JPH0859502A

JPH0859502A - 軟骨障害治療剤

Info

Publication number: JPH0859502A
Application number: JP6218164A
Authority: JP
Inventors: Youtai Iwamoto; 容泰岩本; Sumiharu Noji; 澄晴野地; Toshiichi Nakamura; 敏一中村
Original assignee: Sumitomo Pharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 1994-08-19
Filing date: 1994-08-19
Publication date: 1996-03-05
Anticipated expiration: 2021-01-18
Also published as: JP3737532B2; WO1996005855A1

Abstract

(57)【要約】【目的】変形性関節症などの軟骨障害疾患の治療・予
防に有用な軟骨障害治療剤を提供することを目的とす
る。【構成】本発明の軟骨障害治療剤は、ＨＧＦ（Hepato
cyte Growth Factor, 肝細胞増殖因子）を有効成分とし
て含有することからなる。有効成分であるＨＧＦは、軟
骨細胞の増殖促進作用及びプロテオグリカン生成促進作
用を有しており、軟骨障害に起因する種々の疾患を効果
的に治療することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は軟骨疾患の治療及び予防
に有用な薬剤に関し、より詳細には、ＨＧＦ(Hepatocyt
e Growth Factor)を有効成分として含有する軟骨障害治
療剤、軟骨細胞増殖促進剤及びプロテオグリカン生成促
進剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】軟骨は軟骨細胞とこれを取り囲む基質か
らなる結合組織であり、関節、脊柱の椎間板、肋軟骨、
耳介、外耳道、恥骨結合、咽喉蓋などに存在する。軟骨
は、軟骨細胞と、軟骨細胞が産生する軟骨基質からな
り、軟骨基質はコラーゲン線維などの線維成分、プロテ
オグリカン及び水が主な成分であり、軟骨は軟骨基質の
混じりぐあいにより、硝子軟骨（肋軟骨、咽喉軟骨、関
節軟骨など）、弾性軟骨（耳介軟骨など）及び線維軟骨
（椎間板軟骨、恥骨軟骨、関節軟骨など）に分類するこ
とができる。上記の軟骨基質において、コラーゲン線維
は軟骨の張力及び剪断力に対する剛性と強度に関与し、
プロテオグリカンは圧縮力に対する強度に関与し、水は
生体組織として粘弾性体としての特性にあずかっている
とされており、例えば、関節軟骨の場合、軟骨の質重量
の７８．６％は水が占め、コラーゲンが２０％を占め、
プロテオグリカンが７％を占めている。軟骨の作用とし
ては、骨端の摩擦の低減（骨間の軟骨）、弾性の保持
（耳介軟骨など）、運動機能（肋軟骨、恥骨軟骨など）
が挙げられる。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記のように軟骨は生
体の機能維持の上で重要な作用を有しており、従来から
軟骨の障害に起因する種々の疾患が知られ、例えば、軟
骨形成異常症、変形性関節症、変形性椎間板症、骨折の
修復・治癒不全などが例示される。特に、高齢化社会の
到来、スポーツによる外傷の増加、キーパンチャー病な
どに代表される職業病の出現などにより、関節障害患者
は著しく増加しており、この領域における医療の進歩が
要望されている。従来から軟骨障害を治療するために種
々の治療法が試みられてきているが、それらは直接的に
原因の解消を目的とするものではなく、例えば、抗炎症
剤などを投与することにより、その疾患に基づく痛みな
どの障害を抑制する方法；関節にヒアルロン酸製剤など
を注入して関節の動きを潤滑にする方法など、対症療法
的なものでしかなかった。このように、関節障害の根治
的治療法は見出されておらず、特に変形性関節症は患者
数が多く、その有効な治療法が切望されている。

【０００４】本発明者らは上記の課題を解決するために
鋭意検討した結果、ＨＧＦが軟骨細胞の増殖を促進し、
またプロテオグリカンの生成を促進する作用を有し、軟
骨障害に起因する種々の疾患の治療に有効であることを
見出し、本発明を完成させた。上記のＨＧＦは肝実質
細胞を in vitro で増殖させる因子として見出されたタ
ンパク質である（Biochem Biophys Res Commun, 122, 1
450, 1984、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 6489, 1
986、 FFBS Letter, 22, 311, 1987、Nature,342, 440,
1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 199
0）。肝実質細胞を特異的に増殖させる因子として発見
されたＨＧＦは、本発明者らをはじめとする多くの研究
者による最近の研究成果によって、生体内で組織傷害治
癒などの種々の活性を示している事が明らかとなり、研
究対象としてのみならずヒトや動物の治療薬などへの応
用に期待が集まっている。ＨＧＦは主に間葉系の細胞に
より産生されていることが解明されており、近隣細胞か
ら必要に応じてＨＧＦが供給される、所謂パラクリン機
構が成立していることが明らかにされている。しかしな
がら、肝臓や腎臓に傷害を受けたとき、傷害を受けてい
ない臓器、例えば肺などにおいてもＨＧＦの産生が高ま
ることから、所謂エンドクリン機構によってもＨＧＦが
供給されていると考えられる。このようなＨＧＦの受容
体に関して、最近の研究から、ｃ−Ｍｅｔ原腫瘍遺伝子
がＨＧＦ受容体をコードしていることが確定的になった
(Bottaro et al., Science 251, 802-804, 1991; Naldi
ni et al., Oncogene 6, 501-504, 1991)。上述のよう
にＨＧＦに関しては多くの知見が得られているが、ＨＧ
Ｆの軟骨細胞増殖促進作用及びプロテオグリカン生成促
進作用は従来知られていない新規な知見であり、かかる
知見に基づいてなされた本発明は軟骨障害に起因する種
々の疾患の治療に有用な薬剤を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする軟
骨障害治療剤；ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とする軟
骨細胞増殖促進剤；ＨＧＦを有効成分として含有することを特徴とするプ
ロテオグリカン生成促進剤に関する。

【０００６】本発明で使用されるＨＧＦとしては、医薬
として使用できる程度に精製されたものであれば、種々
の方法で調製されたものを用いることができる。ＨＧＦ
の調製方法としては、各種の方法が知られている。例え
ば、ラット、ウシ、ウマ、ヒツジなどの哺乳動物の肝
臓、脾臓、肺臓、骨髄、脳、腎臓、胎盤等の臓器、血小
板、白血球等の血液細胞や血漿、血清などから抽出、精
製して得ることができる(FEBS Letters, 224, 312, 198
7、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989など
参照)。また、ＨＧＦを産生する初代培養細胞や株化細
胞を培養し、培養物（培養上清、培養細胞等）から分離
精製してＨＧＦを得ることもできる。あるいは遺伝子工
学的手法によりＨＧＦをコードする遺伝子を適切なベク
ターに組込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換
し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えＨ
ＧＦを得ることができる(例えば、Nature, 342, 440, 1
989、特開平５−１１１３８３号公報、Biochem. Biophy
s. Res. Commun., 163, 967, 1989など参照)。上記の宿
主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で
用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、枯草
菌、酵母、糸状菌、植物又は動物細胞などを用いること
ができる。

【０００７】より具体的には、ＨＧＦを生体組織から抽
出精製する方法としては、例えば、ラットに四塩化炭素
を腹腔内投与し、肝炎状態にしたラットの肝臓を摘出し
て粉砕し、Ｓ−セファロース、ヘパリンセファロースな
どのゲルカラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ等の通常
の蛋白質精製法にて精製することができる。また、遺伝
子組換え法を用い、ヒトＨＧＦのアミノ酸配列をコード
する遺伝子を、ウシパピローマウィルスＤＮＡなどのベ
クターに組み込んだ発現ベクターによって動物細胞、例
えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、マ
ウスＣ１２７細胞、サルＣＯＳ細胞などを形質転換し、
その培養上清より得ることができる。

【０００８】かくして得られたＨＧＦは、ＨＧＦと実質
的に同効である限り、そのアミノ酸配列の一部が欠失又
は他のアミノ酸により置換されていたり、他のアミノ酸
配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び／又はＣ末端
に１又は２以上のアミノ酸が結合していたり、あるいは
糖鎖が同様に欠失又は置換されていてもよい。

【０００９】本発明の治療剤及び促進剤は上記のＨＧＦ
を有効成分とし、ＨＧＦは後記試験例に示されるよう
に、軟骨細胞の増殖を促進し、またプロテオグリカンの
生成を促進する作用を有する。更に、ＨＧＦは、障害を
受けていない軟骨組織には作用を示さず、障害を受けて
いる軟骨組織にのみ作用するので、副作用を惹起するお
それが少ないという特長を有する。従って、本発明の治
療剤及び促進剤は、軟骨障害に起因する各種疾患の治療
・予防に有効であり、これらには例えば下記の疾患が包
含される。

【００１０】変形性関節炎軟骨形成異常症骨折の治癒及び修復外傷による関節軟骨、関節円板の修復急性化膿性関節炎結核性関節炎梅毒性関節炎慢性関節リウマチリウマチ熱、全身性エリテマトーデス変形性脊椎症椎間板ヘルニア骨移植による修復

【００１１】本発明の治療剤及び促進剤は、ヒトの他、
哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、イヌ、
ネコ等）における軟骨障害に起因する種々の疾患の治療
・予防に適用される。

【００１２】本発明の治療剤及び促進剤は種々の製剤形
態（例えば、液剤、固形剤、カプセル剤等）をとりうる
が、一般的には有効成分であるＨＧＦのみ又はそれと慣
用の担体と共に注射剤、吸入剤、坐剤又は経口剤とされ
る。当該注射剤は常法により調製することができ、例え
ば、ＨＧＦを適切な溶剤（例えば、滅菌された水、緩衝
液、生理食塩水等）に溶解した後、フィルター等で濾過
して滅菌し、次いで無菌的な容器に充填することにより
調製することができる。注射剤中のＨＧＦ含量として
は、通常0.0002〜0.2(W/V%)程度、好ましくは0.001〜0.
1(W/V%)程度に調整される。また、経口薬としては、例
えば、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、軟又は硬カプセル
剤、液剤、乳剤、懸濁剤、シロップ剤などの剤形に製剤
化され、これらの製剤は製剤化の常法に準じて調製する
ことができる。坐剤も慣用の基剤（例えば、カカオ脂、
ラウリン脂、グリセロゼラチン、マクロゴール、ウィテ
ップゾル等）を用いた製剤上の常法によって調製するこ
とができる。また、吸入剤も製剤上の常套手段に準じて
調製することができる。製剤中のＨＧＦ含量は、剤形、
適用疾患などに応じて適宜調整することができる。

【００１３】製剤化に際して、好ましくは安定化剤が添
加され、安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロ
ブリン、ゼラチン、グリシン、マンニトール、グルコー
ス、デキストラン、ソルビトール、エチレングリコール
などが挙げられる。さらに、本発明の製剤は製剤化に必
要な添加物、例えば、賦形剤、溶解補助剤、酸化防止
剤、無痛化剤、等張化剤等を含んでいてもよい。液状製
剤とした場合は凍結保存、又は凍結乾燥等により水分を
除去して保存するのが望ましい。凍結乾燥製剤は、用時
に注射用蒸留水などを加え、再溶解して使用される。

【００１４】本発明の治療剤及び促進剤は、その製剤形
態に応じた適当な投与経路により投与され得る。例え
ば、注射剤の形態にして静脈、動脈、皮下、筋肉内など
に投与することができる。その投与量は、患者の症状、
年齢、体重などにより適宜調整されるが、通常ＨＧＦと
して0.05mg〜500mg、好ましくは１mg〜100mgであり、こ
れを１日１回ないし数回に分けて投与するのが適当であ
る。

【００１５】

【発明の効果】本発明において、有効成分であるＨＧＦ
は、軟骨細胞の増殖を促進し、またプリテオグリカンの
生成を促進させる作用を有している。従って、本発明の
治療剤及び促進剤は、前述した軟骨障害に起因する各種
疾患の治療・予防に有用である。更に、ＨＧＦは、障害
を受けている軟骨組織にのみ作用するので、副作用の少
ない薬剤を得ることができるという効果を奏する。

【００１６】

【実施例】以下、実施例及び製造例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定され
るものではない。なお、以下の実験で使用した材料及び
方法は以下のとおりである。

【００１７】材料と方法 in situハイブリダイゼーションラットＨＧＦ−ｃＤＮＡ（ＲＢＣ１クローン）(Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3200, 1990)の１．４ｋｂ
ＥｃｏＲＩ断片をｐＧＥＭ７ベクターにサブクローン
し［ａ−³⁵Ｓ］ＵＴＰ（４００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、アマシ
ャム社）で標識化したアンチセンスとセンスのＲＮＡプ
ローブを作製した。標識した転写物は、リボプローブと
して５０−１５０塩基にアルカリ加水分解した。in sit
uハイブリダイゼーションは文献(Biochem. Biophys. Re
s. Commun., 173, 42, 1990)記載の方法で実施した。サ
ンプルは４％パラホルムアルデヒド−リン酸生理食塩水
溶液で固定し、エタノールで脱水、トルエンで洗浄後、
パラフィンに包埋した。５μｍの切片を切り出し、ポリ
ーＬ−リジンでコートしたスライドグラスにマウントし
た。切片はグリシンと無水酢酸で脱パラフィンし、５０
℃、１６時間プローブでハイブリダイズした。その後、
切片を０．１×ＳＳＣ液で５０℃、１時間洗浄し、ＲＮ
ＡａｓｅＡ（２０μｇ／ｍｌ）で３７℃、３０分処理し
てから、２×ＳＳＣ液で３７℃、１０分間で２回洗浄し
た。切片は乳剤（１：１コダックＮＢＴ−２希釈液）に
浸し２週間露光した。切片はコダックＤ−１９に現像定
着し、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。

【００１８】細胞と細胞培養軟骨細胞は、文献(J. Cell. Physiol., 133, 491, 198
7)記載の方法に準じて、ニュージーランドホワイトウサ
ギの２３日齢胎児と４週齢新生児から単離した。関節軟
骨は膝の大腿骨関節軟骨から、肋軟骨は肋骨の硝子軟骨
から単離した(Dev. Biol., 136, 500, 1989)。滑膜線維
芽細胞は、膝関節の滑膜組織から単離した。細切した滑
膜組織断片を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで１０日間培
養し、トリプシン処理で増殖した細胞を集めた。文献(E
xp. Cell Res., 157, 483, 1985)記載の方法に準じて、
２０日齢ラット胎児の脚筋肉組織から胎生間葉系細胞を
単離した。脚芽間葉細胞は、１０．５日齢のラット胎児
から単離した。脚芽は外科用顕微鏡下で切り出し、０．
２５％トリプシンで３０分で処理後、ピペッテングしナ
イロンガーゼで単離細胞を得た。脚芽細胞以外全ての細
胞は、１０％ＦＢＳ、６０μｇ／ｍｌのカナマイシンを
含むＤＭＥＭ（以下、培地Ａという）で３７℃、５％Ｃ
Ｏ₂／９５％空気下で維持した。

【００１９】ＤＮＡ合成の測定ＤＮＡ合成速度は、１０％ＴＣＡ不溶性細胞沈殿への［
³Ｈ］−チミジン（［６−³Ｈ］−チミジン、アマシャム
社、２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の取り込みの測定で評価した
(J. Clin. Invest., 85, 626, 1990)。細胞は、９６穴
プレートの６ｍｍウエル当り１．５×１０⁴個の密度で
播種し、コンフルエントになるまで培養した。増殖を停
止するため、細胞は０．３％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭの０．
１ｍｌでプレインキュベーションした。種々の濃度のＨ
ＧＦを培地に添加した。インキュベーションは２４時間
続けた。１μＣｉ／ｍｌ［³−Ｈ］チミジンは、インキ
ュベーション停止３時間前に添加した。標識後細胞は氷
冷ＰＢＳで３回、３ｍＭチミジンを含有する５％ＴＣＡ
で２回、エタノール：ジメチルエーテル（３：１）で１
回洗浄した。ウエル内の残渣は、１００μｌの０．１Ｎ
ＮａＯＨで可溶化し、液体シンチバイアルに移し、１
ＮＨＣｌで中和後、放射能をシンチレーションカウン
ター（Ｒａｃｋ−ｂｅｔａ、ファルマシア社）で測定し
た。

【００２０】プロテオグリカン合成の測定軟骨細胞は、６ｍｍウエル当り１．５×１０⁴個の密度
で播種し、０．１ｍｌの培地Ａで維持した。細胞がコン
フルエントに達したら、０．３％ＦＢＳを含有する０．
１ｍｌのＤＭＥＭで２４時間プレインキュベーションし
た。その後、０．３％ＦＢＳとＨＧＦを含有する０．１
ｍｌのＤＭＥＭで２４時間インキュベーションした。１
μＣｉ／ｍｌの［³⁵Ｓ］−硫酸基をインキュベーション
終了２０時間前に添加した。プロテオグリカン合成は、
プロテアーゼ消化後のセチルピリジニウムクロライドで
の沈殿物への［³⁵Ｓ］−硫酸基の取り込みの測定により
評価した(Exp. Cell Res., 130, 73, 1980)。

【００２１】総ＲＮＡ調製と逆転写ＰＣＲ軟骨から総ＲＮＡは、文献(Anal. Biochem., 203, 352,
1992)記載の方法の変法で調製した。新鮮単離組織断片
（０．１ｇ湿重量）は、４Ｍグアニジンチオシアネー
ト、０．１ＭＴｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．５）、１％２−
メルカプトエタノールの４ＭＧＩＴＣ溶液２ｍｌです
ばやくホモジェネートした。ホモジェネートは１０％Ｓ
ＤＳ１００μｌに混合し、微量遠心機で５分間遠心し
た。上清２ｍｌをベックマンポリアロマー遠心チューブ
（１３×５１ｍｍ）中で、同容量の１．６ｇセシウムト
リフルオロアセテートと１ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）に重層した。試料を３５，０００ｒｐｍ（１４７，
０００×ｇ）で１８℃、２０時間遠心した。上清を吸引
除去後、沈殿を４ＭＧＩＴＣ溶液２００μｌに溶解
し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール
（２５：２４：１）で抽出処理後、２０μｌの３Ｍ酢酸
ナトリウム（ｐＨ４．８）を混ぜ、２倍容量（４４０μ
ｌ）のエタノールで沈殿させた。沈渣はＤＥＰＣ処理水
に溶解した。まず、０．５μｇ総ＲＮＡからファースト
ストランドｃＤＮＡの合成をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆
転酵素(Gibco-BRL)と下流域のアンチセンスプライマー
を使って行った。引き続いてＰＣＲ増殖を行った。増殖
は、９４℃で３０秒、５８℃で１分、７２℃で１．５分
での３５サイクル（軟骨細胞の場合）又は４０サイクル
（軟骨組織の場合）の条件で行った。ＰＣＲ増殖のプラ
イマー塩基配列は、ラットとマウスのｃ−Ｍｅｔ(Oncog
ene, 2, 593, 1988)に対しては５’−ＣＡＧＴ（Ａ／
Ｇ）ＡＴＧＡＴＣＴＣＡＡＴＧＧＧＣＡＡＴ−３’と
５’−ＡＡＴＧＣＣＣＴＣＴＴＣＣＴＡＴＧＡＣＴＴＣ
−３’で７２５ｂｐ断片を作製した。

【００２２】実施例１発生四肢でのＨＧＦｍＲＮＡ発現発生期マウスの肢芽におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現をin
situハイブリダイゼーション法で試験した。その結果
を図１、図２及び図３に示す。図１は早期発生期マウス
の肢芽におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現を示し、後肢の縦
断面切片の顕微鏡写真であり、明視野（左側）及びそれ
に対応する暗視野（右側）はin situハイブリダイゼー
ション、オートラジオグラフィ及び染色後に撮影したも
のである。同図において、Ａ〜Ｄは１０．５日齢胎児、
Ｅ〜Ｈは１１日齢胎児の切片である。図２は指形成期マ
ウスの肢芽におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現を示し、後肢
の縦断面切片の顕微鏡写真であり、明視野（左側）及び
それに対応する暗視野（右側）はin situハイブリダイ
ゼーション、オートラジオグラフィ及び染色後に撮影し
たものである。同図において、Ａ及びＢは１２．５日齢
胎児、Ｃ〜Ｆは１３日齢胎児、Ｇ〜Ｊは１４日齢胎児の
切片である。また、Ｆｅは大腿骨、Ｆｉは腓骨、Ｔａは
足根骨を、Ｉ〜Ｖは指番号を示す。図３は発生期マウス
の肢芽及び胸郭におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現を示す顕
微鏡写真であり、明視野（左側）及びそれに対応する暗
視野（右側）はin situハイブリダイゼーション、オー
トラジオグラフィ及び染色後に撮影したものである。同
図において、Ａ及びＢは１６日齢胎児の後肢の横断面切
片を；Ｃ及びＤは１３日齢胎児、Ｅ及びＦは１４日齢胎
児の胸郭の縦断面切片を示す。また、Ｔａは足根骨、Ｔ
ｉは脛骨、Ｒｉｂは肋骨軟骨の前軟骨性集積を示す。

【００２３】図１に示されるように、１１日目に四肢の
底部領域周囲にＨＧＦｍＲＮＡのびまん性の発現が検出
された。この段階で軟骨性集積は、四肢に発生していな
かった。軟骨性集積が進行するとＨＧＦｍＲＮＡの発現
部位はより制限されてきた。１２．５日目に基脚、接合
脚、自脚部分が形成されるとき、ＨＧＦｍＲＮＡの発現
は、手首／踝と肘／膝の関節領域で観察された（図２Ａ
及びＢ参照。便宜上、膝及び踝について示した）。後期
（１３〜１４日）には、ＨＧＦｍＲＮＡは、手首／踝と
肘／膝の関節領域の軟骨集積の隣接し限定された間葉系
細胞に発現していた（図２Ｃ〜Ｊ参照）。１６日目に、
ＨＧＦｍＲＮＡは、足根骨の軟骨に隣接する限定された
間葉細胞に局在化されていた（図３Ａ及びＢ参照）。Ｈ
ＧＦｍＲＮＡの四肢での発現レベルは、分化と共に減少
した。試験を通じて手足の成長板でＨＧＦｍＲＮＡを検
出しなかった。

【００２４】実施例２発生胸郭でのＨＧＦｍＲＮＡ発現発生期マウスの胸郭におけるＨＧＦｍＲＮＡの発現をin
situハイブリダイゼーション法で試験した。その結果
を図３Ｃ〜Ｆに示す。図３Ｃ〜Ｆに示されるように、Ｈ
ＧＦｍＲＮＡは、肋間の伸長した前軟骨性集積の先端の
周囲肋間間葉組織で発現していた。前軟骨性集積ではハ
イブリダイゼーションのシグナルは、検出されなかっ
た。

【００２５】実施例３ＨＧＦの軟骨細胞に対するスキャッター活性試験分化している軟骨組織の周囲でどれがＨＧＦの標的細胞
かを決めるため、膝関節軟骨と肋軟骨からの軟骨細胞、
膝関節から滑膜細胞、四肢筋肉組織から増殖した線維芽
細胞の培養細胞を調製し、これらの細胞に外因的に添加
したＨＧＦの効果を検討した。即ち、ウサギ関節軟骨細
胞を１６ｍｍウエルに３×１０³細胞の密度で播種し、
培地Ａで２日間維持した。その後、ＨＧＦで２日間処理
を行った。インキュベーションの終了時に、位相差顕微
鏡写真を撮影した。その結果を図４に示す。図４に示さ
れるように、ＨＧＦ非処理（コントロール）において
は、多角形の軟骨細胞が増殖し島状になった（図４
Ａ）。一方、ＨＧＦ（３ｎｇ／ｍｌ）で処理をした培養
では軟骨細胞は、単細胞状態で島を形成しなかった（図
４Ｂ）。従って、ＨＧＦは軟骨細胞の移動を刺激するこ
とが明らかになった。なお、ＨＧＦは、線維芽細胞及び
滑膜細胞については分散させなかった。

【００２６】実施例４軟骨細胞増殖に対するＨＧＦの効果軟骨細胞の増殖に対するＨＧＦの効果を検討した。即
ち、４週齢のウサギから採取した関節軟骨細胞を培養し
た。コンフルエントになった細胞を２４時間血清除去処
理をした後、種々の濃度のＨＧＦで処置し、材料及び方
法の項に示した方法により［³Ｈ］−チミジンの取り込
み量を測定した。また、ウサギ滑膜線維芽細胞について
も同様な試験を行った。その結果を図５Ａ(関節軟骨細
胞)及びＢ(滑膜線維芽細胞)に示す。なお、結果は３回
の試験の平均値±標準偏差を示す(図５Ｃ、図６並びに
図７Ａ及びＢにおいても同様)。図５Ａに示されるよう
に、ＨＧＦは、ウサギ関節軟骨細胞への［³Ｈ］−チミ
ジンの取り込みを用量依存的に増加させ、ＤＮＡ合成の
促進、即ち関節軟骨細胞に対する増殖促進作用を有する
ことが示された。ＤＮＡ合成は、１ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ
において、コントロールに対して３倍の増加が認められ
た。一方、図５Ｂに示されるように、滑膜線維芽細胞は
ＨＧＦに反応しなかった。

【００２７】また、別実験で、関節軟骨の細胞数に対す
るＨＧＦの効果を検討した。即ち、１６ｍｍウエルにウ
サギ関節軟骨細胞を１×１０⁴細胞播種し、１０％ＦＢ
Ｓを含むＤＭＥＭ培地で維持した。次いで、１０ｎｇ／
ｍｌのＨＧＦを添加して４８時間インキュベーション
し、インキュベーション終了後、細胞数を測定した。そ
の結果を図５Ｃに示す。図５Ｃに示されるように、１０
ｎｇ／ｍｌのＨＧＦは、コントロールに比べて細胞数を
約１．８倍増加させた。

【００２８】実施例５プロテオグリカン生成に対するＨＧＦの効果上記のように、ＨＧＦは軟骨細胞の増殖を促進したの
で、次に、前述の材料及び方法の項で示した方法によ
り、関節軟骨細胞のプロテオグリカン生成に対する効果
を検討した。プロテオグリカン合成は、プロテアーゼ消
化後セチルピリジニウムクロライドで沈殿する巨大分子
（グリコサミノグリカン）への［³⁵Ｓ］−硫酸基の取り
込みの測定で検討した(Exp. Cell Res., 130, 73, 198
0)。なお、ＨＧＦに代えて、下記の因子についても試験
した。インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ：濃度１００ｎｇ
／ｍｌＩＧＦ−ＩＩ：濃度１００ｎｇ／ｍｌ副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）：濃度１０^-7ＭＴＧＦ−β：濃度３ｎｇ／ｍｌその結果を図６に示す。図６に示されるように、ＨＧＦ
は、用量依存的に［³⁵Ｓ］−硫酸基の取り込みを増加さ
せた。最大増加は、１ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで得られた。
この作用は、ＴＧＦ−β(J. Cell Physiol., 138, 329,
1989)やＰＴＨ(J. Clin. Invest., 85, 626, 1990)よ
りは弱かったが、ＩＧＦ−Ｉ及びＩＩとは同程度であっ
た(Exp. Cell Res., 130, 73, 1980)。

【００２９】実施例６抗ＨＧＦ抗体存在下における、ＤＮＡ合成及びプロテオ
グリカン生成に対するＨＧＦの効果前述のように、一般にＨＧＦはパラクリン機構で標的細
胞に作用すると考えられており、前記のin situハイブ
リダイゼーションの結果は、この考えを支持していると
思料される。そこで、この点を確認するために、ＨＧＦ
ポリクローナル抗体が、軟骨細胞の機能を変化させるか
どうかを検討した。即ち、コンフルエントになったウサ
ギ関節軟骨細胞を、３ｎｇ／ｍｌのＨＧＦの存在下又は
非存在下、２５μｇ／ｍｌの抗ＨＧＦポリクローナル抗
体（アフィニティーで精製したＩｇＧ画分）で処理又は
非処理した。その後、前記の材料及び方法の項で示した
方法により、［³Ｈ］−チミジン又は［³⁵Ｓ］−硫酸基
で標識し、ＤＮＡ合成又はプロテオグリカン生成を測定
した。その結果を図７Ａ（ＤＮＡ合成）及びＢ（プロテ
オグリカン生成）に示す。なお、同図において、Ａｂは
抗ＨＧＦポリクローナル抗体を示す。図７に示されるよ
うに、抗ＨＧＦポリクローナル抗体の添加だけでは、関
節軟骨細胞でのＤＮＡ合成もプロテオグリカン生成も変
化させなかった。しかしながら、抗ＨＧＦポリクローナ
ル抗体は、外因性に添加したＨＧＦの効果を完全に阻害
した。このことは、軟骨細胞が軟骨自身の機能を調節す
るのに十分なＨＧＦを産生していないことを示してい
る。

【００３０】実施例７ＨＧＦレセプターｍＲＮＡの軟骨細胞での発現生体内及び生体外における軟骨細胞でのＨＧＦレセプタ
ー（ｃ−Ｍｅｔ）の発現を逆転写ＰＣＲで検討した。関
節組織と肋軟骨の各部分を外科用顕微鏡下で、４週齢ラ
ットから切り出し、総ＲＮＡは、方法と材料の項で述べ
たように抽出した。抽出したＲＮＡ（０．５μｇ）は逆
転写し、ｃ−Ｍｅｔのプライマーを用いて増幅した後、
１．５％アガロースゲル電気泳動法により分析した。そ
の結果を図８に示す。図８に示されるように、関節軟骨
組織及び肋軟骨組織について４０回の増幅後、微量のｃ
−Ｍｅｔ発現を検出し、培養軟骨細胞は３５回の増幅
後、著明なｃ−Ｍｅｔ発現を認めた。

【００３１】製造例１ＨＧＦ製剤の生産例 (1) ＨＧＦ２０μｇヒト血清アルブミン１００ｍｇ上記物質をｐＨ７．０の０．０１ＭのＰＢＳで溶解し、
全量を２０ｍｌに調製し、滅菌後、バイアル瓶に２ｍｌ
ずつ分注し、凍結乾燥密封した。 (2) ＨＧＦ４０μｇツイーン８０１ｍｇヒト血清アルブミン１００ｍｇ上記物質を注射用生理食塩水に溶解し、全量を２０ｍｌ
に調製し、滅菌後、バイアル瓶に２ｍｌずつ分注し、凍
結乾燥密封した。

【図面の簡単な説明】

【図１】早期発生期マウスの肢芽におけるＨＧＦｍＲＮ
Ａの発現を示す顕微鏡写真（生物の形態）である（左側
は明視野、右側はそれに対応する暗視野）。同図におい
て、Ａ〜Ｄは１０．５日齢胎児、Ｅ〜Ｈは１１日齢胎児
の縦断面切片である。

【図２】指形成期マウスの肢芽におけるＨＧＦｍＲＮＡ
の発現を示す顕微鏡写真（生物の形態）である（左側は
明視野、右側はそれに対応する暗視野）。同図におい
て、Ａ及びＢは１２．５日齢胎児、Ｃ〜Ｆは１３日齢胎
児、Ｇ〜Ｊは１４日齢胎児の切片である。また、Ｆｅは
大腿骨、Ｆｉは腓骨、Ｔａは足根骨を、Ｉ〜Ｖは指番号
を示す。

【図３】発生期マウスの肢芽及び胸郭におけるＨＧＦｍ
ＲＮＡの発現を示す顕微鏡写真（生物の形態）である
（左側は明視野、右側はそれに対応する暗視野）。同図
において、Ａ及びＢは１６日齢胎児の後肢の横断面切
片；Ｃ及びＤは１３日齢胎児、Ｅ及びＦは１４日齢胎児
の胸郭の縦断面切片を示す。また、Ｔａは足根骨、Ｔｉ
は脛骨、Ｒｉｂは肋骨軟骨の前軟骨性集積を示す。

【図４】ＨＧＦの軟骨細胞に対するスキャッター活性を
示す顕微鏡写真（生物の形態）である。同図において、
Ａはコントロール（ＨＧＦ非処理）を、ＢはＨＧＦ処理
を示す。

【図５】軟骨細胞増殖に対するＨＧＦの効果を示す図で
ある。同図において、Ａは関節軟骨細胞のＤＮＡ合成に
対する効果を、Ｂは滑膜細胞のＤＮＡ合成に対する効果
を、Ｃは関節軟骨細胞の増殖（細胞数）に対する効果を
示す。

【図６】プロテオグリカン生成に対するＨＧＦの効果を
示す図である。

【図７】抗ＨＧＦ抗体存在下における、ＤＮＡ合成（図
７Ａ）及びプロテオグリカン生成（図７Ｂ）に対するＨ
ＧＦの効果を示す図である。

【図８】ＨＧＦレセプターｍＲＮＡの軟骨細胞での発現
を示す電気泳動写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 37/24 ＡＥＤ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＨＧＦを有効成分として含有するこ
とを特徴とする軟骨障害治療剤。
【請求項２】ＨＧＦを有効成分として含有するこ
とを特徴とする軟骨細胞増殖促進剤。
【請求項３】ＨＧＦを有効成分として含有するこ
とを特徴とするプロテオグリカン生成促進剤。