ES2346044T3 - Utilizacion del g-csf como tratamiento adyuvante en la reconstruccion de tejidos conjuntivos. - Google Patents

Abstract

Utilización del G-CSF (factor de estimulación de las colonias de granulocitos) para la preparación de un medicamento útil como tratamiento adyuvante en un proceso de reconstrucción de tejidos conjuntivos in situ en un ser vivo.

Description

Utilización del G-CSF como tratamiento adyuvante en la reconstrucción de tejidos conjuntivos.

La presente invención se refiere a una nueva aplicación terapéutica del G-CSF y más particularmente a su utilización para la preparación de un medicamento útil en medicina humana o veterinaria.

El G-CSF (abreviatura de "Granulocyte Colony-Stimulating Factor", es decir "Factor de Estimulación de las Colonias de Granulocitos") es un factor de crecimiento. Corresponde a una de las clases de citoquinas denominadas factores de crecimiento hematopoyético o CSF (Colony-Stimulating Factors). Los CFS forman una familia de glicoproteínas que tienen unas funciones capitales en la formación de las células sanguíneas. El G-CSF estimula la producción de las células hematopoyéticas y de manera predominante la producción de polinucleares. El G-CSF es una glicoproteína y el producto de la expresión de un gen situado en el cromosoma 17. Está producido por diferentes células, tales como los fibroblastos, macrófagos, células endoteliales, y células epiteliales. El G-CSF es detectable en la sangre, y se puede purificar a partir de sobrenadantes de cultivos de células tumorales humanas.

La ingeniería biológica permite asimismo producir un alotipo humano de G-CSF, el G-CSF recombinante humano (rHuG-CSF). Se debe observar que el rHuG-CSF es eficaz en otras especies animales (Gratwohl et al.: Transplantation of G-CSF mobilized allogeneic peripheral blood stem cells in rabbits. Bone Marrow Transplant 1995; 16(1):63-68).

Diferentes procedimientos de producción del G-CSF se han descrito en las publicaciones de patentes siguientes: US nº 4.810.643, EP 0 169 566, WO 87 01132 y JP 15 327 384.

En Francia, están disponibles dos medicamentos que pertenecen a la clase del G-CSF: el Neupogen® (rmetHuG-CSF, Filgrastim, comercializado por Amgen/Produits Roche), y el Granocyte® (rHuG-CSF, Lenograstim, comercializado por los laboratorios Rhône-Poulenc Rorer), estos dos medicamentos se utilizan por vía de inyección sub-cutánea o por perfusión intravenosa, para una administración sistémica, a unas dosis comprendidas generalmente entre 5 y 10 \mug por kilogramo de peso corporal y por día.

Las indicaciones actuales del G-CSF en terapéutica humana son el tratamiento de las neutropenias crónicas severas, la reducción de las neutropenias inducidas por los tratamientos quimioterapéuticos anticancerígenos mielotóxicos, la reducción de las neutropenias inducidas por las terapias mielosupresivas (quimioterapia o radioterapia) seguidas de injerto de médula en el tratamiento de los cánceres o de las leucemias, la movilización de las células cepas hematopoyéticas para constituir un injerto con vistas a un injerto de médula (autoinjerto o aloinjerto).

Se debe subrayar que, en esta última utilización, el objetivo del tratamiento es extraer de la médula ósea las células cepas hematopoyéticas y hacerlas pasar a la sangre circulante. Estas células cepas se recogen entonces mediante citaféresis sucesivas y constituirán el injerto. Se trata por lo tanto de movilizar al máximo hacia la sangre circulante este contingente de células cepas hematopoyéticas que, en el estado normal, se encuentran en cantidad muy reducida en la sangre circulante, lo cual no permite constituir un injerto de calidad suficiente.

Esta técnica de recolección del injerto mediante citaféresis después de la movilización de las células cepas ha sustituido ventajosamente la recolección directa de la médula ósea mediante citopunción que necesita una anestesia del paciente y múltiples punciones de médula. El injerto así constituido se transfunde al paciente, cuya propia médula ha sido destruida por la quimioterapia o la radioterapia; constituye entonces la nueva fuente de producción de las células sanguíneas.

El G-CSF se utiliza de manera diaria para estas diferentes indicaciones. Su inocuidad ampliamente reconocida permite utilizarlo asimismo en personas con buena salud para constituir unos injertos de médula en el marco de los aloinjertos.

Conviene recordar que la médula ósea, repartida en los diferentes huesos del organismo, es el lugar de producción de las células sanguíneas maduras (eritrocitos, plaquetas, polinucleares, monocitos, linfocitos). La producción de estas células sanguíneas se efectúa a partir de la multiplicación y de la diferenciación de una población de células cepas pluripotentes (Célula Cepa Hematopoyética, abreviado "CSH"). Estas últimas representan cuantitativamente una fracción muy reducida de la población celular de la médula ósea. Están caracterizadas habitualmente por la expresión de un marcador celular denominado CD34 (cluster de diferenciación 34).

Sin embargo, se ha descrito otro tipo de células cepas de la médula ósea (Pittenger et al.: Multilineage potential of human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143-147; Dennis et at.: A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse. J Bone Miner Res 1999; 14(5): 700-709). Se trata de una población de células capaz de una vía de diferenciación conjuntiva; estas células cepas se denominan Células Cepas Mesenquimatosas (abreviado "CSM"). Esta población de células cepas constituye asimismo en el estado normal un contingente muy reducido de los elementos celulares de la médula ósea pero presenta la capacidad de diferenciarse en múltiples direcciones de naturaleza conjuntiva (hueso, cartílago, fibrotendón, músculo, grasa). Actualmente se discute la existencia de un precursor común (célula cepa CD34 negativa) al conjunto de las líneas hematopoyéticas y conjuntivas (Seshi et al.: Human bone marrow stromal cell: coexpression of markers specific for multiple mesenchymal stem lineage. Blood Cell Mol Dis 2000(3): 234-246; Lange et al.: Hematopoietic reconstruction of syngenic mice with a peripheral blood-derived, monoclonal CD34-, Sca-1+, Thy1(low), c-kit+ stem cell ligne. J Hematother Stem Cell Res. 1999; 8(4): 335-342).

Esta población de células cepas constituye actualmente el objeto de una actividad de investigación intensiva, en particular en el campo de la cirugía plástica, de la reparación ósea y de la osteoporosis, en el marco de los campos emergentes de la medicina que son la ingeniería tisular y la terapia celular. Sin embargo, constituyendo al principio esta población de CSM una cantidad de células particularmente baja, las técnicas utilizadas recurren a un paso in vitro. Para resumir, se recoge la médula ósea, y después, in vitro, se separa el contingente de las células mesenquimatosas del resto de las células de la médula, y estas células se cultivan y se multiplican a continuación todavía in vitro. Eventualmente, crecen asimismo artificialmente en el sentido de una diferenciación específica. A continuación, se reinyectan o se reimplantan en un sitio anatómico en el que contribuyen a la reconstrucción de un tejido conjuntivo deteriorado, que puede ser un hueso (Bruder et al.: Bone regeneration by implantation of purified culture-expended human mesenchymal stem cells. J Ortho Res 1998; 16(2): 155-162) o bien un tendon (Awad et al.: Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon. Tissue Eng 1999; 5(3): 267-277; Butler et al.: Perspectives on cell and collagen composites for tendon repair. Clin Orthop 1999; 367 Supl.: S 324-332).

Estas técnicas necesitan sin embargo una colaboración con unos laboratorios muy especializados y la obtención de un injerto conjuntivo de calidad no siempre está asegurada (Solchaga et al.: High variability in rabbit bone marrow-derived mesenchymal cell preparation. Cell Transplant 1999; 8(5): 511-519). La proliferación y la diferenciación de las CSM están inducidas por la Bone Morphogenetic Protein-2 {BMP-2} (Fromigue et al.: Bone morphogenetic protein 2 and transforming growth factor-beta 2 interact to modulate human bone marrow stromal cell proliferation and differenciation. J Cell Biochem. 1998; 68(4): 411-426), pero también los Transforming Growth Factor beta 1 (Andrades et al.: A recombinant TGF-beta 1 fusion protein with collagen-binding domain promotes migration, growth, and differentiation of bone marrow mesenchymal cells. Exp Cell Res 1999; 250(2): 485-498).

En el campo de la reparación de las fracturas óseas, el proceso de reparación óseo después de una fractura de un hueso se describe clásicamente en dos grandes fases. La primera fase es un periodo de unión que comprende sucesivamente un periodo de hematoma, un periodo de proliferación celular de células mesenquimatosas inmaduras a partir del periostio y de los tejidos conjuntivos perióseos, un periodo de constitución de un callo blando en el que las células mesenquimatosas pero también unos fibroblastos y unos neo-vasos invaden el espacio del foco de fractura, y un periodo de callo primario en el que las células mesenquimatosas transformadas en un sentido osteocartilaginoso constituyen un macizo tisular de resistencia mecánica progresivamente reforzado entre los dos extremos óseos. La segunda fase es un periodo de remodelación, en el que el hueso primario se transforma en hueso tejido maduro cuya forma final se adapta a las exigencias de las funciones mecánicas del segmento óseo en cuestión. En el caso de los huesos largos, la cavidad medular se reconstituye así como una cortical.

Numerosos mediadores bioquímicos están implicados en el proceso de reparación ósea (Millis: Bone and non-bone derived growth factors and effects on bone healing. Vet Clin North Am Small Anim Pract 1999; 29(5):1221-1246). Pueden actuar de manera endocrina, paracrina o autocrina. Los FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), IGF (insuline-like growth factor) I y II, TGF beta (transforming growth factor beta), las BMP (Bone Morphogenetic Proteins), las prostaglandinas, la osteoglicina (osteo inductive factor) y la hormona de crecimiento (GH) están implicados a diferentes niveles.

El tratamiento básico de las fracturas óseas consiste esencialmente en la estabilización del foco de la fractura. Esta estabilización se puede obtener mediante una contención del segmento óseo en el marco de un tratamiento ortopédico o mediante osteosíntesis si fuese necesario recurrir a la cirugía. Una prevención de las infecciones y de los accidentes tromboembólicos es asimismo necesaria.

Se debe observar que no existe en la actualidad ningún tratamiento medicamentoso por vía general utilizado en la práctica médico-quirúrgica diaria y capaz de mejorar la reparación de las fracturas óseas, incluso si algunos medicamentos como la L-Dopa o unos péptidos de tipo FGF son evaluados por algunos autores.

Unos sistemas de suministro local, sobre el foco de la reparación ósea, de factores de crecimiento destinados a mejorar el proceso de reconstrucción ósea son evaluados asimismo por algunos autores. Se han utilizado diferentes moléculas: el TGF-beta (transforming growth factor beta), el FGF (fibroblast growth factor), las BMP, las BMP-2 y BMP-7 en particular (Bonn: The application of cell biology to broken bones. Lancet 1999; 353 (9153): 650). Unas moléculas tales como los heparanos sulfatos parecen asimismo prometedoras (Lafont et al.: RGTA11, a new healing agent, triggers developmental events during healing craniotomy defects in adult rats. Growth Factors 1998; 16(1): 23-38).

Por otra parte, se ha desarrollado un modelo de cirugía experimental de construcción osteocartilaginosa por transferencia de colgajos de periostio (Tesis del Doctor en medicina D. Moukoko, Facultad de medicina, universidad Montpellier I, 1996: Etude Expérimentale de l'ostéogenèse des lambeaux périostés vascularisés; Primer congreso de investigación en ortopedia pediátrica, Toulouse 1997, Presentación: La osteogénesis de los colgajos periostios vascularizados, D Moukoko, A Dimeglio; Congreso anual de la European Pediatric Orthopedic Society Heidelberg 1997, Presentación: The osteogenical properties of periosteal vascularized flaps, D Moukoko, A Dimeglio; Segundo congreso de investigación en ortopedia pediátrica, Montpellier 1998, Presentación: Histogénesis precoz de los colgajos periostios vascularizados en un entorno muscular, D Moukoko, D Pourquier, A Dimeglio).

Este modelo quirúrgico ya bien conocido (Poussa et al.: The osteogenic capacity of free periosteal and osteoperiosteal grafts. Acta Orthop Scand 1979; 50: 491-499; Ritsilä et al.: Periosteal and perichondral grafting in reconstructive surgery. Clin Orthop 1994; 302: 259-265; Finley et al.: Revascularized periosteal grafts - A new method to produce functional new bone without bone grafting. Plast Reconstr Surg 1978; 61(1): 1-6; Rubak: Reconstruction of articular cartilage defects with free periosteal grafts. Acta Orthop Scand 1982; 53: 175; Masquelet et al.: Vascularized periosteal grafts. Anatomic description, experimental study, preliminary report of clinical experience. Rev Chir Orthop Réparatrice Appar Mot 1988; 74 Supl. 2: 240-243; van den Wildenberg et al.: Free revascularised periosteum transplantation: an experimental study. Br Plast Surg 1984; 37(2): 226-235; O'Driscoll et al.: Durability of regenerated articular cartilage produced by free autogenous periosteal grafts in major full-thickness defects on joint surfaces under the influence of continuous passive motion. A follow-up report at one year. J Bone Joint Surg Am 1988; 70(4): 595-606) en el campo de la reconstrucción de cartílago articular o de la reconstrucción ósea, ha permitido, en las investigaciones de los solicitantes, producir hueso en el sitio que corresponde a la zona de implantación del colgajo de periostio. La transferencia de colgajos de pericondrio permite una producción cartilaginosa (Diaz-Flores et al.: Growth of two types of cartilage after implantation of free autogenic perichondrial grafts. Clin Orthop 1988 Sep.; (234): 267-279).

El procedimiento de realización era el siguiente:

Incisión longitudinal de la cara interna de la pierna. Exposición del músculo de la pierna anterior, incisión de su aponeurosis longitudinalmente a 5 mm de la cresta tibial anterior. Instalación de hilos tractores que evitan las manipulaciones del colgajo de periostio, incisión del periostio longitudinalmente, en la cara lateral de la diáfisis tibial. Desprendimiento del periostio, de su incisión hacia la cresta tibial postero-medial. Incisión del periostio a lo largo de la cresta tibial posteo-medial (anchura del colgajo 10 mm). Incisiones transversales, proximal y distal, liberando el colgajo sobre 30 mm de largo. Desprendimiento del músculo flexor de los dedos del pie, cuya vascularización procede de un pedículo diferente. El colgajo queda vascularizado sobre el pedículo safeno por medio del fascia externo de la pierna, del eje safeno a la cresta tibial anterior, que actúa como lámina porta-vasos. Así individualizado, el colgajo se puede posicionar en situación ectópica u ortotópica.

Una variante más compleja de este modelo permitía transferir el colgajo vascularizado en la proximidad de las estructuras óseas de la tibia y del fémur y de la articulación de la rodilla. Este modelo ha sido utilizado al mismo tiempo en el conejo y en el carnero.

El sacrificio de diferentes grupos de animales en unos plazos post operatorios de duraciones crecientes, permitía estudiar las etapas sucesivas de la formación del cartílago y del hueso. Después del sacrificio de los animales, el conjunto de los tejidos que corresponden al hueso neoformado y a los otros tejidos del entorno se extraían y se estudiaban mediante histología.

La neoproducción mostraba, en el estudio histológico de los diferentes tiempos, una secuencia de proliferación celular, diferenciación celular y tisular; y después una maduración de los tejidos neoformados. Esta secuencia comprendía una fase de proliferación celular de una mesénquima poco diferenciada, una fase de maduración de esta mesénquima en un tejido cartilaginoso, una fase de osificación de esta matriz cartilaginosa por medio de un frente de osificación, una fase de osificación completa de este hueso en el modo de un hueso primario, una fase de maduración de este hueso primario en un hueso secundario de tipo tejido, la constitución de una cavidad medular llena de médula ósea. El conjunto realizaba por último el equivalente de un pequeño hueso largo con una cavidad medular y una cortical.

El conjunto de estas observaciones mostraba asimismo un paralelismo sorprendente con la secuencia de acontecimientos biológicos que presiden al mismo tiempo la construcción del brote de miembro durante la embriogénesis, y con las diferentes fases de la reconstrucción ósea en los callos de las fracturas óseas, siendo estos dos procesos considerados en la actualidad como muy próximos al plano de la biología molecular (Ferguson et al.: Common molecular pathways in skeletal morphogenesis and repair: Ann NY Acad Sci: 1998; 23 857: 33-42).

Unos experimentos complementarios que utilizan unas membranas semi-permeables (membranas permeables a las moléculas e impermeables a las células) mostraban asimismo que el colgajo de periostio actuaba sobre los tejidos del entorno por medio de la difusión local de moléculas bioquímicas difundibles, que constituyen de hecho una zona de influencia del colgajo de periostio en los tejidos del entorno. Un reciente estudio en el campo de la biología del periostio muestra que uno de los mediadores emitido precozmente en el medio es la BMP 2 (Bone Morphogenetic Protein 2) (Sanyal et al.: Initial evidence for the involvement of bone morphogenetic protein-2 early during periosteal chondrogenesis. J Orthop Res 1999 17(6): 926-934), confirmando todavía la similitud entre los acontecimientos desarrollados en las fracturas óseas y los acontecimientos desarrollados en el modelo de reconstrucción ósea por colgajo de periostio. Desde el punto de vista fisiopatológico, esta emisión local de mediadores bioquímicos está generada por la "activación" del periostio, siendo esta activación iniciada a su vez por el desprendimiento mecánico del periostio de su soporte óseo (uno de los elementos fundamentales de la fisiopatología de la fractura ósea). Se debe observar que la capacidad osteogénica del periostio "activado" por desprendimiento se observa asimismo habitualmente en la práctica clínica, por ejemplo en caso de desprendimiento tumoral, infeccioso o hemático. Algunos estudios muestran que el desprendimiento del periostio y de una fina capa ósea sub-periostial inicia el mismo proceso (Poussa et al. The osteogenic capacity of free periosteal and osteoperiosteal grafts. Acta Orthop Scand 1979; 50:491-499; Sakai et al.: Free vascularized thin corticoperiosteal graft. Plast Reconstr Surg 1991; 87(2): 290-298).

Sin embargo, en este modelo, unos elementos de conocimiento nuevos han aparecido en particular gracias a los estudios histológicos. Lo más importante es la contribución de células cepas mesenquimatosas presentes en la circulación sanguínea al proceso de reconstrucción óseo.

Una forma de contribución de las CSM medulares ya se conoce en el marco de la formación del callo de fractura durante la reparación ósea. Sin embargo, se entiende como una contribución de naturaleza puramente local, contribuyendo la médula ósea situada en el trazo de la fractura a la reconstrucción del hueso fracturado.

Algunos argumentos histológicos han demostrado que esta contribución se realiza asimismo a partir de células cepas mesenquimatosas presentes en la sangre circulante que son reclutadas localmente por los diferentes mediadores bioquímicos emitidos en los tejidos alrededor del colgajo de periostio.

En particular alrededor del hueso neoformado, es de observación frecuente identificar en los músculos en el seno de los septos inter-musculares (que son, se recuerda, unas láminas porta-vasos) una población de células diferenciadas en las diferentes direcciones conjuntivas (hueso, cartílago, fibrotendón, músculo) y en un sentido hematopoyético.

La situación micro-anatómica específica de estas células en las láminas porta-vasos muestra claramente que proceden del flujo sanguíneo y han sido reclutadas localmente por los factores de crecimiento emitidos en los tejidos que rodean el colgajo de periostio. A pesar de ser claramente diferenciados en un sentido conjuntivo, estos elementos no habían sido integrados sin embargo al bloque óseo neoformado (datos no publicados).

Otra observación regular en el modelo es la presencia de células conjuntivas de los diferentes tipos y de células hematopoyéticas en masa en las cavidades articulares presentes en la zona de influencia del colgajo.

Estas imágenes indican claramente una salida hacia la cavidad articular de estas células a partir de los vasos del revestimiento sinovial, constituyendo la cavidad articular entonces un receptáculo (datos no publicados).

Otra observación interesante era la observación de zonas de diferenciación masiva en un sentido conjuntivo (hueso, cartílago, músculo, fibrotendón) de células de la médula ósea en la cavidad medular de los huesos situados en la zona de influencia del colgajo de periostio. Esta última observación mostraba una influencia idéntica del colgajo de periostio en la población de las CSM, pero esta vez en el contingente de CSM medulares no circulante.

El conjunto de estas observaciones permite suponer un mecanismo de "reclutamiento" local en la zona de influencia del colgajo de una población de células cepas presente en la sangre circulante. Estas células, saliendo de los vasos a nivel de la zona de influencia del colgajo, son puestas a disposición del proceso de reconstrucción tisular como unos "ladrillos" que contribuyen a la construcción de un edificio.

Otro argumento importante era la presencia muy regular de un contingente de células hematopoyéticas maduras mezcladas con unos elementos conjuntivos. Este último aspecto puede, en efecto, indicar que el reclutamiento local de células cepas se refiere o bien a unas células cepas circulantes particularmente inmaduras y pluripotentes capaces de diferenciarse en las direcciones al mismo tiempo hematopoyética y conjuntiva, o bien las dos poblaciones celulares cepas (CSH y CSM) circulantes.

Las figuras 1 y 2 ilustran las relaciones del colgajo de periostio transferido y de las diferentes estructuras anatómicas interesadas.

La figura 1 muestra el colgajo de periostio 1 y su zona de influencia 2 en las etapas muy precoces del modelo. La zona de influencia se entiende como el espacio en el que la difusión de los factores de crecimiento y de los diferentes mediadores influye en los tejidos del entorno. En esta figura, 3 designa el músculo y los septos inter-musculares adyacentes al colgajo de periostio 1. Se ha representado además un fémur 4 y su médula ósea 5 y una tibia 6 y su médula ósea 7. Por último, 8 designa la cavidad articular comprendida entre el fémur y la tibia.

La figura 2 muestra el resultado de la transferencia en un plazo más largo después de la transferencia del colgajo de periostio; el hueso neoformado 9 ha aparecido en el sitio de transferencia del colgajo, a pesar de que unos focos de diferenciación conjuntiva multidireccional (representados por unas cruces) han aparecido en la médula ósea, los septos inter-musculares y la cavidad articular situados en la zona de influencia del colgajo de periostio.

En términos cuantitativos, la importancia del reclutamiento local de CSM depende, sin embargo, del número de células cepas presentes en el flujo sanguíneo a nivel de los vasos situados en la zona de influencia del colgajo. Como ya se ha mencionado, esta población de células cepas es, en el sujeto con buena salud, cuantitativamente muy reducida en la médula ósea. En la sangre, estas células cepas son identificables en estado normal (Huss et al.: Evidence of peripheral blood-derived, plastic-adherent CD34(-/low) hematopoietic stem cell clones with mesenchymal stem cell characteristics. Stem Cell 2000; 18(4): 252-260), pero también si el sujeto ha sido tratado mediante quimioterapia mielotóxica seguida de una movilización de las células cepas de la médula ósea por unos factores de crecimiento de tipo G-CSF (Fernandez et al.: Detection of stromal cells in peripheral blood progenitor cell collections from breast cancer patients. Bone marrow Transplant 1997; 20: 265-271). Es interesante observar que en este caso, un aumento de la cantidad de las CSM circulantes está correlacionado con el aumento concomitante del número de CSH (CD 34 positivas) circulantes, dejando suponer una influencia de los tratamientos en las dos poblaciones de células cepas de la médula ósea (o en un precursor común) y en la movilización hacia la sangre circulante. Sin embargo, la parte respectiva del tratamiento quimioterapéutico y del tratamiento por los factores de crecimiento en el aumento del número de células cepas circulantes sigue siendo difícil de precisar.

Los solicitantes han descubierto, de manera sorprendente, una nueva aplicación terapéutica del G-CSF, tal como se ha definido anteriormente. Se ha descubierto, tras diferentes estudios e investigaciones, que el G-CSF podía ser utilizado asimismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento adyuvante en un proceso de reconstrucción de los tejidos conjuntivos en un ser vivo.

Mediante la expresión "tejidos conjuntivos", se designan principalmente los huesos, los tendones, los fibrotendones, los cartílagos, los músculos, etc., presentes en el cuerpo de un ser vivo, en particular en el ser humano y el animal.

En base a las observaciones anteriores, los solicitantes han estudiado la influencia de la estimulación de la médula ósea por el G-CSF en el volumen de la producción ósea en el marco de la formación de hueso a partir de colgajos de periostio vascularizados y transferidos a un entorno muscular.

En efecto, el G-CSF posee un potente poder proliferativo sobre la médula ósea. A pesar de que la línea hematopoyética (y en particular la vía de diferenciación hacia los polinucleares) esté sobre todo afectada por este poder proliferativo, es frecuente que los factores de crecimiento posean un espectro de acción relativamente amplio, y aún más por cuanto que el modo de acción de estas citoquinas en la movilización de las células cepas de la médula no es claro (Kronenwett et al.: The role of cytokines and adhésion molécules for mobilization of peripheral blood stem cells. Stem Cells 2000 18(5): 320-330). Los solicitantes han ensayado la eventual capacidad del G-CSF para aumentar el volumen de la producción ósea desarrollada por un colgajo de periostio transferido a un entorno muscular (con, como hipótesis fisiológica que la proliferación y la movilización hacia la sangre circulante de células cepas medulares capaces de diferenciarse en un sentido conjuntivo permite aumentar la cantidad de células cepas circulantes disponibles en la zona de influencia del colgajo de periostio, y por lo tanto la contribución eventual de estas células a la producción de hueso neoformado). Se han constituido dos grupos de animales:

Un primer grupo (A) comprendía 20 conejos adultos jóvenes, y se realizó sobre este grupo una transferencia de colgajo de periostio en el miembro inferior derecho.

Un segundo grupo (B) comprendía un número idéntico de animales de la misma edad y del mismo peso, y se realizó la misma transferencia de colgajo de periostio. Sin embargo, la víspera de la intervención quirúrgica, el día de la intervención y los tres días siguientes a la intervención se procedía a una inyección de rmetHuG-CSF (Neupogen® {filgrastime} Amgen Inc Califomie USA/Produits Roche France) por vía sub-cutánea con la dosis de 10 \mug (1 MU) por kilogramo de peso corporal. Con el fin de trabajar realmente "a ciegas" y con el fin de no influir en la calidad del gesto
quirúrgico realizado en cada grupo, el cirujano ignoraba si el animal operado pertenecía al grupo A o al grupo B.

Los dos grupos de animales fueron dejados después sin más tratamiento salvo la aportación en agua y comida necesaria para las necesidades vitales. Quince días después de la fecha de intervención, los animales se sacrificaron y la neo-producción ósea se extraía de su entorno muscular. Se ha evaluado a continuación el volumen del hueso. Presentando el hueso neoformado una forma más o menos cilíndrica, se realizó una medición de la longitud y unas mediciones del diámetro máximo en la parte mediana y en los dos extremos del cilindro óseo con el fin de obtener un diámetro medio. El volumen del hueso neoformado se calculó como el volumen de un cilindro en función del diámetro medio y de la longitud.

El grupo A mostraba un volumen medio de hueso de 189,5 mm^{3}, el grupo B un volumen medio de hueso de 853,9 mm^{3}; la longitud media era en el grupo A de 28,65 milímetros, en el grupo B de 34,9 milímetros; el diámetro medio era en el grupo A de 2,29 milímetros, en el grupo B de 5,57 milímetros. La diferencia entre el grupo A y el grupo B era estadísticamente significativa mediante el ensayo T de Student (volumen A, diámetro A y longitud A inferiores respectivamente al volumen B, diámetro B y longitud B; p inferior a 0,00001, alfa = 5%), al mismo tiempo para la longitud, para el volumen y para el diámetro del cilindro de hueso neoformado.

El conjunto de estos resultados (resultados no publicados) ha demostrado que el G-CSF aumenta la cantidad de hueso neoformados por un modelo in vivo de construcción ósea conocido por presentar una secuencia de acontecimientos biológicos idénticos a los procesos de reparación de las fracturas. Numerosos argumentos tienden a mostrar que este aumento podría deberse a un aumento del número de CSM presentes en la sangre circulante. Durante los procesos de construcción ósea a partir del colgajo de periostio o en el marco de una fractura ósea, estos elementos son reclutados localmente por los factores de crecimiento y diferentes mediadores emitidos en los tejidos. Las CSM salen de los vasos a nivel del foco de construcción ósea y contribuyen cuantitativamente a la constitución del cartílago y del hueso neoformado, pero pueden contribuir probablemente asimismo a la reconstitución de los diferentes tejidos conjuntivos de tipo fibrotendón o músculo.

La invención se refiere por lo tanto más particularmente a la utilización del G-CSF en la preparación de un medicamento para el tratamiento adyuvante en unos procesos de reconstitución de tejidos conjuntivos. Así, encuentra una aplicación nueva e interesante en las terapéuticas quirúrgicas y/o médicas utilizadas en el marco de la patología del aparato locomotor.

De acuerdo con la invención, el G-CSF se puede utilizar como medicamento en el tratamiento de las fracturas óseas, osteocartilaginosas, de las pseudo-artrosis, de los retrasos de consolidación de las fracturas óseas, de las lesiones cartilaginosas, o también de las roturas o secciones de tendones y ligamentos y de las lesiones de los músculos. Se puede utilizar asimismo como medicamento en el tratamiento de alargamiento de los miembros, o también como medicamento en el tratamiento que asocia un gesto quirúrgico de reconstrucción ósea o cartilaginosa mediante transferencia de colgajo de periostio, y de manera general en la cirugía de regeneración tisular de los miembros y del aparato locomotor. En estas diferentes aplicaciones, el G-CSF está destinado a la administración por vía general.

Entra asimismo en el marco de la invención utilizar el G-CSF como medicamento destinado a la administración por vía general y combinarlo con por lo menos otro factor destinado a la administración local o por vía general. La expresión "administración local" significa que la administración del principio terapéutico se efectúa en el sitio anatómico en el que se desea reconstruir el hueso o el cartílago.

Este otro factor se selecciona ventajosamente de entre uno por lo menos de los factores siguientes: BMP (Bone Morphogenetic Protein), SCF (stem cell factor), FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), IGF (insuline-like growth factor), Insulina, KGF (keratinocyte growth factor), TGF (transforming growth factor), Interferón, Interleucina, VEGF (vascular endothélial growth factor), TNF (tumor necrosing factor), GDNF (glial cell ligne-derived neurotrophic factor), NGF (neurotrophin nerve growth factor), GM-CSF (granulocytemacrophage colony stimulating factor), HGF (hepatocyte growth factor), Eritropoyetina, PDGF (platelet-derived growth factor), Sulfato de heparano, Prostaglandinas, Osteoglicina (osteoinductive factor), BCDF (B cell differentiation factor), GDF-5 (growth and differentiation factor-5), Hormona de crecimiento; M-CSF (macrophage colony stimulating factor); o cualquier otro factor de crecimiento conocido de origen humano o animal, de extracción o recombinante.

Para la realización de la invención, el G-CSF es ventajosamente un recombinante humano (para la medicina humana), o el filgrastim, o también el lenograstim.

El G-CSF utilizado será preferentemente un alotipo humano en el marco del tratamiento de una persona humana. La dosificación utilizada será generalmente de 0,1 a 1.000 \mug (0,01 a 100 MU) por kilogramo de peso corporal y por día. De manera preferida, se utilizará una dosis de 5 a 10 \mug por kilogramo de peso corporal y por día.

El principio de la invención requiere que el G-CSF sea administrado por vía general, lo que significa que el G-CSF entra en la circulación sanguínea general. El modo de suministro para obtener una administración por vía general puede comprender un modo por inyección intravascular directa, un modo por inyección subcutánea, por inyección intramuscular, por inyección intra-articular, un suministro por vía digestiva, inyección intraperitoneal, suministro transpulmonar, transcutáneo, transbucal, transnasal, transrectal, transconjuntival, intrarraquídeo.

El principio biológico de la invención es movilizar las CSM (o el precursor común de las CSM y de las CSH) de la médula ósea hacia la sangre circulante. Este aumento del número de células cepas en la circulación sanguínea permite que los mediadores bioquímicos emitidos localmente en las fracturas óseas recluten en el foco de la fractura una cantidad de CSM superior a la cantidad de CSM que la naturaleza podría haber suministrado en el estado fisiológico.

El mismo mecanismo adyuvante se propone para la reparación de los tendones o de los ligamentos, puesto que la aportación directa en el sitio de reparación de células cepas mesenquimatosas contribuye a una mejora significativa del proceso de reparación (mejora de los rendimientos mecánicos), (Awad et al.: Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon. Tissue Eng 1999; 5(3): 267-277; Butler et al.: Perspectives on cell and collagen composites for tendon repair. Clin Orthop; 367 Supl.: S 324-332).

La invención se escribirá ahora haciendo referencia a unos ejemplos.

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Ejemplo nº 1 Tratamiento de las pseudoartrosis

La pseudoartrosis es un defecto de unión espontáneo y definido de los segmentos óseos tras una fractura ósea o una osteotomía. Una fibrosis se interpone generalmente entre los extremos de los dos segmentos óseos. El tratamiento habitual consiste en la escisión de la fibrosis de interposición, y se puede asimismo aportar localmente hueso mediante un injerto óseo. Un gesto quirúrgico complementario y más específico del tratamiento de las pseudoartrosis consiste en realizar una decorticación en la circunferencia de los huesos en el extremo de los segmentos óseos desunidos. En el caso de la presente invención, se inyectará al paciente G-CSF (Neupogen® {Filgrastim}) a la dosis de 10 \mug (1 MU) por kilogramo de peso corporal, 48 horas y 24 horas antes de la intervención, el día de la invención, y 24 horas y 48 horas después de la intervención. El gesto quirúrgico de decorticación (que lleva una fina lámina de hueso cortical conservando al mismo tiempo este último atado al periostio vascularizado que lo recubre) realiza realmente el equivalente a una activación del periostio muy comparable a la que se obtiene en la cirugía de transferencia de los colgajos de periostio o mediante el desprendimiento del periostio en las fracturas de los huesos. El proceso de reconstrucción ósea se encuentra reiniciado y el tratamiento mediante G-CSF hace que aumente todavía más el rendimiento del gesto quirúrgico.

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Ejemplo nº 2 Tratamiento de una fractura ósea grave

Se trata del tratamiento de fracturas tales como, por ejemplo, una fractura de fragmentos múltiples, una fractura abierta, una fractura asociada a una pérdida de sustancia ósea y/o a una degeneración muscular. En esta situación, la atención terapéutica se realiza en urgencias. El tratamiento comprenderá la atención quirúrgica habitual. Una primera dosis de 10 \mug (1 MU) por kilogramo de peso corporal de G-CSF (Neupogen®, Filgrastim) se inyectará por vía subcutánea al paciente desde su admisión en el hospital. La misma dosis se inyectará de manera diaria durante los cuatro días siguientes. El G-CSG permitirá una colonización máxima del hematoma de la fractura por unas CSM, induciendo la reconstrucción de un callo de fractura de buena calidad.

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Ejemplo nº 3 En el marco de un gesto quirúrgico de reconstrucción cartilaginosa por transferencia de colgajo de periostio, para reconstruir de un cartílago articular

Se realiza una transferencia de colgajo de periostio vascularizado en un entorno muscular, se vuelve a intervenir dos días más tarde en el mismo sitio operatorio, y se extrae el tejido desarrollado en el sitio operatorio (material constituido por células cepas mesenquimatosas). Este material se dispone a continuación en la articulación que necesita una reconstrucción en la que regenerará el cartílago lesionado. En este caso, una dosis de 10 \mug de G-CSF (Neupogen®, Filgrastim) por kilogramo de peso corporal se inyectará por vía subcutánea diariamente durante los dos días anteriores a la intervención, el día de la intervención, y los dos días siguientes a la intervención. El principio terapéutico evita el paso in vitro utilizado en los métodos de ingeniería tisular o de terapia celular, y la utilización de G-CSF aumenta el número de células mesenquimatosas presentes en el sitio operatorio y que se pueden utilizar para la reconstrucción articular.

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Ejemplo nº 4 En el marco de un gesto quirúrgico de reconstrucción de hueso mediante transferencia de colgajo de periostio para subsanar una pérdida de sustancia masiva

En caso de pérdida de sustancia ósea masiva, las fuentes de hueso de sustitución recuperable en el organismo son bastante limitadas. Esencialmente, se trata de los injertos de huesos a partir de las crestas ilíacas, y de las transferencias de peroné para la cirugía de la pierna. Por otro lado, se considera que los injertos óseos suministran hueso muerto. El gesto quirúrgico consistirá en una transferencia de colgajo de periostio vascularizado; se dejará que el colgajo evolucione en un hueso bastante maduro (por ejemplo durante tres semanas), se intervendrá entonces nuevamente en el sitio operatorio para recuperar este hueso, y se tomará la precaución de recuperar el pedículo vascular fuente del colgajo y del hueso neoformado. Este conjunto se transferirá al sitio anatómico de la pérdida de sustancia ósea, y se procederá a una reimplantación vascular del pedículo fuente en un eje arterio-venoso adaptado. En este caso, una dosis de 10 \mug de G-CSF (Neupogen®, Filgrastim) por kilogramo de peso corporal se inyectará por vía subcutánea diariamente durante los dos días anteriores a la primera intervención, el día de la primera intervención, y los dos días después de la primera intervención. La transferencia y la reimplantación del pedículo vascular evitan la transferencia de un hueso muerto, y la utilización del G-CSF aumentará el volumen del hueso neoformado transferido y por lo tanto aumentará los rendimientos del procedimiento.

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Ejemplo nº 5 En el marco de una cirugía de alargamiento de los miembros

Para alargar un miembro, el tratamiento actual comprende una sección del segmento óseo que debe ser alargado y después la instalación de un sistema de fijadores externos o de un dispositivo centro-medular que permite una separación progresiva de los segmentos óseos a medida que se produce la reconstrucción del callo (la estimulación de la osteogénesis se mantiene mediante la separación permanente de los dos segmentos óseos). En algunos pacientes, el hueso neoformado es, sin embargo, de un calibre claramente inferior al calibre de los segmentos óseos supra y subyacentes: el hueso neoformado tiene por lo tanto un aspecto delgado y de resistencia mecánica reducida. Se propone por lo tanto como tratamiento adyuvante una dosis diaria de 10 \mug de G-CSF por vía subcutánea a lo largo del procedimiento de alargamiento.

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Ejemplo nº 6 En el marco de una cirugía de reparación de los tendones

En el caso de una rotura o de una sección traumática del tendón, el tratamiento habitual consiste en una cirugía inmediata con sutura de los dos extremos tendinosos, una inmovilización del tendón y después una removilización del tendón. El tratamiento adyuvante comprenderá una primera dosis de 10 \mug (1 MU) por kilogramo de peso corporal de G-CSF (Neupogen®, Filgrastime) que se inyectará por vía subcutánea al paciente desde su admisión en el hospital. La misma dosis se inyectará de manera diaria durante los cuatro días siguientes a la intervención.

Evidentemente, los ejemplos anteriores se proporcionan únicamente a título ilustrativo y no pretenden limitar el alcance de la invención.

Claims (12)

1. Utilización del G-CSF (factor de estimulación de las colonias de granulocitos) para la preparación de un medicamento útil como tratamiento adyuvante en un proceso de reconstrucción de tejidos conjuntivos in situ en un ser vivo.

2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque el G-CSF se utiliza como medicamento en el tratamiento de las fracturas óseas, osteocartilaginosas, de las pseudoartrosis, de los retrasos de consolidación de las fracturas óseas, de las lesiones cartilaginosas, o también de las roturas o secciones de tendones o ligamentos y de las lesiones de los músculos, y está destinado a la administración por vía general.

3. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque el G-CSF se utiliza como medicamento en el tratamiento de alargamiento de los miembros y está destinado a la administración por vía general.

4. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque el G-CSF se utiliza como medicamento en el tratamiento que asocia un gesto quirúrgico de reconstrucción ósea o cartilaginosa por transferencia de colgajo de periostio, y de manera general en la cirugía de regeneración tisular de los miembros y del aparato locomotor, y está destinado a la administración por vía general.

5. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el G-CSF se utiliza como medicamento destinado a la administración por vía general y se combina con por lo menos otro factor destinado a la administración local o por vía general.

6. Utilización según la reivindicación 5, caracterizada porque este otro factor se selecciona de entre por lo menos uno de los factores siguientes: BMP (Bone Morphogenetic Protein), SCF (stem cell factor), FGF (fibroblast growth factor), EGF (epidermal growth factor), IGF (insuline-like growth factor), Insulina, KGF (keratinocyte growth factor), TGF (transforming growth factor), Interferón, Interleucina, VEGF (vascular endothélial growth factor), TNF (tumor necrosing factor), GDNF (glial cell ligne-derived neurotrophic factor), NGF (neurotrophin nerve growth factor), GM-CSF (granulocytemacrophage colony stimulating factor), HGF (hepatocyte growth factor), Eritropoyetina, PDGF (platelet-derived growth factor), Sulfato de heparano, Prostaglandinas, Osteoglicina (osteoinductive factor), BCDF (B cell differentiation factor), GDF-5 (growth and differentiation factor-5), Hormona de crecimiento; M-CSF (macrophage colony stimulating factor); o cualquier otro factor de crecimiento conocido de origen humano o animal, de extracción o recombinante.

7. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el G-CSF es un recombinante humano.

8. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el G-CSF es el Filgrastim.

9. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el G-CSF es el Lenograstim.

10. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el medicamento se utiliza con una dosificación en G-CSF de 0,1 a 1.000 \mug (0,01 a 100 MU), preferentemente de 5 a 10 \mug, por kilogramo de peso corporal y por día.

11. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el medicamento se utiliza en medicina humana.

12. Utilización según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque el medicamento se utiliza en medicina veterinaria.