CN117645972A - 一种脐带间充质干细胞修复因子制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种脐带间充质干细胞修复因子制备方法。本发明首次从脐带间充质干细胞中提取分离得到修复因子，该修复因子具备良好的促成纤维细胞增殖活性，且能有效促成纤维细胞分泌I型和III型胶原，可用于皮肤损伤修复，尤其适用于因灼伤导致的皮肤损伤。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，特别涉及一种脐带间充质干细胞修复因子制备方法。
背景技术
脐带间充质干细胞是一种富含于人脐带组织中的成体间充质干细胞。这些干细胞具有多向分化潜能，在体外可以向脂肪，骨，软骨，肌肉和神经细胞分化。并且脐带间充质干细胞能够分泌多种生物活性物质，包括蛋白质、多肽及细胞因子等，比如干细胞生长因子(SCGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子等，这些细胞生长因子能够控制或者维持受伤组织细胞，引导其自身修复。
干细胞修复因子是由干细胞分泌，其在体内含量极低，但却有极高的生物活性，可促进细胞分化增殖，诱导趋化炎症细胞，并影响细胞的分裂、迁移。因此，干细胞修复因子在皮肤修复中起着重要作用。通常，干细胞修复因子提取液是从人脐带中提取诱导分化的干细胞在培养过程中收集的上清液，其中含有干细胞因子种类有；表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板源性生长因子(PDGF)、血小板内皮细胞生长因子(VEGF)等。表皮生长因子(EGF)，可促进皮肤细胞的新陈代谢，同时还可间接促进胶原蛋白和透明质酸的分泌。成纤维细胞生长因子(EGF)，可促进成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等的增殖，刺激血管新生、增加纤溶酶原激活物生成以及胶原蛋白的合成，从而减少瘢痕形成。血管内皮生长因子(VEGF)，可诱导皮肤微血管的生成，改善皮肤新陈代谢，同时也可提高微血管通透性，为皮肤细胞增殖和胶原蛋白的合成提供丰富的营养。
然而，目前缺乏有效的脐带间充质干细胞修复因子的制备方法。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种脐带间充质干细胞修复因子制备方法。该方法相比于传统方法而言，具备工艺简单，且能有效锁定大量的干细胞修复因子，有效提高了制备方法的效率，可用于皮肤损伤修复。
具体而言，本发明首先提供了一种脐带间充质干细胞修复因子的制备方法包括如下步骤：
1)从脐带组织中分离得到脐带间充质干细胞；
2)将步骤1)中的脐带间充质干细胞进行传代培养，连续传代三-七次后备用；
3)收集步骤2)中的三-七次传代后的脐带间充质干细胞上清液，10000-15000g，4-10℃离心60-100min吸取上清液去除细胞沉淀；
4)收集步骤2)中三-七次传代后的脐带间充质干细胞，加入2-6倍体积细胞裂解液超声破碎孵育20-60min；
5)将步骤4)中的细胞裂解液进行10000-15000g，4-10℃离心60-100min吸取上清液；
6)将步骤3)得到的上清液与步骤4)中得到的上清液混合均匀，即得得到脐带间充质干细胞修复因子。
优选地，所述脐带间充质干细胞修复因子的制备方法包括如下步骤：
1)从脐带组织中分离得到脐带间充质干细胞；
2)将步骤1)中的脐带间充质干细胞进行传代培养，连续传代三次后备用；
3)收集步骤2)中的三次传代后的脐带间充质干细胞上清液，10000g，4℃离心60min吸取上清液去除细胞沉淀；
4)收集步骤2)中三次传代后的脐带间充质干细胞，加入2倍体积细胞裂解液超声破碎孵育20min；
5)将步骤4)中的细胞裂解液进行10000g，4℃离心60min吸取上清液；
6)将步骤3)得到的上清液与步骤4)中得到的上清液混合均匀，即得得到脐带间充质干细胞修复因子。
优选地，所述脐带间充质干细胞修复因子的制备方法包括如下步骤：
1)从脐带组织中分离得到脐带间充质干细胞；
2)将步骤1)中的脐带间充质干细胞进行传代培养，连续传代五次后备用；
3)收集步骤2)中的五次传代后的脐带间充质干细胞上清液，15000g，4℃离心80min吸取上清液去除细胞杂志沉淀；
4)收集步骤2)中五次传代后的脐带间充质干细胞，加入4倍体积细胞裂解液超声破碎孵育30min；
5)将步骤4)中的细胞裂解液进行15000g，4℃离心80min吸取上清液；
6)将步骤3)得到的上清液与步骤4)中得到的上清液混合均匀，即得得到脐带间充质干细胞修复因子。
优选地，所述脐带间充质干细胞修复因子的制备方法包括如下步骤：
1)从脐带组织中分离得到脐带间充质干细胞；
2)将步骤1)中的脐带间充质干细胞进行传代培养，连续传代七次后备用；
3)收集步骤2)中的七次传代后的脐带间充质干细胞上清液，15000g，10℃离心100min吸取上清液去除细胞杂志沉淀；
4)收集步骤2)中七次传代后的脐带间充质干细胞，加入6倍体积细胞裂解液超声破碎孵育50min；
5)将步骤4)中的细胞裂解液进行15000g，10℃离心80min吸取上清液；
6)将步骤3)得到的上清液与步骤4)中得到的上清液混合均匀，即得得到脐带间充质干细胞修复因子。
进一步优选地，步骤3)中还包括使用0.1-0.22μm滤膜过滤上清液的步骤；
进一步优选地，步骤4)中的细胞裂解液包括0.5-1M EDTA、1-5M焦磷酸钠和1-5MTris-Hcl，pH为4.5-5.5；
进一步优选地，步骤5)中还包括使用0.1-0.22μm滤膜过滤上清液的步骤；
进一步优选地，步骤6)中还包括使用0.1-0.22μm滤膜过滤上清液的步骤；
进一步优选地，步骤6)中还包括对脐带间充质干细胞修复因子浓度使用BCA蛋白定量试剂盒进行测定，-20℃冷冻保存；
另一方面，本发明还提供了所述脐带间充质干细胞修复因子在皮肤损伤修复产品中的用途。
进一步优选地，所述脐带间充质干细胞修复因子能够促进成纤维细胞的活性，促进皮肤组织修复，延缓皮肤衰老。
进一步优选地，所述产品中还包括药学上常见的辅料。
另一方面，本发明还提供了一种含有脐带间充质干细胞修复因子的产品，其特征在于，所述产品可有效促进成纤维细胞的增殖和刺激胶原蛋白的分泌。
本发明的优点如下：本发明首次从脐带间充质干细胞中提取分离得到修复因子，该修复因子具备良好的促成纤维细胞增殖活性，且能有效促成纤维细胞分泌I型和III型胶原，可用于皮肤损伤修复，尤其适用于因灼伤导致的皮肤损伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，并不用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
脐带间充质干细胞修复因子的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)从脐带组织中分离得到脐带间充质干细胞；
2)将步骤1)中的脐带间充质干细胞进行传代培养，连续传代三次后备用；
3)收集步骤2)中的三次传代后的脐带间充质干细胞上清液，10000g，4℃离心60min吸取上清液去除细胞杂志沉淀；使用0.22μm滤膜过滤，备用；
4)收集步骤2)中三次传代后的脐带间充质干细胞，加入2倍体积细胞裂解液超声破碎孵育20min；其中所述细胞裂解液包括0.5MEDTA、1M焦磷酸钠和1M Tris-Hcl，pH为4.5；
5)将步骤4)中的细胞裂解液进行10000g，4℃离心60min吸取上清液，并使用0.22μm滤膜过滤，备用；
6)将步骤3)得到的上清液与步骤4)中得到的上清液混合均匀，即得得到脐带间充质干细胞修复因子；对脐带间充质干细胞修复因子浓度使用BCA蛋白定量试剂盒进行测定，-20℃冷冻保存。
实施例2
脐带间充质干细胞修复因子的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)从脐带组织中分离得到脐带间充质干细胞；
2)将步骤1)中的脐带间充质干细胞进行传代培养，连续传代五次后备用；
3)收集步骤2)中的五次传代后的脐带间充质干细胞上清液，15000g，4℃离心80min吸取上清液去除细胞沉淀；使用0.22μm滤膜过滤，备用；
4)收集步骤2)中五次传代后的脐带间充质干细胞，加入4倍体积细胞裂解液超声破碎孵育30min；其中所述细胞裂解液包括1MEDTA、3M焦磷酸钠和3M Tris-Hcl，pH为4.5；
5)将步骤4)中的细胞裂解液进行15000g，4℃离心80min吸取上清液；并使用0.22μm滤膜过滤，备用；
6)将步骤3)得到的上清液与步骤4)中得到的上清液混合均匀，即得得到脐带间充质干细胞修复因子；对脐带间充质干细胞修复因子浓度使用BCA蛋白定量试剂盒进行测定，-20℃冷冻保存。
实施例3
脐带间充质干细胞修复因子的制备方法，所述方法包括如下步骤：
1)从脐带组织中分离得到脐带间充质干细胞；
2)将步骤1)中的脐带间充质干细胞进行传代培养，连续传代七次后备用；
3)收集步骤2)中的七次传代后的脐带间充质干细胞上清液，15000g，10℃离心100min吸取上清液去除细胞沉淀；使用0.22μm滤膜过滤，备用；
4)收集步骤2)中七次传代后的脐带间充质干细胞，加入6倍体积细胞裂解液超声破碎孵育50min；其中所述细胞裂解液包括1MEDTA、5M焦磷酸钠和5M Tris-Hcl，pH为4.5；
5)将步骤4)中的细胞裂解液进行15000g，10℃离心80min吸取上清液；并使用0.22μm滤膜过滤，备用；
6)将步骤3)得到的上清液与步骤4)中得到的上清液混合均匀，即得得到脐带间充质干细胞修复因子；对脐带间充质干细胞修复因子浓度使用BCA蛋白定量试剂盒进行测定，-80℃冷冻保存。
对照组1
制备方法步骤同实施例1，区别在于，未经过步骤4)和5)处理，直接将步骤3)得到的细胞上清液进行冷冻保存。
对照组2
为含有10μg/ml市售脐带间充质干细胞外泌体的DMEM完全培养基。
试验例
1、实施例1-3任一项所述脐带间充质干细胞修复因子对成纤维细胞增殖的影响：采用MTT方法检测实施例1-3任一项所述脐带间充质干细胞修复因子对成纤维细胞HFF-1的增殖影响。具体检测步骤可根据试剂盒说明书进行常规调整，其中，空白组为DMEM完全培养基，实验组1-3分别含有10μg/ml本发明实施例1-3任一项所述脐带间充质干细胞修复因子的DMEM完全培养基，对照组1为含有10μg/ml对照组1方法制备得到的脐带间充质干细胞修复因子；对照组2为含有10μg/ml市售脐带间充质干细胞外泌体的DMEM完全培养基，实验组和对照组中的细胞用量均在5×103个。
表1成纤维细胞增殖分析
| 组别 | OD值 |
| 空白组 | 0.215±0.058 |
| 实验组1 | 0.689±0.012 |
| 实验组2 | 0.712±0.005 |
| 实验组3 | 0.708±0.024 |
| 对照组1 | 0.412±0.076 |
| 对照组2 | 0.325±0.065 |
检测结果如下表1所示：空白组不能有效促进成纤维细胞的增殖，对照组1和2均可小幅度提高成纤维细胞的增殖能力，但是其增殖能力有限。而采用本发明实验组1-3任一项所述的脐带间充质干细胞修复因子可以高效率地促进成纤维细胞进行增殖，且其促增殖效果明显优于对照组(P＜0.05)，差异显著，具有统计学意义。进一步证实，本发明所述方法步骤4)和步骤5)的处理对于提高脐带间充质干细胞修复因子的含量与活性至关重要。
2、实施例1-3任一项所述脐带间充质干细胞修复因子对胶原分泌的影响：根据上述分组情况，分别处理后的成纤维细胞HFF-1进行培养，培养24h后，收集细胞，通过ELISA试剂盒检测I型和III型胶原分泌情况。结果如表2所示。
表2 I型和III型胶原分泌
| 组别 | I型胶原(ng/mL) | III型胶原(ng/mL) |
| 空白组 | 101±3.25 | 1.56±0.054 |
| 实验组1 | 280±4.25 | 6.57±0.055 |
| 实验组1 | 320±3.78 | 6.98±0.048 |
| 实验组1 | 300±2.69 | 6.87±0.025 |
| 对照组1 | 184±1.25 | 3.25±0.225 |
| 对照组2 | 168±1.98 | 2.36±0.123 |
从表2的结果可以看出，采用本发明脐带间充质干细胞修复因子可以高效率地促进成纤维细胞分泌I型和III型胶原，该效果明显优于对照组1和2(P＜0.05)，差异显著，具有统计学意义。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种脐带间充质干细胞修复因子的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)从脐带组织中分离得到脐带间充质干细胞；
2)将步骤1)中的脐带间充质干细胞进行传代培养，连续传代三-七次后备用；
3)收集步骤2)中的三-七次传代后的脐带间充质干细胞上清液，10000-15000g，4-10℃离心60-100min吸取上清液去除细胞沉淀；
4)收集步骤2)中三-七次传代后的脐带间充质干细胞，加入2-6倍体积细胞裂解液超声破碎孵育20-60min；
5)将步骤4)中的细胞裂解液进行10000-15000g，4-10℃离心60-100min吸取上清液；
6)将步骤3)得到的上清液与步骤4)中得到的上清液混合均匀，即得得到脐带间充质干细胞修复因子。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中还包括使用0.1-0.22μm滤膜过滤上清液的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中的细胞裂解液包括0.5-1M EDTA、1-5M焦磷酸钠和1-5M Tris-Hcl，pH为4.5-5.5。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5)中还包括使用0.1-0.22μm滤膜过滤上清液的步骤。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中还包括使用0.1-0.22μm滤膜过滤上清液的步骤。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6)中还包括对脐带间充质干细胞修复因子浓度使用BCA蛋白定量试剂盒进行测定，-20℃冷冻保存。
7.权利要求1-6任一项所述方法制备得到的脐带间充质干细胞修复因子在制备皮肤损伤修复产品中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述脐带间充质干细胞修复因子能够促进成纤维细胞的活性，促进皮肤组织修复，延缓皮肤衰老。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述产品中还包括药学上常见的辅料。
10.一种含有权利要求1-6任一项所述的脐带间充质干细胞修复因子的产品，其特征在于，所述产品可促进成纤维细胞的增殖和刺激胶原蛋白的分泌。
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