PT1365795E - Nova aplicação terapêutica do g-csf - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

NOVA APLICAÇÃO TERAPÊUTICA DO G-CSF A invenção refere-se a uma nova aplicação terapêutica do G-CSF e, mais particularmente, à sua utilização para a preparação de um medicamento útil em medicina humana ou veterinária. 0 G-CSF (abreviatura de "Granulocyte Colony-Stimulating Factor", isto é, "Factor de Estimulação de Colónias de Granulócitos") é um factor de crescimento. Corresponde a uma das classes de citoquinas designadas factores de crescimento hematopoiéticos ou G-CSF ("Colony-Stimulating Factors") . Os CSF formam uma família de glicoproteínas que têm funções vitais na formação das células sanguíneas. 0 G-CSF estimula a produção das células hematopoiéticas e, predominantemente, a produção de elementos polinucleares. 0 G-CSF é uma glicoproteína e o produto da expressão de um gene situado sobre o cromossoma 17. É produzido por diferentes células, tais como fibroblastos, macrófagos, células endoteliais, células epiteliais. 0 G-CSF é detectável no sangue. Pode ser purificado a partir de sobrenadantes de culturas de células tumorais humanas. 0 génio biológico permite também produzir um alotipo humano de G-CSF, o G-CSF recombinante humano (rHuG-CSF). É de referir que o rHuG-CSF é eficaz noutras espécies animais (Gratwohl e col.: Transplantation of G-CSF mobilized allogeneic peripheral blood stem cells in rabbits. Bone Marrow Transplant 1995; 16(1):63-68). 1

Descrevem-se diferentes processos de produção do G-CSF nas patentes seguintes: US 4 810 643, EP 0 169 566, WO 87 01132 e JP 15 327 384.

Em França, estão disponíveis dois medicamentos pertencendo à classe do G-CSF: o Neupogen® (rmetHuG-CSF, Filgrastim, comercializado por Amagen/ Produtos Roche) e o Granocyte® (rHuG-CSF, Lenograstim, comercializado pelos Laboratórios Rhône-Poulenc Rorer); estes dois medicamentos são utilizados por via de injecção subcutânea ou por perfusão intravenosa, para uma administração sistémica, em doses geralmente compreendidas entre 5 e 10 yg, por quilograma de peso corporal e por dia.

As indicações actuais do G-CSF em terapia humana são o tratamento das neutropenias crónicas graves, a redução das neutropenias induzidas pelos tratamentos quimioterapêuticos anti-cancerígenos mielotóxicos, a redução das neutropenias induzidas pelas terapêuticas mielossupressoras (quimioterapia ou radioterapia) seguidas de transplante de medula óssea no tratamento dos cancros ou das leucemias, a mobilização das células matrizes hematopoiéticas para formar um enxerto com vista a um transplante de medula óssea (autotransplante ou alotransplante).

Sublinhe-se que, nesta última utilização, o objectivo do tratamento é o de extrair da medula óssea as células matrizes hematopoiéticas e fazê-las passar no sangue circulante. Estas células matrizes são então recolhidas por citafereses sucessivas e vão constituir o enxerto. Trata-se portanto de mobilizar ao máximo para o sangue circulante esse contingente de células matrizes hematopoiéticas que, no estado normal, se 2 encontram numa quantidade muito reduzida no sangue circulante, o que não permite formar um enxerto com qualidade suficiente.

Esta técnica de recolha do enxerto por citaferese após mobilização das células matrizes veio substituir, com vantagem, a recolha directa da medula óssea por citopunção que necessita de anestesia do paciente e de múltiplas punções de medula. Realiza-se uma transfusão do enxerto assim constituído para o paciente cuja medula foi destruída pela quimioterapia ou a radioterapia; constitui portanto uma nova fonte de produção de células sanguíneas.

Utiliza-se quotidianamente o G-CSF devido às suas diferentes indicações. A sua inocuidade largamente reconhecida permite utilizá-lo também em pessoas sãs para constituir enxertos de medula no âmbito dos aloenxertos.

Convém lembrar que a medula óssea, repartida pelos diferentes ossos do organismo, é o local de produção das células sanguíneas maduras (eritrócitos, plaquetas, elementos polinucleares, monócitos, linfócitos) . A produção destas células sanguíneas efectua-se a partir da multiplicação e da diferenciação de uma população de células matrizes pluripotenciais (Célula Matriz Hematopoiética, em abreviatura "CMH") Estas últimas representam quantitativamente uma fracção muito pequena da população celular da medula óssea. São classicamente caracterizadas pela expressão de um marcador celular chamado CD34 (cluster de diferenciação 34).

Entretanto, foi descrito um outro tipo de células matrizes da medula óssea (Pittenger e col.: Multilineage potencial of human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284; 143-147;

Dennis e col.: A quadripotential mesenchymal progenitor cell 3 isolated from the marrow of an adult mouse. J. Bone Miner Res 1999; 14(5): 700-709). Trata-se de uma população de células capaz de uma via de diferenciação conjuntiva; estas células matrizes são designadas Células Matrizes Mesenquimatosas (em abreviatura "CMM"). Esta população de células matrizes constitui, também ela, no estado normal, um contingente muito pequeno de elementos celulares da medula óssea, mas apresenta a capacidade de se diferenciar em múltiplas direcções de natureza conjuntiva (osso, cartilagem, fibro-tendão, músculo, gordura). A existência de um precursor comum (célula matriz CD34 negativa) no conjunto das linhagens hematopoiéticas e conjuntivas está, actualmente, em discussão (Seshi e col.: Human bone marrow stromal cell: coexpression of markers specific for multiples mesenchymal stem lineage. Blood Cell Mol Dis 2000(3); 234-246; Lange e col.: Hematopoietic reconstruction of syngenic mouse with a peripheral blood-derived, monoclonal CD32-, Sca-1+, Thyl (low), c-kit+ stem cell ligne. J. Hematother Stem Cell Res. 1999; 8(4): 335-342).

Esta população de células matrizes é, actualmente, objecto de uma intensa actividade de pesquisa, em particular no dominio da cirurgia plástica, da reparação óssea e da osteoporose, isto no quadro dos domínios emergentes da medicina que são a engenharia tissular e a terapia celular. No entanto, sendo que esta população de CMM constitui à partida uma quantidade de células particularmente fraca, as técnicas utilizadas recorrem a uma passagem in vitro. Em resumo, recolhe-se a medula óssea, depois, in vitro, separa-se o contingente de células matrizes mesenquimatosas do resto das células da medula e, em seguida, cultivam-se e multiplicam-se as células, sempre in vitro. Eventualmente, são também forçadas artificialmente no sentido de uma diferenciação específica. Em seguida, são reinjectadas ou reimplantadas num local 4 anatómico no qual contribuem para a reconstituição do tecido conjuntivo degradado, que pode ser um osso (Bruder e col.: Bone regeneration by implantation of purified culture-expended human mesenchymal stem cells. J Ortho Resl998; 16(2): 155-162) ou um tendão (Awad e col.: Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon. Tissue Eng 1999; 5(3): 267-277; Butler e col.: Perspectives on cell and collagen composites for tendon repair. Clin Orthop 1999; 367 Supl: S 324-332).

Estas técnicas necessitam, no entanto, de uma colaboração com laboratórios muito especializados e nem sempre está assegurada a obtenção de um enxerto conjuntivo de qualidade (Solchaga e col.: High variability in rabbit bone marrow-derived mesenchymal cell preparation. Cell Transplant 1999; 8(5): 511-519). A proliferação e a diferenciação das CMM são induzidas pela Bone Morphogenetic Protein-2 {BMP-2} (Fromigue e col.: Bone morphogenetic protein 2 and transforming growth factor-beta 2 interact to modulate human bone marrow stromal cell proliferation and differenciation. J Cell Biochem. 1988; 68(4): 411-426), mas também pelos Transforming Growth Factor beta 1 (Andrades e col.: A recombinant TGF-beta 1 fusion protein with collagen-binding domain promotes migration, growth, and differentiation of bone marrow mesenchymal cells. Exp Cell Res 1999: 250(2): 485-498).

No dominio da reparação das fracturas ósseas, o processo de reparação óssea após fractura de um osso é classicamente descrito em duas grandes fases. A primeira fase é um período de união que comporta, sucessivamente, um período de hematoma, um período de proliferação celular de células mesenquimatosas imaturas do periósteo e dos tecidos conjuntivos periósticos, um período de constituição de um calo mole em que as células 5 mesenquimatosas, mas também fibroblastos e neo-vasos, invadem o espaço do foco de fractura, e um período de calo primário em que as células mesenquimatosas transformadas num sentido osteocartilaginoso formam um maciço tissular de resistência mecânica progressivamente reforçada entre as duas extremidades ósseas. A segunda fase é um período de reestruturação em que o osso primário se transforma em osso tecido maduro cuja forma final se adapta às exigências das funções mecânicas do respectivo segmento ósseo. No caso dos ossos longos, é reconstituída a cavidade medular, bem como uma cortical.

No processo de reparação óssea estão envolvidos numerosos mediadores bioquímicos (Millis: Bone and non-bone derived growth factors and effects on bone healing. Vet Clin North Am Small Anim Pract 1999; 29(5): 1221-1246). Eles podem actuar de forma endócrina, parácrina ou autócrina. Estão implicados a diferentes níveis os FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), IGF (insuline-like growth factor) I e II, TGF beta (transforming growth factor beta), as BMP (Bone Morphogenetic Proteins), as Prostaglandinas, a Osteoglicina (osteo inductive factor) e a Hormona de Crescimento (GH). 0 tratamento de base das fracturas ósseas consiste essencialmente na estabilização do foco de fractura. Esta estabilização pode ser obtida por uma contenção do segmento ósseo, no quadro de um tratamento ortopédico, ou por osteossíntese se for necessário recorrer à cirurgia. É também necessária uma prevenção das infecções e dos acidentes tromboembólicos. 6

De referir que não existe actualmente tratamento medicamentoso por via geral utilizado na prática médico-cirúrgica quotidiana e capaz de melhorar a reparação das fracturas ósseas, apesar de certos medicamentos, como a L-Dopa ou péptidos de tipo FGF, estarem a ser avaliados por certos autores.

Os sistemas de libertação local, sobre o foco de reparação óssea, de factores de crescimento destinados a melhorar o processo de reconstrução óssea estão também a ser avaliados por certos autores. Utilizaram-se diferentes moléculas: o TGF-beta (transforming growth factor beta), o FGF (fibroblast growth factor), as BMP, as BMP-2 e BMP-7 em particular (Bonn: The application of cell biology to broken bones. Lancet 1999; 353 (9153): 650). Moléculas tais como os sulfatos de heparano também parecem prometedoras (Lafont e col.: RGTA11, a new healing agent, triggers developmental events during healing craniotomy defects in adult rats. Growth Factors 1998; 16(1): 23-38).

Por outro lado, desenvolveu-se um modelo de cirurgia experimental de construção osteocartilaginosa por transferência de fragmento de periósteo (Tese de Doutoramento em Medicina de D. Moukoko, Faculdade de Medicina,

Universidade de Montpellier I 1996: Etude Experimentale de I'osteogenese des lambeaux périostes vascularisés; Primeiro Congresso de Pesquisa em Ortopedia Pediátrica, Toulouse, 1997, Apresentação: L'osteogenese des lambeaux périostes vascularisés, D Moukoko, A Dimeglio; Congresso anual da Sociedade Europeia de Ortopedia, Heidelberg, 1997, Apresentação: The osteogenical properties of periosteal vascularired flaps, D Moukoko, A Dimeglio; Segundo Congresso de Pesquisa em Ortopedia Pediátrica, Montpeilier 1998, 7

Apresentação: Histogenèse precoce des lambeaux périostes vascularisés dans un environnement musculaire, D Moukoko, D Pourquier, A Dimeglio).

Este modelo cirúrgico já bem conhecido (Poussa e col.: The osteogenic capacity of free periosteal and osteoperiosteal grafts. Acta Orthop Scand 1979; 50: 491-499; Ritsilã e col.: Periosteal and perichondral grafting in reconstructive surgery. Clin Orthop 1994; 302: 259-265 ; Finley e col.:

Revascularized periosteal grafts - A new method to produce functional new bone without bone grafting. Plast Reconstr Surg 1978; 61(1): 1-6; Rubak: Reconstruction of articular cartilage defects with free periosteal grafts. Acta Orthop Scand 1982; 53: 175; Masquelet e col.: Vascularized periosteal grafts. Anatomic description, experimental study, preliminary report of clinicai experience. Rev Chir Orthop Réparatrice Appar Mot 1988: 74 Supl. 2: 240-243; van den

Wildenberg e col.: Free revascularised periosteum transplantation: an experimental study. Br Plast Surg 1984; 37(2): 226-235; 0'Driscoii e col.: Durability of regenerated articular cartilage produced by free autogenous periosteal grafts in major full-thickness defects on joint surfaces under the influence of continuous passive motion. A follow-up report at one year. J Bone Joint Surg Am 1988; 70(4): 595-606) no domínio da reconstrução de cartilagem articular ou da reconstrução óssea, permitiu nos trabalhos dos Requerentes produzir osso no local correspondente à zona de implantação do fragmento de periósteo. A transferência de fragmento de pericôndrio permite uma produção cartilaginosa (Diaz-Flores e col.: Growth of two types of cartilage after implantation of free autogenic perichondrial grafts. Clin Orthop Set de 1988; (234): 267-279). 8 0 processo operatório era o seguinte.

Incisão longitudinal da face interna da perna. Exposição do músculo anterior da perna, incisão da sua aponevrose, longitudinalmente a 5 mm da cristã tibial anterior. Colocação de fios de tracção que evitam as manipulações do fragmento de periósteo, incisão do periósteo longitudinalmente, sobre a face lateral da diáfise tibial. Descolamento do periósteo, desde sua incisão até à cristã tibial posterior-medial. Incisão do periósteo ao longo da cristã tibial posterior-medial (fragmento de 10 mm de largura). Incisões transversais, proximal e distai, libertando o fragmento em 30 mm do seu comprimento. Descolamento do músculo fluxor dos dedos dos pés, cuja vascularização provem de um pediculo diferente. O fragmento mantém-se vascularizado sobre o pediculo safeno por intermédio da fáscia externa da perna, do eixo safeno até à cristã tibial anterior, agindo como lâmina porta-vasos. Individualizado deste modo, o fragmento pode ser posicionado em situação ectópica ou ortotópica.

Uma variante mais complexa deste modelo permitia transferir o fragmento vascularizado para a proximidade das estruturas ósseas da tibia e do fémur e da articulação do joelho. Este modelo foi utilizado tanto no Coelho como no Carneiro. O sacrifício de diferentes grupos de animais em períodos pós-operatórias cada vez maiores permitia estudar as sucessivas etapas da formação da cartilagem e do osso. Após o sacrifício dos animais, retirava-se e estudava-se por histologia o conjunto dos tecidos correspondente ao osso neoformado e aos outros tecidos vizinhos. 9 A nova produção mostrava, no estudo histológico os diferentes períodos, uma sequência de proliferação celular, diferenciação celular e tissular; depois maturação dos tecidos neoformados. Esta sequência compreendia uma fase de proliferação celular de um mesênquima pouco diferenciado, uma fase de maturação desse mesênquima num tecido cartilaginoso, uma fase de ossificação desta matriz cartilaginosa por via de uma frente de ossificação, uma fase de ossificação completa desse osso na modalidade de osso primário, uma fase de maturação deste osso primário num osso secundário de tipo tecido, a constituição de uma cavidade medular cheia de medula óssea. 0 conjunto produzia, finalmente, o equivalente a um pequeno osso comprido com uma cavidade medular e uma cortical. 0 conjunto destas observações mostrava também um paralelismo surpreendente com a sequência de acontecimentos biológicos que presidem ao mesmo tempo à construção da protuberância de membro durante a embriogenese e com as diferentes fases da reconstrução óssea nos calos das fracturas ósseas, sendo estes dois processos considerados actualmente como muito próximos no plano da biologia molecular (Ferguson e col.: Common molecular pathways in skeletal morphogenesis and repair: Ann N Y Acad Sei: 1998: 23 857: 33-42).

Experiências complementares utilizando membranas semi-permeáveis (membranas permeáveis às moléculas e impermeáveis às células) mostravam também que o fragmento de periósteo actuava sobre os tecidos vizinhos através da difusão local de moléculas bioquímicas difusíveis, constituindo de facto uma zona de influência do fragmento de periósteo nos tecidos vizinhos. Um estudo recente no domínio da biologia do periósteo mostra que um dos mediadores emitidos precocemente 10 no meio é a BMP 2 (Bone Morphogenetic Protein 2) (Sanyal e col.: Initial evidence for the involvement of bone morphogenetic protein-2 early during periosteal chondrogenesis. J Orthop Res 1999 17 (6): 926-934), confirmando ainda a semelhança entre os acontecimentos desenvolvidos nas fracturas ósseas e os acontecimentos desenvolvidos no modelo de reconstrução óssea por fragmento de periósteo. Do ponto de vista fisiopatológico, esta emissão local de mediadores bioquímicos é gerada pela "activação" do periósteo, sendo esta activação, ela própria, desencadeada pelo descolamento mecânico do periósteo do seu suporte ósseo (um dos elementos fundamentais da fisiopatologia da fractura óssea). Note-se que a capacidade osteogénica do periósteo "activado" por descolamento também se observa habitualmente em prática clinica, por exemplo, no caso de descolamento tumoral, infeccioso ou hemático. Certos estudos mostram que o descolamento do periósteo e de uma fina camada óssea sub-perióstica desencadeia o mesmo processo (Poussa e col. The osteogenic capacity of free periosteal and osteoperiosteal grafts. Acta Orthop Scand 1979; 50:491-499; Sakai e col.: Free vascularized thin corticoperiosteal graft. Plast Reconstr Surg 1991; 87(2): 290-298).

Entretanto, no seio deste modelo, surgiram novos elementos de conhecimento, em particular graças aos estudos histológicos. O mais importante é a contribuição das células matrizes mesenquimatosas presentes na circulação sanguínea no processo de reconstrução óssea.

Uma forma de contribuição das CMM medulares já é conhecido no quadro da formação do calo de fractura no decurso da reparação óssea. No entanto, ela é entendida como uma contribuição de natureza puramente local, em que a medula 11 óssea situada no traçado de fractura para a reconstrução do osso fracturado.

Certos argumentos histológicos vieram demonstrar que esta produção se faz também a partir de células matrizes mesenquimatosas, presentes no sangue circulante, que são recrutadas localmente pelos diferentes mediadores bioquímicos emitidos nos tecidos em torno do fragmento de periósteo.

Observa-se frequentemente, em particular em torno do osso neoformado, a identificação nos músculos no seio dos septos intermusculares (que são, é preciso lembrar, lâminas porta-vasos) de uma população de células diferenciadas nas diferentes direcções conjuntivas (osso, cartilagem, fibro-tendão, músculo) e num sentido homopoiético. A situação micro-anatómica especifica dessas células nas lâminas porta-vasos mostra claramente que elas têm origem na corrente sanguínea e que foram recrutadas localmente pelos factores de crescimento emitidos nos tecidos em torno do fragmento de periósteo. Se bem que claramente diferenciados num sentido conjuntivo, estes elementos não tinham no entanto sido integrados no bloco ósseo neoformado (dados não publicados).

Uma outra observação regular no seio do modelo é a presença de células conjuntivas dos diferentes tipos e de células hematopoiéticas em massa nas cavidades articulares presentes na zona de influência do fragmento.

Estas imagens indicam claramente uma saída no sentido da cavidade articular dessas células a partir dos vasos do 12 revestimento sinovial, constituindo então a cavidade articular um receptáculo (dados não publicados).

Uma outra observação interessante era a observação de zonas de diferenciação massiva num sentido conjuntivo (osso, cartilagem, músculo, fibro-tendão) de células da medula óssea na cavidade medular dos ossos situados na zona de influência do fragmento de periósteo. Esta última observação mostrava uma influência idêntica do fragmento de periósteo sobre a população das CMM, mas desta vez sobre o contingente de CMM medulares não circulantes. 0 conjunto destas observações deixa supor um mecanismo de "recrutamento" local, na zona de influência do fragmento, de uma população de células matrizes presentes no sangue circulante. Estas células, ao saírem dos vasos ao nível da zona de influência do fragmento, são colocadas à disposição do processo de reconstrução tissular como "tijolos" que contribuem para a construção de um edifício.

Um outro argumento importante era a presença muito regular de um contingente de células hematopoiéticas com elementos conjuntivos. Este último aspecto pode, com efeito, indicar que o recrutamento local de células matrizes respeita, quer a células matrizes circulantes, particularmente imaturas e pluripotenciais, capazes de se diferenciarem nas direcções tanto hematopoiética como conjuntiva, quer a populações de celulares matrizes (CMH e CMM) circulantes.

As Figuras 1 e 2 vêm ilustrar as relações do fragmento de periósteo transferido com as diferentes estruturas anatómicas de interesse. 13 A Figura 1 mostra o fragmento de periósteo 1 e a sua zona de influência 2 nos estados muito precoces do modelo. A zona de influência é entendida como o espaço no qual a difusão dos factores de crescimento e dos diferentes mediadores influenciam os tecidos vizinhos. Nesta figura, 3 designa o músculo e os septos intermusculares adjacentes ao fragmento de periósteo 1. Representou-se também um fémur 4 e a sua medula óssea 5 e uma tibia 6 e a sua medula óssea 7. Por fim, 8 designa a cavidade articular compreendida entre o fémur e a tibia. A Figura 2 mostra o resultado da transferência num periodo mais longo após a transferência do fragmento de periósteo; o osso neoformado 9 surgiu no local de transferência do fragmento, enquanto que focos de diferenciação conjuntiva multidireccional (representados por cruzes) surgiram na medula óssea, nos septos intermusculares e na cavidade articular situados na zona de influência do fragmento de periósteo.

Em termos quantitativos, a importância do recrutamento local de CMM está, no entanto, dependente do número de células matrizes presentes na corrente sanguínea ao nível dos vasos situados na zona de influência do fragmento. Como já foi mencionado, esta população de células matrizes é, no sujeito são, quantitativamente muito reduzida na medula óssea. No sangue, as células matrizes são identificadas no estado normal (Huss e col.: Evidence of peripheral blood-derived, plastic-adherent CD34(-/low) hematopoetic stem cell clones with mesenchymal stem cell characteristics. Stem Cell 200; 18(4); 252-260) mas também no caso do sujeito ter sido tratado por quimioterapia mielotóxica, seguida de uma mobilização das células matrizes da medula óssea por factores 14 de crescimento de tipo G-CSF (Fernandez e col.: Detection of stromal cells in peripherical blood progenitor cell collections from breast câncer pacients. Bone Marrow Transplant 1997; 20: 265-271). É interessante notar que nesse caso um aumento da quantidade das CMM circulantes está correlacionado com o concomitante aumento do número de CMH (CD 34 positivas) circulantes, fazendo supor uma influência do tratamento nas duas populações de células matrizes da medula óssea (ou num percursor comum) e sobre a sua mobilização para o sangue circulante. No entanto, a parte do tratamento quimioterapêutico e do tratamento pelos factores de crescimento que respeita ao aumento do número de células matrizes circulantes é dificil de precisar.

Os Requerentes descobriram, de maneira surpreendente, uma nova aplicação terapêutica do G-CSF, tal como definido acima. Descobriu-se, na sequência de diferentes trabalhos e pesquisas, que o G-CSF podia também ser utilizado na preparação de um medicamento para o tratamento adjuvante num processo de reconstrução de tecidos conjuntivos num ser vivo.

Pela expressão "tecidos conjuntivos, designa-se principalmente os ossos, os tendões, os fibrotendões, as cartilagens, os músculos, etc. presentes no corpo de um ser vivo, em particular no homem e no animal.

Com base em observações anteriores, os Requerentes estudaram a influência da estimulação da medula óssea pelo G-CSF sobre o volume da produção óssea no quadro da formação de osso a partir de fragmentos de periósteo vascularizados e transferidos para um ambiente muscular. 15

Com efeito, o G-CSF possui um potente poder de proliferação sobre a medula óssea. Se bem que a linhagem hematopoiética (e em particular a via de diferenciação para os elementos polinucleares) respeite sobretudo a este poder de proliferação, é frequente que os factores de crescimento possuam um espectro de acção relativamente largo e isto tanto mais quanto o modo de acção destas citoquinas na mobilização das células matrizes da medula não é claro (Kronenwett e col.: The role of cytokines and adhésion molécules for mobilization of peripheral blood stem cells. Stem Cells 2000 18(5): 320-330). Os requerentes testaram a eventual capacidade do G-CSF de aumentar o volume de produção óssea desenvolvida por um fragmento de periósteo transferido para um ambiente muscular (tendo como hipótese fisiológica que a proliferação e a mobilização, para o sangue circulante, de células matrizes medulares capazes de se diferenciarem num sentido conjuntivo permite aumentar a quantidade de células matrizes circulantes disponíveis na zona de influência do fragmento de periósteo e, portanto, a eventual contribuição destas células na produção do osso neoformado). Formaram-se dois grupos de animais:

Um primeiro grupo (A) comportava 20 coelhos adultos jovens e, sobre este grupo, realizava-se uma transferência de fragmento de periósteo para o membro inferior direito.

Um segundo grupo (B) comportava um número idêntico de animais da mesma idade e com o mesmo peso e realizava-se a mesma transferência de fragmento de periósteo para o membro inferior direito.

No entanto, na véspera da intervenção cirúrgica, no dia da intervenção e três dias depois da intervenção, procedia-se a uma injecção de metHuG-CSF (Neupogen® {Filgrastim} Amgen Inc, Califórnia, EUA / Produtos Roche, França) por via subcutânea 16 na dose de 10 μς (1 UM) por quilograma de peso corporal. A fim de trabalhar verdadeiramente "em cegueira" e com o objectivo de não influenciar a qualidade do gesto cirúrgico realizado em cada grupo, o cirurgião ignorava se o animal que operava pertencia ao grupo A ou ao grupo B.

Os dois grupos de animais eram em seguida deixados sem outro tratamento que não fosse a água e a comida necessárias às suas necessidades vitais. Quinze dias depois da data da intervenção, os animais eram sacrificados e extraída a nova produção óssea do seu ambiente muscular. Em seguida, avaliava-se o volume do osso. Uma vez que osso neoformado apresentava uma forma grosseiramente cilíndrica, realizava-se uma medição do comprimento e do diâmetro máximo na parte mediana e nas duas extremidades do cilindro ósseo a fim de obter um diâmetro médio O volume do osso neoformado era calculado como o volume de um cilindro em função do diâmetro médio e do comprimento. 0 grupo A mostrava um volume médio de osso de 189,5 mm3; o grupo B mostrava um volume médio de osso de 853, 9 mm3; o comprimento médio era, no grupo A, de 28,65 milímetros, no grupo B de 34,9 milímetros; o diâmetro média era, no grupo, A de 2,29 milímetros, no grupo B era de 5,57 milímetros. A diferença entre o grupo A e o Grupo B era estatisticamente significativa pelo teste T de Student (volume A, diâmetro A e comprimento A inferiores, respectivamente, a volume B, diâmetro B e comprimento B; p inferior a 0,00001, alfa = 5%), tanto para o comprimento como para o volume e para o diâmetro do cilindro de osso neoformado. O conjunto destes resultados (resultados não publicados) veio mostrar que o G-CSF aumenta a quantidade de osso neoformado 17 por um modelo in vivo de construção óssea, conhecido por apresentar uma sequência de acontecimentos biológicos idêntica à do processo de reparação de fracturas. Numerosos argumentos tendem a mostrar que este aumento poderia dever-se a um aumento do número de CMM presentes no sangue circulante. No decurso dos processos de construção óssea a partir do fragmento de periósteo, ou no quadro de uma fractura óssea, estes elementos são recrutados localmente pelos factores de crescimento e diferentes mediadores emitidos nos tecidos. As CMM saem dos vasos ao nível do foco de construção óssea e contribuem quantitativamente para a construção da cartilagem e do osso neoformado, mas podem eventualmente contribuir também para a reconstrução dos diferentes tecidos conjuntivos de tipo fibro-tendão ou músculo. A invenção refere-se, portanto, particularmente à utilização do G-CSF na preparação de um medicamento para o tratamento adjuvante em processos de reconstrução de tecidos conjuntivos 0 G-CSF encontra assim uma aplicação nova e interessante nas terapêuticas cirúrgicas e/ou medicinais utilizadas no quadro do aparelho locomotor.

De acordo com a invenção, o G-CSF pode ser utilizado como medicamento no tratamento das fracturas ósseas, osteocartilaginosas, das pseudartroses, dos atrasos de consolidação das fracturas ósseas, das lesões cartilaginosas ou ainda das rupturas ou secções de tendões e ligamentos e das lesões dos músculos. Pode também ser utilizado como medicamento no tratamento de alongamento dos membros ou ainda como medicamento no tratamento que associa um gesto cirúrgico de reconstrução óssea ou cartilaginosa por transferência de fragmento de periósteo e, de maneira geral, na cirurgia de regeneração tissular dos membros e do aparelho locomotor. Nas 18 suas diferentes aplicações, o G-CSF destina-se a administração por via geral.

Faz igualmente parte do âmbito da invenção, utilizar o G-CSF como medicamento destinado à administração por via geral e combiná-lo com pelo menos um outro factor destinado à administração local ou por via geral. A expressão "administração local" significa que a administração do principio terapêutico se efectua no local anatómico onde se deseja reconstruir o osso ou a cartilagem.

Esse outro factor é escolhido, com vantagem, entre pelo menos um dos seguintes factores: BMP (Bone Morphogenetic Protein), SCF (stem cell factor); FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), IGF (insuline-like growth factor), insulina, KGF (keratinocyte growth factor), TGF (transforming growth factor), Interferão, Interleucina, VEGF (vascular endothélial growth factor), TNF (tumor necrosin factor), GDNF (glial cell ligne-derived nerotrophic factor), NGF

(neurotrophin nerve growth factor), GM-CSF

(granulocytemacrophage colony stimulating factor), HGF (hepatocyte growth factor), Eritropoietina, PDGF (platelet-derived growth factor), Sulfato de Heparano, Prostaglandinas, Osteoglicina (osteoinductive factor), BCDF (B cell differentiation factor), GDF-5 (growth and differentiation factor-5), Hormona de Crescimento; M-CSF (macrophage colony stimulating factor) ou qualquer outro factor de crescimento conhecido de origem humana ou animal, de extracção ou recombinante.

Para a realização da invenção, o G-CSF é vantajosamente um recombinante humano (para a medicina humana) ou o Filgrastim ou ainda o Lenograstim. 19 0 G-CSF utilizado será de preferência de um alotipo humano no âmbito do tratamento da pessoa humana. A dose utilizada será geralmente de 0,1 a 1000 pg (0,01 a 100 UM), por quilograma de peso corporal e por dia. De maneira preferencial, utilizar-se-á uma dose de 5 a 10 μς, por quilograma de peso corporal e por dia. O principio da invenção requer que o G-CSF seja administrado por via geral, o que significa que o G-CSF entra na circulação sanguínea geral. O modo de libertação para obter uma administração por via geral pode compreender um modo por injecção intravascular directa, um modo por injecção subcutânea, por injecção intramuscular, por injecção intra-articular, uma libertação por via digestiva, injecção intra-peritoneal, libertação transpulmonar, transcutânea, transbocal, transnasal, transrectal, transconjuntival, intra-araquidiana. O principio biológico da invenção é o de mobilizar as CMM (ou o precursor comum das CMM e das CMH) da medula óssea para o sangue circulante. Este aumento do número de células matrizes na circulação sanguínea permite aos mediadores bioquímicos, emitidos localmente nas fracturas ósseas, recrutarem para o foco da fractura óssea uma quantidade de CMM superior à quantidade de CMM que a natureza teria podido fornecer em estado fisiológico.

Propõe-se o mesmo mecanismo adjuvante para a reparação dos tendões e dos ligamentos, uma vez que o aporte directo no local de reparação de células matrizes mesenquimatosas contribui para uma melhoria significativa do processo de reparação (melhoria dos desempenhos mecânicos), (Awad e col.: 20

Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair tendon. Tissue Eng 1999; 5(3): 267-277; Butler e col.: Perspectives on cell and collagen composites for tendon repair. Clin Orthop; 367 Supl: S 324-332). A invenção será agora descrita com referência a exemplos. Exemplo N° 1: Tratamento das pseudartroses A pseudartrose é um defeito da união espontânea e definitiva dos segmentos ósseos na sequência de uma fractura óssea ou de uma osteotomia. Entre as extremidades dos dois fragmentos ósseos interpõe-se uma fibrose. 0 tratamento clássico consiste na excisão da fibrose de interposição, pode também trazer-se localmente osso para um enxerto ósseo. Um gesto cirúrgico complementar e mais especifico do tratamento das pseudartroses consiste em realizar uma descorticação na circunferência dos ossos na extremidade dos segmentos ósseos separados. No caso da presente invenção, injectar-se-á ao paciente G-CSF Neupogen® ({Filgrastim}) na dose de 10 yg (1 UM), por quilograma de peso corporal, 48 horas e 24 horas antes da intervenção, no dia da intervenção, 24 horas e 48 horas após a intervenção. O gesto cirúrgico de descorticação (que retira uma fina lamela de osso cortical, deixando este último ligado ao periósteo vascularizado que o cobre) realiza, de facto, o equivalente a uma activação do periósteo totalmente comparável à que se obtém na cirurgia de transferência dos fragmentos de periósteo ou pelo descolamento do periósteo nas fracturas dos ossos. O processo de reconstrução óssea está reactivado e o tratamento pelo G-CSF vem ainda aumentar o desempenho do gesto cirúrgico. 21

Exemplo N° 2: Tratamento de uma fractura óssea grave

Trata-se do tratamento de fracturas tais como, por exemplo, fractura com múltiplos fragmentos, fractura exposta, fractura associada a uma perda de substância óssea e/ou a uma degradação muscular. Nesta situação é urgente assumir a responsabilidade terapêutica. 0 tratamento comportará a responsabilidade cirúrgica clássica. Irá injectar-se no paciente uma primeira dose de 10 yg (1 UM), por quilograma de peso corporal de G-CSF (Neupogen®, Filgrastim), por via subcutânea, assim que der entrada no hospital. Injectar-se-á a mesma dose quotidianamente durante os quatro dias seguintes 0 G-CSF irá permitir uma colonização máxima do hematoma da fractura pelas CMM, induzindo a reconstrução de um calo de fractura de boa qualidade.

Exemplo N° 3: No quadro de um gesto cirúrgico de reconstrução cartilaginosa por transferência de fragmento de periósteo para renovação de uma cartilagem articular

Realiza-se uma transferência de fragmento de periósteo vascularizado para um ambiente muscular, faz-se nova intervenção dois dias mais tarde sobre o mesmo local operatório e retira-se o tecido desenvolvido no local operatório (material constituído por células matrizes mesenquimatosas). Em seguida, coloca-se esse material na articulação que necessita de uma renovação onde vai regenerar a cartilagem lesionada. Neste caso irá injectar-se uma dose de 10 yg de G-CSF (Neupogen®, Filgrastim), por quilograma de peso corporal, por via subcutânea, quotidianamente durante os dois dias que precedem a intervenção, no dia da intervenção, nos dois dias seguintes à intervenção. O princípio terapêutico evita a passagem in vitro utilizada nos métodos 22 de engenharia tissular ou de terapia celular, a utilização do G-CSF aumenta o número de células mesenquiomatosas presentes no local operatório utilizáveis para a renovação articular.

Exemplo N° 4: No quadro de um gesto cirúrgico de reconstrução de osso por transferência de fragmento de periósteo para colmatar uma perda de substância massiva

Em caso de perda de substância óssea massiva, as fontes de osso de substituição recuperável no organismo são muito limitadas. No essencial trata-se de enxertos de osso a partir de cristãs iliacas e de grandes transferências de Perónio pela cirurgia da perna. Por outro lado, considera-se que os enxertos ósseos fornecem osso morto. 0 gesto cirúrgico consistirá numa transferência de fragmento de periósteo vascularizado; deixar-se-á o fragmento evoluir em osso bastante maduro (por exemplo, durante três semanas), irá então intervir-se no local operatório para recuperar esse osso, ter-se-á o cuidado de recuperar o pediculo vascular fonte do fragmento e do osso neoformado. Transferir-se-á este conjunto para o local anatómico da perda de substância óssea e proceder-se-á a uma reimplantação vascular do pediculo fonte sobre um eixo arterio-venoso adaptado. Neste caso irá injectar-se uma dose de 10 pg de G-CSF (Neupogen®, Filgrastim), por quilograma de peso corporal, por via subcutânea, quotidianamente durante os dois dias que precedem a primeira intervenção, no dia da primeira intervenção, nos dois dias seguintes à primeira intervenção. A transferência e a reimplantação do pediculo vascular evitam a transferência de um osso morto, a utilização do G-CSF vem aumentar o volume de osso neoformado transferido e, portanto, aumentar os sucessos do processo. 23

Exemplo N° 5: No quadro de uma cirurgia de alongamento dos membros

Para alongar um membro, o tratamento actual comporta uma secção do segmento ósseo que deverá ser alongado, depois a colocação de um sistema de fixadores externos ou de um dispositivo centro-medular que permite um afastamento progressivo dos segmentos ósseos à medida que o calo se for reconstruindo (mantém-se a estimulação da osteogenese por afastamento permanente dos dois segmentos ósseos). Em determinados pacientes, o osso neoformado é, no entanto, de um calibre claramente inferior ao calibre dos segmentos ósseos sobre e subjacentes; o osso neoformado tem portanto um aspecto débil e resistência mecânica reduzida. Propõe-se então, como tratamento adjuvante uma dose quotidiana de 10 yg de G-CSF, por via subcutânea, durante todo o procedimento de alongamento.

Exemplo N° 6: No quadro de uma cirurgia de reparação dos tendões

Em caso de ruptura ou de secção traumática do tendão, o tratamento clássico consiste numa cirurgia imediata com sutura das duas extremidades tendinosas, uma imobilização do tendão, seguida de uma nova mobilização do tendão. O tratamento adjuvante comportará uma primeira dose de 10 yg (1 UM), por quilograma de peso corporal de G-CSF (Neupogen®, Filgrastim), que será injectada ao paciente por via subcutânea assim que der entrada no hospital. Injectar-se-á a mesma dose quotidianamente durante os quatro dias seguintes à intervenção. 24

Claro que os exemplos acima são fornecidos a título indicativo e não pretendem limitar o âmbito da invenção. 12-08-2010 25

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização do G-CSF (Factor de Estimulação de Colónias de Granulócitos) para a preparação de um medicamento útil como tratamento adjuvante num processo de reconstrução de tecidos conjuntivos in vivo num ser vivo.
2. 2. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o G-CSF ser utilizado como medicamento no tratamento das fracturas ósseas, osteocartilaginosas, das pseudartroses, dos atrasos de consolidação das fracturas ósseas, das lesões cartilaginosas ou ainda das rupturas ou secções de tendões ou ligamentos e das lesões dos músculos e ser destinado à administração por via geral.
3. 3. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o G-CSF ser utilizado como medicamento no tratamento de alongamento dos membros e ser destinado à administração por via geral.
4. 4. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o G-CSF ser utilizado como medicamento no tratamento que associa um gesto cirúrgico de reconstrução óssea ou cartilaginosa por transferência de fragmento de periósteo e, de maneira geral, na cirurgia de regeneração tissular dos membros e do aparelho locomotor e ser destinado à administração por via geral.
5. 5. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada o G-CSF ser utilizado como medicamento destinado a administração por via geral e por ser combinado com pelo menos um outro factor destinado à administração local ou por via geral. 1
6. 6. Utilização, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por esse outro factor ser escolhido entre pelo menos um dos seguintes factores: BMP (Bone Morphogenetic Protein), SCF (stem cell factor); FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), IGF (insuline-like growth factor), insulina, KGF (keratinocyte growth factor), TGF (transforming growth factor), Interferão, Interleucina, VEGF (vascular endothélial growth factor), TNF (tumor necrosing factor), GDNF (glial cell ligne-derived nerotrophic factor), NGF (neurotrophin nerve growth factor), GM-CSF (granulocytemacrophage colony stimulating factor), HGF (hepatocyte growth factor), Eritropoietina, PDGF (platelet-derived growth factor), Sulfato de Heparano, Prostaglandinas, Osteoglicina (osteoinductive factor), BCDF (B cell differentiation factor), GDF-5 (growth and differentiation factor-5), Hormona de Crescimento; M-CSF (macrophage colony stimulating factor) ou qualquer outro factor de crescimento conhecido de origem humana ou animal, de extracção ou recombinante.
7. 7. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por o G-CSF ser um recombinante humano.
8. 8. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por o G-CSF ser o Filgrastim.
9. 9. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por o G-CSF ser o Lenogastrim.
10. 10. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por o medicamento ser utilizado numa dosagem em 2 G-CSF de 0,1 a 1000 μς (0,01 a 100 UM), de preferência de 5 a 10 μg, por quilograma de peso corporal e por dia.
11. 11. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por o medicamento ser utilizado em medicina humana.

    12. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por o medicamento ser utilizado em medicina veterinária. 12-08-2010 3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização do G-CSF (Factor de Estimulação de Colónias de Granulócitos) para a preparação de um medicamento útil como tratamento adjuvante num processo de reconstrução de tecidos conjuntivos in vivo num ser vivo. 2. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o G-CSF ser utilizado como medicamento no tratamento das fracturas ósseas, osteocartilaginosas, das pseudartroses, dos atrasos de consolidação das fracturas ósseas, das lesões cartilaginosas ou ainda das rupturas ou secções de tendões ou ligamentos e das lesões dos músculos e ser destinado à administração por via geral. 3. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o G-CSF ser utilizado como medicamento no tratamento de alongamento dos membros e ser destinado à administração por via geral. 4. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o G-CSF ser utilizado como medicamento no tratamento que associa um gesto cirúrgico de reconstrução óssea ou cartilaginosa por transferência de fragmento de periósteo e, de maneira geral, na cirurgia de regeneração tissular dos membros e do aparelho locomotor e ser destinado à administração por via geral. 5. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada o G-CSF ser utilizado como medicamento destinado a administração por via geral e por ser combinado com pelo menos um outro factor destinado à administração local ou por via geral. 1 6. Utilização, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por esse outro factor ser escolhido entre pelo menos um dos seguintes factores: BMP (Bone Morphogenetic Protein), SCF (stem cell factor); FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), IGF (insuline-like growth factor), insulina, KGF (keratinocyte growth factor), TGF (transforming growth factor), Interferão, Interleucina, VEGF (vascular endothélial growth factor), TNF (tumor necrosing factor), GDNF (glial cell ligne-derived nerotrophic factor), NGF (neurotrophin nerve growth factor), GM-CSF (granulocytemacrophage colony stimulating factor), HGF (hepatocyte growth factor), Eritropoietina, PDGF (platelet-derived growth factor), Sulfato de Heparano, Prostaglandinas, Osteoglicina (osteoinductive factor), BCDF (B cell differentiation factor), GDF-5 (growth and differentiation factor-5), Hormona de Crescimento; M-CSF (macrophage colony stimulating factor) ou qualquer outro factor de crescimento conhecido de origem humana ou animal, de extracção ou recombinante. 7. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por o G-CSF ser um recombinante humano. 8. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por o G-CSF ser o Filgrastim. 9. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por o G-CSF ser o Lenogastrim. 10. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por o medicamento ser utilizado numa dosagem em 2 G-CSF de 0,1 a 1000 μς (0,01 a 100 UM), de preferência de 5 a 10 μg, por quilograma de peso corporal e por dia. 11. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada por o medicamento ser utilizado em medicina humana.
12. 12. Utilização, de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada por o medicamento ser utilizado em medicina veterinária. 12-08-2010 3 1/1

    FIG.2

    6

    Olfias européen des breveis 80298 MUNICH ALLÊMAHNE Tel. +43(0)89 2399-13 Fax +49(0)892393-4485

    Potrr toutes qusstions sur cette communieation; Tel.-.+31 (0)70 340 45 OB FRANGE Λ ^ TS® ~— 22.04.10 t & ΑΊ·/ 02645^7455 CVÍfk 5 -1 Demande ιΛ rBSStwC"-- 02702463.7 - 2112/1365795 Demendeiir/Tríiilsire Pourquier, ptdier, et al Dáctelon relativa à la ddilvrance d'im br&vei auropéen en Application de rarticte 97(1) CBE La demande de brevet européen No. 02702463.7 ayant été dflment examinée, il est procede, pour 1'ensembfe des Etats contraotants désignés à !a délitfranee d’uii brevet européen áyarrt pour iiíre oelui qiii figure dans lanofifióationen date du 05.01.10 éiriise én appíicatioii de la ràgle 71(3) CBE et dana la version conforma aux documente indiques dans çette noSfi eadon. No de brevet Date de dépôt Priorité revandiquée Les Etats oontraeiants et ls(s) Titulai re(s) du brevet 1365795 07.02.02 22.02.Q1/FRAQta24O6 AT BE CH CY DE DK ES Fl FR GB GR ΙΕ IT LI LU MO NL PT SE TR Pourtjuier, Dídier 3 bis, rue des Cororcilies 34070 Montpeíter/Ffi AT BE CH CY DE DK ES Fl FR GB GR IE ÍT Li LU MC NL PT SE TR Moukoko, Didier 431, avenue du Pichagret 3498G SaintGely du Feso/FR La décision prend effeí au jour de la pubiicatidn au Bulletín européen des brevets de la mentkm de la dslivranoe (art, 97(3) CBE). Date de publication de cette mention au Bulletín européen des Brevets No 10/20 du 19:05.10. Division d'examen Tullberg E Escolar Blasoo P Herrera S

    Lettre recdíffinaridée OEBFiijm 2(1064 12.Q7 16.04.10 áU coúrrier interne : 16.04.10