KR20220055921A - 제대유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 건 또는 인대 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 제대유래 줄기세포를 유효성분으로 하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 제대유래 줄기세포를 유효성분으로 포함함으로써, 건 질환에 적용시 부작용없이 손상된 건을 재생 및 재구축하여 건 또는 인대 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

제대유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 건 또는 인대 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating tendor or ligament diseases comprising　Umbilical Cord　Derived-Stem Cells}

본 발명은 제대유래 줄기세포를 유효성분으로 하는 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 제대유래 줄기세포를 단독으로 투여하여 건 또는 인대 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 조성물과 이의 용도에 관한 것이다.

근골격계 손상의 45%를 차지하는 건 질환은 상당한 통증, 활동 장애 그리고 경제적 부담을 야기하며, 매년 미국인의 1,700만 명이 이 질환을 앓고 있을 정도의 심각하다. 건 질환을 치료하기 위해 휴식, 물리치료, 운동, 수술적 치료, 스테로이드 주사 및 비 스테로이드 성 항염증제 등이 사용되어 왔다. 이러한 종래 치료법들은, 건 질환의 근본적인 원인(건 조직의 퇴행성 변화)을 완전히 해결할 수 없기 때문에, 시간이 지난 후 증상이 지속되는 등 치료에 한계가 있다.

건(힘줄) 또는 인대는 혈류의 공급이 인체의 다른 조직들보다 상대적으로 부족하고, 손상된 건의 건 세포는 대부분 더 이상 재생과정에 참여하지 않으므로, 한번 손상되면 정상적인 건의 기능을 완전히 회복시키기 어렵다.

상술한 문제점을 해결하기 위해, 최근 중간엽 줄기세포를 이용한 근골격계 치료제의 개발이 이루어지고 있다. 중간엽　줄기세포(Mesenchymal Stem Cell; MSC)는 지방세포, 뼈세포 및 연골세포와 같은 여러 세포계통으로 분화할 수 있는 골수를 포함하는 전신에 존재하는　줄기세포이다. 이에, 줄기세포를 이용한 치료법이 많은 주목을 받고 있고, 실제 시험관 내에서 높은 효율로 줄기세포를 활용한 결과들이 보고되어 왔다. 그러나, 줄기세포를 동물모델 또는 사람에게 이식하는 경우 효율성이 현저히 떨어지는 문제점이 존재하였다. 줄기세포는, 그 종류와 대상 질환에 따라 치료 효과가 전혀 다르게 나타나며, 줄기세포의 유래 조직 및 배양 조건에 따라 그 효과가 전혀 달라질 수 있으며, 특히 건 손상의 경우 다른 근골격계 질환 치료제의 치료 효과가 그대로 적용되지 않는 경우가 많다.

이러한 실정에도 골수유래 중간엽 줄기세포, 지방유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 및 제대유래 중간엽 줄기세포의 건 손상에서의 효과 차이에 대해서는 충분한 연구가 이루어지지 않고 있다.

특허문헌 1. 대한민국공개특허공보 제 10-2020-0061242호

본 발명자들은 건 또는 인대 질환을 치료할 수 있는 물질을 발굴하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 손상된 건(힘줄)(tendon)을 정상수준으로 회복할 수 있으면서 이소성 골형성과 같은 부작용은 억제하는 효과를 갖는지에 대해, 종래 줄기세포(골수유래 중간엽 줄기세포, 지방유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 및 제대유래 중간엽 줄기세포)를 대상으로 연구한 결과, 제대유래 중간엽 줄기세포가 건 기질 유전자와 단백질 발현을 증가시키고 재생되는 건과 주위 조직과의 유착없이 거시적으로 건의 손상을 개선하며, 조직학적으로도 건의 퇴행성을 억제하면서, 콜라겐 섬유 배열을 회복시키며, 섬유아세포의 변형 및 이소성 연골형성을 억제함으로써 부작용없이 건을 효과적으로 재생 및 회복시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 건 또는 인대 질환을 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 건 또는 인대 질환에 의해 유도되는 이소성 골형성 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 제대유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 건 또는 인대 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 건(힘줄)(tendon) 또는 인대 손상시, 건 또는 인대 조직을 재생 및 회복시키는 신규 물질을 발굴하고자 노력한 결과, 부작용없이 손상된 건을 재생 및 재구축하여 건 또는 인대 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 제대유래 중간엽 줄기세포를 발견하였다.

본 발명에서 "중간엽　줄기세포"는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된　줄기세포이다.　중간엽　줄기세포는 다양한 조직에서 유래할 수 있으며, 특히 지방조직, 골수,　제대, 말초 혈액, 태반 또는　제대혈에서 유래할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 제대　유래　중간엽　줄기세포를 사용하고 있다. 각 조직에서　줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있는 방법이라면 모두 사용가능하며, 특별히 이에 제한되지 않는다.

상기 제대유래 중간엽 줄기세포는 Scleraxis 유전자, 제1형 콜라겐 유전자 및 제3형 콜라겐 유전자를 발현하고, 이의 발현량이 다른 줄기세포(지방유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유대 중간엽 줄기세포, 골수유래 중간엽 줄기세포 등)보다 유의하게 높을 뿐만 아니라, 손상된 건의 재생과 회복 효과도 우수함을 확인하였다.

따라서, 제대유래 중간엽 줄기세포로도 건 또는 인대 질환을 용이하게 예방, 개선 또는 치료할 수 있으나, 상기 제대유래 중간엽 줄기세포에서 Zkscan8 유전자를 과발현시킬 경우, 거시적으로 건 재생 및 회복 효과가 제대유래 중간엽 줄기세포보다 향상됨을 밝혀냄으로써, 바람직하게 상기 제대유래 중간엽 줄기세포는 Zkscan8 유전자를 형질도입한 것을 사용할 수 있다.

상기 Zkscan8 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있고, 이의 단백질은 서열번호 2로 표시될 수 있다.

상기 Zkscan8 유전자를 형질도입한 제대유래 중간엽 줄기세포는, Zkscan8 유전자를 포함하는 벡터를 도입함으로써, 제조된 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 및 재조합 바이러스성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은 예를 들어 미세 주입법(Harland and Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099 (1985)), 칼슘포스페이트 침전법(Chen and Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752 (1987)), 전기천공법(Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990))가 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 제대유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 하는 조성물은, 건 재생 또는 회복뿐만 아니라, 건 질환에 의해 유도되는 이소성 골형성을 억제하는 이중 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다. 일반적으로 손상된 건 조직이 자연적으로나 줄기세포 등의 치료물질에 의해 회복될 때, 이소성 연골과 골이 형성되는 이소성 골형성이 함께 유도되어 어깨의 통증과 재파열 및 합병증이 발생하는 등 부작용이 유발되는 문제가 발생하였다. 그러나 본 발명에 따른 조성물은, 다른 줄기세포와 달리 이소성 연골의 형성이 현저히 억제 및 감소됨을 확인하였다(실험예 6).

즉, 본 발명에 따른 조성물은 건 또는 인대 질환에 대한 우수한 예방, 개선 또는 치료효과를 갖는 동시에 이소성 골형성이라는 부작용을 억제하는 효과를 동시에 갖는 것으로써, 종래 건 질환 치료제와 달리 부작용을 억제하기 위한 별도의 약물이나 치료를 진행하지 않아도 되는 장점을 갖는다.

본 발명에서 '건 질환'은 과용 또는 노화로 인해 점차적으로 건에 마모가 일어나고, 인열이 일어나 발생하는 건의 만성 장애 또는 손상이거나, 건파열 또는 골로부터 건이 분리되어 발생하는 것일 수 있으며, 구체적으로 아킬레스 건 질환, 슬개건 질환, 외측 상과염, 내측 상과염, 족저 근막염, 회전근개 건 질환, 건활막염, 건병증, 건염, 건초염, 건 손상, 건 파열 및 건 박리로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 아킬레스 건 질환이나, 슬개건 질환, 회전근개 건 질환은 아킬레스 건, 슬개건 혹은 회전근개 건이 파열되거나, 건 자체에 염증이 생겨 유발되거나, 과사용으로 인해 건 자체의 콜라겐의 퇴행성 변화로 병증이 생기거나, 건 자체가 과용이나 노화로 인해 손상되거나, 골로부터 건이 분리되어 발생하는 질환을 모두 포함할 수 있다.

상기 건 파열(tendon rupture)은 근육을 뼈에 붙이는 섬유성 끈인 건(힘줄)이 일부가 찢어지거나, 완전하게 파열되어 두 조각으로 나누어져 유발되는 질환으로, 아킬레스 건 파열(Acute achilles tendon rupture) 및 슬개건 파열(Patellar tendon rupture)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 건 염은 갑작스럽고 과도한 부하가 근건 단위(musculotendinous unit)에 가해졌을 때 건의 미세 파열(micro tear)에 의해 발생하는 건 자체의 염증에 의해 유발되는 질환으로, 오스굿 슐라터(Osgood schlatter), 건초염(Tenosynovitis), 석회성 건염(Calcific tendinitis), 슬개건염(Patellar tendinitis), 아킬레스 건염(Achilles' tendonitis), 상완 이두건염(Biceps tendinitis), 회전근개 건염(Rotator cuff tendinitis), 외측 상과염(lateral epicondylitis), 극상근 건염(Supraspinatus tendinitis), 팔꿈치 건염 (Triceps Tendonitis) 및 내측 상과염(medial epicondylitis)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 건병증은 만성적인 과사용(overuse)으로 인해 건 자체의 콜라겐의 퇴행성 변화에 의해 발생하는 비염증 또는 만성 염증에 의해 유발되는 건 질환으로, 아킬레스 건병증(achilles tendinopathy), 슬개 건병증(patella tendinopathy) 및 상완이두근건 병증(bicipital tendinopathy)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

상기 인대 질환은 십자인대 손상, 족관절 인대 손상, 측부인대 손상, 인대 파열, 인대 염좌로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.

본 명세서에서 '예방'은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸릴 가능성이 있는 대상체에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 명세서에서 '치료'는 (a) 질환, 질병 또는 증상의 발전의 억제; (b) 질환, 질병 또는 증상의 경감; 또는 (c) 질환, 질병 또는 증상을 제거하는 것을 의미한다. 본 발명의 조성물이 대상체에 투여되면 건 조직의 회복과 콜라겐 형성을 유도하여 건 또는 인대 질환 증상의 발전을 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 그 자체로 건 또는 인대 질환의 치료 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어 '치료' 또는 '치료제'는 '치료 보조' 또는 '치료 보조제'의 의미를 포함한다.

본 명세서에서 '투여' 또는 '투여하다'는 본 발명의 조성물의 치료적 유효량을 대상체에 직접적으로 투여함으로써 대상체의 체내에서 동일한 양이 형성되도록 하는 것을 말한다.

본 발명에서 '치료적 유효량'은 본 발명의 조성물을 투여하고자 하는 개체에게 조성물 내의 약리성분이 치료적 또는 예방적 효과를 제공하기에 충분한 정도로 함유된 조성물의 함량을 의미하며, 이에 '예방적 유효량'을 포함하는 의미이다.

본 명세서에서 '대상체'는 제한없이 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 원숭이, 침팬지, 비비 또는 붉은털 원숭이를 포함한다. 구체적으로는, 본 발명의 대상체는 인간이다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있고, 상기 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 멸균된 수용액, 비수성용제 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 제대유래 중간엽 줄기세포 또는 Zkscan8 유전자가 형질도입된 제대유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하므로, 세포 치료제(cell therapy) 분야에서 통상적으로 사용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 제재학적 방법에 따라 조직내-이식용 주사제, 정맥 주사제, 주사용 동결건조제제 등의 형태로 제제화될 수 있으며, 바람직하게는 조직내-이식용 주사제 또는 정맥 주사제의 형태로 제제화될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 1일당 1 cells/kg 이상, 바람직하게는 1 cells/kg 내지 1 X 10¹⁰ cells/kg, 보다 바람직하게는 1 X 10³ cells/kg 내지 1 X 10⁹ cells/kg, 가장 바람직하게는 1 X 10⁵ cells/kg 내지 5 X 10⁸ cells/kg일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다(대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989). 본 발명의 약학 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 시술, 수술, 약물 치료, 운동치료, 물리치료, 재활치료, 방사선 치료 등 기존의 다양한 치료 방법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 건 질환을 치료할 수 있다.

따라서, 본 발명은 제대유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 건 또는 인대 질환에 의한 이소성 골형성 예방 또는 치료용 약학 조성물로 사용할 수 있다.

이소성 골형성(Ectopic bone formation)은 정상적으로 골형성이 되지 않는 조직에서 성숙된 연골 또는 골이 형성되는 것으로, 연부조직내의 석회화와는 다른 의미이다.

상기 이소성 골형성은 건 또는 인대 질환에 의해 발생하는 합병증일 수 있고, 구체적으로 건 또는 인대 조직 주위로 이소성 연골이나 이소성 골이 형성되는 것일 수 있다.

상기 이소성 골형성은 화상, 외상, 수술이나 자가이식과 같은 자극에 의해 촉진될 수 있으나, 본 발명의 조성물은 제대유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하여, 건 또는 인대 질환에 의해 유발되는 이소성 골형성을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다.

상기 이소성 골형성 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 설명 중 상술한 본 발명의 건 또는 인대 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대한 설명과 동일한 부분은 그 부분을 참고하기로 한다.

본 발명에 따른 조성물은 제대유래 줄기세포를 유효성분으로 포함하되, 이를 단독으로 약학적 유효량 포함되도록 하여, 건 또는 인대 질환에 적용함으로써 부작용없이 손상된 건 또는 인대를 재생 및 재구축하여 건 또는 인대 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.

도 1은 실시예 1로부터 제조한 제대유래 중간엽 줄기세포(UC MSC), 비교예 1로부터 제조한 지방유래 중간엽 줄기세포(AD MSC) 및 비교예 2로부터 제조한 골수유래 줄기세포(BM MSC)의 Scleraxis 유전자 발현정도를 RT-PCR로 정량하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 실시예 1로부터 제조한 제대유래 중간엽 줄기세포(UC MSC), 비교예 1로부터 제조한 지방유래 중간엽 줄기세포(AD MSC) 및 비교예 2로부터 제조한 골수유래 줄기세포(BM MSC)의 제1형 콜라겐 유전자 발현정도를 RT-PCR로 정량하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 1로부터 제조한 제대유래 중간엽 줄기세포(UC MSC), 비교예 1로부터 제조한 지방유래 중간엽 줄기세포(AD MSC) 및 비교예 2로부터 제조한 골수유래 줄기세포(BM MSC)의 제3형 콜라겐 유전자 발현정도를 RT-PCR로 정량하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 극상근-상완골에서 근상건을 촬영하여 나타낸 사진이다.
도 4A는 각 그룹의 극상건의 거시적 모습(건의 결손 상태를 명확하게 관찰하기 위하여 결손 주위의 주변 조직들을 제거함)이고, 도 4B는 각 그룹의 극상건에 대한 총 거시적 점수(the total macroscopic score)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 극상근-상완골에서 건 조직을 회수하고, 이의 퇴행성 변화 및 구조의 통일성을 평가한 결과이다. 도 5A는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건을 H&E로 염색한 후 광학 현미경으로 촬영한 사진(배율; X200)이다. 도 5B는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건에 대한 총 퇴행성 평가 점수(the total degeneration score)를 나타낸 그래프이고, 도 5C 내지 도 5I는 퇴행성 점수의 세부 변수들을 나타낸 그래프이며, 도 5J는 구조 통일성 평가(Integration of structure)를 나타낸 그래프이다.
도 6은 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 극상근-상완골에서 건 조직을 회수하고, 이로부터 콜라겐 조직 및 섬유아세포를 평가한 결과이다. 도 6A는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건을 PSR로 염색한 후 광학 현미경으로 촬영한 사진(배율; X200)이다. 도 6B는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건에 대한 콜라겐 구조(collage organization)를 평가하여 나타낸 그래프이고, 도 6C는 콜라겐 섬유의 배열(collage fiber coherence)를 평가하여 나타낸 그래프이다.
도 6D는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건의 섬유아세포를 촬영한 사진(배율; X400)이고, 도 6E는 섬유아세포의 밀도(fibroblast density)를 평가하여 나타낸 그래프이며, 도 6F는 섬유아세포 둥그러진 핵 모양(Nuclear aspect ratio)을 평가하여 나타낸 그래프이며, 도 6G는 세포의 기울기(nuclear orientation angle)를 평가하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 극상근-상완골에서 건 조직을 회수하고, 이로부터 건 내 이소성 변화를 분석한 결과이다. 도 7A는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건을 Saf-O로 염색한 후 촬영한 사진(배율; X200)이다. 도 7B는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건에 대한 글리코사미노글리칸 풍부영역(GAG-rich area)을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 7C는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건에 대한 이소성 골화 영역(area of ossification)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 8은 ZSCAN family의 구조에 대한 모델을 도시한 것이다.
도 9는 pscAAV-Zkscan 8의 개열지도이다.
도 10은 pscAAV-GFP 벡터와 pscAAV-Zkscan 8 벡터의 구조를 보여주는 모식도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<실시예>

본 발명은 보라매병원의 임상연구심의위원회와 실험동물 연구위원회에 의해 승인되었고 승인된 절차에 따라 진행하였다(IRB No. 16-2015-115 and IACUC_2019-0006).

실시예 1. 제대유래 중간엽 줄기세포 분리 및 계대배양

본 연구에 사용된 조직은 환자의 동의 하에 채취하였다. 탯줄과 건 조직은 항생제(100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin sulfate, and 0.25 μg/ml amphotericin B(antibiotic-antimycotic solution; Welgene, Daegu, Korea))가 첨가된 칼슘 및 마그네슘 부재 Dulbecco 인산염 완충 식염수로 2~3회 세척하여 외부의 혈액을 제거하였다.

제왕절개 환자로부터 얻은 탯줄은 길이와 무게를 측정한 후 수술용 가위를 이용하여 약 2-4 mm × 2-4 mm 크기의 입방체로 잘게 자르고 1 g에 해당하는 양을 150 cm² 배양접시에 정렬하여 접종한다. 탯줄이 배양 접시에 완전히 부착된 후 배양배지(LG DMEM, 10% fetal bovine serum(FBS; Welgene, Daegu, Korea), antibiotic-antimycotic solution)를 첨가하여 5% CO² 공급 하에 37 ℃ 조건에서 배양하였다.

상기 세포를 0.3% 제2형 콜라게나제(Gibco)와 항생제가 함유된 high-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium (HG DMEM; Welgene, Daegu, Korea) 내에서 가볍게 교반하면서 37 ℃ 2 시간 동안 처리하였다. 이 후 동량의 배양배지(HG DMEM, 10% FBS 및 antibiotic-antimycotic solution)을 첨가하고, 분해되지 않은 조직을 100-μm 세포 여과기로 제거하였다. 20 ℃ 에서 500 g로 15 분간 원심분리하여 세포를 모으고, 배양배지로 2회 세척하였다. 분리된 세포를 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)을 이용하여 세포 수를 계수하고 2-5×10⁴ cells/cm² 밀도로 배양 접시에 넣고 37 ℃, 5% CO²가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다.

배양 용기의 60~80%로 정도로 세포가 자라면 DPBS로 두 번 세척을 해주고 0.05% 트립신(trypsin), 0.53 mM 트립신-EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid)(Welgene, Daegu, Korea)을 3 분간 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 수득한 제대유래 중간엽 줄기세포는 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)으로 계수한 후, 세포를 배양배지로 1:4~1:6 비율로 희석하여 계대배양을 수행하였다. 3-5번의 계대를 한 신선한 세포를 실험에 사용하였다.

실시예 2. 제대유래 중간엽 줄기세포 분리 및 계대배양

제조사(Cell Biolabs, CA, USA)에서 제공한 pscAAV-GFP 벡터 플라스미드(vector plasmid)를 사용하였다. 제한효소 BamHI와 SalI으로 GFP 부분을 절단하고 그 부위에 BamHI와 SalI 제한효소를 포함하는 프라이머(FP: 5’- AAGGATCCATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTATGGCGGAGGAAAGTCGG-3’, RP: 5’-AAGTCGACCTAGACTGAGATAGACTC-3’)를 이용하여 Zkscan8(염기서열 1)를 클로닝하여 제조하였다. pscAAV-Zkscan 8 벡터의 개열지도는 도 8A에 나타내었고, 제조된 pscAAV-GFP 벡터와 pscAAV-Zkscan 8 벡터의 구조는 개략적으로 도 8B에 나타내었다. 완성된 pscAAV-Zkscan8는 서열을 확인하기 위해 시퀀싱을 분석하였다. 바이러스 패키징 스탁을 생산하기 위해 제조사의 방법에 따라 총 3가지의 벡터(타겟 발현 벡터, pAAV-RC, pHelper)를 293세포에 주입하였다. 72 시간 후에 세포를 포함한 배양배지를 수집하고 동결, 해동 과정을 반복하여 상기 Zkscan8 유전자를 포함한 아데노바이러스를 수확하고 저장하였다. 이렇게 제조된 바이러스는 실시예 1로부터 제조된 제대유래 중간엽 줄기세포에 Zkscan 8 유전자 전달 시스템으로 이용하였다.

비교예 1. 지방유래 중간엽 줄기세포 분리 및 계대

환자의 동의 하에, 지방조직을 채취하였다. 지방조직으로부터 혈액을 제거하기 위하여, 항생제(100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin sulfate, and 0.25 μg/ml amphotericin B(antibiotic-antimycotic solution; Welgene, Daegu, Korea))가 첨가된 칼슘 및 마그네슘 부재 Dulbecco 인산염 완충 식염수로 2~3회 세척하였다. 세척한 지방조직을 잘게 자른 후, 5% CO₂ 및 37 ℃ 조건에서 가볍게 교반하면서 0.1% 제1형 콜라게나제(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 60 분간 처리하였다. 이 후 동량의 Dulbecco 인산염 완충 식염수(Dubecco's phosphate-buffered saline; DPBS)를 첨가한 후, 20 ℃ 에서 1200 g으로 10 분간 원심분리하고, 세포를 회수하였다. 세포 중에 분해되지 않은 조직을 제거하기 위해 100-μm 세포 여과기를 이용한 후, 배양배지(HG DMEM, 10% FBS 및 antibiotic-antimycotic solution)로 2회 세척하였다. 혈구계수기(Hemocytometer)를 이용하여 세포의 개수를 측정한 후 1×10⁶ cells/cm² 밀도로 배양용기에 접종하고, 37 ℃, 5% CO₂ 배양기에서 24 시간 배양하였다. 지방유래 중간엽 줄기세포가 배양용기의 60~80%로 정도로 자라면 DPBS로 두 번 세척한 후, 0.05% 트립신(trypsin), 0.53 mM trypsin-EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid)(Welgene, Daegu, Korea)을 3 분간 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 수득한 지방유래 중간엽 줄기세포는 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)으로 계수한 후, 세포를 배양배지로 1:4~1:6 비율로 희석하여 계대배양을 수행하였다. 3-5번의 계대를 한 신선한 세포를 실험에 사용하였다.

비교예 2. 골수유래 중간엽 줄기세포 분리 및 계대

환자의 동의 하에, 골수를 채취하였다. 골수는 1:4로 칼슘 및 마그네슘 부재 Dulbecco 인산염 완충 식염수(Ca²⁺, Mg²⁺-free Dubecco's phosphate-buffered saline; DPBS, Gibco, NY, USA)로 1:4의 비율로 희석하였다. 희석된 골수는 Ficoll-PaqueTM Premium(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)과 혼합되지 않도록 조심스럽게 첨가하고, 혼합액의 표면층을 이루게 하며, 최종적으로 1:2의 비율이 되게 하였다. 다음으로, 20 ℃에서 400 g으로 30 분간 브레이크를 끈 원심분리기를 이용하여 층을 분리한 후, 가장 위 상층액은 버리고, 중간의 단핵세포 층만을 회수하였다. 회수한 단핵세포 층은 1:4로 칼슘 및 마그네슘 부재 Dulbecco 인산염 완충 식염수로 희석하였다. 20 ℃에서 400 g으로 5 분간 원심분리하여 세포만을 수득한 후, 다시 한번 칼슘 및 마그네슘 부재 Dulbecco 인산염 완충 식염수로 희석하였다. 그 후 20 ℃에서 400 g으로 5 분간 원심분리한 후, 세포만 남기고 상층액을 버렸다. 회수한 세포를 항생제와 저농도 포도당 함유 DMEM 배지(low-glucose Dulbecco’s modified Eagle medium containing 10% inactivated FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 lg/mL streptomycin) 10 mL로 희석하였다. 원심분리와 배지 첨가 과정을 두 번 반복하여 희석된 세포용액을 제조하였다. 상기 용액 내 세포의 개수를 혈구계수기(Hemocytometer)를 이용하여 측정하고, 1×10⁵ cells/cm² 밀도로 세포를 배양용기에 접종한 후, 37 ℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.

골수유래 중간엽 줄기세포가 배양용기의 60~80%로 정도로 자라면 DPBS로 두 번 세척한 후, 0.05% 트립신(trypsin), 0.53 mM 트립신-EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid)(Welgene, Daegu, Korea)을 3 분간 처리하여 단일 세포로 분리하여 수득하였다. 수득한 골수유래 중간엽 줄기세포는 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)로 계수한 후, 세포를 배양배지로 1:4~1:6 비율로 희석하여 계대배양을 수행하였다. 3-5번의 계대를 한 신선한 세포를 실험에 사용하였다.

비교예 3. 제대혈 유래 중간엽 줄기세포 분리 및 계대

제대혈 유래 중간엽 줄기세포(HUXUB_01001, cyagne, 2255 martinmar,Santa Clara, CA 95050, USA)를 구매(Passage 3)하여 전용 배지(HUXUB_90011)를 이용하여 재대혈 유래 중간엽 줄기세포를 배양하였다. 배양 용기의 60~80%로 정도로 세포가 자라면 DPBS로 두 번 세척을 해주고, 0.05% 트립신(trypsin), 0.53 mM 트립신-EDTA(ethylenediamine tetraacetic acid)(Welgene, Daegu, Korea)을 3 분간 처리하여 부착된 세포를 떼어낸 후, 세포를 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)으로 계수하고, 1:4~6 비율로 계대한 후 배양하였다. 3-5번의 계대를 한 신선한 세포를 실험에 사용하였다.

<실험예>

통계분석

모든 데이터는 평균 ± SD로 표시되었다. 데이터는 일원 분산 분석(one-way analysis of variance, ANOVA)으로 분석되었고 사후분석은 Bonferroni multiple comparison test를 사용하였다. 모든 통계 분석은 SPSS 소프트웨어 버전 23(IBM)을 이용하여 진행하였다. p < 0.050 이하의 유의값이 나왔을 경우 통계적으로 유의하다고 간주하였다.

실험예 1. 건 특이 마커 및 건 기질 유전자 및 단백질 발현

실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2로부터 제조한 3계대 이상 배양한 줄기세포(n=5)을 수집하여 Scleraxis 유전자와 제1형 콜라겐, 제3형 콜라겐 유전자 발현을 확인하였다.

1) 정량적 역전사-중합효소 연쇄반응(quantitative RT-PCR)

실시예 1, 비교예 1 및 비교예 2로부터 제조한 3계대 이상 배양한 줄기세포로부터, 건 관련 유전자(Scleraxis 유전자와 제1형 콜라겐, 제3형 콜라겐 유전자)의 발현을 확인하고자 하였다.

우선, HiYield Total RNA mini kit(Real Biotech Corporation, Taiwan)을 이용하여 총 RNA를 추출하였고, 분광광도계(NanoDrop, DE, USA)를 사용하여 260 ㎚와 280 ㎚에서의 흡광도를 측정한 후, 유출액 내의 총 RNA를 정량하였다. 각각의 총 RNA 1 ㎍을 Superscript II Reverse Transcriptase(Invitrogen, CA. USA)을 사용하여 cDNA를 합성하였다. 정량적 역전사-중합효소 연쇄반응(quantitative RT-PCR; qRT-PCR)은 Go Taq® probe qPCR and RT-qPCR systems(Promega, WI, USA), TaqMan® Gene Expression Assays(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 및 LightCycler 480(Roche Applied Science, Mannhein, Germany)을 이용하여 scleraxis, 제1형 및 제3형 콜라겐 유전자 발현을 실시간으로 확인하였다. 중합 효소 연쇄반응은 전변성(pre-denaturation) 95 ℃에서 10 분, 변성(denaturation) 95 ℃ 15 초, 결합(annealing) 60 ℃ 1 분, 연장(extension) 72 ℃ 4 초 수행하는 것을 1 사이클(cycle)로 하여, 50 사이클 반복한 후, 40 ℃에서 30 초 동안 쿨링(cooling)하였다. 용융 곡선(Melting curve) 분석은 2-ΔCt 계산법을 사용하였으며, GAPDH의 발현을 참고치(reference)로 하여 qRT-PCR 결과를 분석하였다[Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method. Methods. 2001, 25:402-408].

2) 결과

도 1 내지 도 3은 실시예 1로부터 제조한 제대유래 중간엽 줄기세포(UC MSC), 비교예 1로부터 제조한 지방유래 중간엽 줄기세포(AD MSC) 및 비교예 2로부터 제조한 골수유래 줄기세포(BM MSC)의 Scleraxis 유전자, 제1형 콜라겐 유전자, 제3형 콜라겐 유전자 발현정도를 RT-PCR로 정량하여 나타낸 그래프이다. *P < 0.050; **P < 0.010

도 1 내지 도 3에 나타난 바와 같이, 제대유래 중간엽 줄기세포는 골수유래 중간엽 줄기세포와 지방유래 중간엽 줄기세포보다 건 특이마커인 Scleraxis mRNA의 발현이 1.3배, 2.3배 더 높은 것을 확인하였다(각각 p = 0.146, 0.001).

제대유래 중간엽 줄기세포는 골수유래 중간엽 줄기세포와 지방유래 중간엽 줄기세포보다 제1형 콜라겐 유전자 발현이 각각 9.9배 및 2.9배 증가되어 있었으며(각각 P = 0.009 및 0.027), 제3형 콜라겐 mRNA의 발현 또한 각각 11.6배 및 2.2배 증가되어 있음을 확인하였다(각각 P = 0.020 및 0.097).

따라서 본 발명에 따라 배양한 제대유래 중간엽 줄기세포를 건 손상 부위에 적용하면 건 세포의 재생과 회복을 촉진함으로써, 건 질환을 용이하게 예방, 개선 또는 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.

실험예 2. 랫트 회전근개 파열 모델을 이용한 유효성 평가

40마리의 수컷 Sprague-Dawley 랫트(12주, 340~360g)를 표 1과 같이 5개의 군으로 나눠 실험을 수행하였다.

상기 각 실험군의 구체적인 제조방법은 다음과 같다. 우선 졸레틸 및 럼푼(30 mg/kg + 10 mg/kg)을 사용하여 마취를 유도하였고, 모든 실험에는 랫트의 왼쪽 어깨만을 사용하였다. 수술 전, 랫트의 발바닥을 손톱으로 살짝 눌러 마취가 제대로 되었는지 확인한 후에, 왼쪽 어깨의 견봉을 촉지하고 앞가쪽 피부를 2cm 절개하였다. 견봉에 부착되어 있는 승모근과 삼각근을 절개하여 극상근의 건을 노출시킨 후, 극상근의 건과 상완골두와의 연골 부위에서 1 mm 떨어진 곳에 2 mm 지름(건 넓이의 약 50% 이상)을 가진 생검펀치(Biopsy Punch)(BP-20F, Kai Medical Europe GmbH, Bremen, Germany)로 둥근 모양의 전층 파열 건 손상을 만들었다. 그 후 30G(게이지) 바늘의 주사기를 이용하여 파열된 부위 양쪽에 남아있는 건에 생리식염수 또는 줄기세포를 각각 두 번에 나눠서 주입하였다. 주입한 후, 승모근과 삼각근을 4-0 Vicryl 봉합사(W9074, Ethicon, Cincinnati, OH, USA)로 봉합하고, 피부는 Black silk(SK439, AILee, Busa, Korea)로 봉합한 다음 상처 부위를 소독하였다. 수술 후, 랫트에게 자유로운 케이지 활동을 허하였다.

각 그룹의 랫트는 수술 후 2주와 4주에 희생되었고 극상근의 건을 수확하여 거시적 그리고 조직학적 평가에 사용하였다.

구분	실험설계	비고
대조군 (saline group)	전층파열 건손상 동물모델의 환부(건 손상 부위)에 10 μL의 생리식염수	8
실험군-UC (UC MSC group)	전층파열 건손상 동물모델의 환부(건 손상 부위)에 실시예 1의 제대유래 중간엽 줄기세포(1×106 cells/10μL 생리식염수)	8
실험군-ZUC (Zkscan8 UC MSC group)	전층파열 건손상 동물모델의 환부(건 손상 부위)에 실시예 2의 Zkscan8이 강화된 제대 유래 중간엽 줄기세포(1×106 cells/10μL 생리식염수)	8
비교군-BM (BM MSC group)	전층파열 건손상 동물모델의 환부(건 손상 부위)에 비교예 2의 골수유래 중간엽 줄기세포(1×106 cells/10μL 생리식염수)	8
비교군-UCB (UCB MSC group)	전층파열 건손상 동물모델의 환부(건 손상 부위)에 비교예 3의 제대혈유래 중간엽 줄기세포(1×106 cells/10μL 생리식염수)	8

실험예 3. 거시적 평가

실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주에 각각 4마리의 랫트를 이산화탄소 챔버에서 희생시켰다. 건의 결손 상태를 명확하게 관찰하기 위하여 각각의 그룹에서 극상근의 건의 원래 모습을 유지하도록 상완골의 머리와 극상근을 제거하지 않은 극상근-상완골을 수확하였다.

건의 재생을 거시적으로 평가하기 위하여 Stoll의 수정된 반정량 평가 방법을 이용하였다. 평가 방법에는 총 12개의 변수가 있다; 건의 파열(tendon rupture; 결손 부위 건이 끊어진 상태), 염증(inflammation; 건이 붓거나 붉은 색으로 변하고 염증이 발생한 상태), 건의 표면(tendon surface; 건의 표면이 매끄럽지 못하고 거칠고 불퉁불퉁하게 변한 상태), 주위 건의 변화(neighboring tendon; 결손 된 부분 주위 건의 색과 두께, 겉표면이 비정상적으로 변한 상태), 결손 부위의 두께(level of the defect; 결손 부위가 매워진 것이 주위 건보다 오히려 튀어 나온 상태), 결손 크기(defect size; 결손의 크기가 3 mm 이상 늘어나서 결손 크기가 커진 상태), 건의 부기/발적(swelling/redness of tendon; 손상된 건이 붉게 변하거나 만졌을 때 붓기가 있는 상태), 주위 조직과의 유착(connection surrounding tissue and slidability; 손상된 건이 주위 조직과 매끄럽게 미끄러지지(분리되지) 않고 엉겨 붙어 있는 형태), 건의 두께(tendon thickness; 건의 두께가 원래 두께 보다 두꺼워 진 상태), 건의 색(color of tendon; 빛나는 하얀색의 건이 불투명하고 탁하고 붉은 색으로 변한 상태), 하나의 근에서 연결됨(single strains of muscle; 극상근의 건이 극상근에서만 연결되지 않고 주위 근과 조직이 섞이듯 연결된 상태), 그리고 주위 건강한 조직과의 연결성(transition of the construct to the surrounding healthy tissue; 결손부위와 주위 건강한 건의 연결이 매끄럽지 않은 상태, 결손이 시작되는 부위가 분명히 구분되는 상태). 각 변수에 대해서 0점이나 1점이 주었고 건의 부기/발적은 0~2점 건의 두께는 0~3점을 주었다. 총 거시적 점수(total macroscopic score)는 정상과 가까울 때 0점 그리고 손상이 가장 심할 때 15점을 주었다.

도 4는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 극상근-상완골에서 근상건을 촬영하여 나타낸 사진이다.

도 4A는 각 그룹의 극상건의 거시적 모습(건의 결손 상태를 명확하게 관찰하기 위하여 결손 주위의 주변 조직들을 제거함)이고, 도 4B는 각 그룹의 극상건에 대한 총 거시적 점수(the total macroscopic score)를 나타낸 그래프이다. 도 4B의 그래프는 평균(the mean) ± 표준편차 (SD)를 나타낸다. *P < 0.050.

도 4에 나타난 바와 같이, 제대유래 중간엽 줄기세포를 투여한 실험군-UC의 2주차에서는 총 거시적 평가 결과, 7.00 ± 1.07이였고, 비교군-BM과 비교군 UCB에서는 각각 9.00 ± 1.07(p = 0.002), 10.00 ± 1.07(P < 0.000)인 것으로 확인되었다. 즉, 제대유래 중간엽 줄기세포가 투여될 경우 짧은 기간에 건 손상이 다른 줄기세포보다 유의적으로 현저히 회복됨을 알 수 있다.

특히, 실험군-UC는 주위 건의 변화, 결손 부위의 두께, 건의 부기와 발적 변수에서 다른 군들에 비해 0.5점 이상 낮은 손상 정도를 갖는 것으로 확인되었다.

4주에서는, 제대유래 중간엽 줄기세포를 투여한 실험군-UC의 총 거시적 평가 결과, 3.38 ± 7.00이였고, 비교군-BM과 비교군 UCB에서는 각각 4.88 ± 1.13(P = 0.012), 7.00 ± 1.41(P < 0.000)인 것으로 확인되었다. 즉, 제대유래 중간엽 줄기세포가 투여될 경우, 다른 줄기세포보다 유의적으로 건 손상이 회복됨을 알 수 있다.

특히 실험군-UC은 건의 부기 및 발적, 주위 조직과의 유착 그리고 건의 두께 변수에서 다른 군들에 비해 0.5점 이상 낮은 손상 정도를 갖는 것으로 확인되었다.

건 질환 치료를 위한 세포치료제로, 제대유래 중간엽 줄기세포를 사용할 경우, NK-, T- 그리고 B-세포와 같은 선천적 및 후천적 면역 반응의 표적으로 작용하여, 이종이식뿐만 아니라 동종이식에 대해 면역반응이 유도될 것이라는 우려가 있다.

그러나, 실시예 1의 제대유래 중간엽 줄기세포의 경우, 줄기세포 유래와는 전혀 다른 종인 랫트에게 주입하였음에도 불구하고(이종이식), 이식 후 특별한 거부반응이 관찰되지 않았다. 오히려 제대유래 줄기세포는 다른 줄기세포보다 주위 건의 변화, 결손 부위 두께, 건의 부기와 발적 변수에서 다른 줄기세포보다 유의미하게 낮은 손상 정도를 갖는 것으로 평가되었다.

본 발명에 따른 제대유래 중간엽 줄기세포는 건 손상에 있어서, 다른 줄기세포보다 대식세포와 T-림프구의 조절하여 면역반응을 제어하고, 세포 자연사를 줄이며, 생착에 호의적이므로, 이종이식시 부담이 현저히 적은 것으로 여겨진다.

또한, 일반적으로 회전근개, 건 손상이 발생하면, 손상된 건은 주위 조직과 유착되어 회복되므로, 치료된다 하더라도 정상적이던 건처럼 그 기능이 완전히 회복되지 못하고 오히려 움직임이 제한되거나 통증이 유발되는 문제가 발생하였다. 본 발명에 따른 제대유래 중간엽 줄기세포는 주위 조직과의 유착이 다른 줄기세포보다 0.5점 이상 낮고, 주위 건강한 조직과의 연결성, 하나의 근에서 연결됨 등의 변수 역시 0.5점 이상 현저히 개선되었음을 확인한 바, 제대유래 중간엽 줄기세포를 사용하는 것이 건 질환을 예방, 개선 또는 치료하는데 가장 바람직함을 알 수 있다.

실험예 4. 건의 퇴행성 변화 및 구조의 통일성 평가

실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주에 각각 4마리의 랫트를 이산화탄소 챔버에서 희생시켰다. 건의 결손 상태를 명확하게 관찰하기 위하여 각각의 그룹에서 극상근의 건의 원래 모습을 유지하도록 상완골의 머리와 극상근을 제거하지 않은 극상근-상완골을 수확하였다.

그룹별로 수확한 극상근-상완골로부터 건 조직을 분리하고, 분리한 건 조직은 즉시 4%(w/v)의 파라포름 알데히드(paraformaldehyde, PFA; Merck, Germany)에 넣어 24 시간 동안 고정시키고, 10% 에틸렌 디아민 테트라 아세트산(ethylendiaminetetracetic acid, EDTA; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)에 넣어 이틀 동안 석회를 제거하였다. 이어서, 점진적으로 농도가 높아지는 에탄올 용액을 이용하여 탈수한 후, 클로로포름을 이용하여 탈지하였다. 고정과정이 완료된 건 조직은 파라핀 블록으로 포매했으며, 마이크로톰(microtome)을 이용하여 건의 중심 주위까지 조심스럽게 절단한 후, 중심부에서는 4 mm 두께로 연속하여 잘라 슬라이드로 제조하였다.

상기 슬라이드로부터 각 그룹별로 슬라이드를 무작위로 선택한 후, 헤마토실린과 에오신(hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색하고, 광학 현미경(U-TVO　63XC;　Olympus　Corp., Japan)을 이용하여 이미지를 얻었다.

먼저, 상기 이미지로부터, 각 그룹별 건의 퇴행성 정도를 평가하였다. 각 슬라이드는 수정된 Astrom and Movin의 반정량 평가 방법을 이용하여 분석하였다[Jo CH, Shin WH, Park JW, Shin JS, Kim JE. Degree of tendon degeneration and stage of rotator cuff disease. Knee Surg Sport Tr A. 2017;25(7):2100-8]. 퇴행성 분석에는 총 7개의 변수를 사용하였다; 섬유의 구조(fiber structure; 긴 섬유모양의 콜라겐들이 작게 조각난 상태), 섬유의 배열(fiber arrangement; 평행하게 배열되어 있던 콜라겐 섬유들이 불규칙하게 배열되어 있는 상태), 핵의 동그란 모양(rounding of the nuclei; 평소에 비활성화되어 납작했던 섬유아세포의 핵들이 손상 혹은 활성화 되면서 둥글게 모양이 변한 상태), 세포의 다양성(variations in cellularity; 건에 존재하는 세포의 숫자가 증가하고 군데군데 군집으로 모여 있는 상태), 증가된 혈관(increased vascularity; 건에 존재하는 혈관들의 숫자와 크기가 증가한 상태), 감소한 염색성(decreased stainability; 건을 구성하고 있던 섬유들이 손상으로 인하여 적어지고 적어진 섬유들의 밀도에 의하여 염색성이 떨어진 상태), 그리고 유리질화(hyalinization; 섬유 형태의 콜라겐으로 이루어져 있던 건 조직들이 맨들맨들한 유리질로 바뀐 상태). 총 퇴행성 점수(Total degeneration score)는 정상과 가까울 때 0점 그리고 가장 심한 퇴행성 변화가 일어났을 때는 21점으로 평가하였다.

다음으로, 상기 그룹별 슬라이드의 광학 이미지로부터 구조의 통일성을 평가하였다. 구조의 통일성(Integration of structure)은 결손 부위의 건과 결손 되지 않은 부위의 건이 연결되는 양상을 평가하기 위한 것으로, Burgisser의 평가방법을 이용하여 근위부 정상 건 조직과 결손 조직과의 통일성을 0점에서 3점까지 등급 척도를 사용하여 평가하였다; 0(갭이 없음), 1(변화가 되는 것을 인식할 줄 있는 정도), 2(급작스럽게 변함, 갭이나 캘러스 조직을 인식할 수 있을 정도), 3(결손 부위가 비어 있음)[Meier Burgisser G, Calcagni M, Bachmann E, Fessel G, Snedeker JG, Giovanoli P, et al. Rabbit Achilles tendon full transection model - wound healing, adhesion formation and biomechanics at 3, 6 and 12 weeks post-surgery. Biol Open. 2016;5(9):1324-33].

도 5는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 극상근-상완골에서 건 조직을 회수하고, 이의 퇴행성 변화 및 구조의 통일성을 평가한 결과이다. 도 5A는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건을 H&E로 염색한 후 광학 현미경으로 촬영한 사진(배율; X200)이다. 도 5B는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건에 대한 총 퇴행성 평가 점수(the total degeneration score)를 나타낸 그래프이고, 도 5C 내지 도 5I는 퇴행성 점수의 세부 변수들을 나타낸 그래프이며, 도 5J는 구조 통일성 평가(Integration of structure)를 나타낸 그래프이다. 여기서, 각 그래프는 평균(the mean) ± 표준편차(SD)를 나타낸다. *P < 0.050.

도 5에 나타난 바와 같이, 제대유래 중간엽 줄기세포를 투여한 실험군-UC의 2주차에서는 총 퇴행성 점수 평가 결과, 15.50 ± 1.20 이였고, 비교군-BM과 비교군 UCB는 각각 17.00 ± 0.00(P = 0.005), 17.50 ± 0.53(P < 0.001)로 확인되었다. 즉, 재대유래 중간엽 줄기세포가 투여될 경우 짧은 기간에 건 조직의 퇴행성 변화가 다른 줄기세포보다 유의하게 낮음을 알 수 있다. 이를 통해 제대유래 중간엽 줄기세포가 제대혈 유래 중간엽 줄기세포보다 건 손상에 있어서, 유의하게 더 높은 회복능력을 갖고 있음을 알 수 있다.

4주에서는, 제대유래 중간엽 줄기세포를 투여한 실험군-UC의 총 거시적 평가 결과, 7.50 ± 0.93이였고, 비교군-BM과 비교군 UCB에서는 각각 13.13 ± 0.99(P < 0.001), 11.25 ± 0.89(P = 0.050)인 것으로 확인되었다. 즉, 제대유래 중간엽 줄기세포가 투여될 경우, 다른 줄기세포보다 유의적으로 건의 퇴행성 정도가 유의하게 낮음을 확인하였다. 특히 제대유래 중간엽 줄기세포는 다른 줄기세포보다 섬유의 구조. 핵의 둥근 모양, 세포의 다양성, 증가된 혈관 및 유리질화 변수에서 유의한 차이로 회복됨을 알 수 있다.

도 5J에서와 같이, 결손 부위와 결손되지 않은 부위의 연결 양상을 나타낸 구조의 통일성(Integration of structure) 평가결과를 살펴보면, 제대유래 중간엽 줄기세포를 투여한 실험군-UC는 1.25 ± 0.46이고, 대조군, 비교군-BM 및 비교군 UCB은 2.25 ± 0.46(P = 0.002), 1.75 ± 0.46 및 1.50 ± 0.53인 것으로 확인되었다. 즉, 골수유래 중간엽 줄기세포와 제대혈유래 중간엽 줄기세포는 대조군에 비해 유의한 회복을 보이지 못하였으나, 본 발명의 제대유래 중간엽 줄기세포는 대조군 대비 유의한 회복을 나타내었다.

실험예 5. 건의 콜라겐 조직 및 섬유아세포 평가

실험예 4로부터 제조된 각 그룹별 슬라이드를 피크로시리우스 레드(picrosirius red, PSR)로 염색한 후, 원형 편광 광학 현미경을 사용하여 이미지를 얻었다. 상기 이미지로부터 콜라겐의 구조화(collagen orientation; 콜라겐 생성 정도와 구조화된 상태) 및 콜라겐 섬유의 배열(collagen fiber coherence; 건을 이루는 콜라겐 섬유들이 일관되게 평행한 상태)을 분석하였다. 먼저, 콜라겐 섬유의 구조화는 상기 이미지를 image J 프로그램을 이용하여 gray scale(black, 0; white, 255)로 바꿔준 후 intense white areas로 측정하였다. 높은 점수일수록 좀 더 구조화되고 성숙한 콜라겐이 형성된 것을 의미한다[Zhao S, Zhao JW, Dong SK, Huangfu XQ, Bin L, Yang HL, et al. Biological augmentation of rotator cuff repair using bFGF-loaded electrospun poly(lactide-co-glycolide) fibrous membranes. Int J Nanomed. 2014;9:2373-85]

다음, 상기 이미지로부터 콜라겐 섬유의 배열을 분석하기 위해서, 건의 주된 축에서 collagen fiber들이 얼마나 틀어졌는지를 확인하였으며, 이는 Orientation J plug-in for image J라는 프로그램을 이용하였다. 각 그룹별 슬라이드 마다 다섯개의 영역을 분석하였으며, 나온 평균값에 100을 곱하여 최종 값으로 사용하였다[Degen RM, Carbone A, Carballo C, Zong JC, Chen T, Lebaschi A, et al. The Effect of Purified Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells on Rotator Cuff Tendon Healing in an Athymic Rat. Arthroscopy. 2016;32(12):2435-43].

다음, 섬유아세포를 평가하고자 하였다. 정상적인 건은 적은 숫자의 납작한 형태의 섬유아세포가 건의 방향과 평행하게 위치하고, 손상된 건의 섬유아세포는 그 수가 증가함과 동시에, 세포의 핵이 둥글고 건의 방향과 다르게 비틀어진 형태로 변하게 된다. 따라서 각 그룹의 건 조직에서 섬유아세포의 밀도(fibroblast density; 손상이 심할수록 섬유아세포의 밀도가 증가하는 양상을 보임), 섬유아세포의 핵 모양(Nuclear aspect ratio; 세포의 활동이 증가하거나, 세포가 손상받았을 경우 세포의 핵이 둥근 모양으로 바뀌는 양상을 보임)와 세포 기울기(nuclear orientation angle; 주위 조직이 손상을 받거나, 섬유아세포가 손상을 받은 경우 세포의 기울기가 증가하는 경향을 보임)을 측정하여 손상 정도를 확인하여, 손상정도를 분석하였다. 각 그룹별 슬라이드마다 총 5군데를 측정하였고, 그 평균을 기록하였다.

도 6은 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 극상근-상완골에서 건 조직을 회수하고, 이로부터 콜라겐 조직 및 섬유아세포를 평가한 결과이다. 도 6A는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건을 PSR로 염색한 후 광학 현미경으로 촬영한 사진(배율; X200)이다. 도 6B는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건에 대한 콜라겐 구조(collage organization)를 평가하여 나타낸 그래프이고, 도 6C는 콜라겐 섬유의 배열(collage fiber coherence)를 평가하여 나타낸 그래프이다.

도 6D는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건의 섬유아세포를 촬영한 사진(배율; X400)이고, 도 6E는 섬유아세포의 밀도(fibroblast density)를 평가하여 나타낸 그래프이며, 도 6F는 섬유아세포 둥그러진 핵 모양(Nuclear aspect ratio)을 평가하여 나타낸 그래프이며, 도 6G는 세포의 기울기(nuclear orientation angle)를 평가하여 나타낸 그래프이다. 여기서 그래프는 평균(the mean) ± 표준편차(SD)로 나타낸다. *P < 0.050.

도 6에 나타난 바와 같이, 제대유래 중간엽 줄기세포를 투여한 실험군-UC의 4주차에서 콜라겐 구조의 점수는, 103.60 ± 16.88이였다. 대조군, 비교군-BM 및 비교군 UCB의 콜라겐 구조 점수는 각각 63.36 ± 15.45(P = 0.002), 83.30 ± 14.30 및 82.19 ± 8.21이였다. 즉, 골수유래 중간엽 줄기세포와 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 대조군에 비하여 유의한 회복을 보이지 못하였으나, 제대유래 중간엽 줄기세포는 대조군에 비하여 유의하게 회복됨을 알 수 있다.

콜라겐 섬유의 배열 점수를 살펴보면(도 6C), 제대유래 중간엽 줄기세포를 투여한 실험군-UC은 44.15 ± 4.94이고, 대조군, 비교군-BM 및 비교군 UCB은 각각 20.88 ± 6.80(P = 0.002), 23.61 ± 8.86(P = 0.006) 및 31.29 ± 8.21인 것을 확인하였다. 즉 골수유래 중간엽 줄기세포와 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 대조군에 비하여 콜라겐 섬유의 배열 손상이 거의 회복되지 못하였으나, 제대유래 중간엽 줄기세포는 대조군에 비하여 유의하게 콜라겐 섬유 배열이 회복됨을 확인하였다.

섬유모세포의 밀도 점수를 살펴보면(도 6D~6G), 제대유래 중간엽 줄기세포를 투여한 실험군-UC는 1594.93 ± 221.90 cells/mm²이고, 대조군, 비교군-BM 및 비교군 UCB은 각각 1887.71 ± 407.93 cells/mm², 1944.60 ± 117.16 cells/mm² 및 2335.03 ± 350.40 cells/mm²인 것을 확인하였다. 즉 골수유래 중간엽 줄기세포와 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 대조군에 비하여 섬유아세포의 밀도 변화가 거의 나타나지 않았으나, 제대유래 중간엽 줄기세포는 대조군에 비하여 유의하게 섬유아세포의 밀도 점수가 감소하였음을 확인하였다.

섬유모세포의 핵 모양을 분석한 결과(도 6F), 제대유래 중간엽 줄기세포를 투여한 실험군-UC는 0.24 ± 0.06이고, 대조군, 비교군-BM 및 비교군 UCB은 각각 0.35 ± 0.06, 0.31 ± 0.04 및 0.30 ± 0.04인 것을 확인하였다. 즉 골수유래 중간엽 줄기세포와 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 대조군에 비하여 섬유모세포의 둥근 핵의 비율이 유사하나, 제대유래 중간엽 줄기세포는 대조군에 비하여 섬유아세포의 둥근 핵의 비율이 현저히 감소됨을 확인하였다.

섬유모세포의 기울기를 분석한 결과(도 6G), 제대유래 중간엽 줄기세포를 투여한 실험군-UC는 7.75 ± 4.01이고, 대조군, 비교군-BM 및 비교군 UCB은 각각 18.05 ± 6.20, 17.73 ± 3.75 및 13.76 ± 3.47인 것을 확인하였다. 즉 골수 유래 중간엽 줄기세포와 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 대조군과 유사한 높은 섬유모 기울기를 가졌으나, 제대유래 중간엽 줄기세포는 대조군에 비하여 섬우모세포의 기울기가 현저히 감소하였음을 확인하였다.

실험예 6. 건 내의 이소성 변화 평가

실험예 4로부터 제조된 각 그룹별 슬라이드를 사프라닌 O-패스트 그린(safranin-O/fast green, Saf-O)을 염색한 후, 광학 현미경을 이용하여 이미지를 얻었다. image J 프로그램을 이용하여, 상기 이미지(전체 건 조직)로부터 글리코사미노글리칸 풍부영역(적색 영역)이 차지하는 넓이를 분석하였다. 글리코사미노글리칸 풍부 영역(glycoaminoglycan(GAG)-rich area; 건 조직 내에 비특이적인 연골 조직이 발생한 상태)은 이소성 연골형성과 연관되어 있으므로, 이를 통해 이소성 연골형성 여부를 평가할 수 있다.

또한, 이소성 골화(area of ossification; 건 조직내에 비특이적인 골 조직이 발생한 상태)의 발생을 평가하기 위해, 실험예 4로부터 제조된 각 그룹별 슬라이드를 H&E로 염색한 후, image J를 이용하여 분리, 군집 및 막대모양의 foci 영역의 넓이를 분석하였다.

도 7은 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 극상근-상완골에서 건 조직을 회수하고, 이로부터 건 내 이소성 변화를 분석한 결과이다. 도 7A는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건을 Saf-O로 염색한 후 촬영한 사진(배율; X200)이다. 도 7B는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건에 대한 글리코사미노글리칸 풍부영역(GAG-rich area)을 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 7C는 실험예 1로부터 제조된 대조군(Saline), 실험군-UC(UC-MSC), 비교군-BM(BM-MSC), 비교군-UCB(UCB-MSC)을 2주와 4주차에 희생하여 수득한 건에 대한 이소성골화 영역(area of ossification)을 측정하여 나타낸 그래프이다. 여기서 그래프는 평균(the mean) ± 표준편차(SD)를 나타낸다. *P < 0.050.

도 7에 나타난 바와 같이, 제대유래 중간엽 줄기세포를 투여한 실험군-UC의 글리코사미노글리칸 풍부영역(4 주)은 176.16 ± 63.28 mm²이고, 대조군, 비교군-BM 및 비교군 UCB의 글리코사미노글리칸 풍부영역(4 주)은 각각 939.50 ± 148.66 mm²(P < 0.000), 1428.32 ± 134.16 mm²(P < 0.000) 및 788.64 ± 194.95 mm²(P < 0.000)인 것으로 확인되었다. 즉, 골수유래 중간엽 줄기세포는 대조군보다 이소성 연골형성이 오히려 증가하였으며, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포는 대조군과 유사한 정도로 이소성 연골이 형성되었으나, 제대유래 중간엽 줄기세포는 대조군보다 유의하게 이소성 연골 형성이 감소하였음을 확인하였다(도 7B).

이소성 골화를 살펴보면, 제대유래 중간엽 줄기세포를 비롯한 다른 모든 군에서 비특이적인 골형성이 이루어지지 않았음을 확인하였다.

건 질환의 치료가 어려운 이유는, 건이 손상되고 회복될 때, 원래 정상 조직으로 회복되지 않고 불규칙한 콜라겐 섬유와 많은 혈관으로 이루어진 반흔 조직(scar tissue)으로 대체되어 회복되기 때문이다. 상술한 실험을 통해, 본 발명의 제대유래 중간엽 줄기세포는 골수유래 중간엽 줄기세포와 제대혈유래 중간엽 줄기세포보다 유의적으로 콜라겐 형성 및 구조화 그리고 정렬성의 향상을 도와, 건의 결손 부위가 반흔 조직으로 대체되지 않고 정상적인 건 조직으로 채워질 수 있도록 함을 확인하였다.

또한 줄기세포를 적용시, 이소성 연골과 골화를 유도하여 어깨의 통증과 재파열 및 합병증의 빈도를 높이는 등의 부작용이 나타날 수 있는데, 본 발명의 제대 유래 중간엽 줄기세포는 골수유래 중간엽 줄기세포와 제대혈유래 중간엽 줄기세포와 달리 이소성 연골 형성을 억제하였으며, 이소성 골화를 유도하지 않으므로, 임상 적용에 부작용이 없으며 오히려 건 질환에 적용 시 정상적인 건 조직, 기능을 회복할 수 있도록 함을 알 수 있다.

따라서, 건 질환, 특히 회전근개 전층 파열 건 손상시, 제대유래 중간엽 줄기세포가 골수유래 중간엽 줄기세포와 제대혈유래 중간엽 줄기세포 등의 다른 줄기세포보다 거시적 측면 및 조직학적 측면에서 유의적으로 가장 효과적이며, 정상적인 건 조직과 기능을 회복할 수 있도록 함과 동시에 이소성 골형성과 같은 부작용없이 적용이 가능함을 확인하였다.

실험예 7. Zkscan8 유전자를 형질도입한 제대유래 중간엽 줄기세포에 대한 거시적 평가

본 기관의 실험동물 연구위원회에 의해 승인되었고 승인된 절차에 따라 진행되었다(IACUC_2019_0044). 수컷 Sprague-Dawley 랫트(12주, 340~360 g)를 4 개의 군(1) 정상군(Normal group); 2) 생리식염수군(Saline group); 3) 제대유래 중간엽 줄기세포군(MSC group); 4) Zkscan8 유전자가 형질도입된 제대유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group))으로 나눠 제조하였다.

졸레틸(30 ㎎/㎏) 및 럼푼(10 ㎎/㎏)을 사용하여 마취를 유도하였고, 모든 실험에는 랫트의 왼쪽 어깨만을 사용했다. 먼저 랫트의 발바닥을 손톱으로 살짝 눌러 마취가 제대로 되었는지 확인한 후 수술을 수행하였다. 다음 왼쪽 어깨의 견봉을 촉지하고 앞가쪽 피부를 2 ㎝ 절개하였다. 견봉에 부착되어 있는 승모근과 삼각근을 절개하여 극상근의 건을 노출시킨 후, 극상근의 건과 상완골두와의 연골 부위에서 1 ㎜가 떨어진 곳에 2 ㎜ 지름(건 넓이의 약 50% 이상)을 가진 생검 펀치(Biopsy Punch)(BP-20F, Kai Medical Europe GmbH, Bremen, Germany)로 둥근 모양의 전층 파열 건 손상을 만들었다. 그 후 30 G 바늘의 주사기를 이용하여 파열된 부위 양쪽에 남아있는 건에 2) 10 ㎕의 생리식염수, 3) 제대유래 중간엽 줄기세포(1 × 10⁶ cells/10㎕ 생리식염수) 그리고 4) Zkscan8 유전자가 형질도입된 제대유래 중간엽 줄기세포(1 × 10⁶ cells/10㎕ 생리식염수)를 두 번에 나눠서 주입시켰다. 승모근과 삼각근을 4-0 Vicryl 봉합사(W9074, Ethicon, Cincinnati, OH, USA)로 봉합하고, 피부는 블랙실크(Black silk)(SK439, AILee, Busa, Korea)로 봉합한 후 상처 부위를 소독하였다. 수술이 완료된 후, 랫트에게 자유로운 케이지 활동을 허하였다.

각 그룹의 랫트는 수술 후 2 주와 4 주에 희생되었고 극상근의 건을 수확하여 거시적, 조직학적 그리고 생역학적 평가에 사용했다.

각 그룹의 랫트는 수술하고나서 2 주, 4 주가 지났을 때, 이상화탄소 챔버에서 희생시켰다. 상완골의 머리와 극상근을 제거하지 않고 랫트의 극상근의 건의 원래 모습을 유지하며 수확하였다. 건의 재생을 거시적으로 평가하기 위하여, 실험예 3의 Stoll 수정된 반정량 평가 방법을 이용하였다[Stoll C, John T, Conrad C et al. Healing parameters in a rabbit partial tendon defect following tenocyte/biomaterial implantation. Biomaterials 2011;32(21):4806-4815].

도 11은 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 제대유래 중간엽 줄기세포(MSC group) 및 Zkscan8 유전자가 형질도입된 제대유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건의 거시적 모습이다. 이때 건의 결손 상태를 명확하게 관찰하기 위해, 결손 주위의 주변 조직들을 제거하였다.

도 12는 정상군(Normal group), 생리식염수군(Saline group), 제대유래 중간엽 줄기세포군(MSC group) 및 Zkscan8 유전자가 형질도입된 제대유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)에 대한 실험시작 2 주 및 4 주째 극상건에 대한 총 거시적점수(the total macroscopic score)를 분석하여 나타낸 결과이다. 그래프는 평균(the mean) ± 표준편차 (SD)를 나타낸다. *P < 0.050.

도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, 외형적으로 심한 손상을 평가하는 총 거시적 점수를 각 군별로 비교하였다. 2 주째일 때 Zkscan8 유전자가 형질도입된 제대유래 중간엽 줄기세포군(실시예 2)(MSC-Zk8 group)은 4.75 ± 0.46이였으나, 생리식염수군과 제대유래 중간엽 줄기세포군은 각 10.75 ± 1.28(p < 0.000), 7.25 ± 0.89 (P < 0.000)으로 손상 정도가 심각한 것을 알 수 있다. 특히 Zkscan8 유전자가 형질도입된 제대유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 염증, 주위 조직과의 유착, 건의 두께 변수에서 다른 군들에 비해 낮은 점수(낮은 손상)을 나타내는 것을 확인하였다.

4 주째일 때, Zkscan8 유전자가 형질도입된 제대유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 총 거시적 점수가 2.75 ± 0.46이였고, 생리식염수군과 제대유래 중간엽 줄기세포군은 각 9.00 ± 0.00(P < 0.000) 그리고 4.25 ± 0.89 (P < 0.000)인 것으로 확인하였다. 4주째일때는 Zkscan8 유전자가 형질도입된 제대유래 중간엽 줄기세포군이 제대유래 중간엽 줄기세포군보다 낮은 점수를 나타내었다.

상술한 실험을 통해 Zkscan8가 과발현될 경우, 제대유래 중간엽 줄기세포의 조직 손상 회복 능력이 상승함을 알 수 있다. Zkscan8 유전자가 형질도입된 제대유래 중간엽 줄기세포군(MSC-Zk8 group)은 제대유래 중간엽 줄기세포보다 빠른 시간 내에 건 손상에 의해 야기될 수 있는 환자의 고통과 증상을 예방 또는 치료하는 효과를 나타냄을 확인하였다.

<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL ACESOSTEM BIOSTRATEGIES INC. <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating tendor or ligament diseases comprising Umbilical Cord Derived-Stem Cells <130> HPC9501 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1737 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zkscan 8(Zinc finger protein with KRAB and SCAN domains 8) <400> 1 atggctgaag aatcaagaaa gccttcagcc ccatccccac cagaccagac tcctgaagag 60 gatcttgtaa tcgtcaaggt agaggaggat catggttggg accaggaatc tagtctgcat 120 gaaagtaacc ctcttggcca agaagtgttc cgcctgcgct tcaggcagtt acgctaccag 180 gagacactag gaccccgaga agctctgatc caactacggg ccctttgcca tcagtggctg 240 aggccagatt tgaacaccaa ggaacagatc ctggagctgc tggtgctgga gcagttcttg 300 accatcctac ctgaggagct ccagacactg gttaaggaac atcagctaga gaacggagag 360 gaggtggtga ccctattaga ggatttggaa aggcagattg atatactagg acgaccagtc 420 tcagctcgcg tacatggaca tagggtactc tgggaggagg tagtacattc agcatctgca 480 ccagagcctc caaatactca gctccaatct gaggcaaccc aacataaatc 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Leu Leu Gly Arg Leu Glu Arg Gln Arg Gly Asn Pro Thr Gln Glu Arg 305 310 315 320 Arg His Lys Cys Asp Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ala Gln Ser Ser Gly 325 330 335 Leu Val Arg His Trp Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys 340 345 350 Asn Val Cys Gly Lys Ala Phe Ser Tyr Arg Ser Ala Leu Leu Ser His 355 360 365 Gln Asp Ile His Asn Lys Val Lys Arg Tyr His Cys Lys Glu Cys Gly 370 375 380 Lys Ala Phe Ser Gln Asn Thr Gly Leu Ile Leu His Gln Arg Ile His 385 390 395 400 Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Gln Cys Asn Gln Cys Gly Lys Ala Phe Ser 405 410 415 Gln Ser Ala Gly Leu Ile Leu His Gln Arg Ile His Ser Gly Glu Arg 420 425 430 Pro Tyr Glu Cys Asn Glu Cys Gly Lys Ala Phe Ser His Ser Ser His 435 440 445 Leu Ile Gly His Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys 450 455 460 Asp Glu Cys Gly Lys Thr Phe Arg Arg Ser Ser His Leu Ile Gly His 465 470 475 480 Gln Arg Ser His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Asn Glu Cys Gly 485 490 495 Arg Ala Phe Ser Gln Lys Ser Gly Leu Ile Glu His Gln Arg Ile His 500 505 510 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Claims (6)

1. 제대유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 건 또는 인대 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 제대유래 줄기세포는 Scleraxis 유전자, 제1형 콜라겐 유전자 및 제3형 콜라겐 유전자를 발현하는 것을 특징으로 하는 건 또는 인대 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 건 질환은 아킬레스 건 질환, 슬개건 질환, 외측 상과염, 내측 상과염, 족저 근막염, 회전근개 건 질환, 건활막염, 건병증, 건염, 건초염, 건 손상 및 건 박리로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상이고,
   상기 인대 질환은 십자인대 손상, 족관절 인대 손상, 측부인대 손상, 인대 파열 및 인대 염좌로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 건 또는 인대 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 손상된 건 또는 인대가 재생되는 과정에서 유발되는 이소성 골화증을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 하는 건 또는 인대 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
5. 제대유래 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 건 또는 인대 질환에 의한 이소성 골형성 예방 또는 치료용 약학 조성물.
6. 제5항에 있어서,
   상기 이소성 골형성은 손상된 건 또는 인대가 재생되는 과정에서 유발되는 것을 특징으로 하는 조성물.

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