JP2023533236A - 腫瘍壊死因子－刺激された遺伝子６を発現する間葉系幹細胞を含む骨関節炎の予防または治療用組成物 - Google Patents
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Abstract
本出願は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞の軟骨再生用途および／または骨関節炎治療用途に関する。本出願は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞を有効成分として含む軟骨再生用組成物および骨関節炎治療用薬学組成物を提供する。本出願が提供する軟骨再生用組成物および／または骨関節炎治療用薬学的組成物は、軟骨細胞のコラーゲン発現を増加させ、炎症を低下させ、軟骨構造を復元することができる。
Description
関連出願との相互参照
本出願は、２０２０年７月１７日付の大韓民国特許出願第１０－２０２０－００８９１４８号に基づく優先権の利益を主張し、当該大韓民国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書に一部として含まれる。
本出願は、２０２０年７月１７日付の大韓民国特許出願第１０－２０２０－００８９１４８号に基づく優先権の利益を主張し、当該大韓民国特許出願の文献に開示されたすべての内容は本明細書に一部として含まれる。
本出願は、関節炎の治療のための組成物またはこれを用いた治療方法に関し、より詳しくは、腫瘍壊死因子－刺激された遺伝子６（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ６；ＴＳＧ－６）を発現する間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ；ＭＳＣ）を含む骨関節炎の治療用薬学組成物および／またはこれを用いた治療方法に関する。
骨関節炎（Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）は変性性関節炎（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）とも知られており、骨の端部分で骨を保護する役割を果たす軟骨がすり減ってなくなることで発生する関節疾患の一つである。関節炎の最も一般的な類型として、特に朝には関節痛、むくみ、こわばりのような症状を示す。軟骨（Ｃａｒｔｉｌａｇｅ）は、全身の２つの骨を互いに連結する関節部位の表面に位置した線維性結合組織であり、軟骨細胞と軟骨芽細胞とから構成される。軟骨の核心的な構成成分はコラーゲンで、特にコラーゲンＩＩ（２型コラーゲン、Ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ）から構成される。
現在、骨関節炎に対する治療は痛みを緩和しながら関節を柔軟に維持することに焦点を当てており、薬物と運動、物理治療などが一般に使用され、関節がひどく損傷した場合は、制限的に人工関節置換術のような手術が施されたりもする。
ＴＳＧ－６はＬＩＮＫとＣＵＢＥの２個のドメインからなるタンパク質で、ＴＮＦのような炎症刺激によって誘導されて、線維芽細胞、結合組織細胞のような細胞で主に生産されることが知られている。
ＴＳＧ－６は消炎作用を有することが知られているが、関節腔内に注射する場合、短時間内に関節腔外に分散することが知られている。２０１６年の報告によれば、関節腔内に注射されたＴＳＧ－６の半減期は０．５時間に満たず（Ｋｉｍ Ｄ－Ｋ，ｅｔ ａｌ．，２０１６，ＰＬｏＳ ＯＮＥ１１（１））、ＴＳＧ－６の消炎作用にかかわらず、直接注射時に持続的な治療効果を期待しにくいという限界がある。
本出願の一例は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞を有効成分として含む、軟骨再生用薬学的組成物を提供する。
他の例は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞の薬学的有効量の軟骨再生を必要とする対象に投与する段階を含む、軟骨再生方法を提供する。
他の例は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間系葉幹細胞の軟骨再生に用いるための用途または軟骨再生用薬学的組成物の製造に用いるための用途を提供する。
このようなＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞の軟骨再生効果は、コラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加によるものであってもよい。一例において、前記軟骨再生用薬学的組成物、方法、および／または用途の適用（投与）対象は、コラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌が低い（例えば、正常人に比べて低い）患者および／またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加を必要とする患者であってもよい。また、前記軟骨再生方法は、投与する段階の前に、軟骨再生を必要としたり、および／またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加を必要とする（例えば、コラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌が正常人より低い）対象を確認する段階を追加的に含むことができる。
本出願の他の例は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞を有効成分として含む、骨関節炎の予防および／または治療用薬学的組成物を提供する。
他の例は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞の薬学的有効量を骨関節炎の予防および／または治療を必要とする対象に投与する段階を含む骨関節炎の予防および／または治療方法を提供する。
他の例は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞の骨関節炎の予防および／または治療に用いるための用途または骨関節炎の予防および／または治療用薬学的組成物の製造に用いるための用途を提供する。
このようなＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞の骨関節炎の予防および／または治療効果は、軟骨再生および／またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加によるものであってもよい。一例において、前記骨関節炎の予防および／または治療用薬学的組成物、方法、および／または用途の適用（投与）対象は、コラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌が低い（例えば、正常人に比べて低い）患者および／またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加を必要とする患者および／または軟骨再生を必要とする患者であってもよい。また、前記骨関節炎の予防および／または治療方法は、投与する段階の前に、骨関節炎の予防および／または治療を必要としたり、および／または軟骨再生を必要としたり、および／またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加を必要とする（例えば、コラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌が正常人より低い）対象を確認する段階を追加的に含むことができる。
本出願の他の例は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞を有効成分として含む、コラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌用またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加用組成物を提供する。
他の例は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞の薬学的有効量をコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加を必要とする対象に投与する段階を含むコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌方法またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加方法を提供する。
他の例は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞のコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加に用いるための用途またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加用組成物の製造に用いるための用途を提供する。
本出願は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞を有効成分として含む、軟骨再生用組成物および／または骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物および／またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加用組成物、および／またはこれらを用いた方法を提供する。
本明細書において、「ＴＳＧ－６タンパク質」は、腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦ）－刺激された遺伝子６（ＴＮＦ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅ ６）タンパク質を意味する。
本明細書で使用された「間葉系幹細胞」（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＭＳＣ）は、多様な細胞、例えば、脂肪細胞、軟骨細胞または軟骨芽細胞、骨細胞または骨芽細胞、筋肉細胞などに分化できる全能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）または多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）細胞を意味することができる。前記間葉系幹細胞は、前記全能性または多能性を維持する範囲でその由来が限定されない。例えば、前記間葉系幹細胞は、血液、真皮、臍帯血、へその緒、脂肪組織、胎盤、成体筋肉、角膜基質（ｃｏｒｎｅａｌ ｓｔｒｏｍａ）、乳歯の歯髄（ｄｅｎｔａｌ ｐｕｌｐ）および／または骨膜などのような非骨髄組織（ｎｏｎ－ｍａｒｒｏｗ ｔｉｓｓｕｅｓ）、または骨髄組織、好ましくは、非骨髄組織に由来する多能性細胞の中から選択されたものであってもよいが、これに制限されるわけではない。本明細書において、間葉系幹細胞は「ＭＳＣ」と混用される。
前記間葉系幹細胞は、哺乳動物に由来する間葉系幹細胞であってもよいし、前記哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、マウス、ラットなどを含むことができるが、これに制限されるわけではない。前記間葉系幹細胞は、骨関節炎患者由来または骨関節炎患者ではない供与者から分離されるものであってもよい。
本出願が提供する軟骨再生用組成物および／または骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物および／またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加用組成物、および／またはこれらを用いた方法は、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞を有効成分として含むか、または使用（投与）する。
前記ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞は、ＴＳＧ－６タンパク質をコードする遺伝子、前記ＴＳＧ－６タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクター、またはこれらのすべてを含む間葉系幹細胞であってもよい。本出願で提供されるＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞は、外来のＴＳＧ－６タンパク質をコードする遺伝子および／またはこれを含む組換えベクター（発現ベクター）を含むことによって、ＴＳＧ－６タンパク質を発現することを特徴とし、ＴＮＦ－ａなどのような刺激因子によってＴＳＧ－６タンパク質の遺伝子レベルおよび／またはタンパク質レベルでの発現が増加した細胞と区別されるものであってもよい。
一例において、前記ＴＳＧ－６タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターは、ＴＳＧ－６タンパク質を常時発現できるように常時発現プロモーターとＴＳＧ－６タンパク質をコードする遺伝子が作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されない。
前記ＴＳＧ－６タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号２の核酸配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質であってもよい。
前記ＴＳＧ－６タンパク質を発現する（ＴＳＧ－６遺伝子の発現ベクターが導入された）間葉系幹細胞におけるＴＳＧ－６遺伝子（例、ｍＲＮＡ）および／またはタンパク質の発現レベルは、ＴＳＧ－６タンパク質遺伝子の発現ベクターが導入されない同種間葉系幹細胞（例、同種の非変形間葉系幹細胞、ＴＮＦ－ａ刺激された間葉系幹細胞など）に比べて、約２倍以上、約５倍以上、約１０倍以上、約２０倍以上、約５０倍以上、約７０倍以上、約１００倍以上、約２００倍以上、または約３００倍以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。
前記ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞におけるＴＳＧ－６タンパク質の発現量は、約１０～約２００ｎｇ／１０万個の細胞／２４時間（以下、単位同一）、約１０～約１００、約１０～約８０、約１０～約７０、約１０～約６５、約３０～約２００、約３０～約１００、約３０～約８０、約３０～約７０、約３０～約６５、約５０～約２００、約５０～約１００、約５０～約８０、約５０～約７０、または約５０～約６５ｎｇ／１０万個の細胞／２４時間であってもよいが、これに限定されない。本明細書において、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、後の数値と同等または類似の範囲の数値をすべて含むための表現で、記載された数値を基準として約１０％、約８％、約５％、約３％、約２％、約１％、約０．５％、または約０．１％増減した範囲を包括する意味であってもよいが、これに限定されない（以下、同一の意味で解釈される）。
本出願が提供する軟骨再生用組成物および／または骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物におけるＴＳＧ－６の発現量は、約１０～約５０，０００ｎｇ／ｍＬ／２４時間（以下、単位同一）、約１０～約３０，０００；約１０～約１０，０００；約１０～約５，０００、約５０～約５０，０００、約５０～約３０，０００、約５０～約１０，０００、約５０～約５，０００、約１００～約５０，０００、約１００～約３０，０００、約１００～約１０，０００、約１００～約５，０００、約１００～約５，０００、約５００～約５０，０００、約５００～約３０，０００、約５００～約１０，０００、約５００～約５，０００、約１，０００～約５０，０００、約１，０００～約３０，０００、約１，０００～約１０，０００、または約１，０００～約５，０００ｎｇ／ｍＬ／２４時間であってもよいが、これに限定されない。
本出願が提供するＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞は、ＴＳＧ－６タンパク質を持続的に発現するものであってもよいし、これによってＴＳＧ－６の関節腔内の短い半減期を克服可能で、軟骨の回復（再生）および／または骨関節炎の予防または治療に適合する。また、本出願で提供されるＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞は、ＴＮＦ－ａ、ＩＬ－１ｂなどのような炎症性指標を抑制することによって、骨関節炎における炎症および／または痛み緩和効果を有することに加えて、コラーゲンＩＩタンパク質の発現量および／または分泌量を増加させ、軟骨を再生および／または損傷した軟骨を再建（回復）することによって、骨関節炎、特に退行性骨関節炎のより根本的な治療を可能にする。
本出願が提供する軟骨再生用組成物および／または方法、および／または骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物および／または方法、および／またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加用組成物および／または方法（以下、「本出願で提供される組成物および／または方法」と通称する）は、軟骨細胞および／または軟骨組織におけるコラーゲンＩＩタンパク質の遺伝子（ｍＲＮＡ）レベルおよび／またはタンパク質レベルでの発現量および／または細胞外への分泌量を増加させることができる。一例において、本出願が提供する組成物を投与した軟骨細胞および／または軟骨組織内のコラーゲンＩＩタンパク質の発現量および／または分泌量は、未投与対照群および／またはＴＮＦ－ａ未処理またはＴＮＦ－ａ処理（活性化）された同種間葉幹系細胞処理群に比べて増加できる（例えば、未投与対照群および／またはＴＮＦ－ａ未処理またはＴＮＦ－ａ処理された同種細胞処理群のコラーゲンＩＩタンパク質の発現量（例えば、ｍＲＮＡレベルおよび／またはタンパク質レベル）および／または分泌量（例えば、培地内のコラーゲンＩＩタンパク質の濃度）に比べて、約１．２倍以上、約１．３倍以上、約１．４倍以上、約１．５倍以上、約１．６倍以上、約１．７倍以上、約１．８倍以上、または約１．９倍以上増加；増加程度の上限値は特に限定はなく、例えば、約２０倍、約１５倍、約１０倍、約５倍、または約２倍であってもよいが、これに限定されない）。
本出願で提供される組成物および／または方法は、軟骨の厚さを維持および／または回復できる。一例において、本出願が提供する薬学的組成物を投与した軟骨の厚さは、未投与対照群に比べて、約１倍超約１０倍以下、約１倍超約５倍以下、約１倍超約３倍以下、約１倍超約２倍以下、約１．３～約１０倍、約１．３～約５倍、約１．３～約３倍、約１．３～約２倍、約１．５～約１０倍、約１．５～約５倍、約１．５～約３倍または約１．５～約２倍増加できるが、これに限定されない。一実施形態において、本出願の薬学的組成物を投与したＯＡ動物モデルの軟骨の厚さは、未投与ＯＡ患者に比べて軟骨の厚さの回復が観察され、同量のＴＳＧ－６未発現ＭＳＣ投与群に比べて約１．５倍以上高い軟骨の厚さを示した。
本出願で提供される組成物および／または方法は、軟骨細胞および／または滑膜細胞の細胞内、および／または軟骨組織および／または滑膜組織内の炎症性指標の発現量を減少させることができる。前記炎症性指標の発現量の減少は、本出願で提供される組成物および／または方法を投与または適用しない未投与対照群に比べて減少したものであってもよい。前記炎症性指標（例、炎症性サイトカイン）は、例えば、転換成長因子－ベータ１（ＴＧＦ－ｂ１；ＴＧＦ－β１）、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－ａ；ＴＮＦ－α）、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－ｒ；ＩＦＮ－γ）、およびインターロイキン－６（ＩＬ－６）からなる群より選択される１以上、２以上、３以上、またはこれらのすべてであってもよいが、これに限定されない。一実施例において、ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞を投与した場合、滑膜細胞と軟骨細胞における前記炎症性指標の発現量が正常群レベルに減少した。
一例において、本出願で提供される組成物および／または方法が投与または適用された軟骨部位（軟骨細胞および／または軟骨組織、以下、同一）におけるＴＧＦ－ｂ１の発現量は、患者群におけるＴＧＦ－ｂ１の発現量に比べて、約５５％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、または約３０％以下のレベルであってもよいが、これに限定されない。前記ＴＧＦ－ｂ１の発現量は、ＴＳＧ－６の発現量が増加するにつれて減少するものであってもよい。
一例において、本出願で提供される組成物および／または方法が投与または適用された軟骨部位におけるＴＮＦ－ａの発現量は、患者群におけるＴＮＦ－ａの発現量に比べて、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、または３５％以下のレベルであってもよいが、これに限定されない。前記ＴＮＦ－ａの発現量は、ＴＳＧ－６の発現量が増加するにつれて減少するものであってもよい。
一例において、本出願で提供される組成物および／または方法が投与または適用された軟骨部位におけるＩＦＮ－ｒの発現量は、患者群におけるＩＦＮ－ｒの発現量に比べて、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、または約３５％以下のレベルであってもよいが、これに限定されない。前記ＩＦＮ－ｒの発現量は、ＴＳＧ－６の発現量が増加するにつれて減少するものであってもよい。
一例において、本出願で提供される組成物および／または方法が投与または適用された軟骨部位におけるＩＬ－６の発現量は、患者群におけるＩＬ－６の発現量に比べて、約６０％以下、約５５％以下、または約５０％以下のレベルであってもよいが、これに限定されない。前記ＩＬ－６の発現量は、ＴＳＧ－６の発現量が増加するにつれて減少するものであってもよい。
一例において、本出願で提供される組成物および／または方法が投与または適用された滑膜部位（滑膜細胞および／または滑膜組織、以下、同一）におけるＴＧＦ－ｂ１の発現量は、患者群におけるＴＧＦ－ｂ１の発現量に比べて、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、または約３０％以下のレベルであってもよいが、これに限定されない。
一例において、本出願で提供される組成物および／または方法が投与または適用された滑膜部位におけるＴＮＦ－ａの発現量は、患者群におけるＴＮＦ－ａの発現量に比べて、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、または約２５％以下のレベルであってもよいが、これに限定されない。
一例において、本出願で提供される組成物および／または方法が投与または適用された滑膜部位におけるＩＦＮ－ｒの発現量は、患者群におけるＩＦＮ－ｒの発現量に比べて、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、または約３５％以下のレベルであってもよいが、これに限定されない。
一例において、本出願で提供される組成物および／または方法が投与または適用された滑膜部位におけるＩＬ－６の発現量は、患者群におけるＩＬ－６の発現量に比べて、約４５％以下、約４０％以下、または約３５％以下のレベルであってもよいが、これに限定されない。
本出願で提供される組成物および／または方法は、薬学的に有効な量のＴＳＧ－６を発現する間葉系幹細胞を単独で含むか、または投与したりすることができ、１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を追加的に含むか、または投与することができる。前記薬学的に有効な量は、軟骨再生、骨関節炎の症状を予防、改善および／または治療、および／またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現および／または分泌増加効果を示すことができる量を意味し、間葉系幹細胞のＴＳＧ－６の総発現量が約２００ｎｇ／２４時間以上、約５００ｎｇ／２４時間以上、約１，０００ｎｇ／２４時間以上、約１０，０００ｎｇ／２４時間以上、約５０，０００ｎｇ／２４時間以上、約２００～約１００，０００ｎｇ／２４時間、約２００～約５０，００００ｎｇ／２４時間、約２００～約１０，０００ｎｇ／２４時間、約２００～約５，０００ｎｇ／２４時間、約２００～約３０００ｎｇ／２４時間、約２００～約２０００ｎｇ／２４時間、約５００～約１００，０００ｎｇ／２４時間、約５００～約５０，００００ｎｇ／２４時間、約５００～１０，０００ｎｇ／２４時間、約５００～約５，０００ｎｇ／２４時間、約５００～約３，０００ｎｇ／２４時間、または約５００～約２，０００ｎｇ／２４時間であってもよいが、これに限定されない。
一例において、前記薬学的に有効な量の間葉系幹細胞は、約１０万～約２５００万個の細胞／ｍｌ（ｃｅｌｌ／ｍＬ、以下、単位同一）、約１０万～約２０００万、約１０万～約１５００万、約１０万～約１０００万、約１０万～約５００万、約５０万～約２５００万、約５０万～約２０００万、約５０万～約１５００万、約５０万～約１０００万、約５０万～約５００万、約１００万～約２５００万、約１００万～約２０００万、約１００万～約１５００万、約１００万～約１０００万、または約１００万～約５００万個の細胞／ｍｌであってもよいが、これに限定されない。
前記「薬学的に許容される」とは、生理学的に許容され、ヒトに投与される時、通常、胃腸障害、めまいのようなアレルギー反応またはこれと類似の反応を起こさない組成物を制限なく含む。前記担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油からなる群より選択される１つ以上であってもよいが、これに限定されない。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤および防腐剤などを追加的に含むことができる。
本出願が提供する骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物は、活性成分の迅速、持続、または遅延放出を提供できるように、当業界にて公知の方法を用いて剤形化することができる。前記剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアゾール、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、または滅菌粉末の形態であってもよい。一実施形態において、前記組成物は、注射溶液として剤形化される。
一実施形態において、本出願が提供する骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物は、骨関節炎の治療目的で経口、経皮、皮下、静脈、または筋肉を含む様々な経路を通して投与可能であり、例えば、関節腔内投与されるものであってもよい。
本発明の組成物および／または方法の適用（投与）対象は、ヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類、またはこれから分離された細胞、組織、またはこれらの培養物であってもよい。一具体例において、前記対象は、軟骨再生、および／または骨関節炎の予防および／または治療、および／またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現増加を必要とするヒト、サルなどを含む霊長類、マウス、ラットなどを含む齧歯類などを含む哺乳類、またはこれから分離された細胞、組織、またはこれらの培養物であってもよい。
本出願はまた、間葉系幹細胞にＴＳＧ－６遺伝子および／または前記ＴＳＧ－６遺伝子を含むベクターを形質導入する段階を含む、軟骨再生用組成物および／または骨関節炎の予防および／または治療用組成物および／またはコラーゲンＩＩタンパク質の発現増加用組成物の製造方法を提供することができる。
前記形質導入は、間葉系幹細胞の形質導入の目的範囲で当業界にて知られた形質導入方法を自由に選択して行われる。
前記ＴＳＧ－６遺伝子および／またはこれを含むベクターは、上述した通りである。
本出願で提供される軟骨再生用組成物および／または骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物および／または方法は、軟骨再生能および／または抗炎効果に優れている。
本出願で提供される組成物および／または方法は、ＴＳＧ－６タンパク質の短い関節腔内の半減期による持続性の問題を克服することができる。
また、本出願で提供される組成物および／または方法は、コラーゲンＩＩタンパク質の発現量増加効果に優れており、軟骨再生およびこれによる骨関節炎の予防および／または治療により根本的で有利な効果を有する。
以下、本出願を実施例により具体的に説明する。しかし、下記の実施例は本出願を例示するためのものに過ぎず、下記の実施例によって本出願の権利範囲が制限されない。
本明細書において、特別な言及がない限り、「ＡＣ」はａｒｔｉｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｎｉｎｇ ｃａｒｔｉｌａｇｅの略字であり、「ＯＡ」は骨関節炎（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ）の略字である。
実施例１．ＴＳＧ－６遺伝子が導入された間葉系幹細胞の作製
１－１．レンチウイルスの製造
ＴＳＧ－６ ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００７１１５；配列番号３）に対してコドン最適化（ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を行った後、ＳＩＲＩＯＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ社に依頼して、前記コドン最適化を終えたｃＤＮＡ配列（配列番号４）を含むレンチウイルスベクターを製造した。
１－１．レンチウイルスの製造
ＴＳＧ－６ ｃＤＮＡ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＭ＿００７１１５；配列番号３）に対してコドン最適化（ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を行った後、ＳＩＲＩＯＮ－Ｂｉｏｔｅｃｈ社に依頼して、前記コドン最適化を終えたｃＤＮＡ配列（配列番号４）を含むレンチウイルスベクターを製造した。
１－２．間葉系幹細胞にＴＳＧ－６遺伝子導入
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は臍帯血由来の間葉系幹細胞を５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、摂氏３７度の条件でＭＳＣ培養用培地で培養した。培養されたＭＳＣ５０，０００ｃｅｌｌｓまたは１００，０００ｃｅｌｌｓに前記ＴＳＧ－６ ｃＤＮＡが導入されたレンチウイルスを添加して、再度、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、摂氏３７度の条件で２４時間培養した。ＴＳＧ－６遺伝子のｃＤＮＡ配列が導入されたＭＳＣ（ＴＳＧ－６ ＭＳＣ）はＥＬＩＳＡで選別した。
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は臍帯血由来の間葉系幹細胞を５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、摂氏３７度の条件でＭＳＣ培養用培地で培養した。培養されたＭＳＣ５０，０００ｃｅｌｌｓまたは１００，０００ｃｅｌｌｓに前記ＴＳＧ－６ ｃＤＮＡが導入されたレンチウイルスを添加して、再度、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、摂氏３７度の条件で２４時間培養した。ＴＳＧ－６遺伝子のｃＤＮＡ配列が導入されたＭＳＣ（ＴＳＧ－６ ＭＳＣ）はＥＬＩＳＡで選別した。
実施例２．ＴＳＧ－６ ＭＳＣにおけるＴＳＧ－６タンパク質の分泌量確認
前記実施例１で製造されたＴＳＧ－６ ＭＳＣにおけるＴＳＧ－６タンパク質の分泌量確認のために、ＥＬＩＳＡを行ってＴＳＧ－６タンパク質の分泌量を確認した。具体的には、対照群としてはＴＳＧ－６ ｃＤＮＡを含むレンチウイルスを感染させなかったＭＳＣを用い、各ＭＳＣはＳｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ培地および５％ＣＯ２、３７℃の培養条件で２４時間培養して２４時間発現したＴＳＧ－６タンパク質の総量を測定した。
前記実施例１で製造されたＴＳＧ－６ ＭＳＣにおけるＴＳＧ－６タンパク質の分泌量確認のために、ＥＬＩＳＡを行ってＴＳＧ－６タンパク質の分泌量を確認した。具体的には、対照群としてはＴＳＧ－６ ｃＤＮＡを含むレンチウイルスを感染させなかったＭＳＣを用い、各ＭＳＣはＳｅｒｕｍ－ｆｒｅｅ培地および５％ＣＯ２、３７℃の培養条件で２４時間培養して２４時間発現したＴＳＧ－６タンパク質の総量を測定した。
図１にＴＳＧ－６ ＭＳＧおよび対照群におけるＴＳＧ－６の発現量測定結果のグラフを示した。測定結果、ＴＳＧ－６導入された間葉系幹細胞は、ＴＳＧ－６タンパク質を約１０～１００ｎｇ／１０万個の細胞／２４時間分泌することが確認された。
実施例３．軟骨－滑膜細胞（Ｃａｒｔｉｌａｇｅ－ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）共培養モデルにおけるＴＳＧ－６ ＭＳＣの関節炎の治療効果の確認
ｉｎ ｖｉｔｒｏレベルでＴＳＧ－６ ＭＳＣの関節炎に対する治療効果を確認するために、軟骨－滑膜細胞の共培養条件で前記実施例１で製造されたＴＳＧ－６ ＭＳＣの追加有無によるコラーゲンＩＩ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＩ）の発現量を確認した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏレベルでＴＳＧ－６ ＭＳＣの関節炎に対する治療効果を確認するために、軟骨－滑膜細胞の共培養条件で前記実施例１で製造されたＴＳＧ－６ ＭＳＣの追加有無によるコラーゲンＩＩ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＩ）の発現量を確認した。
図２Ａに実験デザインの概略図を示した。具体的には、軟骨細胞を単独でＵ－ｂｏｔｔｏｍ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに接種して、軟骨分化培地で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２、３７℃で３週（２１日）間培養して軟骨集合体（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成し、この軟骨集合体を滑膜細胞と５％ＣＯ２、３７℃で２日間共培養し、この時には、ＴＮＦ－ａｌｐｈａ（ＴＮＦ－ａ）１０ｎｇ／ｍｌとインターロイキン１－ベータ（ＩＬ１ｂ）１０ｎｇ／ｍＬを添加して炎症を誘発した。
共培養（炎症誘発）２日後に精製されたＴＳＧ－６タンパク質を２００ｎｇ／ｍＬ添加して１日間培養後、滑膜細胞を除去して精製されたＴＳＧ－６タンパク質を先に添加した濃度と同一に２００ｎｇ／ｍＬ添加して、再度、７日間培養した。ＴＳＧ－６ ＭＳＣの関節炎に対する治療効果を確認するための実験群は、共培養（炎症誘発）３日後に滑膜細胞を除去し、１０ｎｇ／ｍＬ／２４時間レベルのＴＳＧ－６タンパク質を発現するように、または３０ｎｇ／ｍＬ／２４時間レベルのＴＳＧ－６タンパク質を発現するように、ＴＳＧ－６ ＭＳＣの量を異なるものとして、再度、７日間共培養した。
正常群としては炎症非誘導グループ（Ｎｏ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＮＩＣ）、陰性対照群としては炎症誘導後にＴＳＧ－６未添加グループ（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ、ＩＣ）を使用した。以後、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔを用いて各グループ別のＣｏｌｌａｇｅｎ ＩＩタンパク質の発現量を測定し、対照群としてはＧＡＰＤＨタンパク質の発現量を確認した。
下記表１に各グループをまとめて示した。
図２Ｂに各グループ別のＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ結果を定量した値（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＩタンパク質の発現量／ＧＡＰＤＨの発現量）を示した。
図２Ｂに示されているように、炎症が誘導された軟骨細胞（２番カラム）ではコラーゲンＩＩタンパク質がほとんど生成されなかったが、ＴＳＧ－６タンパク質が精製されたタンパク質またはＴＳＧ－６ ＭＳＣで発現する形態で添加された場合、いずれもコラーゲンＩＩタンパク質の発現量が増加した。また、ＴＳＧ－６タンパク質が精製されたタンパク質形態で添加された場合とＴＳＧ－６発現ベクターが導入されたＭＳＣ形態で添加された場合、いずれもＴＳＧ－６タンパク質の濃度依存的にコラーゲンＩＩタンパク質の発現量が増加したが、特にＴＳＧ－６タンパク質がＴＳＧ－６発現ベクターの導入されたＭＳＣ形態（つまり、ＴＳＧ－６タンパク質がＭＳＣで発現する形態）で添加された場合、精製されたＴＳＧ－６タンパク質が添加された場合よりコラーゲンＩＩタンパク質の発現量が高く、３０ｎｇ／ｍＬ／２４時間レベルのＴＳＧ－６タンパク質を発現するＴＳＧ－６ ＭＳＣと共培養した場合には、ＮＩＣ群と類似レベルのコラーゲンＩＩタンパク質の発現量を示した。
つまり、ＴＳＧ－６タンパク質の濃度依存的にコラーゲンＩＩタンパク質の発現量が増加し、本出願が提供するＴＳＧ－６タンパク質を発現するＴＳＧ－６ ＭＳＣは、精製ＴＳＧ－６と類似しているか、より優れた水準のコラーゲンＩＩタンパク質の回復効果があることを確認した。
当該結果により、本出願が提供するＴＳＧ－６ ＭＳＣが軟骨再生および／または回復効果を有することを確認することができ、これにより関節炎の治療に有利に活用できることが分かる。
実施例４．退行性骨関節炎ウサギモデルにおけるＴＳＧ－６ ＭＳＣの治療効果の確認
ｉｎ ｖｉｖｏレベルでＴＳＧ－６ ＭＳＣの治療効果を確認するために、退行性骨関節炎ウサギモデルで実験を行った。
ｉｎ ｖｉｖｏレベルでＴＳＧ－６ ＭＳＣの治療効果を確認するために、退行性骨関節炎ウサギモデルで実験を行った。
具体的には、退行性骨関節炎ウサギモデルとしてＳＰＦ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｗｈｉｔｅ系ウサギ（Ｋａｎｇｄａ）雌（約１０ヶ月齢）を用いており、ＴＳＧ－６ ＭＳＣなどの投与時、体重は３．９ｋｇ水準であった。前記ウサギモデルは計６グループに分類された。下記表２に各グループに関する簡単な説明を表した。
前記表２に表された６グループのうち、Ｃ～Ｆグループにそれぞれ当該ＭＳＣを注射を用いて注入した。注入後１６週経過した後に、各ウサギから膝関節を回収して軟骨組織をヘマトキシリン－エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、ＩＨＣ染色またはサフラニンＯ染色して顕微鏡観察および各免疫活性、上皮の厚さ測定、または炎症細胞数の分析を行った。
４－１．軟骨構造指標の確認（サフラニンＯ染色）
図３ＡにサフラニンＯ染色結果の写真を、図３Ｂに各グループ別の関節面の表面軟骨（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｎｉｎｇ ｃａｒｔｉｌａｇｅ；ＡＣ）の厚さをそれぞれ大腿骨（Ｆｅｍｕｒ）と脛骨（Ｔｉｂｉａ）側で測定した結果のグラフおよび統計的有意度を示した。
図３ＡにサフラニンＯ染色結果の写真を、図３Ｂに各グループ別の関節面の表面軟骨（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｎｉｎｇ ｃａｒｔｉｌａｇｅ；ＡＣ）の厚さをそれぞれ大腿骨（Ｆｅｍｕｒ）と脛骨（Ｔｉｂｉａ）側で測定した結果のグラフおよび統計的有意度を示した。
下記表３に測定されたＡＣの厚さの平均値をそれぞれ示した。Ｆｅｍｕｒは大腿骨側で測定したＡＣの厚さを、Ｔｉｂｉａは脛骨側で測定したＡＣの厚さを意味する。
関節炎（ＯＡ）群では、すべての正常群に比べて軟骨の厚さが顕著に減少し、ＴＳＧ－６ ＩおよびＴＳＧ－６ ＩＩグループではそれぞれ軟骨の厚さが統計的に有意に回復し、特にＴＳＧ－６タンパク質の濃度が増加するほど軟骨の厚さの増加幅がより大きくなる傾向を示した。このような濃度依存性は大腿骨側軟骨でさらに著しくなった。ＴＳＧ－６ ＩＩグループでは、特に正常群と有意な差がない程度に（ｎ．ｓ．：ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）軟骨構造の改善が確認された。一方、Ｎａｉｖｅ群よりは、Ｎａｉｖｅ ＩおよびＮａｉｖｅ ＩＩ群の間に有意な差が観察されなかった。
４－２．軟骨のＩＨＣ染色による炎症指標の確認
前記表２の各グループの軟骨組織においてＴＧＦ－ｂ１、ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－ｒ、およびＩＬ－６に対してそれぞれ免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ、ＩＨＣ染色）を行って、各炎症指標の発現量をそれぞれ確認した。
前記表２の各グループの軟骨組織においてＴＧＦ－ｂ１、ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－ｒ、およびＩＬ－６に対してそれぞれ免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ、ＩＨＣ染色）を行って、各炎症指標の発現量をそれぞれ確認した。
図４Ａ～４ＢはＴＧＦ－ｂ１、図５Ａ～５ＢはＴＮＦ－ａ、図６Ａ～６ＢはＩＦＮ－ｒ、図７Ａ～７ＢはＩＬ－６に対するＩＨＣ染色結果と、大腿骨（Ｆｅｍｕｒ）と脛骨（Ｔｉｂｉａ）側で測定した各指標の免疫活性（ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）結果を、下記表４に各免疫活性の測定数値を示した。下記表４にて、各炎症指標の発現量の数値単位（％／ｍｍ２）は省略された。
ＯＡ群ではＴＧＦ－ｂ１、ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－ｒ、およびＩＬ－６の免疫活性が非常に高くなったが、ＴＳＧ－６ ＭＳＣ処理群ではいずれもＯＡ群に比べて低い免疫活性を示した。特にＴＧＦ－ｂ１、ＩＦＮ－ｒ、およびＩＬ－６は正常群と類似レベルに（ｎ．ｓ．）免疫活性が減少して、本出願が提供するＴＳＧ－６ ＭＳＣが優れた抗炎効果を示すことを確認した。
また、投与用量に関係なく、類似の炎症指標数値を示したＮａｉｖｅ群に比べて、本出願のＴＳＧ－６ ＭＳＣ処理群は、処理用量が増加するほど炎症指標の免疫活性数値がいずれも減少して、抗炎活性に優れていることが確認された。
４－３．滑膜のＨ＆Ｅ染色による炎症指標の確認
前記表２の各グループの滑膜を分離してＨ＆Ｅ染色を行い、その結果を図８Ａ～８Ｂに示した。図８Ａは滑膜上皮の厚さ（Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を、図８Ｂは単位面積あたりの炎症細胞の数を示すグラフとその統計的有意性を示す表である。下記表５にて、滑膜で測定された上皮の厚さと炎症細胞（ＩＦ ｃｅｌｌ）の数をそれぞれ示した。
前記表２の各グループの滑膜を分離してＨ＆Ｅ染色を行い、その結果を図８Ａ～８Ｂに示した。図８Ａは滑膜上皮の厚さ（Ｓｙｎｏｖｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を、図８Ｂは単位面積あたりの炎症細胞の数を示すグラフとその統計的有意性を示す表である。下記表５にて、滑膜で測定された上皮の厚さと炎症細胞（ＩＦ ｃｅｌｌ）の数をそれぞれ示した。
図８Ｂから確認できるように、滑膜上皮の厚さはＴＳＧ－６ ＩＩ群でＩｎｔａｃｔ群と類似レベルに減少し、炎症細胞の数もＩｎｔａｃｔ群と類似レベルに減少した。
４－４．滑膜のＩＨＣ染色による炎症指標の確認
前記表２の各グループの滑膜組織においてＴＧＦ－ｂ１、ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－ｒ、およびＩＬ－６に対してそれぞれ免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ、ＩＨＣ染色）を行って、各炎症指標の発現量をそれぞれ確認した。
前記表２の各グループの滑膜組織においてＴＧＦ－ｂ１、ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－ｒ、およびＩＬ－６に対してそれぞれ免疫組織化学染色（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｓｔａｉｎｉｎｇ、ＩＨＣ染色）を行って、各炎症指標の発現量をそれぞれ確認した。
図９Ａには各グループ別のＴＧＦ－ｂ１とＴＮＦ－ａに対するＩＨＣ染色結果を、図９Ｂには各グループ別のＴＧＦ－ｂ１とＴＮＦ－ａの免疫活性測定結果と統計的有意度を示し、図１０Ａには各グループ別のＩＦＮ－ｒおよびＩＬ－６に対するＩＨＣ染色結果を、図１０Ｂには各グループ別のＩＦＮ－ｒおよびＩＬ－６の免疫活性測定結果のグラフと統計的有意度を示した。下記表６に各グループ別の炎症指標の発現量の測定結果を示した。
滑膜細胞に対するＩＨＣ染色結果、ＯＡ群では各炎症性指標がＩｎｔａｃｔ群に比べて大きく増加したが、ＴＳＧ－６ ＭＳＣ投与群（ＴＳＧ－６ Ｉ、およびＴＳＧ－６ ＩＩ）ではいずれも炎症性指標が減少した。特にＴＳＧ－６ ＩＩ群ではＴＧＦ－ｂ１、ＩＦＮ－ｒ、およびＩＬ－６が正常群と類似レベルに免疫活性が減少して、本出願が提供するＴＳＧ－６ ＭＳＣの抗炎活性に優れていることを確認した。
実施例５．ＴＳＧ－６遺伝子の発現ベクターが導入されたＭＳＣとＴＮＦ－ａ処理されたＭＳＣとの比較
５－１．ＴＮＦ－ａ処理されたＭＳＣの用意
臍帯血由来のＭＳＣをＴＮＦ－αで活性化した。簡略に説明すれば、臍帯血由来のＭＳＣを、各ウェルあたり１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ＭＡ、ＵＳ）培地２ｍｌを含む６－ｗｅｌｌプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓの量でプレーティングし、２４時間培養した。その後、培地を１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ－α（Ｐｅｐｔｒｏｔｅｃｈ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ培地に切り替え、２４時間培養した。前記細胞を１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）と共に０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンを３７℃で２分間処理してトリプシン化（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）させた。回収された細胞を下記の実施例に使用した。
５－１．ＴＮＦ－ａ処理されたＭＳＣの用意
臍帯血由来のＭＳＣをＴＮＦ－αで活性化した。簡略に説明すれば、臍帯血由来のＭＳＣを、各ウェルあたり１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、ＭＡ、ＵＳ）培地２ｍｌを含む６－ｗｅｌｌプレートに１×１０５ｃｅｌｌｓの量でプレーティングし、２４時間培養した。その後、培地を１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ－α（Ｐｅｐｔｒｏｔｅｃｈ、ＮＹ、ＵＳＡ）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ培地に切り替え、２４時間培養した。前記細胞を１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）と共に０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンを３７℃で２分間処理してトリプシン化（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）させた。回収された細胞を下記の実施例に使用した。
５－２．ＴＳＧ－６ ｍＲＮＡレベルの比較（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ：ＲＴ－ｑＰＣＲ）
非変形臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＭＳＣ」；対照群）、実施例１．２で用意されたＴＳＧ－６発現ベクターが導入された臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＴＳＧ－６ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ＭＳＣ」；試験群）、および実施例５－１で用意されたＴＮＦ－αで活性化された臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＴＮＦ－α ｔｒｅａｔｅｄ ＭＳＣ」；比較群）の２４時間のＴＳＧ－６発現レベル（ｍＲＮＡレベル）をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造会社の使用説明に従って、前記細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いてｃＤＮＡを合成した後、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）上でＲＴ－ｑＰＣＲを行った。内在の対照遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用した。使用されたプライマ－を下記表７にまとめた。
非変形臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＭＳＣ」；対照群）、実施例１．２で用意されたＴＳＧ－６発現ベクターが導入された臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＴＳＧ－６ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ＭＳＣ」；試験群）、および実施例５－１で用意されたＴＮＦ－αで活性化された臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＴＮＦ－α ｔｒｅａｔｅｄ ＭＳＣ」；比較群）の２４時間のＴＳＧ－６発現レベル（ｍＲＮＡレベル）をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造会社の使用説明に従って、前記細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いてｃＤＮＡを合成した後、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）上でＲＴ－ｑＰＣＲを行った。内在の対照遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用した。使用されたプライマ－を下記表７にまとめた。
前記得られた結果をｒｅｌａｔｉｖｅ Ｃｔ ｖａｌｕｅｓ（ＴＳＧ－６／ＧＡＰＤＨ）として求めて、図１１Ａに示した。前記の相対的な発現レベルは２－ΔΔＣｔ ｍｅｔｈｏｄを用いて計算した。図１１Ａに示されているように、ＴＮＦ－α ｔｒｅａｔｅｄ ＭＳＣ（比較群）の相対的なＴＳＧ－６の発現レベル（ｍＲＮＡレベル）は、対照群であるＭＳＣと大きな差を示していないのに対し（対照群対比３．４７倍）、ＴＳＧ－６ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ＭＳＣ（試験群）の相対的なＴＳＧ－６の発現レベル（ｍＲＮＡレベル）は、対照群はもちろん、比較群に比べて顕著に高くなった（対照群対比約１２４８倍、比較群対比約３６０倍）。
５－３．ＴＳＧ－６タンパク質レベルの比較（ＥＬＩＳＡ）
非変形臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＭＳＣ」；対照群）、実施例１．２で用意されたＴＳＧ－６発現ベクターが導入された臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＴＳＧ－６ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ＭＳＣ」；試験群）、および実施例５－１で用意されたＴＮＦ－αで活性化された臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＴＮＦ－α ｔｒｅａｔｅｄ ＭＳＣ」；比較群）で２４時間発現（培地に分泌）したＴＳＧ－６タンパク質レベルを、ＴＳＧ－６ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ、ＧＡ、ＵＳ）を用いて、製造会社の使用説明に従って測定した。
非変形臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＭＳＣ」；対照群）、実施例１．２で用意されたＴＳＧ－６発現ベクターが導入された臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＴＳＧ－６ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ＭＳＣ」；試験群）、および実施例５－１で用意されたＴＮＦ－αで活性化された臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＴＮＦ－α ｔｒｅａｔｅｄ ＭＳＣ」；比較群）で２４時間発現（培地に分泌）したＴＳＧ－６タンパク質レベルを、ＴＳＧ－６ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ（Ｒａｙｂｉｏｔｅｃｈ、ＧＡ、ＵＳ）を用いて、製造会社の使用説明に従って測定した。
前記得られた結果（ｎｇ／１０５ｃｅｌｌｓ／２４時間）を図１１Ｂに示した。図１１Ｂに示されているように、対照群ＭＳＣおよび比較群ＴＮＦ－α ｔｒｅａｔｅｄ ＭＳＣはＴＳＧ－６タンパク質の分泌量が測定されない程度に低いレベルであるのに対し、ＴＳＧ－６ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ＭＳＣは、対照群ＭＳＣおよび比較群ＴＮＦ－α ｔｒｅａｔｅｄ ＭＳＣに比べて顕著に高いレベル（約７０ｎｇ／１０５ｃｅｌｌｓ／２４時間）にＴＳＧ－６タンパク質を分泌した。
５－４．コラーゲンＩＩ ｍＲＮＡレベルの比較（ＲＴ－ｑＰＣＲ）
非変形臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＭＳＣ」；対照群）、ＴＳＧ－６発現ベクターが導入された臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＴＳＧ－６ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ＭＳＣ」；試験群；実施例１．２参照）、およびＴＮＦ－αで活性化された臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＴＮＦ－α ｔｒｅａｔｅｄ ＭＳＣ」；比較群；実施例５－１参照）をそれぞれ用意した。このように用意されたそれぞれの臍帯血由来のＭＳＣを、各ウェルあたり１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ培地２ｍｌを含む６－ｗｅｌｌ ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＡ、ＵＳ）に１ｘ１０５ｃｅｌｌｓの量でプレーティングし、２４時間培養した。その後、培地を１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ－ａを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ培地に切り替え、２４時間培養して活性化されたＭＳＣを誘発した。
非変形臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＭＳＣ」；対照群）、ＴＳＧ－６発現ベクターが導入された臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＴＳＧ－６ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ＭＳＣ」；試験群；実施例１．２参照）、およびＴＮＦ－αで活性化された臍帯血由来のＭＳＣ（以下、「ＴＮＦ－α ｔｒｅａｔｅｄ ＭＳＣ」；比較群；実施例５－１参照）をそれぞれ用意した。このように用意されたそれぞれの臍帯血由来のＭＳＣを、各ウェルあたり１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ培地２ｍｌを含む６－ｗｅｌｌ ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＡ、ＵＳ）に１ｘ１０５ｃｅｌｌｓの量でプレーティングし、２４時間培養した。その後、培地を１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ－ａを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ培地に切り替え、２４時間培養して活性化されたＭＳＣを誘発した。
軟骨細胞（肋軟骨由来；実施例３参照）を、各ウェルあたり１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ培地２ｍｌを含む６－ｗｅｌｌプレートに１ｘ１０５ｃｅｌｌｓの量でプレーティングし、２４時間培養した。その後、培地を１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび７５ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１ｂ（Ｐｅｐｔｒｏｔｅｃｈ、ＮＹ、ＵＳ）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ ＭＥＭ培地に切り替え、２４時間培養して炎症誘発した。前記６－ｗｅｌｌ ｔｒａｎｓｗｅｌｌで活性化させたＭＳＣと２４時間共培養した。軟骨細胞を１ｍＭ ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）と共に０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンを３７℃で２分間処理してトリプシン化（ｔｒｙｐｓｉｎｉｚａｔｉｏｎ）させた。回収した細胞を下記のコラーゲンＩＩ ｍＲＮＡレベルの比較（ＲＴ－ｑＰＣＲ）に使用した。
前記のように非変形臍帯血由来のＭＳＣ（ＭＳＣ；対照群）、ＴＳＧ－６発現ベクターが導入された臍帯血由来のＭＳＣ（ＴＳＧ－６ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ＭＳＣ；試験群）、またはＴＮＦ－αで活性化された臍帯血由来のＭＳＣ（ＴＮＦ－α ｔｒｅａｔｅｄ ＭＳＣ；比較群）と共培養された軟骨細胞における２４時間のコラーゲンＩＩの発現量（ｍＲＮＡレベル）をＲＴ－ｑＰＣＲで測定した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、製造会社の使用説明に従って、前記細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いてｃＤＮＡを合成した後、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲＴＭ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を用いてＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ ６ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）上でＲＴ－ｑＰＣＲを行った。内在の対照遺伝子としてＧＡＰＤＨを使用した。使用されたプライマ－を前記表８にまとめた。
前記得られた結果をｒｅｌａｔｉｖｅ Ｃｔ ｖａｌｕｅｓ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ＩＩ／ＧＡＰＤＨ）として求めて、図１１Ｃに示した。前記の相対的な発現レベルは２－ΔΔＣｔ ｍｅｔｈｏｄを用いて計算した。図１１Ｃに示されているように、ＴＮＦ－α ｔｒｅａｔｅｄ ＭＳＣ（比較群）の相対的なコラーゲンＩＩの発現レベル（ｍＲＮＡレベル）は、対照群であるＭＳＣと大きな差を示していないのに対し（対照群対比１．０３倍）、ＴＳＧ－６ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ ＭＳＣ（試験群）の相対的なコラーゲンＩＩの発現レベル（ｍＲＮＡレベル）は、対照群はもちろん、比較群に比べて顕著に高くなった（対照群対比約１．９３倍、比較群対比約１．８７倍）。このような結果は、ＴＳＧ－６発現ベクターが導入されたＭＳＣは、非変形ＭＳＣはもちろん、ＴＮＦ－αで活性化（刺激）されたＭＳＣと比較して、軟骨細胞におけるコラーゲンＩＩの発現効果が顕著に優れていることが確認され、このような結果は、ＴＳＧ－６発現ベクターが導入されたＭＳＣの優れた軟骨再生効果および／または骨関節炎の治療効果を立証する。
Claims (14)
- ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞を有効成分として含む、軟骨再生用組成物。
- 前記ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞は、
ＴＳＧ－６タンパク質をコードする遺伝子および前記ＴＳＧ－６タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターからなる群より選択される１つ以上を含む組換え間葉系幹細胞である、請求項１に記載の軟骨再生用組成物。 - 前記組成物は、次の特徴を有するものである、請求項１に記載の軟骨再生用組成物：
ＴＳＧ－６タンパク質の発現量が１０～２００ｎｇ／１０万個の細胞／２４時間、
ＴＳＧ－６タンパク質の発現量が１０～５０，０００ｎｇ／ｍＬ／２４時間、または
これらのすべて。 - 前記組成物を投与した軟骨細胞および軟骨組織からなる群より選択される１つ以上のコラーゲンＩＩタンパク質の発現量が未投与対照群に比べて増加するものである、請求項１に記載の軟骨再生用組成物。
- 前記組成物を投与した軟骨細胞、軟骨組織、滑膜細胞および滑膜組織からなる群より選択される１つ以上の炎症性指標の発現量が未投与対照群に比べて減少し、
前記炎症性指標は、ＴＧＦ－ｂ１、ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－ｒ、およびＩＬ－６からなる群より選択される１つ以上である、請求項１に記載の軟骨再生用組成物。 - ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞を有効成分として含む、骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞は、
ＴＳＧ－６タンパク質をコードする遺伝子および前記ＴＳＧ－６タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターからなる群より選択される１つ以上を含む組換え間葉系幹細胞である、請求項６に記載の骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物。 - 前記組成物は、次の特徴を有するものである、請求項７に記載の骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物：
ＴＳＧ－６タンパク質の発現量が１０～２００ｎｇ／１０万個の細胞／２４時間、
ＴＳＧ－６タンパク質の発現量が１０～５０，０００ｎｇ／ｍＬ／２４時間、または
これらのすべて。 - 前記組成物は、次の効果を有するものである、請求項７に記載の骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物：
軟骨細胞および軟骨組織からなる群より選択される１つ以上のコラーゲンＩＩタンパク質の発現量の未投与対照群対比増加、
軟骨細胞、軟骨組織、滑膜細胞および滑膜組織からなる群より選択される１つ以上における、ＴＧＦ－ｂ１、ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－ｒ、およびＩＬ－６からなる群より選択される１つ以上の炎症性指標の発現量の未投与対照群対比減少、または
これらのすべて。 - 関節腔内投与用である、請求項６～９のいずれか１項に記載の骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物。
- 前記組成物は、注射剤である、請求項６～９のいずれか１項に記載の骨関節炎の予防または治療用薬学的組成物。
- ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞を有効成分として含む、コラーゲンＩＩタンパク質発現用組成物。
- 前記ＴＳＧ－６タンパク質を発現する間葉系幹細胞は、
ＴＳＧ－６タンパク質をコードする遺伝子および前記ＴＳＧ－６タンパク質をコードする遺伝子を含む組換えベクターからなる群より選択される１つ以上を含む組換え間葉系幹細胞である、請求項１２に記載のコラーゲンＩＩタンパク質発現用組成物。 - 前記組成物は、次の特徴を有するものである、請求項１２に記載のコラーゲンＩＩタンパク質発現用組成物：
ＴＳＧ－６タンパク質の発現量が１０～２００ｎｇ／１０万個の細胞／２４時間、
ＴＳＧ－６タンパク質の発現量が１０～５０，０００ｎｇ／ｍＬ／２４時間、または
これらのすべて。
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