KR101770252B1

KR101770252B1 - 골관절염을 치료하기 위해 사용되는 pedf-유도 폴리펩티드의 용도

Info

Publication number: KR101770252B1
Application number: KR1020157009725A
Authority: KR
Inventors: 예우-핑 챠오; 쭝-츄안 호
Original assignee: 맥케이 메모리얼 호스피탈
Priority date: 2012-09-20
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2017-08-22
Also published as: US20150239942A1; EP2897974A4; EA201590601A1; CN104903344A; CN104903344B; KR20150058365A; EA030022B1; AU2012390210B2; WO2014043871A1; EP2897974A1; AU2012390210A1; US9777048B2; JP6208763B2; JP2015530392A; IL237835B; EP2897974B1; IL237835A0

Abstract

본원에는 20 내지 39개의 아미노산 잔기를 가지는 아미노산 서열을 가지는 합성 펩티드가 개시된다. 합성 펩티드는 SEQ ID NO:1에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 가지며, SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 30에 대해 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 적어도 20개의 연속적인 잔기를 포함한다. 또한 본원에는 그 합성 펩티드를 함유하는 약학적 조성물 및 그것의 용도가 개시된다. 본 발명의 다양한 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 대상의 골관절염을 치료하는 데 유용하다.

Description

골관절염을 치료하기 위해 사용되는 PEDF-유도 폴리펩티드의 용도{USE OF PEDF-DERIVED POLYPEPTIDES FOR TREATING OSTEOARTHRITIS}

본 발명은 골관절염의 치료에 관한 것이다. 특히 개시된 발명은 골관절염을 치료하기 위해 사용되는 PEDF-유도 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.

골관절염은 퇴행성 관절 질병으로, 그것은 주로 관절을 형성하기 위해 만나는 곳인 뼈의 단부를 덮고 있는 미끄러운 조직인 연골에 영향을 미친다. 건강한 연골은 뼈들이 서로 미끄러지는 것을 허용하고 신체 움직임의 충격으로부터 에너지를 흡수한다. 골관절염에서는 연골의 표면층이 깨지고 마모되므로, 손상된 연골 아래의 뼈들이 함께 문질러지게 되어 관절의 통증, 부기 및 운동 상실을 유발한다. 골관절염은 노화와 관련되며 무릎, 힙, 손가락 및 하부 척추 영역을 포함하여, 여러 해를 통해 지속적으로 압박을 받는 관절에 주로 영향을 미칠 것이다.

골관절염은 훨씬 더 가장 흔한 유형의 관절염이다. 2008년 현재, 25세 이상의 미국인 중 2천 7백만명이 골관절염에 걸린 것으로 추정된다. 전 세계적으로는 60세 이상의 남성 9.6%와 여성 18.0%가 골관절염의 증상을 나타내는 것으로 추정된다. 세계 보건 기구(WHO) 조사는 골관절염에 걸린 사람들 중 80%가 운동에 한계를 느끼고, 25%는 그들의 삶의 주요한 일상의 활동을 수행할 수 없는 것을 나타낸다.

골관절염에 대한 치료제는 없다. 현재 질병 관리는 관절 통증 및 강직을 제어하는 것과 매일의 활동을 수행하는 환자의 능력을 보존하는 것에 초점을 맞춘다. 물리치료법이 자주 권장되는데, 그것이 근육과 뼈를 강화하는 것을 돕고, 근육의 유연성을 증가시키며, 그로써 통증을 줄일 수 있기 때문이다. 골관절염에 대한 약물요법은 대부분 통증 완화에 주력한다. 진통제와 국소 통증 완화제가 불편함에 대항하지만, 염증에는 대항하지 못한다. 경구용 및 주사용 코르티코스테로이드는 염증을 조절하지만, 자주 또는 장기간 사용에 대해서는 권장되지 않는다. 비-스테로이드성 항염증 약물(NSAID)이 통증, 부기 및 염증을 줄이기 위해 처방되지만; 그것들은 위장 장애 및 궤양을 유발할 수 있을뿐 아니라 어떤 사람들에게서는 심장마비의 위험도 증가시킨다. 관절경 검사 과정으로부터 종합적인 관절성형술에 이르기까지 수술은 극도로 손상된 관절에 대한 선택일 수 있다.

전술한 관점에서, 골관절염을 효과적으로 치료하는 수단에 대한 요구가 해당 기술분야에 여전히 존재한다.

발명의 요약

다음은 독자에게 기본적인 이해를 제공하기 위해 발명의 간단한 개요를 제시한다. 이 개요는 발명의 광범위한 개관이 아니며 본 발명의 핵심/중요한 요소들을 확인하거나 본 발명의 범주를 묘사하지 않는다. 그것의 유일한 목적은 본원에 개시된 몇 가지 개념을 나중에 제시되는 보다 상세한 설명에 대한 전주로서 간단한 형태로 제시하는 것이다.

본 발명은 적어도, 색소 상피-유도 인자(PEDF)로부터 유도된 합성 펩티드가 연골세포 증식을 자극하고, 연골의 재생을 촉진하며, 간엽 줄기세포의 연골형성을 유도할 수 있고, 그러므로 그것이 대상의 골관절염을 치료하는 데 효과적이라는 발견을 토대로 한다. 그러므로 본 발명의 PEDF-유도 합성 펩티드는 골관절염을 치료하기 위한 의약으로서 유용하다.

따라서, 한 측면으로 본 발명은 대상의 골관절염을 치료하기 위한 합성 펩티드의 용도에 관련된다.

본 발명의 구체예들에 따르면, 합성 펩티드는 길이가 20 내지 39 아미노산 잔기이고, SEQ ID NO:1에 대해 적어도 80% 동일한 아미노산 서열을 가진다. 또한 아미노산 서열은 적어도 20개의 연속적인 잔기를 포함하고, 그것은 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 30에 대해 적어도 90% 동일하여, 합성 펩티드는 대상의 골관절염을 치료하는 데 유용하다.

본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드의 적어도 4개의 연속적인 잔기는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 14에 동일하다. 그런 합성 펩티드의 비-제한적인 실례는 각각 SEQ ID NO:1(39-량체), SEQ ID NO:2(34-량체), SEQ ID NO:3(29-량체), SEQ ID NO:5(24-량체), SEQ ID NO:6(20-량체), SEQ ID NO:8(MO 29-량체) 및 SEQ ID NO:9(MO 20-량체)의 아미노산 서열을 가지는 것들을 포함한다. 본 발명의 어떤 구체예에서, 합성 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:3(29-량체), SEQ ID NO:5(24-량체) 또는 SEQ ID NO:6(20-량체)이다.

본 발명의 다양한 구체예에 따르면, 대상은 인간을 포함하여, 포유류로서 분류되는 어떠한 동물일 수 있다.

다른 측면으로, 본 발명은 대상의 골관절염을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관련된다. 대상은 인간을 포함하여, 포유류로서 분류되는 어떠한 동물일 수 있다.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 약학적 조성물은 상기 언급된 측면/구체예 중 어느 것에 따르는 합성 펩티드를 포함하고, 그 합성 펩티드는 대상의 골관절염을 치료하기에 충분히 효과적인 양으로 존재한다. 약학적 조성물은 또한 그 합성 펩티드에 대해 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.

임의의 특정 구체예에서, 약학적 조성물은 글리코사미노글리칸, 예컨대 히알루론산 또는 히알루론산 나트륨을 더 포함한다.

본 발명의 다양한 구체예에서, 약학적 조성물은 주사가능한 단위용량 형태로 제형될 수 있다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 골관절염에 걸린 적어도 하나의 병변을 가지는 대상의 골관절염을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 그 대상은 인간을 포함하여, 포유류로서 분류되는 어떠한 동물일 수 있다.

한 구체예에서, 방법은 상기 언급된 측면/구체예 중 어느 것을 따르는 합성 펩티드의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 특히 합성 펩티드는 그 합성 펩티드가 골관절염을 치료하기 위해 대상의 윤활 공간에 도달할 수 있을 방식으로 투여된다.

임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 본 발명의 상기 언급된 측면/구체예들을 따르는 약학적 조성물로 제형된다.

임의의 어떤 구체예에서, 합성 펩티드 또는 약학적 조성물은 대상의 윤활 공간에 관절-내로 주사된다.

본 발명의 많은 부수적인 특징 및 장점들은 첨부되는 도면과 함께 고려되는 다음의 상세한 설명을 참조로 더 잘 이해될 것이다.

본 특허 또는 출원 파일은 칼라로 그려진 적어도 하나의 도면을 포함한다. 칼라 도면이 포함된 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 필요한 비용이 요구되고 지불될 때 관청에 제공될 것이다.
본 설명은 첨부되는 도면에 비추어 다음의 상세한 설명을 판독하면 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 한 작업 실시예에 따르는 무릎 관절 시편의 대표적인 H&E 염색된 단면을 제시한다(F: 대퇴골과; T: 경골과; M: 반월상 연골).
도 2는 도 1의 작업 실시예로부터의 무릎 관절 조직 단면의 대표적인 현미경 영상을 제시한다(원래의 배율, X400).
도 3은 본 발명의 다른 작업 실시예에 따르는 무릎 관절 시편의 대표적인 면역염색된 영상을 제시한다(원래의 배율, X1000).
도 4A는 본 발명의 또 다른 작업 실시예에 따르는, 관절의 연골-유도된 콜로니의 형태 및 그것의 정체성을 나타내기 위한 그 콜로니의 면역염색된 영상을 예시하는 대표적인 영상을 제시하고,
도 4B는 도 4A의 작업 실시예에 따르는 쥐 관절 연골로부터의 세포들의 대표적인 면역염색된 영상을 제시한다(원래의 배율, X1000).

정의

첨부된 도면과 관련하여 아래에 제공되는 상세한 설명은 본 발명의 실시예의 설명으로서 의도되며 본 발명의 실시예가 구성되거나 활용될 수 있는 유일한 형태를 나타내기 위해 의도된 것은 아니다. 설명은 실시예의 기능 및 그 실시예를 구성하고 작동시키기 위한 단계들의 순서를 나타낸다. 그러나, 동일하거나 동등한 기능 및 순서는 상이한 실시예들에 의해서도 이루어질 수 있다.

편리를 위해, 전체 출원(명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위를 포함함)에 사용된 특정 용어들을 여기에 모았다. 본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본 발명에 사용된 과학적이고 기술적인 용어들은 관련된 기술분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이해되고 사용되는 의미를 가져야 한다. 맥락에 의해 다르게 요구되지 않는 한, 단일한 용어는 동일한 다수 형태를 포함하고 복수의 용어는 단일 형태를 포함하는 것으로 인지될 것이다. 구체적으로, 본원 및 청구범위에서 사용되는 것과 같이, 단일한 형태를 나타내는 것은 맥락이 분명하게 다른 것을 가리키지 않는 한 다수의 참조를 포함한다.

본 발명의 광범위한 범주를 기술하는 숫자상의 범위와 매개변수들은 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에서 기술된 수치는 가능한 한 정확하게 기록된다. 그러나, 어떠한 수치든지 각각의 시험 측정에서 발견된 표준 편차로부터 필수적으로 발생하는 특정 오차를 고유하게 함유한다. 또한 본원에서 사용된 것과 같은 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1% 또는 0.5% 내에 있는 것을 의미한다. 다르게는, 용어 "약"은 해당 기술분야의 숙련자에 의해 고려될 때 평균의 허용되는 표준 오차 내에 있는 것을 의미한다. 작동/작업 실시예 이외에, 또는 다르게 명시되지 않는 한, 모든 수치 범위, 양, 값 및 백분율, 예컨대 본원에 개시된 재료의 양, 시간의 기간, 온도, 작동 조건, 양의 비율 등은 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 표시되지 않는 한, 본 발명 및 첨부된 청구범위에 기술된 숫자 매개변수는 필요에 따라 달라질 수 있는 근사치이다. 최소한 각각의 숫자 매개변수는 적어도 보고된 많은 중요한 숫자의 관점에서 및 통상적인 라운딩 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다.

본원에서 사용된 것과 같이, 용어 "펩티드"는 아미노산 잔기들의 중합체를 나타낸다. 용어 "합성 펩티드"는 본원에서 사용된 것과 같이, 전체가 자연적으로 발생하는 단백질 분자를 포함하지 않는 펩티드를 의미한다. 펩티드는 그것이 화학적 합성, 재조합 유전자 기법 또는 전체 단백질의 단편화 등과 같은 기법을 사용하여 인간 개입에 의해 제조될 수 있다는 점에서 "합성"이다. 본 발명을 통틀어, 펩티드 내의 어떠한 명시된 아미노산 잔기의 위치는 펩티드의 N 말단으로부터 시작하여 넘버링된다.

본원에서 사용된 것과 같이, "증식하는" 및 "증식"은 세포 분할에 의해 집단의 세포의 수를 증가시키는 것을 나타낸다.

본원에서 확인된 합성 폴리펩티드 서열과 관련하여 "백분율(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 일렬 배열하고, 필요하다면 최대 % 서열 동일성을 이루기 위하여 갭을 도입한 후에 특정 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의되고, 서열 동일성의 일부로서 어떠한 보존성 치환을 고려하지 않는다. 백분율 서열 동일성을 측정하는 목적을 위한 배열은 해당 기술분야의 숙련도 내에 있는 다양한 방법으로, 예를 들면 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 활용할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 이루어질 수 있다. 해당 기술분야의 숙련자들은 배열을 측정하기 위한 적절한 매개변수, 이를테면 비교하고자 하는 서열의 전체 길이에 대해 최대 배열을 이루기 위해 필요한 어떠한 알고리즘을 측정할 수 있다. 본원의 목적에 대해 두 개의 아미노산 서열 사이의 서열 비교는 Nation Center for Biotechnology Information(NCBI)에 의해 온라인으로 제공되는 컴퓨터 프로그램 Blastp(단백질-단백질 BLAST)에 의하여 수행될 수 있다. 주어진 아미노산 서열 A의 주어진 아미노산 서열 B에 대한 백분율 아미노산 서열 동일성(다르게 표현하면 주어진 아미노산 서열 B에 대해 특정 %의 아미노산 서열 동일성을 가지는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현할 수 있다)은 다음과 같은 식에 의해 계산되고:

상기 식에서, X는 서열 배열 프로그램 BLAST에 의해 A와 B의 그 프로그램의 배열에서 동일한 매치로서 기록된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 어느 것이 더 짧든지간에 A 또는 B의 총 아미노산 잔기의 수이다.

본원에서 용어 "치료" 및 "치료하는"은 원하는 약학적 및/또는 생리적 효과를 초래하는 방지성(예컨대 예방적), 치유적 또는 완화적 치료를 포함하는 것으로 사용된다. 바람직하게는 그 효과는 골관절염을 부분적으로 또는 완전하게 치유하는 관점에서 치료적이다. 특히, 용어 "치료하는"은 의학적 질환, 질환의 증상, 그 질환에 이차적인 질병 또는 장애, 또는 그 질환에 대한 경향성을 가지고 있는 대상에게, 특별한 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 또는 그것보다 많은 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전하게 경감, 개선, 완화, 개시의 지연, 진전의 억제, 심각성의 감소 및/또는 발생의 감소를 목적으로, 물리적 및/또는 화학적 개입을 적용 또는 투여하는 것을 말한다. 치료는 질병, 장애 및/또는 질환과 관련된 병리학의 발생 위험을 감소시킬 목적에 대해 질병, 장애 및/또는 질환의 징후를 나타내지 않는 대상 또는 단지 질병, 장애 및/또는 질환의 초기 징후만을 나타내는 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명의 원리 및 사상에 따르면, 상기 질병, 장애 또는 질환은 골관절염이다. 치료는 일반적으로 만약 하나 또는 더 많은 증상 또는 임상적 마커가 그 용어가 본원에서 정의된 것과 같이 감소된다면 "효과적"이다.

본원에서 사용된 용어 "유효량"은 원하는 반응을 생성하기에 충분한 성분의 양을 말한다. 구체적인 유효량은 치료되는 특별한 질환, 환자의 신체적 상태(예컨대 환자의 체중, 연령 또는 성별), 치료되는 포유류 또는 동물의 유형, 치료 기간, 공존하는 치료법(만약 있다면)의 본질 및 사용되는 특이한 제형과 같은 인자들에 따라 달라질 것이다. 유효량은 또한 화합물 또는 조성물의 어떠한 독성 또는 유해한 효과보다 치료적으로 유익한 효과가 훨씬 더 크다.

용어 "적용" 또는 "투여"는 본원에서 본 발명의 합성 펩티드 또는 약학적 조성물을 골관절염을 치료하기 위하여 대상에게 제공하는 수단을 나타내기 위해 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 다양한 구체예에 따르면, 관절-내 주사가 바람직한 투여 경로이다. 예를 들어 본 발명의 합성 펩티드 또는 약학적 조성물은 연골 재생을 촉진하기 위해 대상의 윤활 공간으로 관절-내 주사되고, 그로써 골관절염이 치료된다.

본원에서 사용된 것과 같은 용어 "부형제"는 본 발명의 합성 PEDF 펩티드(들)에 대한 비히클/담체를 형성하는 어떠한 비활성 물질(예컨대 분말 또는 액체)을 의미한다. 부형제는 보통 안전하고 비-독성이며, 넓은 의미로는, 또한 약학적 조성물을 제조하기에 유용한 약학 산업분야에서 공지되어 있는 어떠한 물질, 예를 들면 충전제, 희석제, 점착제, 결합제, 윤활제, 연화제, 안정화제, 착색제, 습윤제, 붕괴제 등을 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 것과 같이, "약학적으로 허용되는" 성분은 타당한 유익/위험률과 비례하는 지나친 유해한 부작용(예컨대 독성, 염증 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 동물과 사용하기에 적당한 것이다. 또한 각각의 부형제는 약학적 제형의 다른 성분들과 부합한다는 의미에서 "허용되는" 것이어야 한다. 담체는 고체, 반고체 또는 액체 희석제, 크림 또는 캡슐의 형태일 수 있다.

용어 "대상"은 본 발명의 합성 펩티드, 조성물 및/또는 방법으로 치료가능한 인간 종을 포함한 포유류를 말한다. 용어 "대상"은 한 가지 성이 구체적으로 표시되지 않는 한 남성과 여성 둘 다를 말하는 것으로 의도된다.

색소 상피-유도 인자(PEDF)는 혈관형성 억제, 종양 형성 억제 및 신경영양성 기능을 가지는 다중기능성 분비된 단백질이다. 인간 PEDF 단백질(SEQ ID NO:11)은 대략 50 kDa의 크기와 길이가 418 아미노산인 분비된 단백질이다. PEDF의 34-량체 단편(잔기 44 내지 77) 및 44-량체 단편(잔기 78 내지 121; SEQ ID NO:10)은 각각 혈관형성 억제 및 신경영양성 특성을 가지는 것으로 확인되었다.

본 발명은 적어도, 44-량체 PEDF로부터 유도된 합성 펩티드가 다양한 메커니즘을 통해 연골 재생을 촉진할 수 있다는 발견을 토대로 한다. 본 발명의 실시예는 본 발명의 합성 펩티드가 연골세포의 증식을 증가시키고, 간엽 줄기세포의 연골형성을 유도할 수 있는 것을 증명한다. 본 발명의 다른 진보적 특징은 합성 펩티드가 전체 길이의 PEDF보다 훨씬 더 짧고(최대 39 아미노산 잔기), 그로써 종래의 단백질 약물의 임상적 사용과 관련된 한계점들, 이를테면 높은 제조 비용, 낮은 생체 내 활용성 및 불량한 약물역학을 극복한다는 데 있다. 따라서, 본 발명의 합성 펩티드는 골관절염을 치료하기에 유용하다.

그러므로, 한 측면으로, 본 발명은 대상의 골관절염을 치료하기 위한 합성 펩티드의 용도에 관련된다.

본 발명의 구체예들에 따르면, 합성 펩티드는 20 내지 39 아미노산 잔기의 길이를 가지고, LSVATALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT(SEQ ID NO:1)의 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 예를 들어 합성 펩티드는 SEQ ID NO:1과 약 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다. 또한, 합성 펩티드는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 30에 대해 적어도 90% 동일한 적어도 20개의 연속적인 잔기를 포함한다. 구체적으로, 20개의 연속적인 아미노산 잔기는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 30과 약 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100%의 아미노산 서열 동일성을 가질 수 있다.

한 구체예에서, 합성 펩티드는 SEQ ID NO:1의 서열을 가지며, 그것은 39 아미노산의 길이를 가진다. 이 합성 펩티드는 이하의 설명에서 39-량체로서 언급된다. 이 39-량체 펩티드는 인간 PEDF의 잔기 83 내지 121에 해당하고, 따라서 공지의 PEDF 44-량체(PEDF의 잔기 78 내지 121에 해당함)로부터 유도된 짧은 변이체이다.

본 발명자들에 의해 수행된 선행 실험들, 예컨대 공동 계류중인 출원 US 13/428,996(그것의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다)에서 개시된 것들 및 아래에 제공된 실험은 39-량체로부터 유도된 여러 개의 짧은 합성 PEDF 펩티드가 대상의 골관절염을 치료할 수 있음을 드러낸다.

예를 들어, 선행 출원 및 본 출원 둘 다에 개시된 실험을 토대로, ALSALSLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT(SEQ ID NO:2)의 서열을 가지는 34-량체 합성 펩티드는 대상의 골관절염을 치료하는 데 효과적이다. 이 34-량체 펩티드는 인간 PEDF의 잔기 88 내지 121에 해당한다. 상기에서 제공된 어떠한 2개의 주어진 서열 사이의 서열 동일성의 백분율을 추정하기 위한 방법에 따르면, 34-량체는 39-량체에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 34-량체의 6번째 내지 25번째 아미노산 잔기는 39-량체의 아미노산 잔기 11 내지 30에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.

추가로, 이하의 다양한 실례에 따르면, SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT(SEQ ID NO:3)의 서열을 가지는 29-량체 합성 펩티드는 대상의 골관절염을 치료하는 데 효과적인 것으로 확인되었다. 이 29-량체 펩티드는 39-량체에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 인간 PEDF의 잔기 93 내지 121에 해당한다. 또한, 29-량체의 첫 번째부터 20번째의 아미노산 잔기는 39-량체의 아미노산 잔기 11 내지 30에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.

어떤 실례에서, 24-량체는 대상의 골관절염을 치료하는 데 효과적인 것으로 확인되었다. 24-량체는 SLGAEQRTESIIHRALYYDLISSP(SEQ ID NO:5)의 서열을 가지고, 그것은 인간 PEDF의 잔기 93 내지 116에 해당한다. 이 24-량체 펩티드는 그것의 처음 20개의 아미노산 잔기가 39-량체의 아미노산 잔기 11 내지 30에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 39-량체에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.

다른 실례에서, 20-량체는 대상의 골관절염을 치료할 수 있는 것으로 수립되었다. 20-량체는 SLGAEQRTESIIHRALYYDL(SEQ ID NO:6)의 서열을 가지고, 그것은 인간 PEDF의 잔기 93 내지 112에 해당한다. 이 20-량체 펩티드는 39-량체의 아미노산 잔기 11 내지 30에 대해 완전히 동일하고(100%의 아미노산 서열 동일성), 39-량체에 대해 100%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.

마우스 PEDF로부터 유도된 2개의 합성 펩티드는 또한 선행 출원 및 본 출원 둘 다에서 개시된 실험들을 토대로, 대상의 골관절염을 치료할 수 있다. 본 발명에서 첫 번째 마우스-유도된 펩티드는 "Mo 29-량체"로서 언급된다. Mo 29-량체는 SLGAEHRTESVIHRALYYDLITNPDIHST(SEQ ID NO:8)의 서열을 가지며, 그것은 39-량체에 대해 83%의 아미노산 서열 동일성을 가지고, 그것의 처음 20개의 아미노산 잔기는 39-량체의 11 내지 30 아미노산 잔기에 대해 90%의 아미노산 서열 동일성을 가진다. 다른 마우스-유도된 펩티드, Mo 20-량체는 SLGAEHRTESVIHRALYYDL(SEQ ID NO:9)의 서열을 가진다. Mo 20-량체는 39-량체 또는 39-량체의 11 내지 30 아미노산 잔기 중 어느 하나에 대해 90%의 아미노산 서열 동일성을 가진다.

임의로, 합성 펩티드는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 14에 대해 동일한 4개의 연속적인 잔기를 포함한다. SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 14(즉 SLGA)는 짧은 PEDF 펩티드의 생물학적 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 예를 들어 아래에 제공되는 다양한 실례에 따르면, SLGA 잔기가 없는 18-량체 펩티드(EQRTESIIHRALYYDLIS; SEQ ID NO:7)는 대상의 골관절염에 대해 어떠한 보호도 이끌어내지 못한다. 또한 선행 출원 및 본 출원 둘 다에서 개시된 실험들을 토대로, SLGA가 없는 25-량체 펩티드(EQRTESIIHRALYYDLISSPDIHGT; SEQ ID NO:4)는 대상의 골관절염을 치료하는데 효과적이지 못하다.

본 발명의 합성 펩티드는 알파 아미노기의 t-BOC 또는 FMOC 보호와 같은 통상적으로 사용되는 방법에 의해 합성될 수 있다. 두 가지 방법 모두 단계식 합성을 포함함으로써 단일 아미노산이 펩티드의 C 말단으로부터 시작하여 각 단계에 첨가된다. 본 발명의 펩티드는 또한 잘 알려져 있는 고상 펩티드 합성법에 의해 합성될 수 있다.

39-량체에 관련하여 보존성 변이를 가지는 다른 합성 펩티드도 또한 고려된다. 본원에서 사용된 것과 같은 용어 "보존성 변이"는 또 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의해 한 아미노산 잔기가 대체되는 것을 나타낸다. 보존성 변이의 실례로는 이소로이신, 발린, 로이신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기가 서로 치환되는 것, 또는 한 극성 잔기가 다른 극성 잔기로 치환되는 것, 예를 들면 아르기닌의 라이신에 대한 치환, 글루탐산의 아스파트산에 대한 치환 또는 글루타민의 아스파라긴에 대한 치환 등을 포함한다. 용어 "보존성 변이"는 또한 치환된 폴리펩티드에 대해 발생된 항체가 또한 미치환 폴리펩티드와 면역학적으로 반응한다면, 원래의 미치환 아미노산 대신 치환된 아미노산이 사용되는 것을 포함한다.

본 발명의 다양한 구체예에 따르면, 대상은 인간을 포함하여 포유류로서 분류되는 어떠한 동물일 수 있다.

상기 언급된 구체예에 따르는 합성 펩티드는 대상의 골관절염을 치료하기 위한 약학적 조성물로 제형될 수 있는데, 그것은 본 발명의 다른 측면에 속한다.

본 발명의 한 구체예에 따르면, 약학적 조성물은 상기 언급된 측면/구체예 중 하나에 따르는 합성 펩티드를 포함하고, 그 합성 펩티드는 대상의 골관절염을 치료하기에 충분한 유효량으로 존재한다. 약학적 조성물은 또한 합성 펩티드에 대해 약학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다.

본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 약 1 내지 1,000μM, 바람직하게는 약 10 내지 500μM, 보다 바람직하게는 약 25 내지 250μM의 양으로 약학적 조성물 중에 존재한다. 예를 들어 합성 펩티드의 농도는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1,000μM일 수 있다. 구체적으로, 쥐(약 310그램의 체중)에 대해 하기 작업 실시예에 사용된 농도는 약 200μM이다. 통상적인 지식을 가진 사람들은 본원에 제공된 동물 용량을 토대로 본 발명의 합성 펩티드 또는 약학적 조성물에 대한 인간 동등량(HEQ)을 계산할 수 있을 것이다. 예를 들어, 미국 식품의약국(FDA)은 "Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers"란 제목의 산업분야에 대한 안내서를 발표하였다.

약학적 조성물은 허용되는 약학적 과정, 예컨대 문헌에 기술된 것과 같은(Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, ed. Alfonoso R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa (1985)) 과정을 따라 제조된다.

합성 펩티드와 함께 사용될 약학적으로 허용되는 부형제의 선택은 기본적으로 약학적 조성물이 투여될 방식에 의해 결정된다.

본 발명의 임의의 한 구체예에 따르면, 약학적 조성물은 관절-내 주사를 통해 국소적으로 투여될 수 있다. 이 경우에, 합성 펩티드는 멸균 수용액과 같은 약학적으로 허용되는 부혀제와 함께 제형될 수 있고, 그것은 바람직하게는 수용체의 체액과 등장성이다. 그런 제형은 고체 활성 성분을 생리적으로 부합하는 물질, 예컨대 염화나트륨, 글리신 등을 함유하고, 수용액을 만들기 위한 생리적 조건에 부합하는 완충된 pH를 가지는 물에 녹이거나 현탁시키고, 상기 용액을 멸균성으로 만듦으로써 제조될 수 있다. 멸균 주사용 용액 또는 현탁액을 제조하기에 적당한 다른 희석제 또는 용매로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 1,3-부탄디올, 만니톨, 물 및 링거액을 포함한다. 지방산, 예컨대 올레산 및 그것의 글리세라이드 유도체 또한 올리브유 또는 캐스터유와 같은 천연 약학적으로 허용되는 오일과 같은 주사용 오일을 제조하기에 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 알코올 희석제 또는 카복시메틸 셀룰로스 또는 유사한 분산제를 함유할 수 있다. 통상적으로 사용되는 다른 계면활성제, 예컨대 Tween 또는 Span 또는 약학적으로 허용되는 단위용량 형태를 제조하는 데 통상적으로 사용되는 다른 유사한 유화제 또는 생체 내 활성 증강제가 또한 제형의 목적에 대해 사용될 수 있다.

본 발명의 임의의 구체예에 따르면, 약학적 조성물은 글리코사미노글리칸을 추가로 포함할 수 있다. 글리코사미노글리칸은 카복실기와 하나 또는 그 이상의 설페이트를 가지는 반복되는 2당 유닛으로 구성된 선형 다당이다. 글리코사미노글리칸은 뼈 세포외 기질의 주요 성분인 단백질성 글리칸을 형성하기 위해 코어 단백질에 부착된다. 골관절염에 걸린 연골에서는, 기질의 글리코사미노글리칸의 양이 감소되며, 글리코사미노글리칸과 타입 II 콜라겐 사이의 결합도 감소하고, 그것은 병변에 추가의 손상을 초래할 수 있다. 그러므로 외인성 글리코사미노글리칸을 병변에 제공하는 것이 골관절염의 치료를 촉진할 수 있다. 글리코사미노글리칸의 실례로는 그것에 한정되는 것은 아니지만, 히알루론산 및 히알루론산 나트륨을 포함한다. 하나의 비-제한적인 실례로서, 본 발명의 약학적 조성물은 1 내지 15%(중량%)의 히알루론산을 포함할 수 있다.

또 임의로, 본 발명의 약학적 조성물은 또한 해당 기술분야에 잘 알려져 있는 다양한 약학적으로 허용되는 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 첨가제로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 건조제, 가려움 억제제, 발포 억제제, 완충제, 중화제, pH 조정제, 착색제, 탈색제, 진정제, 유화제, 에멀션 안정화제, 점도 증강제, 보습제, 취기제, 보존제, 항산화제, 화학 안정제, 농축제, 경화제 또는 현탁제를 포함한다.

또 다른 측면으로, 본 발명은 대상의 골관절염을 치료하기 위한 방법에 관련된다. 대상은 인간을 포함하여 포유류로서 뷴류된 어떠한 동물일 수 있다. 본 발명의 원리 및 사상에 따르면, 방법은 연골 재생을 촉진하고, 그것은 계속해서 대상의 골관절염을 개선 또는 치유한다.

한 구체예에서, 방법은 상기 언급된 측면/구체예 중 어느 것을 따르는 합성 펩티드의 유효량을 대상에게 투여하고, 그로써 그 합성 펩티드가 병변 가까이의 윤활 공간에 도달하는 것을 포함한다.

임의의 구체예에 따르면, 합성 펩티드는 본 발명의 상기 언급된 측면/구체예에 따르는 약학적 조성물로 제형된다.

어떤 임의의 구체예에서, 합성 펩티드 또는 약학적 조성물은 윤활 공간으로 관절-내 주사된다.

다음 실시예는 본 발명의 특정 측면을 설명하고 해당 기술분야의 숙련자들이 본 발명을 실시하는 것을 돕기 위해 제공된다. 이들 실시예는 결코 어떤 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않는다. 추가로 더 자세하게 설명하지 않아도, 해당 기술분야의 숙련자는 본원의 설명을 토대로, 본 발명을 충분한 정도로 활용할 수 있을 것으로 여겨진다. 본원에서 인용된 모든 공보는 참고로 그것의 전체 내용이 포함된다.

실시예

재료 및 방법

재료

둘베코 변형 이글스 배지(DMEM), 우태아 혈청(FBS), 0.25%의 트립신, 항생물질, TRIzol 및 Dynabeads를 Invitrogen(Carlsbad, CA)으로부터 구매하였다. 히알루론산(HA), 모노-요오도아세테이트(MIA), 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 피브로넥틴, 퍼콜, 인슐린, 하이드로코르티손, 우혈청 알부민(BSA), 5-브로모-2'-데옥시우리딘(BrdU), Hoechst 33258 염료는 모두 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO) 제품이었다. 항-BrdU, 항-아그레칸 및 항-타입 2 콜라겐 항체를 GeneTex(Taipei, Taiwan)로부터 구하였다. 모든 형광 염료-포합된 이차 항체를 BioLegend(San Diego, CA)로부터 구매하였다. 프로나제 및 콜라게나제를 Roche(Indianapolis, IN)로부터 얻었다. 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염료를 Merck(Rayway, NJ, USA)로부터 구입하였다.

29-량체(SEQ ID NO:3), 24-량체(SEQ ID NO:5), 20-량체(SEQ ID NO:6) 및 18-량체(SEQ ID NO:7)를 포함한 합성 PEDF 펩티드를 합성하였고, NH₂ 말단에서의 아세틸화 및 COOH 말단에서의 아미드화에 의해 변형시켰다. 변형된 펩티드를 이어서 질량 분광학에 의해 특성확인하였다(>95% 순도)(GenScript(Piscataway, NJ)). 각각의 PEDF-유도 짧은 합성 펩티드(29-량체, 24-량체 또는 20-량체; 이하 PEDF 펩티드)를 DMSO에 스톡(5mM)으로서 재구성하여 나중에 사용하기 위해 -20℃에 보관하였다.

동물

본 발명의 작업 실시예에 사용된 모든 동물을 온도 제어(24 내지 25℃) 및 12:12 명-암 주기 하에 동물 방에 가두어 두었다. 표준 실험실 음식과 수돗물을 마음대로 먹을 수 있게 하였다. 실험 과정은 맥케이 메모리얼 호스피탈 리뷰 보드(New Taipei City, Taiwan, R.O.C.)에 의해 승인받았고, 대만 동물 복지 규정에 따라 수행하였다.

골관절염의 동물 모델을 MIA의 관절-내 주사에 의해 수립하였다. 구체적으로, 생후 약 10주의 수컷 Sprague-Dawley 쥐(초기 체중 = 312±11g)를 자일라진(10mg/kg)의 복강 내 주사에 의해 마취시키고, 이어서 MIA(25㎕의 멸균 식염수 중에 1mg의 MIA)를 오른쪽 무릎에 1회 관절-내 주사하였다. 특히, 다리를 무릎에서 90°각도로 구부려서 27G 바늘을 사용하여 무릎인대를 통해 MIA 용액을 주사하였다.

생체 내 세포 증식의 검출을 위해, BrdU를 DMSO에 스톡(80mM)으로서 재구성하였다. 350㎕의 PBS와 혼합된 150㎕의 BrdU를 쥐에 복강 내 주사하고, 16시간 후에 안락사시켰다. 그런 다음 DNA 합성을 아래에서 설명되는 과정을 따라 항-BrdU 항체로의 BrdU 표지화에 의해 평가하였다.

관절의 관절 세포의 분리 및 배양

관절의 연골을 성숙한 8-주령 수컷 Sprague-Dawley 쥐의 대퇴골과로부터(앞, 뒤 및 측부) 수득하였다. 샘플 채취 중에 활막으로 오염되는 것을 피하고 뼈 구조를 파괴하기 위하여 주의를 기울였다. 절개된 조직을 작은(약 0.5mm³) 조각으로 자르고, 프로나제(70U/ml, 37℃에서 1시간)와 콜라게나제(300U/ml, 37℃에서 3시간)로 차례로 소화시켰다. 소화 후에, 콜라게나제를 멸균 인산염-완충된 식염수(PBS)로 1회 세척함으로써 제거하고, 이어서 2% FBS가 첨가된 DMEM으로 2회 더 세척하였다. 일차 배양을 위해, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 10% FBS-DMEM의 6-웰의 웰당 6000개의 트립판 블루-네거티브 세포를 10㎍/ml 피브로넥틴-코팅된 커버슬립 위에 플레이팅하였다. 다음날, 배지를 50nM의 PEDF 펩티드가 첨가되거나 첨가되지 않은 표준 팽창 배지(10%의 FBS-DMEM, 0.1mM의 아스코브산, 0.5mg/ml의 L-글루코스, 100mM의 HEPEPS, 1mM의 피루브산 나트륨, 2mM의 L-글루타민 및 항생물질로 이루어짐)로 바꾸었다. 배지를 12일 동안 매 3일마다 교체하였다.

간엽 줄기 세포의 분리 및 배양

성숙한 생후 8주의 Sprague-Dawley 쥐를 자일라진(10mg/kg)의 복강 내 주사로 마취시켰다. 대퇴골을 무균하에 수득하고, PBS와 항생물질의 혼합물에서 5분 동안 세척한 후, 모든 연조직을 해부하고, 그것의 골단에서 가로로 절개한 다음, 그것의 골수강을 헤파린과 DMEM의 혼합물로 반복적으로 세정하였다. 수득한 세포를 1000xg에서 10분 동안 원심분리하였다. 세포 펠릿을 DMEM으로 재현탁한 후, 세포 현탁액을 5ml의 퍼콜(1.073 g/ml)을 함유하고 있는 15-ml의 원심분리 튜브에 옮겼다. 1500xg에서 30분 동안 원심분리한 후, 중간 층의 단핵 세포를 분리하고, PBS로 3회 세척한 다음, 10% 열-비활성화 FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 저-글루코스 DMEM에 재현탁하였다. 그런 다음 세포를 95% 공기 및 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였고, 배지를 매 4일마다 교체하였다. 미부착 세포를 버리고 점착 세포는 유지시켰다. 일차 간엽 줄기 세포(MSC)는 1주일 동안 배양된 후에 대략 80% 내지 90%의 집밀도까지 성장하였다.

MSC의 연골원성 분화를 유도하기 위하여, 5×10⁵의 팽창된 MSC를 10ng/ml의TGF-β2(R&D Systems; Minneapolis, MN)가 첨가된 연골원성 배지(100nM의 덱사메타손, 0.17mM의 아스코브산-2 인산염, 10㎍/ml의 인슐린, 5㎍/ml의 트란스페린, 5ng/ml의 셀레늄, 1mM의 피루브산 나트륨, 2mM의 L-글루타민 및 2% FBS가 첨가된 고-글루코스 DMEM)에 노출시켰다. PEDF 처리 그룹에서는 세포를 50nM의 PEDF 펩티드가 첨가되어 있는 연골원성 배지에서 배양하였다. 배지를 1주일 동안 매 격일마다 교체하였다.

조직학

무릎 관절을 절개하고 주변의 연조직을 제거하였다. 시편을 4% 파라폼알데하이드에 고정한 다음 Shandon TBD-2 석회질 제거제(Thermo Scientific; Logan, UT)를 사용하여 석회질을 제거하였다. 그런 다음 관절을 정중 시상으로 절개하고 파라핀 블록에 삽입하였다. 단편들(5㎛의 두께)을 세로로 잘랐다.

사용 전에, 고정된 샘플을 자일렌으로 파라핀을 제거하고, 등급별 시리즈의 에탄올로 재수화하였다. 그런 다음 샘플을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하거나 면역조직화학 조사에 사용하였다. 가장 심각하에 퇴행된 영역을 포함하여 무릎당 20개의 단편을 세심하게 제조하였다.

면역형광 및 BrdU 염색

파라핀-삽입된 관절 시편을 자일렌으로 파라핀을 제거하고 등급별 시리즈의 에탄올로 재수화하였다. 그런 다음 파라핀 제거된 시편을 이어지는 면역형광 연구를 위해 1N HCl에 실온에서 1시간 동안 노출하였다.

면역형관 연구를 위해, 시편을 10%의 염소 혈청과 5%의 BSA로 1시간 동안 차단하였다. 면역염색을 아그레칸에 대한 일차 항체(1:100 희석), 타입 II 콜라겐에 대한 일차 항체(1:100 희석) 및 BrdU에 대한 일차 항체(1:100 희석)를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 시행하고, 이어서 적절한 로다민- 또는 FITC-포합된 당나귀 IgG와 함께 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 핵을 Hoechst 33258로 7분 동안 대비염색함으로써 위치시켰다. 영상을 CCD 카메라가 장착된 Zeiss 에피형광 현미경을 사용하여 포착하였다. 맹검 정량을 3중으로, 각 단편의 20개의 무작위 선택된 필드로부터의 세포를 수동으로 계수함으로써 수행하였다.

RNA 추출 및 역전사 -중합효소 연쇄 반응( RT - PCR )

총 RNA를 TRIzol을 사용하여 세포로부터 추출하고, RNase-유리 DNase I(Qiagen, Santa Clarita, CA)으로 처리하여 게놈 DNA를 제거한 후 RNA 정량 키트(Dynabeads)로 정제하였다. BM-MSC로부터 회수한 1㎍의 총 RNA를 0.25㎍의 무작위 프라이머와 0.8mM의 dNTP를 함유하고 있는 20㎕의 반응 완충액 중에서 42℃에서 1시간 동안 200 유닛의 팽창 역전사효소(Roche, Mannheim, Germany)에 의해 cDNA로 역전사시켰다.

2㎕의 cDNA를 PCR 반응에 대해 주형으로서 사용하였다. PCR을 15㎕의 EconoTaq^® PLUS GREEN 2x Master Mix(Lucigen® Corp.), 1μM의 각각의 프라이머 및 2㎕의 주형 DNA를 함유하고 있는 30㎕의 부피에서 수행하였다. cDNA를 18 내지 22 주기의 증폭 반응(변성, 20초, 94℃; 아닐링, 30초, 57℃; 및 중합반응, 40초, 72℃)으로 합성하였다. 프라이머 세트에 대한 주기의 수를 증폭의 선형 범위 내에 있도록 선택하였다. 특이한 PCR 프라이머의 서열은 쥐 아그레칸(승인 번호: J03485) 센스, TTGGAAATCCAGAACCTTCG(SEQ ID NO:12); 안티센스, GTCCAGTGTGTAGCGTGTGG(SEQ ID NO:13); PCR 생성물: 149bp; 및 쥐 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(GAPDH; 승인 번호: X02231.1) 센스, AGACAGCCGCATCTTCTTGT(SEQ ID NO:14); 및 안티센스, CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT(SEQ ID NO:15); PCR 생성물: 207 bp였다. PCR 생성물을 에티듐 브로마이드를 함유하는 2% 아가로스 겔에서 전기영동하고 UV 조명에 의해 가시화하였다. PCR 생성물의 세기를 FUJI LAS-3000 시스템 및 Multi Gauge Ver. 1.01 소프트웨어(Fujifilm, Tokyo, Japan)를 사용하여 농도계로 정량하였다.

통계학

결과들을 평균±평균의 표준 오차(SEM)로서 표시하였다. 통계학적 비교를 위해 1-방향 ANOVA를 사용하였다. P<0.05를 다른 표시가 없는 한 유의미한 것으로 간주하였다.

실시예 1

PEDF 펩티드는 생체 내에서 연골세포 증식과 연골 재생을 자극한다

무릎 골관절염은 관절의 연골의 손실을 특징으로 하는 통상적인 만성 퇴행성 질병이다. 당분해 억제제인 모노-요오도아세테이트(MIA)의 설치류의 대퇴경골 관절 공간으로의 주사는 인간 OA에서 주지되는 그것과 유사한 관절의 연골의 손실을 유도하는 것으로 보고되었다. 광범위한 연골세포 변성/괴사는 보통 MIA 주사 후 7일에 일어나는 것으로 수립되어 있다. 그러므로, PEDF 펩티드 처리를 MIA 주사 후 8일에 시작하여 본 발명의 PEDF 펩티드가 연골 재생을 촉진하는 지의 여부를 알아보았다.

쥐들을 무작위로 6개의 실험 그룹(각 그룹당 n=6)으로 배정하고 다음과 같이 처리하였다. HA 그룹에서는 쥐에게 25㎕의 5% 히알루론산을 주사하였다. 비히클/HA 그룹에서는 쥐를 25㎕의 5% HA에 재용해시킨 DMSO 비히클로 처리하였다. 29-량체/HA, 24-량체/HA, 20-량체/HA 및 18-량체/HA 그룹에 대해서는, 쥐에게 25㎕의 5% HA에 재용해시킨 0.2mM의 PEDF 펩티드(29-량체, 24-량체, 20-량체 또는 18-량체)를 제공하였다. 처리를 MIA 주사 후 각각 8, 12, 16 및 20일에 1회의 관절-내 주사에 의해 적용하였다.

관절 시편을 MIA 주사 후 18일 및 25일에 얻었고, 대표적인 H&E 염색된 단편의 영상을 도 1에 제시한다. MIA 주사를 받지 않은 정상 관절과 비교함으로써, 골관절염과 관련된 형태 변화(연골의 감소, 연골의 표면적 섬유증 및 연골하 함몰을 포함함)가 비히클/HA 및 18-량체/HA 그룹에서, 특히 체중 부하 부위에서 뚜렷하다. 대조적으로, 20-량체/HA 그룹으로부터의 시편에서, 비히클/HA 및 18-량체/HA 그룹에서의 그것들과 비교하여, 연골 표면이 더 매끄럽고, 연골 및 연골하 뼈가 상대적으로 통합적이다. 29-량체 및 24-량체와 같은 다른 PEDF 펩티드는 20-량체와 유사한 효과를 나타낸다(데이터는 제시하지 않음). 이들 발견은 골관절염과 관련된 병리학적 변화가 본 발명의 PEDF 펩티드에 의하여 사라질 수 있음을 가리킨다.

정상 연골은 기능적으로 및 구조적으로 다음의 세 가지 지대로 나누어질 수 있는 조직화된 층 구조를 가진다: 표면 지대, 중간(또는 전이) 지대 및 방사상/심층 지대. 표면 지대는 매끄러운 활주 표면을 제공하는 관절 표면이고; 이 지대는 관절의 연골 두께의 대략 10% 내지 20%를 구성한다. 표면 지대의 연골 세포는 신장된 축 외관을 특징으로 하며, 이 지대의 콜라겐 섬유는 관절 표면과 나란한 매우 질서정연한 배열을 가진다. 전이 지대는 관절의 연골 부피의 40% 내지 60%를 포함한다. 이 지대는 콜라겐 섬유의 덜 조직화된 배열을 가지며, 이 층의 연골 세포는 표면층에서보다 더 둥글다. 심층 지대는 연골의 30%를 구성하며 관절의 표면에 수직 방향인 큰 직경의 콜라겐 소섬유로 이루어진다. 연골세포는 전형적으로 콜라겐 섬유에 나란하고 관절선에 수직인 원주형 양식으로 배열된다. 층 구조를 예시하는 대표적인 현미경 사진을 도 2에 제시하는데, 도면에서 영상은 MIA 주사 후 25일에 얻어진 무릎 시편으로부터 취하였다.

도 2에서 알 수 있는 것과 같이, 정상 연골은 저세포성이었다; 반면 비히클/HA로 처리된 무릎에서는 대규모의 연골세포가 표면 지대로부터 사라졌고, 산란형 세포 클로닝(화살표로 표시됨)이 전이 지대 및 방사상 지대에서 발생하였다. 대조적으로, 29-량체/HA 및d 20-량체/HA 처리는 연골 전체에 대다수의 새롭게 생성된 연골 세포가 퍼지는 것을 유도하였다. 또한, 본 발명의 PEDF 펩티드로 처리된 무릎에서, 연골세포는 각 층에서 보다 조직화되었다. 이런 발견은 연공세포 증식과 구조 재조직화로 구성된 연골 재생 과정이 본 발명의 PEDF 펩티드에 의해 개시된다는 것을 제시한다.

골관절염은 퇴행된 연골에서 세포외 기질(ECM), 예컨대 아그레칸 및 타입 II 콜라겐의 손실을 유발한다. 도 3에 예시된 것과 같이(좌측 패널), 아그레칸-포지티브 신호(녹색)는 20-량체로 처리된 무릎으로부터의 연골의 표면, 전이 및 심층 지대에 다량 축적되었지만, 비히클-처리 무릎으로부터의 연골에서는 희미하게 염색되어 있다. 항-타입 콜라겐 항체를 사용한 무릎 단면의 면역조직화학적 분석은 본 발명의 PEDF 펩티드에 의한 ECM의 유사한 복원을 나타냈고(데이터는 제시하지 않음), 그것은 본 발명의 PEDF 펩티드가 연골 복구를 촉진한다는 개념을 지지한다. 또한, 아그레칸 염색에 의해 나타난 것과 같이, 연골 세포의 개체수는 비히클-처리 연골과 비교하여 20-량체로 처리된 연골에서 훨씬 더 높았다.

아그레칸 및 핵에 대한 이중-면역형광 염색(Hoechst 33258로 파랗게 염색됨; 도 3 중간 패널)은 95% 이상의 세포가 20-량체/HA 그룹에서 아그레칸-포지티브 세포였음을 나타냈고, 그것은 본 발명의 PEDF 펩티드가 연골세포 증식을 촉발시킴으로써 연골 치유를 촉진할 수 있음을 제시한다.

나아가, 항-BrdU 항체에 의한 면역조직화학적 분석은 20-량체/HA 그룹에서 BrdU-포지티브 세포의 수가 비히클/HA 그룹에서의 그것과 비교하여 상당히 증가하였음을 나타냈다(도 3, 우측 패널). 정량 분석을 무릎 관절 시편당 3개의 단편으로부터, 그리고 각 그룹에서 6마리의 쥐로, 상기에서 기술한 것과 같이 수행하였다. BrdU/아그레칸 표지화 지수(%)를 아그레칸-포지티브 세포의 총 수로 나눈 BrdU- 및 아그레칸-이중 포지티브 세포의 수로서 계산하였다. 그 결과를 표 1에 요약한다; *P<0.0001은 비히클/HA 그룹과 비교한 것을 나타낸다.

처리	BrdU / 아그레칸 표지화 지수(%)
Vehicle / HA	0.5±0.34
29-량체/ HA	15.0±2.38*
24-량체/ HA	16.0±2.03*
20-량체/ HA	17.5±2.7*
18-량체/ HA	0.67±0.33
HA	0.71±0.28

표 1의 데이터는 본 발명의 PEDF 펩티드(예컨대 29-량체, 24-량체 및 20-량체)가 HA 또는 비히클/HA의 처리와 비교하여 연골세포 증식을 촉진하는 것을 나타낸다. 또한 "SLGA 잔기"를 포함하지 않은 18-량체도 그런 촉진 효과를 유도하지 못한다.

결론적으로, 실시예 1의 결과는 본 발명의 PEDF 펩티드가 연골 재생에 대한 기본적인 메커니즘인, 손상된 연골의 연골세포 증식을 촉진하는 데 효과적임을 나타낸다. 그러므로 연골 재생은 본 발명의 PEDF 펩티드에 의해 증강될 수 있는 것으로 여겨진다.

실시예 2

PEDF 펩티드는 생체 내에서 관절의 연골세포 증식을 촉진한다

일차 연골세포를 쥐의 관절 연골로부터 분리하여 본 발명의 PEDF 펩티드의 존재 또는 부재 하에 배양함으로써 연골세포 증식에 대한 본 발명의 PEDF 펩티드의 자극 효과를 유도하였다.

도 4A의 사진은 본 발명의 PEDF 펩티드(예컨대 20-량체)의 존재 하에, 연골세포가 더 빠르게 성장하였고, 거대한 삼차원 콜로니로 응집하였음을 나타낸다. 대조적으로, 비히클 그룹에서는, 콜로니가 PEDF 펩티드의 부재시에 훨씬 더 작았다. 콜로니 내에 있는 세포의 연골세포 정체성을 아그레칸 면역염색에 의해 확인하였다(도 4A, 삽입). 단층 배양에서 아그레칸-포지티브 세포의 수준(도 4B)을 20개의 무작위로 선택된 필드로부터 정량하였고, 아그레칸 표지화 지수(%)를 세포의 총 수로 나눈 아그레칸-표지된 세포의 수로서 계산하였다(핵은 Hoechst 33258에 의해 표지화됨). 그 결과를 표 2에 요약한다; *P<0.01은 미처리 세포와 비교한 것이다.

처리	아그레칸 표지화 지수(%)
미처리	32.3±3.7
29-량체	52.2±5.2*
24-량체	50.0±2.9*
20-량체	50.1±3.6*
18-량체	31.8±2.6

요약하면, 본 발명의 PEDF 펩티드(예컨대 29-량체, 24-량체 및 20-량체)는 배양에서 연골세포 팽창을 촉진한다; 이 발견은 생체 내에서 이들 PEDF 펩티드가 연골세포 증식을 자극한다는 결론을 지지한다. 배양된 연골세포에서 증강된 아그레칸 생성은 또한 생체 내에서 연골 기질의 재생을 반영한다.

실시예 3

PEDF 펩티드는 간엽 줄기 세포의 연골형성을 촉진한다

간엽 줄기 세포(MSC)는 연골 복구에 대한 연골원성 세포 공급원으로서 주창되어 왔다. 이 실시예는 본 발명의 PEDF 펩티드가 배양에서 MSC의 연골원성 분화를 증대시키는 지의 여부를 조사하는 것이 목적이다.

MSC를 분리하고 상기 "재료 및 방법" 단원에서 설명한 것과 같이 배양하였다. 아그레칸 mRNA의 발현 수준을 RT-PCR에 의해 정량하였고, 그 결과를 GAPDH 유전자의 발현 수준으로 표준화한다. 비히클 그룹과 관련하여 유도의 배수를 표 3에 요약한다; *P<0.0002는 비히클 그룹과 비교한 것이다.

처리	유도 배수
팽창 배지	0
비히클	1
29-량체	3.8±0.35*
24-량체	3.7±0.56*
20-량체	3.5±0.34*
18-량체	1.1±0.13

표 3에서 알 수 있는 것과 같이, 아그레칸 mRNA는 팽창 배지에서 배양된 MSC에서는 거의 검출할 수 없었다. 대조적으로 연골원성 배지에서 배양된 MSC(비히클 그룹)는 아그레칸 mRNA의 실질적인 발현으로부터 명백한 것과 같이, 연골세포로 분화하였다. 세포의 본 발명의 PEDF 펩티드(29-량체, 24-량체 및 20-량체)에의 노출은 비히클 그룹의 그것과 비교하여 아그레칸 mRNA의 적어도 3.5-배의 증가를 유도하였다. 또한, 18-량체(즉 "SLGA" 잔기를 갖지 않은 합성 펩티드)로의 처리는 연골원성 분화의 촉진에 아무런 영향을 나타내지 않았다.

아그레칸 및 타입 II 콜라겐에 대한 면역염색을 또한 수행하여 본 발명의 PEDF 펩티드의 사전-분화 활성을 조사하였다. 아그레칸-포지티브 세포의 수준을 20개의 무작위로 선택된 필드로부터 정량하였고, 아그레칸 표지화 지수(%)를 세포의 총 수로 나눈 아그레칸-표지된 세포의 수로서 계산하였다(핵은 Hoechst 33258에 의해 표지화됨). 그 결과를 표 4에 요약한다; *P<0.0001은 비히클 그룹과 비교한 것이다.

처리	아그레칸 표지화 지수(%)
비히클	33.8±3.9
29-량체	76.8±5.0*
24-량체	78.8±4.3*
20-량체	78.7±3.8*
18-량체	34.23±.8

표 4의 결과는 본 발명의 PEDF 펩티드(예컨대 29-량체, 24-량체 및 20-량체)의 존재 하에, 비히클 그룹의 그것과 비교하여 더 많은 세포가 연골세포로 분화되었음을 나타낸다. 대조적으로, 18-량체는 BM-MSC의 연골세포로의 분화 효율의 그런 증대를 제공하지 못하였다. 요약하면, 이들 발견은 본 발명의 PEDF 펩티드가 MSC의 연골원성 분화를 촉진하는 것을 드러낸다.

본 발명은 첫째로 짧은 합성 PEDF 펩티드가 골관절염에 의해 유발된 연골 손상에 대해 보호 효과를 가지는 지를 증명하는 것이다. 전체 길이의 PEDF 펩티드를 발현하는 벡터의 종래 전달과 비교하여, 그런 짧은 합성 PEDF 펩티드의 적용은 안전하고 저렴한 접근법이다.

상기 구체예들의 설명은 실례로만 제공된 것이고, 다양한 변형이 해당 기술분야의 숙련자들에 의해 이루어질 수 있다는 것이 인지될 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 구체예의 구성 및 사용의 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 구체예들이 상기에서 특정 정도의 구체성으로, 또는 하나 또는 더 많은 개별적인 구체예들을 참조로 기술되긴 하였지만, 해당 기술분야의 숙련자들은 본 발명의 사상 또는 범주로부터 벗어나지 않으면서 개시된 구체예들에 대해 많은 변화를 만들 수 있을 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> TSAO, YEOU-PING HO, TSUNG-CHUAN <120> USE OF PEDF-DERIVED POLYPEPTIDES FOR TREATING OSTEOARTHRITIS <130> P2733-PCT <160> 15 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 1 Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Gly Ala Glu Gln 1 5 10 15 Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser 20 25 30 Ser Pro Asp Ile His Gly Thr 35 <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 2 Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile 1 5 10 15 Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro Asp Ile His 20 25 30 Gly Thr <210> 3 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 3 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr 20 25 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 4 Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu 1 5 10 15 Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr 20 25 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 5 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 6 Ser Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu 20 <210> 7 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 7 Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu 1 5 10 15 Ile Ser <210> 8 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 8 Ser Leu Gly Ala Glu His Arg Thr Glu Ser Val Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu Ile Thr Asn Pro Asp Ile His Ser Thr 20 25 <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 9 Ser Leu Gly Ala Glu His Arg Thr Glu Ser Val Ile His Arg Ala Leu 1 5 10 15 Tyr Tyr Asp Leu 20 <210> 10 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 10 Val Leu Leu Ser Pro Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser 1 5 10 15 Leu Gly Ala Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr 20 25 30 Tyr Asp Leu Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr 35 <210> 11 <211> 418 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Gln Ala Leu Val Leu Leu Leu Cys Ile Gly Ala Leu Leu Gly His 1 5 10 15 Ser Ser Cys Gln Asn Pro Ala Ser Pro Pro Glu Glu Gly Ser Pro Asp 20 25 30 Pro Asp Ser Thr Gly Ala Leu Val Glu Glu Glu Asp Pro Phe Phe Lys 35 40 45 Val Pro Val Asn Lys Leu Ala Ala Ala Val Ser Asn Phe Gly Tyr Asp 50 55 60 Leu Tyr Arg Val Arg Ser Ser Thr Ser Pro Thr Thr Asn Val Leu Leu 65 70 75 80 Ser Pro Leu Ser Val Ala Thr Ala Leu Ser Ala Leu Ser Leu Gly Ala 85 90 95 Glu Gln Arg Thr Glu Ser Ile Ile His Arg Ala Leu Tyr Tyr Asp Leu 100 105 110 Ile Ser Ser Pro Asp Ile His Gly Thr Tyr Lys Glu Leu Leu Asp Thr 115 120 125 Val Thr Ala Pro Gln Lys Asn Leu Lys Ser Ala Ser Arg Ile Val Phe 130 135 140 Glu Lys Lys Leu Arg Ile Lys Ser Ser Phe Val Ala Pro Leu Glu Lys 145 150 155 160 Ser Tyr Gly Thr Arg Pro Arg Val Leu Thr Gly Asn Pro Arg Leu Asp 165 170 175 Leu Gln Glu Ile Asn Asn Trp Val Gln Ala Gln Met Lys Gly Lys Leu 180 185 190 Ala Arg Ser Thr Lys Glu Ile Pro Asp Glu Ile Ser Ile Leu Leu Leu 195 200 205 Gly Val Ala His Phe Lys Gly Gln Trp Val Thr Lys Phe Asp Ser Arg 210 215 220 Lys Thr Ser Leu Glu Asp Phe Tyr Leu Asp Glu Glu Arg Thr Val Arg 225 230 235 240 Val Pro Met Met Ser Asp Pro Lys Ala Val Leu Arg Tyr Gly Leu Asp 245 250 255 Ser Asp Leu Ser Cys Lys Ile Ala Gln Leu Pro Leu Thr Gly Ser Met 260 265 270 Ser Ile Ile Phe Phe Leu Pro Leu Lys Val Thr Gln Asn Leu Thr Leu 275 280 285 Ile Glu Glu Ser Leu Thr Ser Glu Phe Ile His Asp Ile Asp Arg Glu 290 295 300 Leu Lys Thr Val Gln Ala Val Leu Thr Val Pro Lys Leu Lys Leu Ser 305 310 315 320 Tyr Glu Gly Glu Val Thr Lys Ser Leu Gln Glu Met Lys Leu Gln Ser 325 330 335 Leu Phe Asp Ser Pro Asp Phe Ser Lys Ile Thr Gly Lys Pro Ile Lys 340 345 350 Leu Thr Gln Val Glu His Arg Ala Gly Phe Glu Trp Asn Glu Asp Gly 355 360 365 Ala Gly Thr Thr Pro Ser Pro Gly Leu Gln Pro Ala His Leu Thr Phe 370 375 380 Pro Leu Asp Tyr His Leu Asn Gln Pro Phe Ile Phe Val Leu Arg Asp 385 390 395 400 Thr Asp Thr Gly Ala Leu Leu Phe Ile Gly Lys Ile Leu Asp Pro Arg 405 410 415 Gly Pro <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 ttggaaatcc agaaccttcg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 gtccagtgtg tagcgtgtgg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 agacagccgc atcttcttgt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 cttgccgtgg gtagagtcat 20

Claims

20 내지 39 아미노산 잔기의 길이를 가지고 SEQ ID NO:1에 대해 적어도 80%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진, 대상의 골관절염을 치료하기 위한 합성 펩티드로서, 상기 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 30에 대해 적어도 90%의 아미노산 서열 동일성을 가지는 적어도 20개의 연속적인 잔기를 포함하는 합성 펩티드.
제 1항에 있어서, 합성 펩티드의 적어도 4개의 연속적인 잔기는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 14에 동일한 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
제 1항에 있어서, 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 합성 펩티드.
제 1항의 합성 펩티드의 유효량; 및
약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는,
대상의 골관절염을 치료하기 위한 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 합성 펩티드의 적어도 4개의 연속적인 잔기는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 14에 동일한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 대상은 인간인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 글리코사미노글리칸을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 7항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 히알루론산 또는 히알루론산 나트륨인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 약학적 조성물은 용액, 스프레이, 에어로졸, 발포체, 크림, 로션, 연고, 겔 또는 패치의 형태인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항의 합성 펩티드의 유효량을 대상에게 투여하여 합성 펩티드가 골관절염을 치료하기 위한 윤활 공간에 도달하게 되는 것을 포함하는, 골관절염으로 고생하는 인간을 제외한 대상의 골관절염을 치료하는 방법.
제 10항에 있어서, 합성 펩티드의 적어도 4개의 연속적인 잔기는 SEQ ID NO:1의 잔기 11 내지 14에 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 합성 펩티드는 제 1항의 합성 펩티드 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물로 제형되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 약학적 조성물은 글리코사미노글리칸을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 13항에 있어서, 글리코사미노글리칸은 히알루론산 또는 히알루론산 나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
제 12항에 있어서, 약학적 조성물은 용액, 스프레이, 에어로졸, 발포체, 크림, 로션, 연고, 겔 또는 패치의 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항에 있어서, 합성 펩티드는 윤활 공간 안으로 관절-내 주사되는 것을 특징으로 하는 방법.
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