)降低脑组织中5-羟吲哚乙酸/5-羟色胺比值；

17)降低脑组织中谷氨酸/γ-氨基丁酸比值。

为解决上述技术问题，本发明还提供了所述鹿茸蛋白质提取物或所述鹿茸蛋白质在制备具有下述17种功能的产品中的应用：

1)增加脑组织中的神经元细胞数量；

2)增加脑脊液中多巴胺的含量；

3)增加脑脊液中二羟苯乙酸的含量；

4)增加脑脊液中高香单酸的含量；

5)降低脑脊液中谷氨酸含量；

6)降低脑脊液中γ-氨基丁酸的含量；

7)降低脑脊液中高香单酸/多巴胺比值；

8)降低脑脊液中二羟苯乙酸/多巴胺比值；

9)降低脑脊液中5-羟吲哚乙酸/5-羟色胺比值；

10)降低脑脊液中谷氨酸/γ-氨基丁酸比值；

11)增加脑组织中多巴胺的含量；

12)增加脑组织中5-羟色胺的含量；

13)降低脑组织中谷氨酸含量；

14)降低脑组织中高香单酸/多巴胺比值；

15)降低脑组织中二羟苯乙酸/多巴胺比值；

16)降低脑组织中5-羟吲哚乙酸/5-羟色胺比值；

17)降低脑组织中谷氨酸/γ-氨基丁酸比值。

实验证明，采用本发明的方法制备的鹿茸蛋白质提取物能够缓解模型组大鼠的帕金森病的症状，增加纹状体内的神经元细胞的数量。采用鹿茸蛋白质提取物对模型组大鼠进行治疗后，能够增加大鼠脑脊液中DA、DOPAC和HVA和脑组织中DA和5-HT，降低大鼠脑脊液中谷氨酸和γ-氨基丁酸的含量和脑组织中谷氨酸的含量，降低大鼠脑脊液和脑组织中HAV/DA、DOPAC/DA、5-HIAA/5-HT和谷氨酸/γ-氨基丁酸的比值。通过药理实验证明，鹿茸蛋白质提取物对帕金森病动物模型具有很好的治疗作用，为治疗帕金森病的新药研发提供实验依据。

附图说明

图1为BSA标准曲线。

图2为鹿茸蛋白质提取物的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道1为蛋白质分子量Marker，泳道2-4均为鹿茸蛋白质提取物。

图3为鹿茸蛋白质提取物对定点注射了6-OHDA的大鼠纹状体内神经细胞的影响。

图4为鹿茸蛋白质提取物对定点注射了6-OHDA的大鼠脑脊液中多巴胺及其代谢产物含量的影响(N＝5，*p<0.5vs.model,**p<0.01vs.model)。其中，A为DA含量的检测；B为HVA含量的检测；C为DOPAC含量的检测。

图5为鹿茸蛋白质提取物对定点注射了6-OHDA的大鼠脑脊液中DOPAC/DA和HVA/DA比值的影响(N＝5，*p<0.5vs.model,**p<0.01vs.model)。其中，A为DOPAC/DA比值；B为HVA/DA比值。

图6为鹿茸蛋白质提取物对定点注射了6-OHDA的大鼠脑脊液中5-羟色胺类递质的影响(N＝5，*p<0.5vs.model,**p<0.01vs.model)。其中，A为5-HT含量的检测；B为5-HIAA含量的检测；C为5-HIAA/5-HT比值。

图7为鹿茸蛋白质提取物对定点注射了6-OHDA的大鼠纹状体中多巴胺及其代谢产物含量的影响(N＝5，*p<0.5vs.model,**p<0.01vs.model)。其中，A为DA含量的检测；B为DOPAC含量的检测；C为HVA含量的检测。

图8为鹿茸蛋白质提取物对定点注射了6-OHDA的大鼠纹状体中DOPAC/DA和HVA/DA比值的影响(N＝5，*p<0.5vs.model,**p<0.01vs.model)。其中，A为DOPAC/DA比值；B为HVA/DA比值。

图9为鹿茸蛋白质提取物对定点注射了6-OHDA的大鼠纹状体中5-羟色胺类递质的影响(N＝5，*p<0.5vs.model,**p<0.01vs.model)。其中，A为5-HT含量的检测；B为5-HIAA含量的检测；C为5-HIAA/5-HT比值。

图10为鹿茸蛋白质提取物对定点注射了6-OHDA的大鼠脑脊液中氨基酸含量的影响(N＝5，*p<0.5vs.model,**p<0.01vs.model)。其中，A为谷氨酸含量的检测；B为γ-氨基丁酸含量的检测；C为谷氨酸/γ-氨基丁酸比值。

图11为鹿茸蛋白质提取物对定点注射了6-OHDA的大鼠纹状体中氨基酸含量的影响(N＝5，*p<0.5vs.model,**p<0.01vs.model)。其中，A为谷氨酸含量的检测；B为γ-氨基丁酸含量的检测；C为谷氨酸/γ-氨基丁酸比值。

上述图中，control代表假手术组，model代表模型组，LL代表鹿茸低剂量组，LM代表鹿茸中剂量组，LH代表鹿茸高剂量组，Madopar代表阳性组(美多芭)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的鲜梅花鹿茸为吉林省吉云集团吉云鹿业发展有限公司的产品。

下述实施例中的6-羟多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)为Sigma-Aldrich公司的产品。

下述实施例中的美多芭为Roche公司的产品。

下述实施例中的大鼠为雄性wistar大鼠(体重190-210g)为北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。

下述实施例中Sephadex G-25为Pharmacia公司产品(Lot No.17-0360-01)；超滤离心管为Millipore公司产品(Lot No.UFC800308)；国产安亭牌高速冷冻离心机(Lot No.GL-20G-II)；BCA蛋白定量试剂盒为碧云天生物技术研究所的产品(Lot No.SP2001)；Bradford蛋白定量试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的产品(Lot No.PA102)；即用型透析袋为北京索莱宝科技有限公司的产品(LotNo.P1000D)；胶体磨购自北京锟捷玉诚机械设备有限公司；美国CHRiST冷冻干燥机；美国Bio-rad垂直电泳仪：美国基因公司生产G-Box凝胶成像系统；美国Bio-rad酶标仪；iMark^TM Microplate Absorbance Reader(Bio-Rad,USA)；高效液相色谱仪(Agilent，1200，美国)；氮空一体机(NA-5L，上海荆和分析仪器有限公司)；质谱仪(Bruker,Altra-TOF/TOF，德国)。

实施例1、具有预防和/或治疗帕金森病的鹿茸蛋白质提取物的制备

一、鹿茸蛋白质提取物的制备

按照下述方法制备鹿茸蛋白质提取物，该鹿茸蛋白质提取物即为预防和/或治疗帕金森病的鹿茸蛋白质提取物。具体如下：

鲜鹿茸直接用粉碎机进行第一次粉碎，得到第一次鹿茸粉碎物。将鹿茸第一次粉碎物进行液氮速冻后置入超微粉碎机中，加适量水进行第二次粉碎至肉糜状，得到鹿茸第二次粉碎物，第二次鹿茸粉碎物的分子粒径为75μm。将鹿茸第二次粉碎物补充一定量水(鹿茸第二次粉碎物和水的质量比为1:5)后加入适量的冰醋酸保持pH为3.5置于4℃保持24h，然后4000g离心10min分离上层清夜，该上清液即为鹿茸水溶性提取物。将鹿茸水溶性提取物用自来水进行透析脱盐10-12h，每4h更换一次水，直至经pH试纸测量外部透析液为7.0后，结束透析，透析袋内所得的物质即为鹿茸蛋白质提取物溶液，透析采用的半透膜的截留分子量为1kDa。将鹿茸蛋白质提取物溶液在55℃以下旋转蒸发浓缩至200mL以内，然后4000g离心10min除掉沉淀之后，收集上清液，将该上清液进行冷冻干燥，得到鹿茸蛋白质提取物干粉，冷冻保存。

二、鹿茸蛋白质提取物中蛋白质浓度的测定

采用Bradford蛋白定量试剂盒，按照说明书要求操作，将蛋白标准品(BSA)溶液(浓度为1mg/mL)按0μL，1μL，2μL，3μL，4μL，5μL，6μL的体积加到96孔板的标准品孔中，加入1×PBS缓冲液补足到10μL，向孔中加入190μL考马斯亮蓝染液，混匀，室温放置8min后用酶标仪测定595nm处的OD值，得到标准曲线(图1)。

分别称取5mg按照步骤一方法制备的3个不同时间点的鹿茸蛋白质提取物干粉(1号为2014年12月4日制备，2号为2014年12月5制备，3号为2014年12月25日制备)，分别溶于1×PBS缓冲液中，制备成浓度为2.5mg/mL的鹿茸蛋白质提取物溶液，依次编号为1号、2号和3号的浓度为2.5mg/mL的鹿茸蛋白质提取物溶液，按照说明书要求操作，每组数据重复测定3次。1号、2号和3号的浓度为2.5mg/mL的鹿茸蛋白质提取物溶液的OD₅₉₅的数值分别为1.229±0.127、0.982±0.148、0.905±0.169，根据BSA标准曲线计算得到1号、2号和3号的5mg鹿茸蛋白质提取物干粉中的蛋白质含量分别为0.972mg，0.677mg，0.585mg，3组数据取平均值0.745mg，经计算还原后采用超微粉碎法获得的鹿茸蛋白质提取物干粉中蛋白质的百分含量为14.892％。

三、鹿茸蛋白质提取物中蛋白质分子量的测定

将步骤一制备的鹿茸蛋白质提取物干粉采用1×PBS缓冲液进行溶解，鹿茸蛋白质提取物的上样量为50μg、上样体积为20μL。采用5％浓缩胶，10％分离胶，80V电压下进行SDS-PAGE电泳150min。电泳结束后，经考马斯亮蓝染色后，白光下观察蛋白条带，依据蛋白条带与蛋白质量标准条带的相对位置确定鹿茸蛋白质提取物中蛋白质的分子量。

结果如图2所示，鹿茸蛋白质提取物中蛋白质的分子量范围为10kDa-250kDa。

四、鹿茸蛋白质提取物中蛋白质的质谱鉴定

将鹿茸蛋白质提取物经SDS-PAGE初步分离后得到的含蛋白质的凝胶条带等分为10份进行质谱鉴定。具体步骤如下：

1、样品预处理

将含蛋白质的SDS-PAGE凝胶条带在56℃用DTT还原，然后进行碘乙酰胺烷基化反应，将进行反应后的凝胶条带进行脱色处理。将脱色后的胶粒真空干燥后，加入Roche胰酶溶液，37℃下酶解15小时，获得酶解混合肽溶液。将酶解混合肽溶液进入Fusion液质联用仪进行分析。

2、仪器参数设置

液相色谱：C18色谱柱。

流动相：A相：H₂O,0.1％(v/v)甲酸；B相：乙腈,0.1％(v/v)甲酸。

梯度：5-70min,5％-25％B；70-80min,25％-35％B；80-90min,35％-80％B；90-100min，80％-80％B，流速为400uL/min。

质谱参数：喷雾电压为2.0KV,传输毛细管温度为320℃，一级检测器为orbitrap,质谱一级分辨率为12w,一级扫描范围为350-1550Da,二级碎裂为HCD,碰撞能量为36％，二级检测器为离子阱。

通过质谱鉴定在鹿茸蛋白质提取物中共获得157种蛋白质，通过对157种蛋白质的功能和作用分析研究，可以把这157种蛋白质分为如下几类：钙结合蛋白4个，细胞粘附分子3个，细胞连接蛋白2个，分子伴侣3个，细胞骨架蛋白9个，防御/免疫蛋白6个，酶调节剂14个，细胞外基质蛋白7个，水解酶15个，激酶6个，连接酶3个，裂解酶7个，膜转运蛋白2个，核酸结合蛋白10个，氧化还原酶10个，磷酸酶1个，蛋白酶6个，受体15个，信号分子9个，贮藏蛋白1个，结构蛋白1个，表面活性剂2个，转录因子14个，传输/载体蛋白8个，转移酶11个，跨膜受体调节/接头蛋白5个，转运体9个。157种蛋白质的名称及GI号见表1-表27，蛋白质的功能不是唯一的，一种蛋白质可能同时具有两种或两种以上的功能。其中与发育和繁殖相关蛋白共有15个(表28)。

表1、钙结合蛋白(Calcium-binding protein)

蛋白名称	NCBI登录号
		凝溶胶(Gelsolin)	gi\|74356373
纤溶酶原(Plasminogen)	gi\|113205806
		钙调素(Regucalcin)	gi\|6526714
钙蛋白酶-3(Calpain-3)	gi\|148921535

表2、细胞粘附分子(Cell adhesion molecule)

表3、细胞连接蛋白(Cell junction protein)

蛋白名称	NCBI登录号
		Dachs,isoform E	gi\|320544701
假定蛋白(Uncharacterized protein)	gi\|335306011

表4、分子伴侣(Molecular chaperones)

表5、细胞骨架蛋白(Cytoskeletal protein)

表6、防御/免疫蛋白(Defense/immunity protein)

表7、酶调节剂(Enzyme modulator)

表8、细胞外基质蛋白(Extracellular matrix protein)

表9、水解酶(Hydrolase)

表10、激酶(Kinase)

表11、连接酶(Ligase)

表12、裂解酶(Lyase)

表13、膜转运蛋白(Membrane traffic protein)

蛋白名称	NCBI登录号
		假定蛋白(Uncharacterized protein)	gi\|194035664
突触蛋白1(Synapsin 1)	gi\|374304627

表14、核酸结合蛋白(Nucleic acid binding protein)

表15、氧化还原酶(Oxidoreductase)

表16、磷酸酶(Phosphatase)

蛋白名称	NCBI登录号
		nositol monophosphatase 1	gi\|61680900

表17、蛋白酶(Protease)

表18、受体(Receptor)

表19、信号分子(Signaling molecule)

表20、贮藏蛋白(Storage protein)

蛋白名称	NCBI登录号
		结珠蛋白(Junction plakoglobin)	gi\|157391365

表21、结构蛋白(Structural protein)

表22、表面活性剂(Surfactant)

蛋白名称	NCBI登录号
		胶原α-1(I)的链(Collagen alpha-1(I)chain)	gi\|27734648
胶原α-1(III)链(Collagen alpha-1(III)chain)	gi\|115290

表23、转录因子(Transcription factor)

蛋白名称	NCBI登录号
		PIR蛋白(PIR protein)	gi\|156121359
假定蛋白(Uncharacterized protein)	gi\|545884172
		Pirin	gi\|21336070
Pirin	gi\|58332730
		Pirin	gi\|81883077
Pirin	gi\|12844746
		假定蛋白(Uncharacterized protein)	gi\|302564671
假定蛋白(Uncharacterized protein)	gi\|194034063
		假定蛋白(Uncharacterized protein)	gi\|126337007
SP110核体蛋白(Sp110nuclear body protein)	gi\|25058890
		假定蛋白(Uncharacterized protein)	gi\|587020596
SOX结构域-含有dichaete蛋白(SOX	gi\|21429704

domain-containing protein dichaete)
		假定蛋白(Uncharacterized protein)	gi\|57111643
假定蛋白(Uncharacterized protein)	gi\|345327033

表24、传输/载体蛋白(Transfer/carrier protein)

表25、转移酶(Transferase)

表26、跨膜受体调节蛋白/接头蛋白(Transmembrane receptor regulatory/adaptorprotein)

蛋白名称	NCBI登录号
		EMB蛋白(Embigin)	gi\|114600358
假定蛋白(Uncharacterized protein)	gi\|109077181
		EMB蛋白(Embigin)	gi\|78100071
EMB蛋白(Embigin)	gi\|221043364
		EMB蛋白(Embigin)	gi\|38197442

表27、转运体(Transporter)

表28、与发育和繁殖相关蛋白(developmental process and reproduction protein)

实施例2、鹿茸蛋白质提取物的药效学研究

一、动物造模

将10％的水合氯醛按照0.35mL/100g体重的注射剂量进行大鼠腹腔注射麻醉后，诱导产生感觉缺失。将头部固定于脑立体定位仪上，切开头皮，拨开皮下组织和骨膜，找到前后囟。确定右侧黑质致密部前囟后4.8mm，矢状缝右侧2.0mm，硬骨膜下8.0mm；中脑腹侧被盖区前囟后4.8mm，中线右侧1.2mm，硬骨膜下8.0mm。确定好坐标，向黑质致密部和中脑腹侧被盖区注射配好的6-OHDA溶液各8μL，分次注射，注射完成后留针2min。常规缝合，腹腔注射庆大霉素5×104U，以防感染。按照上述操作步骤，以注射等体积生理盐水的大鼠作为假手术组。

二、行为学评价

在造模21d后，向大鼠腹腔注射盐酸阿扑吗啡诱导其旋转，使用计时器记录注射盐酸阿扑吗啡1h内大鼠的旋转圈数，若大鼠1h内恒定向健侧转圈且旋转圈数大于210r，则视为帕金森病模型造模成功。

三、给药

将造模成功的大鼠随机分成如下5组：鹿茸低剂量组、鹿茸中剂量组、鹿茸高剂量组、阳性组(美多芭)和模型组，每组大鼠6只。连续通过灌胃口服给药21天，将鹿茸蛋白质提取物采用生理盐水溶解，鹿茸低剂量组大鼠给药剂量为60mg/kg体重/d，鹿茸中剂量组大鼠给药剂量为120mg/kg体重/d，鹿茸高剂量组大鼠给药剂量为180mg/kg体重/d；美多芭采用生理盐水溶液配制，阳性组大鼠美多芭的给药剂量为10mg/kg体重/d；模型组给予等体积的生理盐水；假手术组的大鼠6只，给予等体积的生理盐水。

四、鹿茸蛋白质提取物的药效结果

1、病理学形态观察

用10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，开胸暴露心脏，剪开左心室插入灌注针头至升主动脉，用止血钳固定，剪开右心房，快速灌注生理盐水，待血液冲洗干净后，灌注4％多聚甲醛进行灌注固定。然后剥取完整脑组织，将其放入4％多聚甲醛中固定24h后进行石蜡包埋，选取纹状体区和黑质区连续做冠状切片，厚度为6μm。将制作好的切片用苏木素和伊红染色后，于显微镜下观察纹状体区和黑质区内神经元细胞数量和形态并拍照。

结果如图3所示，各组正常侧纹状体内神经元细胞数量较多且呈带状斜行排列，模型组损毁侧纹状体内神经元细胞明显减少，同时形态改变，鹿茸低剂量组、鹿茸中剂量组、鹿茸高剂量组和阳性组的大鼠损毁侧纹状体内神经元细胞有不同程度的增多。

2、鹿茸蛋白质提取物对大鼠脑脊液中单胺类物质含量的影响

所有结果采用均数士标准误(mean±S.D.)表示。检测采用单因素方差分析，组间差异则采用posthoc LSD或Dunnett检验。P<0.05为有显著性差异。

用10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，从枕骨大空部位用0.5的头皮针提取大鼠脑脊液20μL，向脑脊液中加入3倍体积的乙腈，同时加入内标氘代5μL浓度为0.2ng/mL的d-DA和5μL浓度为0.2ng/mL的d-5HT，涡旋沉淀,于4℃，10000rpm条件下10分钟，收集上清液60μL。将60μL上清液用氮气吹干,并用30μL0.1％的甲酸溶液复溶，得到进样溶液。取20μL得到进样溶液HPLC-MS检测，检测脑脊液中巴胺(DA)、二羟苯乙酸(DOPAC)、高香单酸(HVA)、5-羟色胺(5-HT)和5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的含量。参照峰值面积，计算其测定值。

仪器：Agilent 6410QQQ LC-MS分析系统，由美国Agilent RRLC液相色谱仪及Agilent 6410QQQ三重四极杆质谱检测器组成，Masshunter工作站。Eppendorf5417R台式低温高速离心机，IKA T10basic分散机，IKA MS3basic振荡器，Milli-QIntegral 3超纯水处理器、赛多利斯BT25S分析天平，英国STUART SBH130D/3样品浓缩仪(氮吹仪)。

液相条件：色谱柱A美国Waters公司Atlantis^TM T3(2.1mm×100mm,3μm)。流动相为A：水(0.1％甲酸)；B：乙腈。梯度洗脱：0-0.5min，0％B；0.5-5min，0-40B％。流速为0.3mL·min^-1，进样量为20μL，柱温25℃。

质谱条件：ESI离子源，正离子检测方式，MRM模式。离子源条件为干燥气温度(Gas Temp)：300℃，干燥气流量(Gas Flow)：8L·min^-1，雾化器压力(Nebulizer)：45psi，毛细管电压(Capillary)：3000V。

图4中结果表明，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠脑脊液中的DA及其代谢产物DOPAC和HVA含量均下降，但是无显著差异。与模型组大鼠相比，鹿茸低剂量组和鹿茸高剂量组的大鼠脑脊液中的DA及其代谢产物DOPAC和HVA的含量具有不同程度的增加，阳性组(美多芭)的大鼠只有脑脊液中的DA的含量有所增加。与假手术组大鼠相比，模型组大鼠脑脊液中的DOPAC/DA和HVA/DA比值均有显著的升高(P<0.05)；与模型组相比，鹿茸各剂量组和阳性组(美多芭)均可显著降低HVA/DA与DOPAC/DA的比值(P<0.01)(图5)。

图6中结果表明，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠脑脊液中5-HT含量降低，5-HIAA含量无显著变化(P>0.05)，5-HIAA/5-HT比值升高，均无显著性差异；鹿茸中、高剂量组和阳性组(美多芭)虽有降低5-HIAA/5-HT比值的趋势但并无显著性差异，对5-HT及5-HIAA含量无显著影响。

3、鹿茸蛋白质提取物对大鼠脑组织中单胺类物质含量的影响

用10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后断头处死快速取材，分离大鼠脑纹状体，吸干表面水分后，精密称取纹状体的重量，-80℃冰箱保存。将纹状体与水按照1g：5mL的比例进行匀浆，得到匀浆液。将匀浆液于4℃，5000rpm条件下离心10分钟，收集上清液60μL。向60μL上清液加入3倍体积的乙腈，同时加入内标氘代10μL浓度为0.2ng/mL的d-DA和10μL浓度为0.2ng/mL的d-5HT，涡旋沉淀,于4℃，10000rpm条件下离心10分钟，收集上清液195μL。将195μL上清液用氮气吹干,用45μL0.1％甲酸复溶，得到进样溶液。取20μL进样溶液进行HPLC-MS检测，检测各组纹状体中多巴胺(DA)、二羟苯乙酸(DOPAC)、高香单酸(HVA)、5-羟色胺(5-HT)和5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)的含量。参照峰值面积，计算其测定值。检测仪器、液相条件及质谱条件同步骤2。

图7结果表明，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠纹状体中的DA及其代谢产物DOPAC含量均显著下降(P<0.01)，纹状体中的DA含量降低了大约58％，DOPAC下降了26％。与模型组相比，用鹿茸高剂量治疗后大鼠纹状体中的DA含量显著增加接近假手术组大鼠的水平，与阳性组(美多芭)有显著差异，对DOPAC以及HAV含量则无明显影响。与假手术组大鼠相比，模型组大鼠纹状体中的DOPAC/DA和HVA/DA比值均有显著的升高(P<0.05，P<0.01)；与模型组相比，鹿茸低剂量组、鹿茸高剂量组和阳性组(美多芭)均可显著降低HVA/DA与DOPAC/DA的比值(P<0.05)(图8)。

图9中结果表明，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠纹状体中5-HT含量明显降低，5-HIAA含量无显著变化(P>0.05)，5-HIAA/5-HT比值显著升高；鹿茸低剂量组、鹿茸高剂量组和阳性组(美多芭)可明显增加大鼠纹状体中5-HT含量并降低5-HIAA/5-HT比值。

4、鹿茸蛋白质提取物对大鼠脑脊液中氨基酸含量的影响

用10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，从枕骨大空部位用0.5的头皮针提取大鼠脑脊液50μL，加入2倍体积的乙腈进行匀浆沉淀，于4℃，12000rpm条件下离心10分钟，并收集上清液100μL。将100μL上清液用9倍体积的水进行稀释，得到进样溶液。取15μL进样溶液进行HPLC-FLD分析。

仪器：美国Agilent 1200高效液相色谱仪，包括四元泵、荧光检测器、自动进样器、柱温箱及Agilent Chem Station工作站。

色谱条件：色谱柱:ZORBAX Eclipse AAA(4.6×150mm,5μm)；流动相:A为缓冲液：甲醇：四氢呋喃＝400：95：5(v/v/v)B为缓冲液：甲醇＝120：380(v/v)；缓冲液为浓度为20mM乙酸钠溶液(pH7.2)。

梯度洗脱程序:0-10min，B％:0％-63％；10-12min，B％:63％-63％；12.00-17.00min，B％:63％-100％。流速:0.8mL·min^-1；

检测波长:激发光波长λex＝340nm,发射光波长λem＝450nm。柱温40℃。

图10中结果表明，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠脑脊液中兴奋性氨基酸谷氨酸与抑制性氨基酸γ-氨基丁酸(GABA)含量均显著升高。与模型组相比，给予鹿茸各剂量组大鼠脑脊液中的谷氨酸和γ-氨基丁酸均恢复至正常水平，美多芭对大鼠脑脊液中的谷氨酸和γ-氨基丁酸含量则无显著性改变。

5、鹿茸蛋白质提取物对大鼠脑组织中氨基酸含量的影响

取-80℃冰箱保存的脑组织按1:2(w/v)加入乙腈中进行匀浆沉淀，于4℃，12000rpm条件下离心10分钟，并收集上清液100μL。将100μL上清液用9倍体积的水进行稀释，得到进样溶液。取15μL进样溶液进行HPLC-FLD分析。检测仪器、色谱条件、梯度洗脱程序及检测波长同步骤4。

图11结果表明，与假手术组大鼠相比，模型组大鼠脑组织中纹状体中兴奋性氨基酸谷氨酸含量显著增高，而抑制性氨基酸γ-氨基丁酸含量变化不明显，二者的比值表明PD模型以兴奋性为主。与模型组相比，鹿茸各剂量组与阳性组(美多芭)大鼠纹状体中谷氨酸含量不同程度降低，并缓解其兴奋性。

Claims

1.鹿茸提取物的制备方法,包括：

2)对所述鹿茸水溶性提取物用水进行透析至pH值为6.5-8.5，结束透析，得到所述鹿茸提取物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述用水浸提时水的pH值为3-4；所述用水浸提为在2-6℃进行20-26小时。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述透析采用截留分子量为1kDa的半透膜进行。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将结束透析后得到的液体进行浓缩，得到浓缩液；将所述浓缩液进行离心，收集上清液，将所述上清液进行干燥，得到鹿茸提取物干粉的步骤。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述鹿茸提取物含有蛋白质，所述蛋白质的分子量为10kDa-250kDa；所述鹿茸提取物中含有表1-表27中的157种蛋白质。

6.利用权利要求1所述的方法制备的鹿茸提取物。

7.鹿茸蛋白质，其特征在于：所述鹿茸蛋白质含有表1-表27中的157种蛋白质。

8.一种预防和/或治疗帕金森病的产品，其活性成分为权利要求6所述的鹿茸提取物或权利要求7所述的鹿茸蛋白质。

9.活性成分为权利要求6所述的鹿茸提取物或权利要求7所述的鹿茸蛋白质的产品，其特征在于：所述产品具有下述17种功能：

1)增加脑组织中的神经元细胞数量；

2)增加脑脊液中多巴胺的含量；

3)增加脑脊液中二羟苯乙酸的含量；

4)增加脑脊液中高香单酸的含量；

5)降低脑脊液中谷氨酸含量；

6)降低脑脊液中γ-氨基丁酸的含量；

7)降低脑脊液中高香单酸/多巴胺比值；

8)降低脑脊液中二羟苯乙酸/多巴胺比值；

9)降低脑脊液中5-羟吲哚乙酸/5-羟色胺比值；

10)降低脑脊液中谷氨酸/γ-氨基丁酸比值；

11)增加脑组织中多巴胺的含量；

12)增加脑组织中5-羟色胺的含量；

13)降低脑组织中谷氨酸含量；

14)降低脑组织中高香单酸/多巴胺比值；

15)降低脑组织中二羟苯乙酸/多巴胺比值；

16)降低脑组织中5-羟吲哚乙酸/5-羟色胺比值；

17)降低脑组织中谷氨酸/γ-氨基丁酸比值。

10.活性成分为权利要求6所述的鹿茸提取物或权利要求7所述的鹿茸蛋白质在制备具有下述17种功能的产品中的应用：

1)增加脑组织中的神经元细胞数量；

2)增加脑脊液中多巴胺的含量；

3)增加脑脊液中二羟苯乙酸的含量；

4)增加脑脊液中高香单酸的含量；

5)降低脑脊液中谷氨酸含量；

6)降低脑脊液中γ-氨基丁酸的含量；

7)降低脑脊液中高香单酸/多巴胺比值；

8)降低脑脊液中二羟苯乙酸/多巴胺比值；

9)降低脑脊液中5-羟吲哚乙酸/5-羟色胺比值；

10)降低脑脊液中谷氨酸/γ-氨基丁酸比值；

11)增加脑组织中多巴胺的含量；

12)增加脑组织中5-羟色胺的含量；

13)降低脑组织中谷氨酸含量；

14)降低脑组织中高香单酸/多巴胺比值；

15)降低脑组织中二羟苯乙酸/多巴胺比值；

16)降低脑组织中5-羟吲哚乙酸/5-羟色胺比值；

17)降低脑组织中谷氨酸/γ-氨基丁酸比值。