CN103649111A - 白蛋白制剂和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的白蛋白制剂、制备该白蛋白制剂的方法以及该白蛋白制剂在例如细胞培养例如哺乳动物细胞培养尤其是干细胞培养中的用途。
Description
对序列表的引用
本申请包含电脑可读形式的序列表，其通过引用并入本文。
技术领域
本发明涉及一种新的白蛋白制剂以及该白蛋白制剂的用途。
背景技术
白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质。白蛋白已经从大量哺乳动物和鸟类中得到描述和表征。白蛋白被认为在保持正确的渗透压方面发挥作用，也在血流中各种化合物的运输方面发挥作用。白蛋白是用于治疗患有严重烧伤、休克或失血的患者的蛋白质。其也用作药物学活性化合物的赋形剂，其中很多需要稳定，从而例如减少白蛋白的可溶聚集物和/或不可溶聚集物的形成。而且，白蛋白用来补充使包括干细胞的高等真核細胞生长的介质。白蛋白融合蛋白是蛋白与白蛋白或其变体或片段的融合体，并且可以增加或降低蛋白质的半衰期，例如增加体内半衰期。缀合配偶体，例如，蛋白质或化学品，可以与白蛋白缀合以增加或降低缀合配偶体的半衰期，例如，增加体内半衰期。目前，白蛋白从血液制品诸如血清中获得，或在微生物诸如酵母中以重组方式生产（例如，WO96/37515、WO2000/044772）或从转基因植物或动物中生产。通常，白蛋白从生产源纯化而来，以提供足够纯以满足使用者的需求和/或达到产品的高收率的产品。在一些技术领域中，比如细胞培养或制药中，期望产品基本不含或完全不含动物来源的成分。
最终液体形式的纯化白蛋白相对不稳定（与固体形式的白蛋白比），因此为使其保存期限最大化，或将其冻干和/或将稳定剂加入到最终液体制剂中。但是，冻干法会显著增加制备的总成本且对于最终使用者不方便，即，如果他们需要液体产品，需要将冻干的产品进行再混悬。对于优选的液体产品，通常加入到白蛋白中的稳定剂是N-乙酰-色氨酸、辛酸（辛酸酯、辛酸盐）和/或聚山梨醇酯80（例如）。WO2000/044772的白蛋白通过辛酸而稳定。Arakawa&Kita（2000）已公开辛酸盐（酯）和乙酰基色氨酸酯对于牛血清白蛋白的热引发聚集的稳定效果（Biochimica et Biophysica Acta1479:32-36)。Hosseini等（2002）已公开经由辛酸盐（酯）和乙酰基色氨酸酯的热处理人白蛋白的稳定的研究（Iranian Biomedical Journal6(4):135-140）。
本发明人已经意识出，辛酸对于哺乳动物细胞培养尤其是干细胞培养有害。而且，聚山梨醇酯80
对哺乳动物细胞培养有害。需要的是对于哺乳动物细胞培养无害的白蛋白的稳定液体制剂。
发明内容
本发明提供具有改善的稳定性的白蛋白液体制剂，其中稳定性被示为例如制剂中白蛋白的降低水平的可溶聚集物或不可溶聚集物。本发明也提供使用该制剂的方法，以及该制剂的用途，例如哺乳动物培养，特别是干细胞培养。
附图说明
图1示出pH和N-乙酰基色氨酸浓度对于白蛋白组合物（10mg/mL）的稳定性的影响，通过对可见（不可溶）聚集物的测量，经吸光度（A350）增加0.1个吸光度单位（AU）所用的时间（秒）而确定。
图2示出pH和磷酸盐浓度对于白蛋白组合物（10mg/mL）的稳定性的影响，由吸光度（A350）增加0.1个AU所用的时间（秒）而确定。
图3示出pH和钠浓度对于白蛋白组合物（10mg/mL）的稳定性的影响，由吸光度（A350）增加0.1个AU所用的时间（秒）而确定。
图4示出pH和钠浓度（对于较大范围的钠浓度）对于白蛋白组合物（10mg/mL）的稳定性的影响，由吸光度（A350）增加0.1个AU所用的时间（秒）而确定。
图5示出pH和钠浓度对于白蛋白组合物（50mg/mL）的稳定性的影响，由吸光度（A350）增加0.1个AU所用的时间（秒）而确定。
图6示出pH6.5下钠浓度和白蛋白浓度对于白蛋白组合物的稳定性的影响，由吸光度（A350）增加0.1个AU所用的时间（秒）而确定。
图7示出40℃孵育14天的白蛋白组合物中钠浓度与单体相对含量（%）之间的关系。
图8示出40℃孵育14天的白蛋白组合物中钠浓度与多聚体相对含量（%）之间的关系。
图9示出根据本发明的白蛋白制剂的脂肪酸分布。
图10示出根据本发明的白蛋白制剂的由ICP-OES测定的金属离子分布。
图11示出钠浓度和白蛋白浓度对于白蛋白的稳定性的影响，由40℃孵育4周之后的剩余单体含量确定。
图12示出阳离子种类和阳离子浓度对于白蛋白的稳定性的影响，由吸光度（A350）增加0.2个AU所用的时间（秒）而确定。
图13示出钠离子浓度和阴离子种类对于白蛋白的稳定性的影响，由吸光度（A350）增加0.1个AU所用的时间（秒）而确定。
图14示出钠离子浓度和阴离子种类对于白蛋白的稳定性的影响，由65℃孵育2小时后的剩余单体含量确定。
图15示出在不同缓冲液阴离子的存在下，钠离子浓度对于白蛋白的稳定性的影响，其中包含来自NaCl和缓冲液两者的钠的作用，由吸光度（A350）增加0.1个AU所用的时间（秒）而确定。
图16示出在不存在缓冲离子或存在50mM柠檬酸盐作为缓冲离子时钠离子浓度对白蛋白的稳定性的影响，其中忽略来自柠檬酸钠缓冲液的钠离子的作用，由吸光度（A350）增加0.1个AU所用的时间（秒）而确定。
图17示出钠离子浓度对不同白蛋白以及白蛋白变体的稳定性的影响，由吸光度（A350）增加0.1个AU所用的时间（秒）而确定。
图18示出钠离子浓度对小鼠血清白蛋白的稳定性的影响，由吸光度（A350）增加0.1个AU所用的时间（秒）而确定。
图19示出pH和钠离子浓度对于白蛋白的稳定性的影响，由吸光度（A350）增加0.1个AU所用的时间（秒）而确定。
图20示出pH5.0下钠离子浓度对于白蛋白的稳定性的影响，由吸光度（A350）增加0.1个AU所用的时间（秒）而确定。
图21示出pH7.0、7.5和8.0下钠离子浓度对于白蛋白的稳定性的影响，由65℃孵育2小时后的剩余单体含量而确定。
具体实施方式
定义
术语“细胞培养介质”、“培养介质”和“介质制剂”是指培养细胞或使细胞生长的营养液。
“无血清”介质是不含血清（例如，胎牛血清（FBS）、马血清、山羊血清、或任何其他本领域技术人员已知的动物来源血清）的介质。
术语“基础培养介质”是指任何能够支持细胞生长的介质。基础介质供应标准无机盐，例如锌、铁、镁、钙和钾，以及微量元素、维生素、能源、缓冲系统、和必需氨基酸。合适的基础介质包括但不限于α-最低必需培养基（.alpha.MEM）；Eagle基础培养基（BME）；含有Earle's平衡盐溶液（BSS）的Eagle基础培养基；DME/F12；含有L-谷氨酰胺的DMEM高糖培养基；不含L-谷氨酰胺的DMEM高糖培养基；含有L-谷氨酰胺的DMEM:Fl21:1；Dulbecco's改良Eagle's培养基（DMEM）；F-10；F-12；Glasgow's最小必需培养基（G-MEM）；含有L-谷氨酰胺的G-MEM；Grace's完全昆虫培养基；不含FBS的Grace's昆虫培养基；含有L-谷氨酰胺的Ham's F-10；含有L-谷氨酰胺的Ham'sF-12；含有HEPES和L-谷氨酰胺的IMDM；含有HEPES且不含L-谷氨酰胺的IMDM；IPL-41昆虫培养基；Iscove's改良Dulbecco’s培养基；不含L-谷氨酰胺的L-15（Leibovitz）；不含L-谷氨酰胺或酚红的L-15（Leibovitz）（2X）；McCoy's5A改良培养基；培养基199；不含L-谷氨酰胺或酚红的MEM Eagle（2X）；含有L-谷氨酰胺的MEMEagle-Earle's BSS；不含L-谷氨酰胺的MEM Eagle-Earle’BSS；不含L-谷氨酰胺的MEM Eagle-Hanks BSS；最低必需培养基（MEM）；最低必需培养基-α（MEM-α）；含有L-谷氨酰胺的NCTC-109；含有L-谷氨酰胺的Richter's CM培养基；RPMI1640；含有L-谷氨酰胺的RPMI1640；不含L-谷氨酰胺的RPMI1640；含有HEPES、L-谷氨酰胺和/或青霉素-链霉素的RPMI1640；Schneider's昆虫培养基；或任何其他本领域技术人员已知的培养基。用于干细胞培养的优选基础介质包括MEF、DMEM、CTS、和DMEM/F-12。
术语“白蛋白”是指与人血清白蛋白（HSA）或HSA结构域具有相同和/或非常相似的三级结构并具有HSA或相关结构域的相似特性的蛋白质。相似的三级结构是例如在亲本白蛋白下提到的物种的白蛋白的结构。白蛋白的一些主要特性是i）其调节血浆容量的能力，ii）约19天±5天的较长血浆半衰期，iii）配体结合，例如，内源分子诸如包括胆红素脂肪酸、氯化血红素和甲状腺素的酸性亲脂性化合物的结合（另参见Kragh-Hansen等人，2002，Biol.Pharm.Bull.25,695的表1，通过引用的方式并入），iv）具有酸性或带负电特性的有机小化合物的结合，例如药物，如华法林、安定、布洛芬和紫杉醇（另参见Kragh-Hansen等人，2002,Biol.Pharm.Bull.25,695的表1，通过引用的方式并入）。不是所有这些特性都需要满足以将蛋白质或片段表征为白蛋白。例如，如果片段不包含负责特定配体或有机化合物的结合的结构域，则该片段的变体也不预期具有这些特性。术语白蛋白包括变体、和/或衍生物诸如白蛋白或白蛋白变体的融合体和/或缀合物。
术语“变体”是指得自亲本白蛋白的在一个或多个（数个）位置处包含改变（即取代、插入、和/或缺失）的多肽。取代是指用不同的氨基酸来取代占据位置的氨基酸；缺失是指去除占据位置的氨基酸；而插入是指增加与占据位置的氨基酸相邻的1～3个氨基酸。改变的多肽（变体）可以经人工干预通过修改编码亲本白蛋白的多核苷酸序列而获得。变体白蛋白优选与SEQ ID NO:2至少70%，优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，最优选至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%相同，并保持至少一个亲本白蛋白的主要特性或如HSA的相似三级结构。出于本发明的目的，使用在EMBOSS软件包（EMBOSS:The EuropeanMolecular Biology Open Software Suite（欧洲分子生物学开放软件包）,Rice等人,2000,Trends Genet.16:276-277）（优选5.0.0或更新版本）的Needle程序中执行的Needleman-Wunsch算法（Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453），来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是，空位开放罚分为10，空位扩展罚分为0.5，以及EBLOSUM62（BLOSUM62的EMBOSS版本）替换矩阵。Needle标记的“最长同一性”的输出（使用-nobrief选项得到的）被用作百分比同一性并计算如下：（相同残基×100）/（比对长度-比对中的空位总数）。
当与亲本白蛋白相比时，变体可以拥有改变的对FcRn的结合亲和性和/或改变的跨内皮、上皮细胞和/或间皮单细胞层的胞转速率。变体多肽序列优选为在自然界没有发现的一个多肽序列。变体包括，例如，包含白蛋白的至少100、150、200、250、300、350、450、500、550个相邻氨基酸或由其组成的片段。
术语“野生型”（WT）白蛋白是指与天然发现于动物或人中的白蛋白具有相同的氨基酸序列的白蛋白。SEQ ID NO:2是得自智人的野生型白蛋白的实例。
术语“亲本”或“亲本白蛋白”是指对其做出改变以产生可以用在本发明中的白蛋白变体的白蛋白。亲本可以为天然发现的（野生型）多肽或其等位基因或其变体，例如PCT/EP2010/066572中描述的变体或PCT/EP2011/055577中描述的变体或衍生物。
术语“融合体”是指白蛋白（或其变体或其片段）与非白蛋白蛋白的基因融合体。非白蛋白蛋白可以是治疗性的、预防性的、或诊断性的蛋白。白蛋白融合体的实例提供在EP624195、WO2001/079271、WO2003/059934、WO2003/060071、WO2011/051489、PCT/EP11/055577和EP11164955中（其全部内容通过引用的方式合并入本文）。
术语“缀合物”是指化学缀合有非白蛋白部分的白蛋白（或其变体或片段或融合体）。非白蛋白部分可以是治疗性的、预防性的、或诊断性的蛋白。白蛋白缀合物的实例提供在PCT/EP11/055577和EP11164955中（其全部内容通过引用的方式合并入本文）。
术语“悬浮培养”是指培养中的细胞，其中多数或所有培养中的细胞以悬浮存在，且培养容器中少数或没有细胞附着到容器表面或容器内的另一表面（贴壁细胞）。“悬浮培养”可以有多于约50%、60%、65%、75%、85%、或95%的没有附着到在培养容器上或中的表面。
术语“贴壁培养”是指培养中的细胞，其中存在多数或所有培养中的细胞附着到容器表面或容器内的另一表面，且培养容器中少数细胞或没有细胞处于悬浮。“贴壁培养”可以有多于50%、60%、65%、75%、85%、或95%的贴壁细胞。
如本文所用到的，术语“哺乳动物”包括任何人类或非人类哺乳动物，非人类哺乳动物包括但不限于猪科、绵羊、牛科、啮齿目、有蹄类、猪、羊、羔羊、山羊、牛、鹿、骡子、马、灵长类（例如猴子）、狗、猫、大鼠和小鼠。
术语“细胞”包括任何细胞，例如但不限于，本文所述的任何人类或非人类哺乳动物细胞。细胞可以是常规细胞或非常规细胞（例如转化的细胞、确立细胞、或得自病变组织样本的细胞）。细胞可以是体细胞，比如成纤维细胞或角化细胞。优选的细胞为干细胞，例如但不限于胚胎干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞和多能干细胞诸如诱导的多能干细胞。特别优选的细胞为人胚胎干细胞、人胎儿干细胞、人成体干细胞和人多能干细胞诸如诱导的人多能干细胞。
本发明的第一个方面提供组合物，包含白蛋白、溶剂、至少175mM的阳离子，具有约5.0～约9.0的pH，其中，组合物包含等于或少于30mM的辛酸盐（酯）。该组合物的优点是，制剂提供的白蛋白为足够稳定以具有有利的保存期限并在用于哺乳动物细胞培养时对哺乳动物细胞的健康无害（例如，无毒）。
优选组合物包含阴离子，以平衡阳离子。
溶剂可以是无机溶剂例如水或无机缓冲液例如磷酸盐缓冲液如磷酸钠、磷酸钾，或有机缓冲液例如醋酸钠或柠檬酸钠。缓冲液可以稳定pH。磷酸钠（例如NaH2PO4）是优选的pH缓冲液，诸如pH5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。
当前的发明人已经观察到，辛酸盐（酯）对细胞培养中的哺乳动物细胞有害。因此，组合物包含低水平的辛酸盐（酯）。例如，优选组合物包含少于30mM的辛酸盐（酯），更优选少于约28、26、24、22、20、18、16、15、14、12、10、8mM的辛酸盐（酯），甚至更优选少于约6、5、4、3mM的辛酸盐（酯），更优选少于约2、1、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.01、或0.001mM的辛酸盐（酯）。优选组合物基本不含辛酸盐（酯）。换言之，优选组合物中辛酸盐（酯）的水平不足以引起培养过程中对细胞的有害影响，例如对细胞培养诸如体外细胞培养中的哺乳动物细胞（尤其干细胞诸如人干细胞）的有害影响。最优选地，组合物不含辛酸盐（酯）（0mM的辛酸盐（酯））。
脂肪酸的优选参数提供如下。脂肪酸的含量优选为多个样本例如2、3、4或5个样本的平均值：
| 脂肪酸 | 优选范围（mM） |
| C6:0 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C8:0 | ≤2.5mM，更优选≤0.23mM，最优选0mM |
| C9:0 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C10:0 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C11:0 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C12:0 | ≤0.5mM，更优选≤0.05mM，最优选0mM |
| C13:0 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C14:0 | ≤10mM，更优选≤1mM，最优选0mM |
| C14:1 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C15:0 | ≤0.4mM，更优选≤0.04mM，最优选0mM |
| C15:1 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C16:0 | ≤34mM，更优选≤3.38mM，最优选0mM |
| C16:1n7 | ≤0.9mM，更优选≤0.09mM，最优选0mM |
| C16:2n4 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C16:3n4 | ≤0.5mM，更优选≤0.05mM，最优选0mM |
| C17:0 | ≤0.5mM，更优选≤0.05mM，最优选0mM |
| C17:1 | ≤0.1，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C18:0 | ≤20mM，更优选≤2.05mM，最优选0mM |
| C18:1n7 | ≤0.2mM，更优选≤0.02mM，最优选0mM |
| C18:1n9c | ≤8mM，更优选≤0.8mM，最优选0mM |
| C18:1n9t | ≤1.7mM，更优选≤0.17mM，最优选0mM |
| C18:2n6c | ≤4.2mM，更优选≤042mM，最优选0mM |
| C18:2n6t | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C18:3n3 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| 脂肪酸 | 优选范围（mM） |
| C18:4n3 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C19:0 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C20:0 | ≤6mM，更优选≤0.6mM，最优选0mM |
| C20:1n9 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C20:2n6 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C20:3n3 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C20:3n6 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C20:4n6 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C20:5n3 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C22:0 | ≤5.7mM，更优选≤0.57mM，最优选0mM |
| C22:1n11 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C22:1n9 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
| C22:2n6 | ≤0.1mM，更优选≤0.01mM，最优选0mM |
也优选组合物的总脂肪酸含量少于或等于20mM，更优选少于或等于15、10、5、4、3、2或1mM。更优选组合物节本不含脂肪酸，更优选不含脂肪酸。
含有100g·L-1白蛋白、≤1mM辛酸盐（酯）、250mM Na+且pH为约6.5的白蛋白制剂的脂肪酸分布和金属离子分布分别提供在图9和10中。这些是特别优选的分布。白蛋白组合物可以符合图9和图10的分布中的一个或两个。
优选存在至少约175mM的阳离子，例如至少约200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、650、700、750、800、850、900、950、1000mM。优选的最大阳离子浓度包括1000、950、900、850、800、750、700、650、600、575、550、525、500、475、450、425、400、375、350、325、300、275和250mM。优选的阳离子浓度包括200～500mM。更优选阳离子浓度为约200～350mM。最优选阳离子浓度为约250mM。
组合物的pH可以在约5.0和约9.0之间，例如从约5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、或8.5至约5.5、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75或9.0。优选pH为约5.0～8.0，例如约6.0～约8.0，更选优约6.0～约7.0或6.0～6.5。最优选pH为约6.5。
组合物的阳离子可以由任何阳离子提供且可以由后述的一个或多个（数个）类别或种类提供。例如，阳离子可以是单价或二价、单原子或多原子，并且可以由一种或多种（数种）碱金属（例如钠、钾）、碱土金属（例如钙、镁）或铵提供。优选阳离子由钠和/或钾和/或镁提供，最优选钠或镁。
阳离子可以由无机酸的盐（例如1或2族金属盐或铵盐例如氯化钠）、二价酸的盐（例如1或2族金属硫酸盐或磷酸盐或硫酸铵或磷酸盐例如硫酸钠）或有机酸的盐（例如1或2族金属醋酸盐或柠檬酸盐或醋酸铵盐或柠檬酸铵盐例如醋酸钠）。
用于稳定白蛋白的阳离子和阴离子可以由例如本文所述的（i）盐和/或（ii）pH缓冲剂提供。因此，可以有多于一个（数个）种类的阳离子或阴离子，例如2或3个种类。可以有多于一个（数个）的单一阳离子的来源，例如Na可以由pH缓冲液（诸如磷酸钠）和盐（诸如NaCl）两者提供。
对本发明有利的阴离子包括无机酸阴离子诸如磷酸盐，和卤化物诸如氯化物，和有机阴离子诸如醋酸盐和柠檬酸盐。阴离子可以是单价或双价，单原子或多原子。优选的阴离子包括硫酸盐、醋酸盐、磷酸盐、和氯化物，尤其是氯化物、硫酸盐和醋酸盐。
因此，组合物可以包含一种或多种（数种）碱金属磷酸盐或氯化物（诸如磷酸钠、磷酸钾、氯化钠或氯化钾）、碱土金属磷酸盐（诸如磷酸钙、磷酸镁、氯化钙、氯化镁）或磷酸铵或氯化铵。
组合物可以具有的总离子强度为至少175mmol·L-1。例如，约175～1000mmol·L-1诸如从约175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、650、700、750、800、850、900、950、1000mmol·L-1至约1000、950、900、850、800、750、700、650、600、575、550、525、500、475、450、425、400、375、350、325、300、275、250mmol·L-1。更优选总离子强度为约200～350mmol·L-1。最优选离子强度为约250mmol·L-1。
当前的发明人已经意识到，稳定剂诸如洗涤剂（例如聚山梨醇酯80
的存在可能对细胞培养中的哺乳动物细胞有害。因此，优选组合物包含少于20mg.L-1的洗涤剂（例如聚山梨醇酯80），优选少于15、10、5、4、3、2、1、0.5、0.1、0.01、0.001mg·L-1的洗涤剂（例如聚山梨醇酯80）。甚至更优选地，组合物基本不含洗涤剂（例如聚山梨醇酯80）。换言之，优选组合物中洗涤剂（例如聚山梨醇酯80）的水平不足以在培养期间造成对细胞的有害影响，例如对细胞培养诸如体外细胞培养中的哺乳动物细胞（尤其是干细胞诸如人干细胞）的有害影响。最优选组合物不含洗涤剂（例如聚山梨醇酯80）。洗涤剂（例如聚山梨醇酯80）的水平可以通过本领域技术人员已知的技术来检定，例如，但不限于，WO2004/099234（通过引用的方式并入本文）中公开的检定。
对于一些细胞介质，优选介质基本不含或不含色氨酸（例如由Lee等人，2002，Immunology107(4):452-460中公开的不含色氨酸的RPMI1640）。白蛋白组合物可以加入到介质中。因此，为维持介质的不含色氨酸的特征，具有低水平氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸）、基本不含氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸）或不含氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸）的白蛋白组合物是有利的。因此，优选白蛋白组合物包含少于5mM的氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸），优选少于4、3、2、1、0.5、0.1、0.01、0.005、0.001mM的氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸）。甚至更优选地，组合物基本不含氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸）。换言之，优选组合物中氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸）的水平不足以在培养期间对细胞造成有害影响，例如对细胞培养诸如体外细胞培养中的哺乳动物细胞（尤其是干细胞诸如人干细胞）造成影响。更优选地，组合物不含氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸）。
甚至更优选组合物基本不含、或完全不含辛酸盐（酯）、氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸）和洗涤剂（例如聚山梨醇酯80）。
为鉴定白蛋白制剂对细胞培养是否存在有害或毒性作用，可以通过制备含有本发明白蛋白制剂的第一细胞培养介质并制备一种或多种（数种）对照细胞培养介质并监控它们对细胞系的影响，从而进行测试。对照细胞培养介质与第一细胞培养介质相同，除本发明的白蛋白制剂用另一种白蛋白制剂例如用辛酸盐（酯）、洗涤剂（例如聚山梨醇酯80）和/或氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸）稳定的白蛋白制剂替换以外。测试介质和对照可以用于培养一种或多种（数种）细胞系（例如本文所述的细胞系），并且白蛋白对细胞的影响可以例如通过监测细胞生长、细胞形态和/或细胞分化来监测。优选测试在细胞系的多个传代，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个传代上进行。适合的方法在本领域中已知。优选本发明的白蛋白制剂对细胞的毒性或有害性比用高水平的辛酸盐（酯）、洗涤剂或氨基酸稳定的白蛋白要低。例如，比起包含另一种白蛋白制剂例如用辛酸盐（酯）、洗涤剂（例如聚山梨醇酯80）和/或氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸）稳定的白蛋白制剂的对照介质，包含本发明的白蛋白组合物的介质可以表现出至少2、5、10、100、1000、10000、或100000倍的改进。2、5、10、100、1000、10000、或100000倍的改进可能与成活细胞数目、正确或健康的细胞形态和/或分化细胞的数目或相对数目有关，尤其是与表现出向期望细胞种类或类型分化的细胞有关。
优选白蛋白组合物的稳定性高于在水中或在150mM Na中的等量白蛋白。一个比较稳定性的，尤其涉及白蛋白的不可溶聚集物的形成的方法，是：
i）将小份（例如1mL）的白蛋白组合物放置在比色皿（例如聚苯乙烯比色皿，诸如Sarstedt10×4×45mm）中；
ii）将比色皿放置在控温的已经预平衡且控制在期望温度例如65℃的分光光度计中；
iii）通过在规定间隔（例如每18秒）读取读数，在期望时间段（例如2小时）内，参照空比色皿，在350nm监控/测量组合物的吸光度；
iv）通过读取最初数个（例如7个）数据点，使数据点读数平均化并从所有数据点中扣减该平均值来处理数据，以提供约为0的基础吸光度值；
v）确定和/或记录所处理的吸光度值在基线上增加0.1个AU（吸光度单位）所用的时间。
优选稳定性分析为成对进行。
优选本发明的白蛋白组合物的稳定性足够高，使得所测量吸光度在基线上增加0.1个AU所用的时间（根据上述在65℃进行的测试），与在溶剂诸如150mM Na或水中且在相同条件下测量的相同浓度的白蛋白对照溶液相比，至少好10%。更优选稳定性至少好20、30、40、50、60、70、80、90或100%。
可选的或附加的稳定性测试，尤其对于白蛋白的可溶聚集物的形成，是在设定温度下随着时间经GP-HPLC监控可溶白蛋白多聚体的形成。一个使用GP-HPLC测量的合适的稳定性研究包括：
i）将各个将要研究的10mL无菌（例如通过无菌0.22μm过滤器过滤）样本置于无菌瓶（例如烘烤的10mL玻璃瓶）中，该无菌瓶在之后被塞住（例如用无菌的丁基橡胶密封件并任选地进行顶封）；
ii）取约200μL的T0样本并将无菌瓶孵育在特定温度下（例如置于设定在特定温度（例如40℃）的水浴中）；
iii）在某个时间点（例如14天）之后，从各个无菌瓶中取出样本（约200μL）；
iv）将从无菌瓶中取出的白蛋白样本（<50mg/mL）小份（例如25μL）注入GP-HPLC柱中（例如7.8mm内径×300mm长度TSKG3000SWXL柱（Tosoh Bioscience），具有6.0mm内径×40mm长度TSK SW保护柱（Tosoh Bioscience））；
v）以合适的速度（例如1mL/min）在合适的缓冲液（例如25mM磷酸钠、100mM硫酸钠、0.05%（w/v）叠氮化钠，pH7.0）中对小份进行色谱测量；
vi）监测色谱过程，例如通过在280nm的UV检测；
vii）通过识别相对于总峰面积的各个峰面积，将小份中的一种或多种（数种）、或所有的单体、二聚物、三聚物和多聚体的的含量定量为%（w/w）。
优选测试设置为三个平行。
因此，本发明也提供具有如上述测试中的一个或两个所明确的稳定性的白蛋白组合物，以及包括上述测试中的一个或两个的制备白蛋白组合物的方法。
白蛋白已在大量哺乳动物和鸟类中有过记载和表征（例如，WO2010/092135（特别是表1）和PCT/EP11/055577（特别是第9页和SEQID No:2、4～19和31）中所列的白蛋白，两者均通过引用的方式全部并入本文）。
本发明的组合物可以包含一种或多种（数种）白蛋白。优选组合物包含选自人白蛋白（例如AAA98797或P02768-1、SEQ ID NO:2（成熟的）、SEQ ID NO:3（不成熟的）、非人灵长类白蛋白（诸如黑猩猩的白蛋白（例如预测的序列XP_517233.2SEQ ID NO:4）、大猩猩的白蛋白或猕猴的白蛋白（例如NP_001182578,SEQ ID NO:5）、啮齿目的白蛋白（诸如仓鼠白蛋白（例如A6YF56，SEQ ID NO:6）、豚鼠的白蛋白（例如Q6WDN9-1，SEQ ID NO:7）、小鼠的白蛋白（例如AAH49971或P07724-1第3版，SEQ ID NO:8，或成熟序列SEQ ID NO:19）和大鼠的白蛋白（例如AAH85359或P02770-1第2版，SEQ ID NO:9）））、牛科的白蛋白（例如奶牛白蛋白P02769-1，SEQ ID NO:10）、马科的白蛋白诸如马的白蛋白（例如P35747-1，SEQ ID NO:11）或驴的白蛋白（例如Q5XLE4-1，SEQ ID NO:12）、兔的白蛋白（例如P49065-1第2版，SEQ ID NO:13）、山羊的白蛋白（例如ACF10391，SEQ ID NO:14）、绵羊的白蛋白（例如P14639-1，SEQ ID NO:15）、狗的白蛋白（例如P49822-1，SEQ ID NO:16）、鸡的白蛋白（例如P19121-1第2版，SEQID NO:17）和猪的白蛋白（例如P08835-1第2版，SEQ ID NO:18）的白蛋白。特别优选成熟形式的白蛋白，且本领域技术人员能够使用公开可得的信息诸如蛋白质数据库和/或通过使用信号肽识别软件诸如SignalP（例如，SignalP（Nielsen等人，1997，Protein Engineering10:1-6））来鉴定成熟形式。优选SignalP4.0版（Petersen等人，2011，NatureMethods(8):785-786）。
在SEQ ID NO:2中公开的人白蛋白或其任何自然出现的等位基因是本发明的白蛋白组合物的优选白蛋白。SEQ ID NO:2可以由核苷酸序列SEQ ID NO:1编码。
白蛋白，特别是人白蛋白，可以是变体、或衍生物，诸如白蛋白或白蛋白变体的融合体或缀合物。优选白蛋白与HSA（SEQ ID No:2）具有至少70%的同一性，更优选与HSA具有至少72、73、75、80、85、90、95、96、97、98、99、99.5%的同一性。与亲本白蛋白（诸如在序列表中提供的那些）相比，尤其是与SEQ ID No:2相比，白蛋白变体可以具有一个或多个（数个）点突变，例如K573P、K573Y、K573W、K500A（关于SEQ ID No:2描述突变，且本领域技术人员可以使用本文描述的EMBOSS软件通过白蛋白序列与SEQ ID No:2的比对而在其他白蛋白中识别出等效突变。对于与SEQ ID No:2具有约70～80%同一性的白蛋白（诸如小鼠白蛋白，例如SEQ ID NO:19），更优选阳离子至少存在250mM。
优选白蛋白以约1g.L-1～约400g·L-1的浓度存在于组合物中。例如，浓度可以从约1、5、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275g.L-1至约5、10、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375或400g·L-1。优选白蛋白的浓度为约50g·L-1～约200g·L-1。
有利地，组合物可以包含重组的白蛋白。换言之，白蛋白可以来源于重组的有机体诸如重组的微生物、重组的植物或重组的动物。由于一些使用者偏好无动物的成分，更优选白蛋白来源于非动物重组源，诸如重组的微生物或重组的植物。优选的微生物包括原核生物，更优选真核细胞诸如动物、植物、真菌或酵母，例如但不限于，已经将白蛋白成功表达为重组蛋白的以下物种：
-真菌（包括但不限于曲霉属（Aspergillus）（WO2006/066595）、克鲁维酵母属（Kluyveromyces）（Fleer，1991,Bio/technology9,968-975）、毕赤酵母属（Pichia）（Kobayashi，1998，Therapeutic Apheresis2,257-262）以及酵母属（Saccharomyces）（Sleep，1990,Bio/technology8,42-46）），细菌（Pandjaitab，2000,J.Allergy Clin.Immunol.105,279-285））；
-动物（Barash，1993,Transgenic Research2,266-276）；
-植物（包括但不限于土豆和烟草（Sijmons，1990,Bio/technology8,217和Farran，2002,Transgenic Research11,337-346）以及稻例如水稻（Oryza sativa）；
-哺乳动物细胞诸如CHO和HEK。
所有文献均通过引用的方式全部并入本文。
本发明的白蛋白优选在合适的宿主细胞中重组生产。优选非动物宿主细胞。优选的宿主是酵母，优选选自毕赤酵母属或酵母属，更优选为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。
优选的组合物包含50～250g·L-1的白蛋白、200～300mM的Na+、20～30mM的磷酸盐，包含少于2mM的辛酸盐（酯）且具有约6.0～7.0的pH。特别优选的组合物包含50～150g·L-1的白蛋白、225～275mM的Na+、20～30mM的磷酸盐，包含少于1mM的辛酸盐（酯）且具有约6.5的pH。
本发明的另一个方面提供组合物，其包含白蛋白、溶剂、至少175mM的阳离子，具有约5.0～约8.0或9.0的pH。这些组合物的优点是，制剂提供足够稳定以具有有利的保存期限且在用于哺乳动物细胞培养中时对哺乳动物细胞的健康无害的白蛋白。溶剂、阳离子、离子强度和pH的优选参数与本发明的第一方面中公开的那些相同。
根据本发明的白蛋白组合物可以提供在柔韧的聚合物容器中，诸如袋子。合适的容器体积包括约50mL～约10000mL，例如50mL、1000mL、5000mL和10000mL。优选容器包含一个或多个（数个）入口或出口，以使得可以填充容器和/或从袋子中分配。白蛋白组合物可以灭菌，例如，在装入容器之前或之后。
重组白蛋白的生产和很多宿主为本领域已知，宿主为诸如大肠杆菌（Escherichia coli）（EP73,646）、已经在WO00/44772、EP0683233A2和US5,612,196中有过报道的酵母、以及枯草芽孢杆菌（Bacillussubtillis）（Saunders等人,1987,J.Bacteriol.169,2917-2925）、曲霉属。白蛋白的生产已经在转基因植物诸如但不限于烟草、稻和玉米以及转基因动物诸如但不限于鸡和牛科中有过证明。
本发明的第二个方面提供细胞培养介质，包含如本文所述的组合物和基础培养基。例如，细胞培养介质可以用于哺乳动物细胞诸如人细胞的培养。例如，细胞培养介质可以用于干细胞或配子或胚胎的培养，例如用于辅助生殖技术（ART）目的的细胞培养。
优选细胞培养介质基本不含动物来源的成分。更优选细胞培养介质不含动物来源的成分。在上下文中，“动物来源”成分意指已经从动物获得的成分。不包括与动物来源成分相同或基本相同但是作为来自非动物体的重组成分而获得（而非从动物获得）的成分。非动物体包括植物诸如稻、微生物诸如酵母或细菌。
白蛋白制剂可以使用的细胞培养介质的实例包括在WO2008/009641（通过引用的方式全部并入本文）中描述的那些。
包含本发明第一个方面的白蛋白制剂的细胞培养介质可以包含或可以不包含一种或多种（数种）脂肪酸，诸如由脂肪酸补充物提供的。脂肪酸补充物是可商购获得的，例如可以从Sigma-Aldrich获得的F7050脂肪酸补充物（不含动物成分，液体的、无菌过滤的、适于细胞培养）。
本发明的第三个方面涉及本文所述的白蛋白制剂、组合物或细胞培养介质在培养细胞中的用途，诸如参照本发明第二个方面而描述的和/或在以下本发明第五个方面所描述的细胞的培养。
本发明的第四个方面涉及培育细胞的方法，包括在本文所述的培养介质中孵育细胞。细胞可以是参照本发明第二个方面描述的和/在以下本发明第五个方面描述的细胞。
本发明的第五个方面涉及本发明第一个方面的白蛋白制剂在药物产品中的用途。因此，本发明也提供包含白蛋白制剂和活性药物成分（API）的药物组合物。
本发明的第六个方面涉及高浓度阳离子在稳定白蛋白中的用途，例如，本发明第一个方面所述的至少175mM的阳离子。
本发明的组合物和介质可以用于培养多种细胞。在一个实施方式中，介质用于培养真核细胞诸如植物和/或动物细胞。细胞可以是哺乳动物细胞、鱼细胞、昆虫细胞、两栖动物细胞或鸟类细胞。介质可以用于培养选自MK2.7细胞、PER-C6细胞、NS0、GS-NS0、CHO细胞、HEK293细胞、COS细胞和Sp2/0细胞的细胞。MK2.7（ATCC目录号CRL1909）是对得自大鼠脾细胞与小鼠SP2/0骨髓瘤的融合体的杂交瘤细胞系进行表达的抗小鼠VCAM lgGl。MK2.7是可以在无血清培养介质中生长的非贴壁细胞系。其他类型的细胞可以选自5L8杂交瘤细胞、Daudi细胞、EL4细胞、HeLa细胞、HL-60细胞、K562细胞、Jurkat细胞、THP-1细胞、Sp2/0细胞；和/或通过引用并入本文的WO2005/070120表2中列出的杂交瘤细胞或在本文公开的或本领域技术人员已知的任何其他细胞类型的细胞。
优选的细胞包括干细胞，例如但不限于胚胎干细胞、胎儿干细胞、成体干细胞和多能干细胞诸如诱导的多能干细胞。特别优选的细胞是人胚胎干细胞、人胎儿干细胞、人成体干细胞和人多能干细胞诸如诱导的人多能干细胞。细胞系可以得自囊胚。细胞系可以对一种或多种（数种）以下细胞标记物检测阳性：POU5F1（OCT-4）、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81、ALPL、端粒酶活性、和/或hES-CellectTM（CellartisAB，瑞典哥特堡）。细胞系可以对细胞标记物ALPL和/或SSEA-1测试阴性。特别优选的细胞系包括SA121和SA181（Cellartis AB，瑞典哥特堡）。
另外的哺乳细胞类型可以包括，但不限于，包括原代上皮细胞（例如角质细胞、宫颈上皮细胞、支气管上皮细胞、气管上皮细胞、肾上皮细胞和视网膜上皮细胞）以及建立的细胞系及其株系（例如，293胚肾细胞、BHK细胞、HeLa宫颈上皮细胞和PER-C6视网膜细胞、MDBK（NBL-1）细胞、91 1细胞、CRFK细胞、MDCK细胞、CHO细胞、BeWo细胞、Chang细胞、Detroit562细胞、HeLa229细胞、HeLaS3细胞、Hep-2细胞、KB细胞、LS180细胞、LS174T细胞、NCI-H-548细胞、RPMI2650细胞、SW-13细胞、T24细胞、WI-28VA13、2RA细胞、WISH细胞、BS-C-I细胞、LLC-PK.sub.2细胞、Clone M-3细胞、1-10细胞、RAG细胞、TCMK-1细胞、Y-1细胞、LLC-PK.sub.1细胞、PK(15)细胞、GH.1细胞、GH3细胞、L2细胞、LLC-RC256细胞、MH.sub.IC1细胞、XC细胞、MDOK细胞、VSW细胞和TH-I、B1细胞或其衍生物）、来自任何组织或器官（包括但不限于心脏、肝、肾、结肠、肠、食道、胃、神经组织（脑、脊髓）、肺、血管组织（动脉、静脉、毛细血管）、淋巴组织（淋巴腺、腺样、扁桃体、骨髓和血液）、脾以及成纤维细胞和成纤维细胞样细胞系的成纤维细胞（例如，CHO细胞、TRG-2细胞、IMR-33细胞、Don细胞、GHK-21细胞、瓜氨酸血症细胞、Dempsey细胞、Detroit551细胞、Detroit510细胞、Detroit525细胞、Detroit529细胞、Detroit532细胞、Detroit539细胞、Detroit548细胞、Detroit573细胞、HEL299细胞、IMR-90细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、WI-26细胞、MiCl.sub.1细胞、CHO细胞、CV-1细胞、COS-1细胞、COS-3细胞、COS-7细胞、Vero细胞、DBS-FrhL-2细胞、BALB/3T3细胞、F9细胞、SV-T2细胞、M-MSV-BALB/3T3细胞、K-BALB细胞、BLO-11细胞、NOR-10细胞、C3H/IOTI/2细胞、HSDM.sub.IC3细胞、KLN205细胞、McCoy细胞、小鼠L细胞、株系2071（小鼠L）细胞、L-M株（小鼠L）细胞、L-MTK（小鼠L）细胞、NCTC克隆2472和2555、SCC-PSAl细胞、Swiss/3T3细胞、赤麂（Indianmuntjac）细胞、SIRC细胞、CII细胞和Jensen细胞、或其衍生物）。
细胞包括癌细胞，例如但不限于以下癌细胞系：人骨髓瘤（例如，KMM-1、KMS-11、KMS-12-PE、KMS-12-BM、KMS-18、KMS-20、KMS-21-PE、U266、RPMI8226）；人乳腺癌（例如，KPL-1、KPL-4、MDA-MB-231、MCF-7、KPL-3C、T47D、SkBr3、HS578T、MDA4355、Hs606（CRL-7368）、Hs605.T（CRL-7365）HS742.T（CRL-7482）、BT-474、HBL-100、HCC202、HCC1419、HCC1954、MCF7、MDA-361MDA-436、MDA-453、SK-BR-3、ZR-75-30、UACC-732、UACC-812、UACC-893、UACC-3133、MX-1和EFM-192A）；导管（乳腺）癌（例如，HS57HT（HTB-126）、HCC1008（CRL-2320）、HCC1954（CRL-2338）、HCC38（CRL-2314）、HCC1143（CRL-2321）、HCC1187（CRL-2322）、HCC1295（CRL-2324）、HCC1599（CRL-2331）、HCC1937（CRL-2336）、HCC2157（CRL-2340）、HCC2218（CRL-2343）、Hs574.T（CRL-7345）、Hs742.T（CRL-7482）；皮肤癌（例如，COLO829（CRL-1974）、TE354.T（CRL-7762）、Hs925.T（ClU-7677））；人前列腺癌（例如，MDA PCa2a和MDA PCa2b）；骨癌（例如，Hs919.T（CRL-7672）、Hs821.T（CRL-7554）、Hs820.T（CRL-7552）y HS704.T（CRL-7444）、HS707(A).T（CRL-7448）、HS735.T（CRL-7471）、HS860.T（CRL-7595）y HS888.T.（CRL-7622）、HS889.T（CRL-7626）、HS890.T（CRL-7628）、Hs709.T（CRL-7453））；人淋巴瘤（例如，K562）；人宫颈癌（例如，HeLA）；肺癌细胞系（例如，H125、H522、H1299、NCI-H2126（ATCCCCL-256）、NCI-H1672（ATCC CRL-5886）、NCI-2171（CRL-5929）、NCI-H2195（CRL05931）；肺腺癌（例如，NCI-H1395（CRL-5856）、NCI-H1437（CRL-5872）、NCI-H2009（CRL-5911）、NCI-H2122（CRL-5985）、NCI-H2087（CRL-5922）；转移性肺癌（例如,骨）(例如，NCI-H209（HTB-172）)；结肠癌细胞系（例如，LN235、DLD2、结肠A、LIM2537、LIM1215、LIM1863、LIM1899、LIM2405、LIM2412、SK-CO1（ATCC HTB-77）、HT29（ATCC HTB38）、LoVo（ATCCCCL-229）、SW1222（ATCC HB-11028）、和SW480（ATCC CCL-228）；卵巢癌（例如，OVCAR-3（ATCC HTB-161）和SKOV-3（ATCC HTB-77）；间皮瘤（例如NCI-h2052（CRL-5915）；神经内分泌癌（例如，HCI-H1770（例如，CRL-5893）；胃癌（例如，LIM1839）；神经胶质瘤（例如，T98、U251、LN235）；头颈鳞状细胞癌细胞系（例如，SCC4、SCC9和SCC25）；髓母细胞瘤（例如，Daoy、D283Med和D341Med）；睾丸非精原细胞瘤（例如，TERA1）；前列腺癌（例如，178-2BMA、Du145、LNCaP和PC-3）。其他癌细胞系为本领域熟知。
本文公开的介质可以用于悬浮培养细胞或培养贴壁细胞。本发明的介质适于贴壁、单层或悬浮培养，转染，和/或细胞培植，且适于蛋白质或抗体在单层或悬浮培养的细胞中的表达。
细胞培养可以使用多种培养装置进行，例如，发酵型箱式培养装置、气升型培养装置、培养瓶型培养装置、旋转瓶型培养装置、微载体型培养装置、流化床型培养装置、中空纤维型培养装置、滚瓶型培养装置或填充床型培养装置或本领域技术人员已知的任何其他合适装置。
本发明通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应理解为对本发明的范围的限制。
实施例
实施例1：N-乙酰-色氨酸、磷酸盐浓度和钠浓度对白蛋白稳定性的影
响
目的：先前的工作表明，通过在350nm的吸收增加，在65℃下监测不可溶聚集物的形成，对于筛选不同制剂（组合物）参数对白蛋白的稳定性的影响是有效的方法。由于辛酸盐（酯）和聚山梨醇酯80显示出对干细胞生长有害，优选白蛋白制剂基本不含这些成分。本实施例分析pH、钠离子和缓冲液浓度对白蛋白稳定性的影响。用于白蛋白的普通稳定剂为N-乙酰-色氨酸，因此，其包括在本实施例中作为测试成分。
方法：在145mM NaCl中的100mg/mL的白蛋白（白蛋白批次1401）根据表3稀释到10mg/mL。用于稀释的缓冲液示于表1和2中。
| 表1 | rHSA浓度 | Na摩尔浓度 | 色氨酸摩尔浓度 |
| （g/L） | （mM） | （mM） | |
| rHSA溶液（1401） | 100 | 154 | |
| 5M NaCl | 5000 | ||
| 色氨酸 | 501 | 500 |
表2
| 缓冲储备液 | 磷酸盐（mM） | Na（mM） |
| 0.5M磷酸盐pH4 | 502 | 500 |
| 0.5M磷酸盐pH5 | 500 | 518 |
| 0.5M磷酸盐pH6 | 500 | 634 |
| 0.5M磷酸盐pH7 | 500 | 851 |
| 0.5M磷酸盐pH8 | 500 | 970 |
| 0.5M磷酸盐pH9 | 500 | 992 |
一旦稀释，样本用1MHCl调节到它们的目标pH，HCl的体积不显著且不改变最终白蛋白或组成成分的浓度。然后，将小份（1mL）的所得溶液置于聚苯乙烯比色皿中（Sarstedt10×4×45mm）。然后，将比色皿置于已经预平衡并控制在65℃的温控的分光光度计中。然后，参照空的比色皿，在2小时期间用每18秒读取的读数来监测在350nm的吸光度。数据通过取得最初7个数据点、使它们平均（计算均值）并且从所有数据点中扣减该均值而进行处理，以给出约0的基础吸光度值。之后，对于特定制剂样本，记录吸光度在基线上增加0.1个AU（吸光度单位）所用的时间。各个制剂样本以两个平行进行，并且将各个重复的吸光度增加0.1个AU的时间平均化。
结果：对于各个所测试的制剂成分N-乙酰-色氨酸、磷酸盐浓度和钠浓度，各个样本增加0.1个AU的时间的处理数据绘制成，使吸光度增加的时间针对pH。7200秒之上的值是推算的。数据呈现于图1（pH和N-乙酰基色氨酸）、2（pH和磷酸盐）以及3（pH和钠）。
结论：
对于所有数据，除50mM的钠以外，最佳pH在pH6和7之间。对于50mM的钠，虽然不可溶聚集物没有形成，可能的是，高水平的可溶寡聚物正在生成且它们不合并形成不可溶的聚集物。可溶的聚集物可以通过GP-HPLC来鉴定。
对于磷酸盐缓冲液的浓度，在50和100mM之间没有显著差异。但是，0mM的磷酸盐确实在pH6到8之间显得更稳定。虽然不使用磷酸盐在稳定性方面是最佳的，缓冲液的使用有助于pH控制，例如，因为其降低或消除在配制之前白蛋白的pH调节的需求。
递增的钠水平对稳定性具有显著影响，其中稳定性在145和300mM钠之间具有大的增加。
实施例2：递增的钠浓度对白蛋白的稳定性的影响
目的：实施例1表明，增加的钠水平对白蛋白的稳定性具有有利的影响。为进一步调查，在最佳pH范围下调查比实施例1更宽范围内的钠的递增浓度。
方法：在145mM NaCl中的100mg/mL的白蛋白（白蛋白批次1401）根据表6稀释到10mg/mL。用于稀释的缓冲液示于表4和5中。
表5
| 缓冲储备液 | 磷酸盐（mM） | Na（mM） |
| 0.5M磷酸盐pH4 | 502 | 500 |
| 0.5M磷酸盐pH5 | 500 | 518 |
| 0.5M磷酸盐pH6 | 500 | 634 |
| 0.5M磷酸盐pH7 | 500 | 851 |
| 0.5M磷酸盐pH8 | 500 | 970 |
| 0.5M磷酸盐pH9 | 500 | 992 |
稀释通过首先将白蛋白和缓冲液混合为主体并然后通过添加1MHCl将其调整到正确的pH而进行。然后，将其划分，并适当加入水和5M NaCl。这确保所有样本处在完全相同的pH。然后，小份（1mL）的所得溶液置于聚苯乙烯比色皿中（Sarstedt10×4×45mm）。然后，将比色皿置于已经预平衡且控制在65℃的温控的分光光度计中。然后，参照空比色皿，在2小时期间用每18秒读取的读数来检测在350nm的吸光度。数据通过获取最初7个数据点、使它们平均（计算均值）并然后从所有数据点中扣除该均值而进行处理，以给出约0的基础吸光度值。之后，对于特定的制剂样本，记录吸光度在基线上增加0.1个AU（吸光度单位）所用的时间。各个制剂样本以两个平行进行，并且使各个重复的吸光度增加0.1个AU的时间平均化。
结果：对于各个pH，各个样本增加0.1个AU的时间的处理数据绘制成，使吸光度增加的时间针对Na浓度。7200秒之上的值是推算的。数据呈现于图4中。
结论：
与实施例1一致，递增水平的钠增加白蛋白的稳定性。特别在约200mM的情况下，稳定性在该条件下具有突然的增加。这是对于所有pH的情况，尽管在pH6时较为不明显，因为即使在<200mM，递增的盐仍有有利影响。在约200mM处增加的事实在以前没有观察到的原因也许是，因为大部分其他白蛋白制剂为150mM或更低以使它们保持接近生理。对于用在细胞培养介质中的白蛋白，这应该不是问题，因为白蛋白将稀释到介质中，且介质中的总盐浓度将适于细胞培养。
pH6比pH6.5稍好，两者均显著优于pH7。
实施例3：钠浓度对不同浓度的白蛋白的稳定性的影响
目的：实施例2表明，钠浓度对白蛋白的稳定性是重要的。实施例2在白蛋白浓度为10mg/mL时做出。为证实该影响在较高浓度下也是真实的，调查了在较高白蛋白浓度下钠的影响。
方法：在145mM NaCl中的100mg/mL的白蛋白（白蛋白批次1401）根据表9稀释到50或90mg/mL。用于稀释的缓冲液在表7和8中示出。
表8
| 缓冲储备液 | 磷酸盐（mM） | Na（mM） |
| 0.5M磷酸盐pH4 | 502 | 500 |
| 0.5M磷酸盐pH5 | 500 | 518 |
| 0.5M磷酸盐pH6 | 500 | 634 |
| 0.5M磷酸盐pH7 | 500 | 851 |
| 0.5M磷酸盐pH8 | 500 | 970 |
| 0.5M磷酸盐pH9 | 500 | 992 |
稀释通过首先将白蛋白和缓冲液混合为主体并然后通过添加1MHCl将其调整到正确的pH而进行。然后，将其划分，并适当加入水和5M NaCl。这确保所有样本处在完全相同的pH。
然后，小份（1mL）的所得溶液置于聚苯乙烯比色皿中（Sarstedt10×4×45mm）。然后，将比色皿置于已经预平衡且控制在65℃的温控的分光光度计中。然后，参照空比色皿，在2小时期间用每18秒读取的读数来检测在350nm的吸光度。数据通过获取最初7个数据点、使它们平均（计算均值）并然后从所有数据点中扣除该均值而进行处理，以给出约0的基础吸光度值。之后，对于特定的制剂样本，记录吸光度在基线上增加0.1个AU（吸光度单位）所用的时间。各个制剂样本以两个平行进行，并且使各个重复的吸光度增加0.1个AU的时间平均化。
结果：对于50mg/mL白蛋白的各个pH（6.0，6.5和7.0），以及针对pH6.5的三个不同白蛋白浓度（10、50和90mg/mL），将各个样本增加0.1个AU的时间的处理数据绘制成，使吸光度增加的时间针对Na浓度。数据呈现于图5和图6中。
结论：
在50mg/mL的白蛋白时，递增的钠浓度改善白蛋白的稳定性的趋势在所有3个pH下得到证实。在这种情况下，pH6.5为最佳。
在pH6.5时，递增的钠改善稳定性的趋势再次在所有白蛋白浓度下得到证实。这种趋势在90g/L时不明显，但情况是，200mM以上的钠浓度显著改善白蛋白的稳定性。
实施例4：钠浓度对白蛋白中可溶聚集物的产生的影响
目的：实施例1～3使用测量不可溶聚集物的制剂筛选检定来示出，递增的钠浓度改善白蛋白的稳定性。为评判可溶的聚集物（白蛋白多聚体），需要将GP-HPLC用作测量工具，其中多聚体的形成在2周时间段内在40℃下的加速稳定性试验中监测。该测试在pH6.5下进行，因为此pH由实施例1～3示为优选的pH。在先前制剂条件（pH8.6，150mM Na）中的白蛋白对照也用于证实新制剂是显著有利的。实际的白蛋白浓度为90mg/mL而非预期的100mg/mL，因为此浓度是最高可使用的使得可以稀释到各种制剂的浓度。但是，认为在此稍低浓度时观察到的趋势将与在较高白蛋白浓度观察到的趋势相同。
方法：在145mM NaCl中的100mg/mL的白蛋白（白蛋白批次1401）根据表12稀释到90mg/mL。用于稀释的缓冲液示于表10和11。
| 表10 | rHSA浓度(g/L) | Na摩尔浓度(mM) |
| rHSA溶液（1401） | 100 | 154 |
| 5M NaCl | - | 5000 |
表11
*27%w/wNaOH密度=1.3
稀释通过首先将白蛋白和缓冲液混合为主体并然后通过添加1MHCl将其调整到正确的pH而进行。然后，将其分成合适大小的小份，并按需加入水和5M NaCl。这确保所有的样本处在完全相同的pH。
然后，将10mL的各个样本无菌过滤到烘干的用无菌丁基橡胶密封条塞住的10mL玻璃瓶中，并然后顶封。然后，取约200μL的T0样本，将小瓶置于设定在40℃的水浴中。14天后，从各个小瓶中取样本（约200μL），稀释2倍并以三组平行注入GP-HPLC系统中。
GP-HPLC系统通过注射（25μL）到具有6.0mm内径×40mm长度TSK SW保护柱（Tosoh Bioscience）的7.8mm内径×300mm长度TSK G3000SWXL柱中（Tosoh Bioscience）而运行。样本在25mM磷酸钠、100mM硫酸钠、0.05%（w/v）叠氮化钠中以pH7.0和1mL/min进行色谱分析并通过280nm UV检测而监测。单体、二聚物、三聚物和多聚体的含量通过它们相对于总峰面积的各自峰面积而定量为%w/w。将来自三次重复注射的结果平均化以得到各个样本的均值结果。
结果：单体（图7）和多聚体（图8）的14天时间点的数据针对钠浓度作图。
结论：
对于白蛋白批次1401，pH6.5的制剂显著优于pH8.6的制剂。多聚体的水平在pH8.6时显著增加，在40℃下2周之后，上升到约20%，而在pH6.5下的相同钠浓度的为约2%。
用筛选检定观察到的增加钠则增加白蛋白稳定性的所提议的趋势在此处对于可溶聚集物证实为，多聚体形成随递增的钠浓度而降低的显著趋势。从接近生理条件的标准白蛋白浓度150mM开始，到200mM钠，多聚体的水平下降>2倍，之后，从200到250mM，进一步下降约2倍。尽管多聚体在高达350mM（且可能更高）的更高盐浓度下进一步下降，下降的速率变慢。这些结果与剩余单体随增加的钠而增加相匹配。总的来说，从150mM到250mM钠，多聚体形成下降>4倍。结果，优选的白蛋白制剂是25mM磷酸盐缓冲液pH6.5、250mM钠。存在磷酸盐以帮助pH控制。明显地，钠将来自氯化钠和磷酸钠两者（包括用于确保磷酸盐的pH为正确的任何NaOH），因此缓冲液不是250mM NaCl。
尽管工作均已经使用钠而进行，预期相似的单价或二价金属离子具有相似的作用。然而，钠是优选的金属离子，因为已知其与干细胞培养相容。
实施例5：白蛋白浓度和钠离子浓度对白蛋白的稳定性的影响
方法：包含低的辛酸盐（酯）（约0.2mM辛酸盐（酯），100g/L白蛋白）的纯化白蛋白样本使用10KDa Pall Omega错流UF经最少10个连续体积的25mM磷酸盐、50mM钠pH6.5进行渗滤（diafiltered），然后浓缩到338g/L，以产生50mM钠起始材料。然后，样本用表13所示的水、5M NaCl和0.5M磷酸钠pH6.5进行稀释：
然后，样本无菌过滤（0.22μm过滤器）到无菌的5mL玻璃瓶中，且将小瓶放置在40℃孵育箱中4周。以一定间隔从各个样本取出小份，用水稀释到40g/L并如实施例4般通过GP-HPLC检定可溶的聚集物。
结果：图11示出在4周孵育之后的单体的水平。较高的单体含量表明较好的稳定性。
结论：
除150g/L白蛋白、100mM钠的样本以外，所有点均遵循趋势。不清楚为什么该样本不在趋势之内，但很可能是异常值且无损于该实验的总体结论。
对于所有测试的白蛋白浓度，与递增的单体含量有明确的相关性，即，递增的稳定性与递增的钠含量。
多数的改善稳定性伴随着递增的钠离子浓度直到约200mM。在此浓度之上，虽然有稳定性的进一步增加，但其基本上是平稳的。结果，最佳钠离子浓度是200mM或更高。
实施例6：不同阳离子对白蛋白的稳定性的影响
方法：包含低的辛酸盐（酯）（约0.2mM100g/L白蛋白）的纯化白蛋白样本最初用水稀释到50mg/mL，使得其包含50mg/mL白蛋白、75mM NaCl且无pH缓冲成分。pH用0.5M HCl调节到pH6.43，添加的HCl的量不显著且不改变白蛋白或其他成分的浓度。然后，样本使用表14中示出的1M阳离子储备液（KCl、NH4Cl、CaCl2、MgCl2、NaCl）在UV透明微量滴定板的孔中进一步稀释到10mg/mL。
根据表14制备针对各个KCl、NH4Cl、CaCl2、MgCl2、NaCl的样本。因此，总计制备40个不同的样本。各个样本在微量滴定板上成对测试。
微量滴定板轻微地摇晃以混合各个孔的内容物，离心以去除任何气泡并置于已经预平衡并控制在65℃的Biotek Synergy Mx（英国，波顿）酶标仪中。之后，在8小时的总孵育时间内，每分钟在350nm读板。使用Gen5软件（用于2.00.18版酶标仪的Biotek软件）以计算A350nm吸光度在基线上增加0.2个吸光单位所用的时间。基线从最初5个数据点的均值中计算。
结果：图12示出样本吸光度在基线上增加0.2个单位所用的时间。时间越长表明稳定性越好。
结论：
使用NaCl的对照示出与其他样本相同的趋势，即，递增的钠水平改善稳定性。这证实微量滴定板法适于测试稳定性影响。
对于所有的不同阳离子，单价和二价（分别为1族金属和2族金属），随着增加的阳离子浓度，白蛋白的稳定性有明确增加，直到500mM以及可能超出该值。
这些数据表明，所有阳离子均改善白蛋白的稳定性，MgCl2为非常好。
实施例7：不同阴离子对白蛋白的稳定性的影响
方法：包含低浓度的辛酸盐（酯）（约0.2mM，100g/L白蛋白）的纯化白蛋白样本最初用水稀释到50mg/mL，使得其包含50mg/mL白蛋白、75mM NaCl且不包含pH缓冲成分。样本的pH用0.5M HCl调节到6.43，添加的HCl的量不显著且不会改变白蛋白或组成成分的浓度。1M钠阴离子储备液根据表15来制备。
表15：阴离子储备液
*MW：分子量
白蛋白和阴离子储备液如下所述般使用，配制成在聚苯乙烯比色皿（Sarstedt10×4×45mm）中的1mL终体积。在将比色皿放置在已经预平衡且控制在65℃的温控分光光度计中之前，轻轻地混合样本。然后，参照空的比色皿，在2小时的时间段内用每30秒读取的读数来监测350nm的吸光度。数据通过取得最初的9个数据点（约最初4分钟）、计算均值（平均值）并然后从所有数据点中扣除该均值而进行处理，以给出基础吸光度。之后，对于具体的样本，记录吸光度在基线上增加0.1个AU所用的时间。如果吸光度在2小时（7200秒）内没有升高0.1个AU，则推算出数据，以给出大概的时间。与具有较低的阳离子浓度的样本相比，吸光度在2小时内没有升高0.1个AU的样本在稳定性方面有显著提高。
使用分光光度计中的6比色皿支架，其中第一个样本总是对照且其他5个样本使用递增的赋形剂（即，测试材料诸如NaCl、Na2SO4）浓度。对照总是包含250mM NaCl的pH6.5样本，需要该样本以保持溶液在完整的2个小时的65℃孵育中没有不可溶聚集物，以使测试被认为是有效的。
表16
*阴离子储备液记载在表15中
对于柠檬酸盐样本，当通过A350nm吸光度增加的检测来测量不可溶聚集物时，钠的稳定影响不确定。因此，在分光光度计中65℃孵育2小时之后，将样本移除，离心去除任何大颗粒，并通过GP-HPLC来分析样本的可溶聚集物（按照实施例4）。数据表达为剩余单体白蛋白%（值越高，制剂越稳定）。也对磷酸盐样本做此操作。
结果：所有对照均有效。图13示出钠离子浓度和阴离子种类对A350吸光度在基线上增加0.1个AU所用的时间的影响。图14示出柠檬酸盐、磷酸盐和钠对65℃孵育2小时后的白蛋白的稳定性的影响。较高的单体水平表明较高的稳定性。对于同时运行的pH6.5的对照（250mM钠）的结果给出81%单体含量的均值结果。
结论：
氯化钠（无机酸的钠盐）、硫酸钠（二价酸的钠盐）和醋酸钠（有机酸的钠盐）均给出白蛋白的稳定性随递增的钠浓度而变的较强增加。
对于磷酸二氢钠，此趋势不如氯化钠、硫酸钠和醋酸钠强烈。但是，在150mM以上时，存在稳定性随递增的钠含量而变的递增趋势。在测量可溶的聚集物时，正如由剩余单体随钠浓度递增而递增的强烈趋势所示出的，上述趋势被证实。
对于磷酸钠样本，稳定性随着递增的钠浓度而递增的趋势持续到600mM钠，且很可能持续到更高的钠浓度。
对于柠檬酸钠，正如对于不可溶聚集物的存在而通过A350nm吸光度所测量的，没有明显的白蛋白稳定性随钠浓度而变的趋势。但是，当样本（在65℃下孵育2小时后）通过GP-HPLC测量剩余单体含量%而对可溶聚集物进行评测时，则存在趋势。在200mM钠以下，单体含量相当平直，随着钠含量增加到200mM以上，存在确切的递增单体含量的趋势，即白蛋白稳定性递增的趋势。柠檬酸盐是螯合剂，因此存在的钠被螯合到柠檬酸盐，且不大可能如NaCl提供的钠一样地稳定白蛋白。
结果，当前的发明人相信，任何钠盐（或基于先前实施例的任何其他单价或二价阴离子）将以稳定性随阴离子浓度递增而递增的趋势对白蛋白赋予稳定性。
实施例8：不同缓冲液对白蛋白的稳定性的影响
方法：将包含低浓度的辛酸盐（酯）（约0.2mM，100g/L白蛋白）的纯化白蛋白样本最初用水稀释到50mg/mL，使得其包含50mg/mL白蛋白、75mM NaCl且不包含缓冲成分。样本的pH用0.5M HCl调节到pH6.43，加入的HCl的量不显著且不会改变白蛋白或成分的浓度。
制备1M NaCl的不缓冲储备液与以下按照白蛋白储备液将pH调节到6.43的缓冲液（表17）（使得当加到白蛋白时，pH不会改变）。对于磷酸盐，pH用27%NaOH调节，对于柠檬酸盐，其用柠檬酸（柠檬酸粉末）调节，且对于醋酸盐，其用醋酸（冰醋酸）调节。
表17
添加的酸的量不显著且不会改变白蛋白或成分的浓度。
白蛋白和缓冲液储备液如下所述般使用，配制成在聚苯乙烯比色皿（Sarstedt10×4×45mm）中的1mL终体积。在将比色皿放置到已经预平衡且控制在65℃的温控分光光度计中之前，轻轻地混合样本。然后，参照空的比色皿，在2小时时间段内用每30秒读取的读数来监测350nm吸光度。数据通过取得最初9个数据点（约最初4分钟）、计算均值并然后从所有数据点中扣除该均值而进行处理，以给出基础吸光度。对于具体的制剂样本，记录吸光度在基线上增加0.1个AU而所用的时间。如果吸光度在2小时（7200秒）内没有升高0.1个AU，则推算数据，以得到大概时间。
使用分光光度计中的6比色皿支架，其中第一个样本总是对照且其他5个样本使用递增的赋形剂浓度。对照总是包含250mM NaCl的pH6.5样本，需要该样本以保持溶液在完整的2个小时的65℃孵育中没有不可溶的聚集物，以使测试被认为是有效的。
*缓冲液储备液如同表17
结果：所有对照是有效的。对于样本，A350吸光度在基线上增加0.1个AU所用的时间针对钠浓度进行绘图。图15示出，对于所有缓冲液，白蛋白的稳定性随着钠离子浓度增加而增加。
对于柠檬酸盐样本，趋势相对于其他样本似乎是抵消的。结果，没有缓冲液（钠仅由NaCl提供）的数据与用柠檬酸钠缓冲的样本一起绘制，但是来自柠檬酸钠的钠浓度被忽略（图16）。
结论：
对于所有缓冲液，以及无缓冲液，存在明确的白蛋白稳定性随着钠浓度递增而递增的趋势。
甚至对于表现为不如NaCl那样好的白蛋白稳定性用钠供体的柠檬酸盐，存在在递增的钠浓度之内的递增稳定性的趋势，但是被轻微抵消。抵消的原因是，如同对于所有缓冲液，来自缓冲液的钠被用在总钠含量的计算中。结果，如果该钠不与来自氯化钠的钠（如在先前实施例中示出的）一样有效（例如，可用的），则存在抵消。这通过图16来证实。
磷酸钠是好的pH缓冲液，但是作为用于稳定作用的钠供体，存在更好的供体，因此，将磷酸钠与另一个阳离子供体（钠或其他阳离子）合并用于稳定白蛋白可能是有利的。
结果，当前的发明者相信，制剂中的缓冲液不是特别重要，且可以使用任何缓冲液或不使用缓冲液。但是，如果缓冲液是螯合的，由缓冲液出现的阴离子不应该包括在所需的阴离子浓度的计算中。
实施例9：高盐浓度对白蛋白变体的稳定性的影响
方法：将多种白蛋白和变体（表19）用0.5M磷酸钠缓冲液（pH6.5）稀释。这些变体是具有点突变（K573P、K500A、K573Y、K573W）的成熟HSA（SEQ ID No:2）和小鼠血清白蛋白（MSA，SEQ ID No:19）。白蛋白变体储备液的rHSA浓度和钠离子浓度提供在表20中。
*HSA野生型掺入5μL2M辛酸盐（酯）（等效于4mM辛酸盐（酯），100g/L）
**白蛋白：参见表20
***磷酸盐（0.5M，pH6.5）记载在表20b中
| 表20 | rHSA浓度（mg/mL） | Na（mM） |
| K573P储备液 | 104.8 | 145 |
| K500A储备液 | 96.7 | 145 |
| K573Y储备液 | 76.2 | 145 |
| K573W储备液 | 67.7 | 145 |
| K573H储备液 | 87.5 | 145 |
| K573F储备液 | 81.8 | 145 |
| HSA野生型 | 100 | 150 |
| 小鼠 | 95.8 | 145 |
因为所有变体已经不同于野生型人白蛋白进行了轻微纯化，存在的辛酸盐（酯）的水平对于各个变体将轻微不同。从先前的结果评估出，在变体中存在的辛酸盐（酯）将已经等同于100g/L白蛋白时的约4mM。因为野生型储备液具有可忽略水平的所存在辛酸盐（酯），储备液随后掺入5μL的2M辛酸盐（酯）到终体积中，以相对于变体白蛋白给出大致相当浓度的辛酸盐（酯）。
白蛋白储备液和1M NaCl储备液根据表21来使用，各个样本配制成在聚苯乙烯比色皿（Sarstedt10×4×45mm）中的1mL终体积。在将比色皿放置到已经预平衡且控制在65℃的温控分光光度计中之前，轻轻地混合样本。然后，参照空的比色皿，在2小时时间段内用每30秒读取的读数来监测350nm吸光度。数据通过取得最初9个数据点（约最初4分钟）、计算均值并然后从所有数据点中扣除该均值而进行处理，以给出基础吸光度。对于具体的制剂样本，记录吸光度在基线上增加0.1个AU而所用的时间。如果吸光度在2小时（7200秒）内没有升高0.1个AU，则推算数据，以得到大概时间。
使用分光光度计中的6比色皿支架，其中第一个样本总是对照且其他5个样本使用递增的赋形剂浓度。对照总是包含250mM NaCl的pH6.5样本，需要该样本以保持溶液在完整的2个小时的65℃孵育中没有不可溶的聚集物，以使测试被认为是有效的。
*白蛋白浓度提供在表20中
结果：所有对照均有效。图17和18示出钠离子浓度对A350吸光度在基线之上增加0.1个AU所用的时间的影响。
结论：
除野生型白蛋白、150mM钠的样本以外，所有点均遵循趋势。不清楚为什么该点不在趋势之内，但很可能是异常值而无损于整体结论。
对于所有的白蛋白变体，存在明确的白蛋白稳定性随钠浓度递增而递增的趋势。
成熟小鼠血清白蛋白（SEQ ID No:19）与成熟的野生型人血清白蛋白（SEQ ID NO:2）为72.1%相同（使用本文描述的算法），尽管总稳定性不如HSA或HSA变体高，仍然有稳定性随着200mM以上的钠浓度递增而递增的明确趋势。
由于有关所存在的辛酸盐（酯）水平的基础配制没有在各个变体之间绝对控制为相同，因为难以比较变体的稳定性与野生型白蛋白的稳定性，因此很难说是否在不同变体之间存在显著的稳定性差异。但是，在对于各个变体的数据集范围内，辛酸盐（酯）的水平将是相同的，因此稳定性的增加可以仅归因为钠水平的递增。
已知辛酸盐（酯）的一个样本（野生型人血清白蛋白，相当于100g/L白蛋白下4mM）示出，观察到的随钠而变的稳定性增加在此辛酸盐（酯）水平下也有效。
实施例10：pH对白蛋白的稳定性的影响
方法：包含低辛酸盐（酯）（约0.2mM，100g/L白蛋白）的纯化白蛋白的样本最初根据表22使用表23的磷酸盐储备液而稀释到50mg/mL。
*磷酸钠缓冲储备液记载在表23中
表23
样本的pH用0.5M HCl调节（即没有添加钠）以使用pH5储备液给出5.02和5.55的最终pH、用pH6.5储备液给出6.00和6.49的最终pH、使用pH7储备液给出7.04的pH、以及使用pH8储备液给出7.55和7.98的pH。添加的HCl的量不显著且不会改变白蛋白或组成成分的浓度。
储备液如下所述般（表24）使用，配制成在聚苯乙烯比色皿（Sarstedt10×4×45mm）中的1mL终体积。在将比色皿放置到已经预平衡且控制在65℃的温控分光光度计中之前，轻轻地混合样本。然后，参照空的比色皿，在2小时时间段内用每30秒读取的读数来监测350nm吸光度。数据通过取得最初9个数据点（约最初4分钟）、计算均值并然后从所有数据点中扣除该均值而进行处理，以给出基础吸光度。对于具体的制剂样本，记录吸光度在基线上增加0.1个AU而所用的时间。如果吸光度在2小时（7200秒）内没有升高0.1个AU，则推算数据，以得到大概时间。
使用分光光度计中的6比色皿支架，其中第一个样本总是对照且其他5个样本使用递增的赋形剂浓度。对照总是包含250mM NaCl的pH6.5样本，需要该样本以保持溶液在完整的2个小时的65℃孵育中没有不可溶的聚集物，以使测试被认为是有效的。
*白蛋白储备液记载在表23中
对于pH7（测量为pH7.04）、7.5（测量为pH7.55）和8（测量为pH7.98）样本，当通过A350nm吸光度增加的检测来测量不可溶聚集物时，钠的稳定性影响是不确定的。因此，在分光光度计中65℃孵育2小时之后，移除样本，离心去除任何大颗粒，且并通过GP-HPLC来分析样本的可溶聚集物（按照实施例4）。数据表达为剩余单体白蛋白%（该值越高，制剂越稳定）。
结果：所有对照均有效。图19、20和21示出相对于钠离子浓度的白蛋白稳定性。在与pH7、7.5和8样本同时运行的pH6.5对照结果给出82%单体含量的均值。
结论：
对于所有从pH5到pH6.5的pH，清楚的是，如通过A350吸光度增加（不可溶聚集物）所测量的，白蛋白稳定性随递增的钠浓度而增加。
在pH7、7.5和8时，该趋势不清晰（图19），其中在150mM Na左右可能有稳定性的下跌。但是，当这些样本通过GP-HPLC来分析可溶聚集物和剩余单体%时（图21），存在稳定性随钠递增而递增的明确趋势。该趋势在不可溶聚集物中观察不到的原因可能是由于这些pH离白蛋白的pI（对于白蛋白为5.2）最远的事实，因此，它们不太可能从溶液中沉淀聚集物。
在相同的钠离子浓度（250mM）时，pH6.5对照的剩余单体水平要高于任何更高的pH，表明pH6.5对于白蛋白而言是更稳定的pH。
结合不可溶和可溶聚集物两者的数据，示出从pH5到pH8，递增的钠浓度增加白蛋白的稳定性。
实施例11：辛酸盐（酯）对干细胞培养的影响
方法：辛酸盐（酯）对干细胞培养的影响通过合同研究组织CellartisAB（哥特堡，瑞典）进行。简而言之，在标准的干细胞培养基中使用具有变化的辛酸盐（酯）水平（0.2、0.5、1.0和8.0mM）的100g/L白蛋白作为白蛋白补充物。人胚胎干细胞（细胞系SA121和SA181（Cellartis AB，保藏在欧洲人类胚胎干细胞登记处的细胞系））从它们的标准培养基中转移，并在6孔板中在补充有包含变化的辛酸盐（酯）水平的白蛋白的培养基中经5次传代而生长。5次传代中的细胞生长通过在细胞生产的连续传代过程中监测细胞倍增时间而进行评估。培养物的倍增时间应该在28～40小时的范围内，并且可以视为趋势指示物。为确定补充有白蛋白的培养基中的5次传代之后细胞的未分化状态，针对用于未分化状态的四种不同的可接受标记物的抗体，即Oct-4、SSEA-3、Tra-160和hES-Cellect被用于免疫染色。
结果：表25示出倍增时间的数据。初始倍增时间相当高，很可能是由于细胞需要调整到新的培养基组合物。但是，传代2和传代4之间的倍增时间均在预期的范围内，除包含8mM辛酸盐（酯）的样本以外，包含8mM辛酸盐（酯）的样本没能保持可接受的细胞附着并且即使用改良的培养基和涂覆条件也不能持续超过2次传代。传代5的倍增时间高度变化，且对于一些样本，显著地位于标准范围之外。然而，难以得出结论，因为培养没有进一步展开。
表25：5次传代中各个细胞系的以小时计的倍增时间。倍增时间以小时表示，且所使用的公式为Td(h)=T*LOG2/LOG（收获的细胞/接种的细胞）。T=传代之间的以小时计的时间
表26示出分化标记物的免疫细胞化学染色，并示出所有样本（除包含8mM辛酸盐（酯）的样本以外，因为其没有达到5次传代）均支持培养，以保持所测试的5次传代的未分化状态。
表26：使用针对Oct-4、Tra-160、SSEA-3、hES-CellectTM和SSEA-1的抗体而染色的细胞所进行的免疫细胞化学染色的小结。（+++）代表优良的染色且易于检测，而（-）代表没有可检测的染色。
结论：
存在于白蛋白中的辛酸盐（酯）的水平对于干细胞附着、未分化细胞生长的维持较为重要。在100g/L白蛋白中8mM辛酸盐（酯）的情况下，辛酸盐（酯）对于干细胞是有毒的且不能使得它们附着到表面或进行细胞生长。
本文所述并要求保护的发明不限制于本文公开的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明的多个方面的说明。任何等效方面均意在本发明的范围之内。确实，除本文示出和描述的那些以外，本发明的多种修改，基于以上描述，将变得对本领域技术人员显而易见。这样的修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，本公开，包括定义，将做出控制。
Claims (21)
1.一种组合物，包含白蛋白、溶剂、至少200mM阳离子，且具有约5.0～约8.0的pH，其中，所述组合物包含少于或等于5mM的辛酸盐（酯）。
2.根据权利要求1所述的组合物，包含少于或等于1mM的辛酸盐（酯）。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述阳离子以200～1000mM存在。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中，所述阳离子以200～350mM存在。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其中，所述pH为约6.0～约7.0。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物，其中，所述pH为约6.5。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子选自钠、钾、钙、镁、和铵。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的组合物，其中，所述阳离子是钠离子。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的组合物，其包含：
（a）少于5mM的氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸），优选少于1mM的氨基酸；和/或
（b）少于20mg·L-1的洗涤剂（例如聚山梨醇酯80），优选少于5mg.L-1的洗涤剂。
10.根据权利要求8所述的组合物，其基本不含氨基酸（例如N-乙酰基色氨酸）和/或基本不含洗涤剂（例如聚山梨醇酯80）。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的组合物，其中，所述白蛋白、变体或衍生物是白蛋白或白蛋白变体的融合体或缀合物。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的组合物，其中，所述白蛋白处于1g·L-1～400g·L-1的浓度。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的组合物，其中，所述白蛋白是重组白蛋白。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的组合物，其包含：
（a）50～250g·L-1的白蛋白；
（b）225～275mM的Na+；
（c）20～30mM的磷酸盐；
且具有约6.5的pH，其中，所述组合物包含少于2mM的辛酸盐（酯）。
15.根据权利要求1～14中任一项所述的组合物，其基本不含辛酸盐（酯）。
16.一种细胞培养介质，包含任一前述权利要求所述的组合物以及基础培养基。
17.根据权利要求16所述的细胞培养介质，其中，所述细胞培养介质是干细胞培养介质。
18.根据权利要求16或17所述的细胞培养介质，其中，所述细胞培养介质基本不含动物来源的成分。
19.权利要求1～15中任一项所述的组合物或权利要求16～18中任一项所述的细胞培养介质在培养细胞中的的用途。
20.一种培养细胞的方法，包括在权利要求16～18中任一项所述的细胞培养介质中孵育细胞。
21.根据权利要求19或20所述的用途或方法，其中，所述细胞包括干细胞。
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