CN104903344B - Pedf衍生的多肽在治疗骨关节炎中的用途 - Google Patents
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Abstract
本公开了一种合成肽,其具有的氨基酸序列含有20–39个氨基酸残基。该合成肽与SEQ ID NO:1具有至少80%的氨基酸序列相同性,并有至少20个连续氨基酸残基,其与SEQ ID NO:1第11–30个氨基酸残基具有至少90%的氨基酸序列相同性。本公开还公开含有此合成肽的组合物及其用途。根据本公开所载的多种实施方式,此合成肽可用以治疗个体的骨关节炎。
Description
发明背景
1、技术领域
本公开涉及关于骨关节炎治疗。具体而言,所公开的发明涉及使用PEDF衍生的多肽来治疗骨关节炎。
2、相关技术的描述
骨关节炎(osteoarthritis)是一种退行性关节疾病,其主要影响软骨;软骨是一种可滑动的组织,覆盖于骨头末端和另一骨头相接形成关节的部位。健康的软骨使得骨头可相对于另一骨头而滑动,并可吸收物理运动时带来的冲击能量。在骨关节炎中,软骨的表层破裂并受到耗损,因而位于受损软骨下方的骨头会彼此摩擦,导致疼痛、肿胀并失去运动能力。骨关节炎老化有关,最容易影响到常年持续承受压力的关节,譬如膝盖、臀部、手指与下脊椎。
骨关节炎是迄今为止最常见的关节炎类型。在2008年时,25岁以上的美国人当中约有2千7百万人患有骨关节炎。至于在全球60岁以上的人口中,据估计约有9.6%的男性与18.0%的女性具有骨关节炎相关症状。世界卫生组织(WHO)的调查显示,骨关节炎的患者中,80%的患者行动受到限制,25%的患者无法进行主要的日常活动。
目前无法治愈骨关节炎。现有的疾病管理主要着重于控制关节疼痛和僵硬,和维持患者日常活动能力。通常会建议进行物理治疗,因为其有助于强化肌肉与骨骼、增加肌肉挠曲性,从而可减少疼痛。用于骨关节炎的药物主要是缓解疼痛。镇痛药和局部解痛药能够舒缓不适,但无法治疗发炎。口服或注射用的皮质甾类可控制发炎,但不适合频繁、长期使用。非固醇类抗发炎药物(NSAID)可用以减少疼痛、肿胀与发炎;然而它们会导致胃部不适与溃疡,且可能增加某些人心脏病发作的风险。对于严重受损的关节,可考虑外科手术,如关节镜手术乃至于全关节造型术。
有鉴于上述问题,相关领域亟需能够有效治疗骨关节炎的措施。
发明内容
下文提供本公开的简化摘要,以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本公开的完整概述,且其未指出本发明的重要/关键组件或界定本发明的范围。本部分内容的目的仅是以简化形式阐明一些概念,更详细的内容将在后文予以呈现。
本发明至少部分是基于发现衍生自色素上皮衍生因子(PEDF)的合成肽能够刺激软骨细胞增殖、促进软骨再生,并诱导间充质干细胞的软骨形成;因而它们能够有效治疗个体的骨关节炎。因此,本发明PEDF衍生合成肽能够用在治疗骨关节炎的药物。
有鉴于此,一方面,本公开涉及使用合成肽治疗个体骨关节炎。
根据本公开多个实施例,所述的合成肽长20–39个氨基酸残基,且其序列至少80%与SEQ ID NO:1相同。此外,上述氨基酸序列包含至少20个连续氨基酸残基,其序列至少90%与SEQ ID NO:1的残基11–30相同,而使得此合成肽可用于治疗个体的骨关节炎。
在本公开可任选的实施例中,上述合成肽中有至少四个连续的氨基酸,其与SEQID NO:1的残基11–14相同。此种合成肽的非限制性例子包括分别具有SEQ ID NO:1(39-聚体)、SEQ ID NO:2(34-聚体)、SEQ ID NO:3(29-聚体)、SEQ ID NO:5(24-聚体)、SEQ ID NO:6(20-聚体)、SEQ ID NO:8(MO 29-聚体)与SEQ ID NO:9(MO 20-聚体)的氨基酸序列的合成肽。根据本公开某些实施例,上述合成肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:3(29-聚体)、SEQ IDNO:5(24-聚体)或SEQ ID NO:6(20-聚体)。
根据本公开多个实施例,所述个体可以是归类为哺乳动物的任何动物,包括人。
另一方面,本公开涉及用以治疗个体骨关节炎的药物组合物。所述个体可以是归类为哺乳动物的任何动物,包括人。
根据本公开一实施方式,上述药物组合物包含根据上述任一方面/实施例的合成肽,且此合成肽以足以治疗该个体的骨关节炎的有效量存在。此药物组合物亦包含可用以携带该合成肽的药学上可接受赋形剂。
于可任选的实施例中,所述药物组合物还包含糖胺聚糖,譬如透明质酸或透明质酸钠。
根据本公开多个实施例,可将所述药物组合物制成可注射的剂型。
本发明的又一方面涉及一种治疗具有至少一处患有骨关节炎的病灶的个体的骨关节炎的方法。所述个体可以是归类为哺乳动物的任何动物,包括人。
于一实施例中,上述方法包含给予该个体有效量的根据上述任一方面/实施例的合成肽。据具体而言,以使得此合成肽到达该个体的滑液腔(synovial cavity)内,进而治疗骨关节炎的方式给予所述合成肽。
于可任选的实施例中,可将合成肽配制成根据本公开上述方面/实施例所述的组合物。
于某些实施例中,可利用关节内注射(intra-articular injection)的方式将所述合成肽或药物组合物注射至该个体的滑液腔。
在参阅下文详细描述,并结合附图后,本公开许多附带的特征和优点将更易于理解。
附图简要说明
本专利或申请文件包含至少一幅彩图。在提出请求并缴纳所需费用后,专利局将提供带有彩图的此专利或专利申请出版物的副本。
结合附图及下文详述,本说明书将更易于理解。
图1提供本公开一具体实施例中经H&E染色的膝关节样品的代表性切片(F:股骨髁;T:胫骨髁;M:半月板);
图2为图1实施例所示的膝关节组织切片的代表性显微照片(原始倍率:400倍);
图3提供本公开另一具体实施例经免疫染色的膝关节样品的代表性照片(原始倍率:1000倍);
图4A提供本公开另一具体实施例中关节软骨衍生的集落形态的代表性照片和显示该集落身份的免疫染色照片;和
图4B提供图4A具体实施例所示的来自大鼠关节软骨的细胞的代表性免疫染色照片(原始倍率:1000倍)。
描述
下文结合附图详细描述的内容仅仅是对本实施例的描述,并非是实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。此部分公开了实施例的功能以及用于建构与操作这些具体实施例的步骤的顺序。然而,亦可利用其它具体实施例来达成相同或等同的功能与顺序。
出于方便,本申请(包括说明书、实施例和权利要求书)所用的某些术语汇集于此。除非本说明书另有定义,本公开所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。除非另有说明,应理解的是,所用的单数名词涵盖该名词的复数型;而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。具体而言,如本文及权利要求书所用,除非另有说明,单数形式“一”包括其复数形式。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数界是约略的数值,具体实施例的相关数值已尽可能精确地呈现。然而,任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差而导致的误差。同时,本文中,“约”通常指实际数值在一给定数值或范围的正负10%、5%、1%或0.5%之内。或者是,“约”代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内,视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实施例之外,或除非另有明确的说明,当可理解本文所用的所有数值范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例等)均经过“约”的修饰。因此,除非另有相反的说明,本公开与权利要求书所涉及的数值参数皆为约略的数值,且可视需求而更改。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。
本文中,术语“肽”指氨基酸残基的多聚物。本文中,术语“合成肽”指未包含存在于自然界的完整蛋白质分子的肽。此种肽是“合成的”,因为其由人类利用技术手段所得,譬如化学合成、重组遗传技术或将整个蛋白切段等。于本公开中,任何指定氨基酸残基于一肽中的位置系由该肽的N端起算。
本文所用“增殖”指族群中的细胞数目通过细胞分裂而增加。
本文针对合成多肽序列所述的“氨基酸序列相同性百分比(%)”系指该候选合成肽的氨基酸残基与参考多肽的氨基酸残基完全相同的百分比。进行上述比对时,可将该候选合成肽与该参考多肽并排,并于必要时引入间隙(gap),以使两条序列形成最高的序列相同性,且在计算相同性时,并未将保守性取代的氨基酸残基纳入考虑。可采用本领域已有的多种方法进行上述比对,以确定序列相同性百分比,譬如可使用可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)。本领域技术人员可确定比对时的适当参数,包括需要在对比序列的整个长度上获得最大比对所需的各种算法。为了本文的目的,二氨基酸序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心(NCBI)所提供的计算机程序Blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)来进行。给定氨基酸序列A相较于给定氨基酸序列B的氨基酸序列相同性百分比(亦称为给定氨基酸序列A与给定氨基酸序列B具有特定百分比(%)的氨基酸序列相同性)的计算方式如下:
其中X是利用比对程序BLAST对A和B进行比对后所得到的计为完全匹配的氨基酸残基的数量,而Y是A或B中较短者的氨基酸残基总数。本文所用术语“治疗”指预防性(如,预防用药)、治愈性或缓和性的处理,藉以达到所需的药学和/或生理学效果。在较佳的情形中,上述的效果是治疗性的,即能够部分或完全地治愈骨关节炎。此外,术语“治疗”指称将物理和/或化学干预施用或给予个体,此个体有医学疾患、症状、疾病或与疾患相关的异常或易于罹患疾患,以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻特定疾病、异常和/或病症的一或多种症状或特征,或延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对并未出现疾病、异常和/或病症之征兆的对象和/或呈现疾病、异常和/或病症之早期征兆的对象进行治疗,以期降低发展出与该疾病、异常和/或病症相关之病理变化的风险。根据本公开的原理和精神,上述症状、疾病或异常指骨关节炎。如其在本文中所定义的,当一或更多种症状或临床指标减少时,通常认为该治疗是“有效”的。
本文所用术语“有效量”指一成分的用量足以产生所欲的反应。具体的有效量取决于多种因素,诸如欲治疗的特定病症、患者的身体条件(如患者体重、年龄或性别)、接受治疗的哺乳动物或动物的类型、治疗持续时间、共同施与的疗法(如果有的话)的本质以及所用的具体配方。有效量亦指于此用量下,该化合物或组合物的毒性或负面效果不及于其所带来的正面疗效。
术语“施用”或“给药”在本文中可互换使用,指将本发明合成肽或药物组合物提供给个体,以治疗骨关节炎。根据本公开各实施方式,较佳的递送方式为关节内注射。例如,将本发明合成肽或药物组合物关节内注射至个体的滑液腔内,以促进软骨再生,从而治疗骨关节炎。
本文所用术语“赋形剂”指可作为本公开所述合成的PEDF肽的媒剂/载体的任何惰性物质(如粉末或液体)。赋形剂通常是安全、无毒的,且广义上可包括制药产业中用于制备药物组合物的任何已知物质,如填充剂、稀释剂、凝结剂、黏合剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、着色剂、润湿剂、崩解剂等。
在本文中,“药学上可接受”的成分指其适用于人类和/或动物,且在合理的效益/风险比之下不会产生不当的副作用(如毒性、刺激与过敏反应)。此外,每一种赋形剂必须和药学配方中的其它成分兼容,才是“可接受”的。载体可以是固体、半固体、液体稀释剂、霜或胶囊的形式。
术语“个体”指可用本发明的合成肽、组合物和/或方法来进行治疗的哺乳动物(包括人类)。除非另有指明,术语“个体”包含雄性与雌性。
色素上皮衍生因子(PEDF)是一种多功能的分泌性蛋白质,其具有抗血管新生、抗肿瘤生成与神经滋养功能。人PEDF蛋白质(SEQ ID NO:11)是一种大小约50kDa的分泌性蛋白质,长418个氨基酸。已知PEDF的34-聚体片段(第44–77号残基)与44-聚体片段(第78–121号残基;SEQ ID NO:10)分别具有抗血管新生与神经滋养性质。
本公开至少部分是基于发现衍生自44-聚体PEDF的合成肽能够透过多种机制来促进软骨再生。本公开提供的实验例证实,本发明合成肽能够促进软骨细胞增殖且可诱导间充质干细胞的软骨发生。本发明的另一创新特征在于所述合成肽(20-39个氨基酸残基)比全长PEDF短得多,因此克服了传统蛋白质药物在临床使用上面临的限制,诸如制造成本高昂、生物利用率低与药代动力学差。因此,本发明合成肽可用以治疗骨关节炎。
有鉴于此,一方面,本发明涉及使用合成肽治疗个体的骨关节炎。
根据本公开多个实施例,此合成肽有20–39个氨基酸残基,且其氨基酸序列与SEQID NO:1(LSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)有至少80%的氨基酸序列相同性。举例来说,此合成肽与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相同性可为约80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。另外,此合成肽包含至少20个连续的氨基酸残基,其与SEQ ID NO:1第11–30个残基有至少90%的氨基酸序列相同性。具体来说,这20个连续氨基酸残基与SEQ ID NO:1第11–30个残基的氨基酸序列相同性可为约90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。
在本发明一实施例中,所述的合成肽有39个氨基酸残基,其序列即如SEQ ID NO:1所示。在下文实验例中,亦将此合成肽称为39-聚体。此种39-聚体肽对应于人PEDF的第83–121号残基,因此是已知的人44-聚体(对应于PEDF第78-121号残基)的一种较短的变体。
本发明人先前所做的实验(如,待批美国专利申请案第13/428996号,在此将该在先申请的内容一并纳入为本公开的一部分)与本公开所提供的实验例显示还有其它数种来自此39-聚体的短PEDF合成肽能够用以治疗个体的骨关节炎。
譬如,由下文与在先申请的实验可知,如SEQ ID NO:2(ALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示的34-聚体合成肽能够有效地治疗骨关节炎。此34-聚体合成肽对应于人PEDF的第88–121号氨基酸残基;根据上文所述的计算给定两条序列的序列相同性的方法,此34-聚体与39-聚体的氨基酸序列相同性为100%,且34-聚体的第6–25号氨基酸残基与39-聚体的第11–30号氨基酸残基的氨基酸序列相同性也是100%。
此外,下文多个实施例证明,SEQ ID NO:3(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT)所示的29-聚体合成肽能够有效治疗个体的骨关节炎。此29-聚体合成肽对应于人类PEDF的第93–121号氨基酸残基;其与39-聚体的氨基酸序列相同性为100%,且29-聚体的第1–20号氨基酸残基与39-聚体的第11–30号氨基酸残基的氨基酸序列相同性亦为100%。
某些实施例证实,一种24-聚体合成肽亦可有效治疗个体的骨关节炎。此24-聚体的序列如SEQ ID NO:5(SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSP)所示,其对应于人类PEDF第93–116号氨基酸残基。此24-聚体序列与39-聚体具有100%的氨基酸序列相同性,其前20个氨基酸残基与该39-聚体第11–30号氨基酸残基具有100%的氨基酸序列相同性。
其它实施例显示,20-聚体亦可治疗个体的骨关节炎。该20-聚体具有序列SLGAEQRTESIIHRALYYDL(SEQ ID NO:6),对应于人PEDF第93–112号氨基酸残基。此20-聚体与39-聚体的第11–30号氨基酸残基完全相同(氨基酸序列相同性:100%)且其相较于39-聚体的氨基酸序列相同性同样也是100%。
本案与在先申请所揭载的实验亦显示,另外有两种衍生自小鼠PEDF的合成肽同样也能够治疗骨关节炎。第一种衍生自小鼠的合成肽在本公开中称为“Mo 29-聚体”,其序列如SEQ ID NO:8(SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST)所示,此序列与39-聚体的氨基酸序列相同性为83%,且其前20个氨基酸残基与39-聚体第11–30个残基的氨基酸序列相同性为90%。另一种衍生自小鼠PEDF的合成肽称为“Mo 20-聚体”,其序列如SEQ ID NO:9(SLGAEHRTESVIHRALYYDL)所示。Mo 20-聚体与39-聚体或39-聚体的第11–30号氨基酸残基的氨基酸序列相同性皆为90%。
可任选的,所述合成肽含有至少四个连续的氨基酸,其序列与SEQ ID NO:1的氨基酸残基11–14相同。据信,SEQ ID NO:1所示序列的第11–14号氨基酸残基(即,SLGA)对于维持本发明短PEDF合成肽的生物学功能扮演重要的角色。举例来说,下文提出的多个实施例显示,不具有此SLGA片段的18-聚体合成肽(EQRTESIIHRALYYDLIS;SEQ ID NO:7)无法保护个体对抗骨关节炎。此外,由本案与在先申请所载的实验可知,不含SLGA残基的25-聚体肽(EQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT;SEQ ID NO:4)也无法有效治疗个体的骨关节炎。
可利用常用技术来合成本发明的合成肽,譬如使用t-BOC或FMOC来保护α-氨基。这两种方法都采用了逐步合成法,由该肽的C端开始,每次加上一个氨基酸。亦可利用已知的固态肽合成法来合成本发明的合成肽。
本发明的范围亦涵盖了其它相较于39-聚体具有保守性突变的合成肽。本文所用术语“保守性突变”指利用另一种在生物学上相似的残基来取代某一残基。保守性突变的例示包括疏水性残基(如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸与甲硫氨酸)彼此间的置换,或极性残基(如精氨酸与赖氨酸;或谷氨酸与天冬氨酸,或谷氨酰胺与天冬酰胺)彼此间的置换等。“保守性突变”在此亦指利用取代的氨基酸来取代未取代的原始氨基酸,只要针对该取代的多肽产生的抗体也能与该未取代的多肽发生免疫反应即可。
依据本公开多种实施例,所述的个体可以是归类为哺乳动物的任何动物,包括人。
亦可将上述实施方式所述的各种合成肽调制成药物组合物,以治疗个体的骨关节炎;此种药物组合物即属于本发明另一方面之范围。
根据本公开一实施方式,上述药物组合物包含根据本发明上述任一方面/实施例的合成肽,且此合成肽以足以治疗该个体的骨关节炎的有效量存在。此药物组合物亦包含可用以携带该合成肽的药学上可接受赋形剂。
根据本公开的可任选实施例,此药物组合物中所述合成肽的含量为约1–1000μM;较佳为约10–500μM;更优秀为约25-250μM。举例来说,合成肽的浓度可为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950或1,000μM。具体而言,下文实施例中针对约310克重的大鼠所用的浓度为约200μM。本发明所属技术领域具有通常知识者可基于本说明书提出的动物给药剂量计算出本发明合成肽或药物组合物的人体等效剂量(HEQ)。譬如,可根据美国食品暨卫生管理局(FDA)已批准的题为“成年健康志愿者临床治疗实验中最大安全起始剂量的估算”(Estimating the Maximum Safe Starting Dosein Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)的工业指南来估算人个体的最大安全剂量。
可根据既有的药学程序来制备上述药物组合物,譬如《雷明顿制药科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences)(第17版,Alfonoso R.Gennaro编,麦克出版公司(Mack Publishing Company),伊斯顿,宾夕法尼亚(1985))一书中有详细的记载。
在选择适用于投递合成肽的赋形剂时,主要需考虑此药物组合物的给药方式。
根据本公开的可任选实施例,可利用关节内注射的方式局部给药。在此种情形中,可利用例如无菌水溶液作为药学上可接受载体来配制所述合成肽,此水溶液较佳为与接受者体液等张的溶液。可将固体活性成分溶解或悬浮于含有生理可兼容物质(如氯化钠、甘胺酸等),且其pH值经缓冲可与生理条件兼容的水中以得到一水溶液,而后再进行灭菌,从而制备所述制剂。可用来制造上述无菌注射溶液或悬浮液的其它稀释剂或溶剂包括,但不限于,1,3-丁二醇、甘露醇、水与林格氏溶液(Ringer’s solution)。也可使用脂肪酸(如,油酸)及其甘油酯衍生物,或是天然药学可接受的油(如,橄榄油或蓖麻油)来制造注射剂。这类油性溶液或悬浮液中也可包含醇类稀释剂或羧甲基纤维素或类似的分散剂。于调制制剂时,亦可使用其它常用的表面活性剂(如,Tweens或Spans系列)、或其它类似的乳化剂,或于制备药学上可接受剂型时常用的生物利用度促进剂(bioavailability enhancer)。
根据本发明任选实施例,所述的药物组合物还可包含糖胺聚糖。糖胺聚糖是一种线性多糖类,由重复的具有羧基和一个或多个硫酸酯的双糖单元所构成。糖胺聚糖连接至核心蛋白(core protein),形成蛋白多糖,此乃骨细胞外基质(bone extracellularmatrix)的主要成分。在患有骨关节炎的软骨处,基质中糖胺聚糖的含量降低,而使得糖胺聚糖和II型胶原蛋白之间的连结减弱,而使病况加重。因此,提供外来的糖胺聚糖至病灶部位,有助于治疗骨关节炎。糖胺聚糖的例子包括但不限于:透明质酸与透明质酸钠。作为非限制性实施例,本发明药物组合物可包含1–15%(重量百分比)的透明质酸。
同样可任选地,本发明的药物组合物亦可包含所属技术领域中具有通常知识者所熟知的药学上可接受的一或多种添加剂。上述添加剂包括但不限于:干燥剂、抗痒剂、抗发泡剂、缓冲剂、中和剂、pH调节剂、着色剂、脱色剂、润肤剂、乳化剂、乳液稳定剂、增黏剂(viscosity builders)、保湿剂、添味剂(odorants)、防腐剂、抗氧化剂、化学稳定剂、增稠剂、硬化剂、或悬浮剂。。
在又一方面中,本发明提出了一种治疗个体的骨关节炎的方法。所述个体可以是任何归类为哺乳动物的动物,包括人。根据本发明的原理与精神,所述方法能够促进软骨再生,进而能够缓和或治愈该个体的骨关节炎。
于一实施例中,上述方法包含给予该个体有效量的根据本发明上述方面/实施例的合成肽,藉使所述肽到达邻近病灶的滑液腔。
于可任选的实施例中,可将所述合成肽调制为本公开上述方面/实施例所述的药物组合物。
于一些实施例中,可将所述合成肽或药物组合物以关节内注射的方式递送至滑液腔内。
下文提出多个实施例来说明本发明的某些方面,以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实施本发明。不应将这些实施例视为对本发明范围的限制。据信本领域技术人员在阅读了本文的描述后,可完整利用本发明。本文所引用的所有公开文献,其全文均以引用的方式纳入本文。
实验例
材料与方法
<材料>
DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、抗生素、TRIzol和Dynabeads皆购自英杰生命技术有限公司(Invitrogen,加利福尼亚,卡尔斯巴德)。透明质酸(HA)、单碘乙酸(MIA)、二甲亚砜(DMSO)、纤连蛋白、Percoll、胰岛素、氢化可的松、牛血清白蛋白(BSA)、5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)、Hoechst 33258染料购自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)。抗-BrdU抗体、抗蛋白聚糖(anti-aggrecan)抗体和抗II型胶原蛋白抗体购自基泰(GeneTex,台北,台湾)。各种荧光染料结合的二级抗体皆购自生物传奇公司(BioLegend,加利福尼亚,圣地亚哥)。链霉蛋白酶(Pronase)与胶原酶购自罗氏(印第安纳州,印第安纳波利斯)。苏木精与曙红(H&E)染料购自默克(美国新泽西州,雷威(Rayway))。
合成PEDF合成肽(包括29-聚体(SEQ ID NO:3)、24-聚体(SEQ ID NO:5)、20-聚体(SEQ ID NO:6)与18-聚体(SEQ ID NO:7)),并将其N端乙酰化、C端酰胺化而进行修饰。然后以质谱仪(金斯瑞,新泽西州皮斯卡塔市)表征修饰的肽(纯度>95%)。以DMSO重构各PEDF衍生的短合成肽(所述29-聚体、24-聚体或20-聚体,下文称为PEDF肽),制成浓度为5mM的储备溶液,并储存于-20℃中以供后续使用
<动物>
本公开所载实施例所用的所有动物皆饲育于有温度与湿度控制的饲养笼中,饲养温度约24℃至25℃,光暗循环为12:12小时。试验过程中提供饮水与标准使用时饲料供任食。实验计划皆通过马偕纪念医院(新北市,台湾)伦理委员会核准,并遵循国家动物保护相关规范。
对大鼠进行MIA关节内注射,以建立骨关节炎的动物模型。具体来说,10周大的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(最初体重312±11g)经腹腔内注射甲苯噻嗪(每公斤体重10毫克)以进行麻醉;接着在右膝以单一剂关节内注射的方式注入MIA(1毫克MIA溶于25μl的无菌生理盐水中)。具体而言,将膝盖处弯曲成90度,利用27G的针头,经由膝韧带(patellarligament)注入上述MIA溶液。
欲侦测体内细胞增殖时,在DMSO中重构BrdU,获得储备溶液(80mM)。将150μl的BrdU储备溶液和350μl的磷酸缓冲液(PBS)混合后,经腹膜内注射至大鼠体内,并于16小时后将大鼠安乐死。其后根据下文所述方法利用抗-BrdU抗体来标记BrdU,以评估DNA合成。
<关节软骨细胞的分离与培养>
自8周大成年雄性Sprague-Dawley大鼠的股骨髁(包括前方、后方与侧边区域)得关节软骨。取样时需小心以免滑膜引起污染并避免破坏骨质结构。取下的样品切成约0.5mm3的小片后,依序以链霉蛋白酶(70U/ml,37℃下1小时)与胶原酶(300U/ml,37℃下3小时)处理。之后,以无菌PBS冲洗一次,之后再以添加了2%FBS的DMEM冲洗两次,以移除胶原酶。进行原代培养时,在六孔板上放入经10μg/ml纤连蛋白涂覆的盖玻片,并将对台盼蓝呈阴性反应的细胞以每孔6000个的密度培养于六孔板中,所用的培养基为DMEM并添加10%FBS与1%青霉素/链霉素。隔天,将培养基换成标准增殖培养基(由10%FBS-DMEM、0.1mM抗坏血酸、0.5mg/ml L-葡萄糖、100mM HEPES、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺与抗生素组成),培养基中可添加或不添加50nM PEDF肽。每3天更换新鲜培养基,共培养12天。
<间充质干细胞的分离与培养>
8周大成年雄性Sprague-Dawley大鼠经腹腔内注射甲苯噻嗪(每公斤体重10毫克)以进行麻醉。在无菌环境下移出股骨,以PBS和抗生素的混合物冲洗约5分钟后,切除所有软组织、将其股端(epiphysis)截断,之后以肝素和DMEM混合物反复冲洗骨髓腔。将收集到的细胞以1000×g离心10分钟,而后将细胞沉淀物重新溶于DMEM中,并将此细胞悬浮液转移到含有5毫升Percoll(1.073g/ml)的15-ml离心管中,以1500×g离心30分钟。之后取出位于中间层的单核细胞,以PBS冲洗三次后,重新悬浮于低葡萄糖含量的DMEM(添加10%经热灭活的FBS与1%青霉素/链霉素)。细胞在95%空气和5%二氧化碳以及37℃的环境下培养,每4天更换培养基。弃置未贴附的细胞,并保留贴附细胞。在培养约一周后,原代间充质干细胞(MSC)会长至约80–90%铺满。
欲引发间充质干细胞分化形成软骨,将5X 105个增殖的MSC培养于软骨生成培养基(chondrogenic medium)中,此培养基为高葡萄糖含量的DMEM培养基,含有100nM地塞米松、0.17mM抗坏血酸-2磷酸盐、10μg/ml胰岛素、5μg/ml转铁蛋白、5ng/ml硒、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺与2%FBS),并添加10ng/ml TGF-β2(安迪生物(R&D Systems),明尼苏达,明尼阿波利斯)。在PEDF处理组中,将细胞培养于上述软骨生成培养基中,并添加50nM的PEDF肽。每两天更换一次培养基,培养一周。
<组织学分析>
切下膝关节后,移除周围软组织,将样品以4%多聚甲醛固定后,利用ShandonTBD-2脱钙剂(购自赛默科技公司(Thermo Scientific,犹他州,洛根)处理。之后沿着关节中央径向(mid-sagittally)切开,再以石蜡块包埋。切片沿纵向切(厚度约5μm)。
于使用前,于二甲苯中脱蜡,并以一系列浓度梯度的乙醇再水合。之后,样品可用苏木精和曙红(H&E)染色,或用于免疫组化检查。小心为每个膝盖制备20个切片,以尽可能涵盖退化最严重的部分。
<免疫荧光染色与BrdU染色>
经石蜡包埋的关节样品于二甲苯中脱蜡,并以一系列浓度梯度的乙醇再水合。脱蜡的样品在室温下以1N HCl处理1小时,而后再进行免疫荧光研究。
进行免疫染色研究前,将样品以10%山羊血清和5%的BSA处理约1小时以进行阻断。之后以抗-蛋白聚糖(稀释比1:100)、抗-II型胶原蛋白(稀释比1:100)与抗-BrdU(稀释比1:100)的一级抗体在37℃下培育2小时,再和与适当的若丹明或FITC结合的驴IgG于室温下培育1小时,从而进行免疫染色。用Hoechst 33258进行对比染色7分钟,以定位核。使用配有CCD照相机的Zeiss荧光显微镜(Zeiss epifluorescence microscope)来撷取样品影像。计算细胞数目时,从每一切片中随机选取20个视野,由不知道实验分组的人员人力计算,并重复三次。
<RNA提取与反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)>
利用TRIzol自细胞内提取出总RNA,并以不含RNA酶的DNA酶I(恰根公司,加州,圣地克拉力塔(Santa Clarita))处理以移除基因组DNA,之后以RNA纯化试剂盒(Dynabeads)进行纯化。在20μl的反应缓冲液(含0.25μg的随机引物与0.8mMdNTP)中加入1μg取自BM-MSC的总RNA与200单位的扩增反转录酶(罗氏,德国曼海姆),于42℃下反应1小时,以将RNA反转录为cDNA。
取2μl的cDNA作为PCR反应的模板。PCR反应的反应体积为30μl,其中含有15μl的PLUS GREEN 2×Master Mix(公司)、1μM的各种引物以及2μl的模板DNA。在18-22轮的扩增反应中合成cDNA(变性:20秒、94℃;退火:30秒、57℃;以及聚合:40秒、72℃)。每种引物组所用的循环数落在扩增的线性范围内。特异性PCR引物序列为:大鼠蛋白聚糖(登陆号:J03485),正向:TTGGAAATCCAGAACCTTCG(SEQ ID NO:12);反向,GTCCAGTGTGTAGCGTGTGG(SEQ ID NO:13),其PCR产物大小约149bp;大鼠甘油醛3-磷酸去氢酶(GAPDH)基因(登陆号:X02231.1),正向,AGACAGCCGCATCTTCTTGT(SEQ ID NO:14);反向,CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT(SEQ ID NO:15),而PCR产物的大小约207bp。利用含有溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳分析,并以UV光照使其显影。利用FUJI LAS-3000系统与Multi Gauge Ver.1.01软件(富士胶片株式会社,日本东京)对PCR产物进行光密度法定量分析其强度。
<统计分析>
将结果表示为平均值±平均值的标准差(SEM)。利用单向ANOVA分析来进行统计比较。除非另有说明,P<0.05时具有统计上的显著差异。
实验例1
PEDF肽体内促进软骨细胞增殖与软骨再生
膝盖骨关节炎是一种常见的慢性退行性疾病,其特征是关节软骨的减损。单碘乙酸是一种糖解抑制剂,已知将MIA注射至啮齿动物的股胫关节空间会引发关节软骨的流失,此过程与人类骨关节炎的症状相近。研究显示,在注射MIA后7天,通常会出现严重的软骨细胞退化与坏死。因而,在MIA注射后第8天开始进行PEDF肽治疗,以探究本发明PEDF肽是否可促进软骨再生。
将大鼠随机分派至六个实验组,每组6只,并分别接受以下处理。HA组的大鼠接受25μl浓度为5%的透明质酸注射。在载体/HA组中,大鼠用再溶于25μl的5%透明质酸的DMSO载体处理。在29-聚体/HA、24-聚体/HA、20-聚体/HA与18-聚体/HA组中,大鼠接受再溶于25μl的5%透明质酸中的0.2mM PEDF肽(29-聚体、24-聚体、20-聚体或18-聚体)。以上处理皆透过单剂关节内注射,分别在MIA注射后第8、12、16与20天注射一次。
在MIA注射后第18天与第25天取得关节样品,经H&E染色后的代表性照片如图1所示。与未接受MIA注射的正常关节相比,可以发现载体/HA和18-聚体/HA组中与骨关节炎相关的形态改变(包括软骨变小、软骨表面纤维化以及软骨下骨崩坏),这些变化在承受体重的部位尤其明显。相较于载体/HA组和18-聚体/HA组,在来自20-聚体/HA组的样品中,软骨表面平滑,且软骨和软骨下骨相对较为完整。其它PEDF肽诸如29-聚体与24-聚体亦可产生和20-聚体类似的效果(数据未示出)。这些结果显示本发明PEDF肽可以消除与骨关节炎相关的病理学改变。
正常软骨是有组织的层状结构,根据功能和结构可将其分成表层区(superficialzone)、中层或过渡区(middle or transitional zone)以及径向/深层区(radial/deepzone)。表层区是提供平滑滑动面的关节表面;本区约占关节软骨厚度的10%至20%。表层区中的软骨细胞多成狭长纺锤状,此区的胶原蛋白纤维的排列非常规则,且与关节面平行。中层区占关节软骨体积的40%至60%。此区中胶原蛋白纤维排列较不规则,且此层中的软骨细胞外型较圆(相较于表层中的软骨细胞)。深层区占软骨的30%,由直径较大的胶原蛋白纤维所组成,其排列方向与关节表面垂直。软骨细胞通常成柱状,且和胶原蛋白纤维的方向平行并垂直于关节线。图2提供了阐述该层状结构的代表性显微照片,所示照片系取自MIA注射后25天的膝关节样品。
由图2的照片可以看出,正常软骨中的细胞数目较低(hypocellular);而经过载体/HA处理的膝盖中,可以观察到表层区中的软骨细胞大量流失,且在中层区与深层区中,可以看到有分散的细胞集落(如箭头所指处)。相较之下,29-聚体/HA与20-聚体/HA处理导致大量新生软骨细胞占据整个软骨。此外,在经过本发明PEDF肽处理的膝盖中,每一层中的软骨细胞呈现更为规则的排列。这一结果表明,本发明PEDF肽启动了包含软骨细胞增殖以及结构重组的软骨再生过程。
骨关节炎会导致退化的软骨中胞外基质(ECM)(如蛋白聚糖与II型胶原蛋白)的流失。如图3左方照片所示,在经过20-聚体处理的膝盖的软骨的表层区、中层区与深层区内聚集了大量的蛋白聚糖阳性信号(绿色);相较之下,在经过载体处理的膝盖的软骨中,仅可观察到微弱的染色。利用抗-II型胶原蛋白抗体来染色膝盖切片的免疫组化分析显示,本发明PEDF肽对ECM有类似的恢复(数据未显示),此结果与本发明PEDF肽可促进软骨修复的论点相呼应。此外,如软骨蛋白聚染色所示,经20-聚体处理的软骨内,软骨细胞的数目远高于经载体处理的软骨。
对蛋白聚糖与细胞核(以Hoechst 33258染料染成蓝色,图3中图)进行双重免疫荧光染色,结果显示,在20-聚体/HA组中,超过95%的细胞对蛋白聚糖呈阳性反应;意味着本发明PEDF肽能够通过引发软骨细胞增殖而促进软骨愈合。
此外,利用抗-BrdU抗体进行的免疫组化分析显示,相较于载体/HA组,在20-聚体/HA组中,BrdU-阳性细胞的数目明显增加(图3右方照片)。根据上文所述的方法,于每一膝关节样品中取三个切片(每组6只大鼠),以进行定量分析。将BrdU与蛋白聚糖双阳性细胞的数目除以蛋白聚糖阳性细胞总数,计为BrdU/蛋白聚糖标记指数(%)。结果整理于表1;*P<0.0001,相较于载体/HA组。
表1
表1的数据表明,以本发明PEDF肽(如29-聚体、24-聚体与20-聚体)进行处理,可促进软骨细胞增殖(相较于HA组或载体/HA组)。亦可注意到,不含“SLGA残基”的18-聚体则不具有所述的促进效果。
总结来说,实验例1的结果显示,本发明PEDF肽能够有效促进受损软骨中的软骨细胞增殖,这是软骨再生的基础性机制。因而,据信本发明PEDF肽可促进软骨再生。
实验例2
PEDF肽体外促进关节软骨细胞增殖
由大鼠关节软骨分离出原代软骨细胞,并培养于添加或不添加PEDF肽的培养基中,以探究本发明PEDF肽是否可刺激软骨细胞增殖。
图4A的照片显示,存在本发明PEDF肽(如20-聚体)时,软骨细胞的生长较快,且会聚集成较大的三维集落。相较之下,在载体组中,不存在PEDF肽时集落非常小。蛋白聚糖免疫染色分析证实,集落内的细胞是软骨细胞(图4A,插图)。从20个随机选取的视野中定量单层培养物(图4B)中蛋白聚糖阳性的细胞数目,将蛋白聚糖标记的细胞数目除以细胞总数(以Hoechst 33258染料标记细胞核),计为蛋白聚糖标记指数(%)。结果整理于表2;*P<0.01,相较于未处理组。
表2
总结来看,本发明PEDF肽(如29-聚体、24-聚体与20-聚体)可促进培养系统内的软骨细胞增殖;此结果可支持这些PEDF肽体内刺激软骨细胞增殖的结论。此外,经培养的软骨细胞中蛋白聚糖含量提高亦可反映体内软骨基质再生。
实验例3
PEDF肽促进间充质干细胞分化为软骨细胞
在软骨修复过程中,间充质干细胞被认为是产生软骨细胞的来源。本实施例的目的是探究本发明PEDF肽是否可促进培养中的间充质干细胞分化为软骨细胞。
根据上文“材料与方法”一节所述分离并培养间充质干细胞。并利用RT-PCR分析来定量蛋白聚糖mRNA的表达量,所得结果以GAPDH基因的表达量进行标准化。将载体组相对于载体组(设为1)的诱导的倍数归纳在表3中;*P<0.0002,相较于载体组。
表3
由表3可以看出,培养于增殖培养基中的间充质干细胞内几乎无法侦测到蛋白聚糖mRNA。相反地,当培养于促进软骨生成培养基内时,间充质干细胞分化为软骨细胞,如蛋白聚糖mRNA大量表达所证明的(载体组)。暴露于本发明PEDF肽(29-聚体、24-聚体与20-聚体),则会使得蛋白聚糖mRNA的表达量至少提高为载体组的3.5倍。此外,以18-聚体(即,不含所述SLGA残基的合成肽)处理时,则无法促进朝向软骨细胞的分化。
亦进行蛋白聚糖与II型胶原蛋白免疫染色,以探讨本发明PEDF肽促进分化的活性。随机选取20个视野后,定量蛋白聚糖阳性细胞数量,将经蛋白聚糖标记的细胞数量除以细胞总数(以Hoechst 33258染料标记细胞核),计算得到蛋白聚糖标记指数(%)。结果整理于表4;*P<0.0001,相较于载体组。
表4
表4的结果显示,当培养基中加入本发明PEDF肽(如,29-聚体、24-聚体与20-聚体)时,会有更多细胞分化为软骨细胞(相较于载体组)。相较之下,18-聚体则无法提高BM-MSC分化为软骨细胞的效率。总结来看,这些结果显示本发明PEDF肽可促进间充质干细胞朝向软骨细胞分化。
本公开首度证实短的PEDF合成肽对于骨关节炎所导致的软骨损伤有保护效果。相较于常规的递送表达全长PEDF肽的载体,本发明短、合成PEDF肽在使用上不但较为安全,且成本也相对低廉。
应理解,上述实施方式仅仅是以实施例的方式提供,本领域技术人员可作出各种改动。上述说明书、实施例和数据完整地描述了本发明示例性实施方式的结构和用途。虽然较详尽地或结合一个或多个实施例描述了本发明的各实施方式,但本领域技术人员在不悖离本发明原理与精神的情形下可对所公开的各实施方式作出各种改动。
Claims (9)
1.合成肽在制备治疗个体骨关节炎用的药物中的用途,其中,所述合成肽由长20-39个氨基酸残基的氨基酸序列组成,其中,所述氨基酸序列包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ IDNO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9组成的组中的至少一个序列。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述个体是人。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述合成肽被配制成药物组合物,所述药物组合物含有:
有效量的所述合成肽;和
药学上可接受的赋形剂。
4.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述个体是人。
5.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述药物组合物还含有糖胺聚糖。
6.如权利要求5所述的用途,其特征在于,所述糖胺聚糖是透明质酸或透明质酸钠。
7.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述药物组合物为溶液、泡沫、面霜、软膏、凝胶或敷料的形式。
8.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述药物组合物为喷剂或洗剂的形式。
9.如权利要求3所述的用途,其特征在于,所述药物组合物为气雾剂的形式。
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