JP2020152698A

JP2020152698A - 間葉系幹細胞のエキソソームおよびその使用

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Publication number: JP2020152698A
Application number: JP2019054780A
Authority: JP
Inventors: 大清丁; Dah-Ching Ding; 坤佶呉; Kun-Chi Wu; 宇勳張; Yu-Hsun Chang
Original assignee: Buddhist Tcbc Medical Found; BUDDHIST TCBC MEDICAL FOUNDATION
Current assignee: Buddhist Tcbc Medical Found; BUDDHIST TCBC MEDICAL FOUNDATION
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2020-09-24
Also published as: TW202034932A; US20200297761A1; TWI722400B

Abstract

【課題】本開示は、間葉系幹細胞のエキソソームを含む医薬組成物、およびその関節疾患を予防または治療するための使用であって、必要とする対象に治療有効量の前記医薬組成物を投与することを含む使用を提供する。これにより、軟骨組織の保持、軟骨再生の増進、および損傷した関節の修復を行って、関節疾患を予防または治療する。【選択図】図６

Description

本開示は、間葉系幹細胞のエキソソームを含む医薬組成物、およびその関節疾患を予防または治療するための使用に関する。

骨関節症（ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＯＡ）は、退行性関節疾患とも呼ばれ、関節軟骨の退化および損傷、例えば、軟骨下骨の変化および骨棘の形成を特徴とし、よく見られる慢性変性関節疾患であり、主に高齢者の膝やお尻のような荷重の係る関節に影響を及ぼす。統計によると、１０％を超えるアメリカ成人が臨床的に骨関節症と診断されており、これは入院のよくある原因の４位であり、総膝関節置換術および股関節置換術の最も一般的な原因でもある（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｌ．＆Ｈｅｌｍｉｃｋ，Ｃ．Ｇ．，ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｒｓｉｎｇ，１１２，Ｓ１３−１９（２０１２））。骨関節症に罹りやすい全身的要因は、年齢、性別、民族、骨密度、エストロゲン補給、遺伝および栄養が含まれ、局所的な生体力学的要因は、肥満、関節損傷、関節変形、運動および筋力低下が含まれ、これらは骨関節症の悪化を引き起こす（Ｆｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．ｅｔａｌ．，ＡｎｎａｌｓｏｆＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，１３３，６３５−６４６（２０００））。

また、骨関節症は単純な退行性疾患だけではない。最近の研究では、低い炎症作用は、疾患の症状を悪化させるだけでなく、疾患の進行をも加速させることを発見した。例えば、活性化したマクロファージおよび他の先天性免疫細胞は、軟骨損傷を促進させる炎症性サイトカインを放出することができる（Ｌｉｕ−Ｂｒｙａｎ，Ｒ．＆Ｔｅｒｋｅｌｔａｕｂ，Ｒ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．，１１，３５−４４，（２０１５））。また、骨関節症患者から得られた滑膜組織では、ＴＮＦ−α、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ８およびＩＬ２２などを含む炎症誘発性サイトカインの発現に関連する免疫細胞の数の増加が見られる。一方、ＭＭＰ１、３、１３は、細胞外マトリックスのリモデリングに直接関与する。

現在、骨関節症に対する治療および処置は、薬物治療、非薬物治療および外科的処理が含まれている。

骨関節症を緩和する薬物治療としては、アセトアミノフェン、非ステロイド系抗炎症薬、オピオイド薬、局所鎮痛薬、コルチコステロイド注射剤およびヒアルロン酸注射剤が含まれ（Ｓｉｎｕｓａｓ，Ｋ．，Ａｍ．Ｆａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ．，２０１２Ｊａｎ．１；８５（１）：４９−５６）、グルコサミンおよび硫酸コンドロイチンは一定の保護作用がある（Ｌｅｅ，Ｙ．Ｈ．，Ｗｏｏ，Ｊ．Ｈ．，Ｃｈｏｉ，Ｓ．Ｊ．，Ｊｉ，Ｊ．Ｄ．＆Ｓｏｎｇ，Ｇ．Ｇ．，ＲｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，３０，３５７−３６３（２０１０））。また、薬物治療と非薬物治療との併用は、疼痛の制御においてはより有効であることを見出した。さらに、運動は、有効な介入治療だけでなく、骨関節症を予防する方法でもあり、他の物理学療法としては、装具および足用の補助器具が含まれる。

それにもかかわらず、膝関節、股関節および肩甲上腕関節の総関節置換術は、依然として最も有効な治療方法であり、関節機能をほぼ正常に回復させることができる。しかしながら、通常、骨関節症の軟骨欠損は大きすぎるので、骨軟骨（ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ）移植、自己軟骨膜、骨膜移植および軟骨細胞の移植がいずれも適用できない可能性がある（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｅ．，ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＫｎｅｅＳｕｒｇｅｒｙ，１１，４２−４６（１９９８），Ｖｅｒｓｉｅｒ，Ｇ．，Ｄｕｂｒａｎａ，Ｆ．＆ＦｒｅｎｃｈＡｒｔｈｒｏｓｃｏｐｙ，Ｓ．，Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ＆Ｔｒａｕｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｓｕｒｇｅｒｙ＆Ｒｅｓｅａｒｃｈ：ＯＴＳＲ９７，Ｓ１４０−１５（２０１１））。最近の研究では、新たに発見されたカルトゲニン（ｋａｒｔｏｇｅｎｉｎ、ＫＧＮ）は、軟骨組織における間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）を刺激して軟骨細胞に分化させることができ、骨関節症の初期段階において、ＫＧＮの局所投与により、損傷関節を改善できることが示されている（Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．ｅｔａｌ．，Ａｓｔｅｍｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄａｐｐｒｏａｃｈｔｏｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｐａｉｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ３３６，７１７−７２１（２０１２））。

また、組織工学および幹細胞療法も、骨関節症の研究に適用されている（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｔ．ｅｔａｌ．，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓａｎｄＲｈｅｕｍａｔｉｓｍ，６０，１３９０−１４０５（２００９）；Ｔｏｇｈｒａｉｅ，Ｆ．Ｓ．ｅｔａｌ．，ＴｈｅＫｎｅｅ，１８，７１−７５（２０１１））。幹細胞療法は、永久的な生物学的治療を提供することができるが、胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＥＳＣｓ）、人工多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ｉＰＳＣｓ）、胎児幹細胞および成人幹細胞などの様々な起源の幹細胞はいずれもある程度の分化能があり、骨関節症を治療するための幹細胞療法は幹細胞の軟骨に分化する能力に依存するので、移植した幹細胞が罹患関節において生存できることが必要となり、幹細胞の自己複製能と分化能が再生医療にとって非常に重要となる。

近年、広範囲の幹細胞研究では、ヒト胚性幹細胞（ｈｕｍａｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ｈＥＳＣｓ）およびｉＰＳＣｓは、ほとんどすべての種類のヒト細胞に分化でき、高い自己複製能の利点を有することを見出した。組織工学および再生医療において、ｈＥＳＣｓは幹細胞療法の優先的な選択であり、例えば、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄損傷、卒中、心臓病、糖尿病、造血系疾患、肝疾患および肺疾患などの多くの疾患の治療に使用されている（Ｋｅｌｌｅｒ、Ｇ．、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９，１１２９−１１５５、（２００５））が、ｉＰＳＣｓは、個人カスタマイズの潜在力をより有するので、ＥＳＣｓよりも好ましい。

しかしながら、ｈＥＳＣｓおよびｉＰＳＣｓの幹細胞療法は欠点がある。例えば、幹細胞由来のヒト細胞は、奇形腫の形成や免疫反応を引き起こすリスクがある（Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２，１１４５−１１４７（１９９８））。また、マウス胚性線維芽細胞（ｍｏｕｓｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ、ＭＥＦｓ）は、ｈＥＳＣｓの成長を維持するための最も一般的に使用されているフィーダー層であるが、ヒト細胞成分ではないので、ヒトにおける臨床的使用を制限する可能性があるため、このようなｈＥＳＣｓ培養法は疑問視されている。ｈＥＳＣｓおよびｉＰＳＣｓを培養するための新しい方法としては、例えば、フィーダー層なしおよび血清なし、ならびに他のヒト由来細胞との共培養などの方法が開発されているが、腫瘍形成性が依然としてこれらの幹細胞の臨床応用を制限している（Ｘｕ，Ｃ．ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，９７１−９７４，（２００１）；Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｍ．，Ｆｏｎｇ，Ｃ．Ｙ．，Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｋ．，Ｗｏｎｇ，Ｐ．Ｃ．＆Ｂｏｎｇｓｏ，Ａ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０，９３３−９３６（２００２））。

さらに、骨関節症の関節に存在するインターロイキン−１αやＴＮＦ−αなどの異化因子は、幹細胞の軟骨細胞分化を阻害することによって軟骨生成を減少させるので、患者の関節の修復に対しては、軟骨細胞の導入に加えて、炎症性サイトカインの減少も同様に重要である。

したがって、骨関節症の治療法は、依然として打破する必要があり、安全で有効な治療法のさらなる開発が必要となる。

本開示は、間葉系幹細胞のエキソソームを含む医薬組成物、およびその関節疾患を予防または治療するための使用を提供する。具体的には、本開示は、対象の関節疾患を予防または治療する方法であって、対象に医薬組成物を投与することを含み、当該医薬組成物は治療有効量の間葉系幹細胞のエキソソームを含む方法を提供する。

本開示の一つの具体的な実施形態において、前記間葉系幹細胞は、臍帯間葉系幹細胞、胎児間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、羊水間葉系幹細胞、骨髄間葉系幹細胞または脂肪間葉系幹細胞である。別の具体的な実施形態において、前記間葉系幹細胞は、ヒト臍帯間葉系幹細胞である。さらに別の実施形態において、前記間葉系幹細胞は、分化誘導されていない。一つの具体的な実施形態において、前記間葉系幹細胞は、未分化多能性間葉系幹細胞である。別の具体的な実施形態において、前記間葉系幹細胞は、第３継代〜第６継代まで培養される。さらに別の実施形態において、前記間葉系幹細胞は、血清を含まない培地で培養される。

本開示の一つの具体的な実施形態において、前記間葉系幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−ＡＢＣのうちの少なくとも１つの細胞表面マーカーを示す。別の具体的な実施形態において、前記間葉系幹細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびＨＬＡ−ＤＲの細胞表面マーカーを示さない。さらに別の実施形態において、前記間葉系幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−ＡＢＣの細胞表面マーカーを示し、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびＨＬＡ−ＤＲの細胞表面マーカーを示さない。

一つの具体的な実施形態において、前記対象はヒトである。別の具体的な実施形態において、前記関節疾患は、関節軟骨欠損、骨関節症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、肩関節周囲炎、軟骨退化または前十字靭帯損傷である。さらに別の実施形態において、前記関節疾患は骨関節症である。一つの具体的な実施形態において、前記医薬組成物は、必要とする対象に注射で投与される。

一つの具体的な実施形態において、前記医薬組成物は、損傷した関節の修復、軟骨組織の保持、または軟骨再生の増進のために使用されることにより、関節疾患を予防または治療する。

一つの具体的な実施形態において、本開示の関節疾患を予防または治療するための医療組成物を使用した対象は、本開示の組成物を使用していない対象に比べて、より厚い軟骨組織を有する。別の具体的な実施形態において、本開示の関節疾患を予防または治療するための医療組成物を使用した対象は、使用していない対象に比べて、軟骨組織の厚さが少なくとも２倍となる。さらに別の具体的な実施形態において、本開示の関節疾患を予防または治療するための医療組成物を使用した対象は、使用していない対象に比べて、軟骨組織の厚さが２．５倍以上となる。

一つの具体的な実施形態において、前記医療組成物における前記エキソソームは、１×１０^７〜１×１０^９個の間葉系幹細胞から産生される。別の具体的な実施形態において、前記エキソソームは、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１のうちの少なくとも１つの細胞表面マーカーを示す。さらに別の具体的な実施形態において、前記エキソソームは、ＧＭ１３０の細胞表面マーカーを示さない。またさらに別の具体的な実施形態において、前記エキソソームは、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１の細胞表面マーカーを示し、ＧＭ１３０の細胞表面マーカーを示さない。

動物モデルにおいて、エキソソームで修復されていないＯＡ群およびエキソソームで修復されたＯＡ＋ＥＸＯ群の関節を目で検査することを示す図である。図中の矢印は関節軟骨が破壊された箇所を示す。

正常の膝関節とＯＡ群の関節についての組織学的評価および免疫組織化学的分析の結果を示す図である。

ヒト臍帯間葉系幹細胞の細胞表面マーカーの特徴および分化能を示す図である。図３Ａにおいて、第３継代のヒト臍帯間葉系幹細胞のフローサイトメトリー結果は、当該細胞が細胞表面マーカーＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−ＡＢＣを示すが、細胞表面マーカーＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびＨＬＡ−ＤＲを示さないことを示す。図３Ｂにおいて、１４日後のヒト臍帯間葉系幹細胞は、脂肪細胞の生成を示すオイルレッド染色を示す。図３Ｃにおいて、１４日間の骨形成作用後のヒト臍帯間葉系幹細胞は、骨細胞の生成を示すアリザリンレッド染色を示す。図３Ｄにおいて、軟骨生成培地中で３週間培養したヒト臍帯間葉系幹細胞は、軟骨細胞の生成を示す塊を形成する。スケールバー＝１００μｍ。

細胞表面マーカーＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１を示すが、細胞表面マーカーＧＭ１３０は示さないという、精製されたヒト臍帯間葉系幹細胞エキソソームの細胞表面マーカーの特徴を示す図である。

エキソソームで修復されていないＯＡ群（図５Ａ、図５Ｃ、図５Ｅ）およびエキソソームで修復されたＯＡ＋ＥＸＯ群（図５Ｂ、図５Ｄ、図５Ｆ）の関節の異なる拡大倍率でのアグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）の免疫組織化学的分析の結果を示す図である。図５Ｃおよび図５Ｄにおけるスケールバー＝１０００μｍ、図５Ｅおよび図５Ｆにおけるスケールバー＝１００μｍ、矢印は骨関節症が発生した軟骨の内側を示す。

エキソソームで修復されていないＯＡ群およびエキソソームで修復されたＯＡ＋ＥＸＯ群の軟骨の厚さの比較統計図である。＊＊ｐ＜０．０１。マン−ホイットニー検定を用いて比較する（ｎ＝５）。

間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＭＳＣｓ）は、異なる起源に由来する様々な種類、例えば、骨髄間葉系幹細胞（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＢＭ−ＭＳＣｓ）、臍帯血間葉系幹細胞（ｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｂｌｏｏｄ−ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＵＣＢ−ＭＳＣｓ）、ヒト臍帯間葉系幹細胞（ｈｕｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＨＵＣＭＳＣｓ）、脂肪組織間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅｔｉｓｓｕｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＡＤＳＣｓ）、筋肉幹細胞（ｍｕｓｃｌｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＭＤＳＣｓ）および歯髄幹細胞（ｄｅｎｔａｌｐｕｌｐｓｔｅｍｃｅｌｌｓ、ＤＰＳＣｓ）などを含み、これらは幹細胞療法における軟骨細胞の再生に使用されている。これらの間葉系幹細胞において、骨髄間葉系幹細胞、脂肪組織間葉系幹細胞および筋肉幹細胞は、数が豊富であり、骨関節症のリスクがある成人から単離できるため、骨関節症の幹細胞療法に使用される潜在力を有する。

軟骨細胞への直接分化により損傷した骨関節症の関節を修復することに加えて、間葉系幹細胞のパラクリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）作用は、免疫細胞に対して重要な抗炎症作用および免疫抑制作用を有する。間葉系幹細胞は、Ｔ細胞と相互作用し、初代Ｔリンパ球の増殖を阻害し、Ｔｈ１またはＴｈ１７表現型に分化する。環境からの可溶性および接触依存性のシグナルはいずれも間葉系幹細胞の治療効果を引き起こすことができるので、間葉系幹細胞によって細胞外環境に分泌される様々なインターロイキンおよび細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶｓ）は、骨関節症の治療において重要な役割を果たす。

細胞外小胞は、細胞間コミュニケーションの重要なメディエータであり、正常な生理学的機能に関与するだけでなく、疾患の発生および発症にも関与する。エキソソームは、細胞外小胞の一種であり、直径が４０〜１００ｎｍであり、血液、尿液、気管支肺胞洗浄液、母乳、羊水、滑液、胸膜滲出液および腹水などを含むあらゆる種類の体液から遠心分離によって単離できる。また、エキソソームは特異的なマーカーが欠乏することが知られている。

間葉系幹細胞の細胞外小胞（ＭＳＣ−ＥＶ）は、本来の機能を失うことなく保存することができ、また安全性を有するので、間葉系幹細胞の直接移植に代わる代替的な無細胞療法となり得る。間葉系幹細胞の細胞外小胞は、心血管疾患、急性腎臓または肝臓の損傷、肺損傷および皮膚創傷治癒の様々な動物モデルにおいて研究されている（Ｒａｎｉ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２３，８１２−８２３，（２０１５））が、これまで、骨関節症モデルにおける間葉系幹細胞の細胞外小胞に関する研究がなかった。

骨関節症の病原性メカニズムを代表できる動物モデルは、新しい治療法の開発にとっては非常に重要であり、患者の関節に関連する臨床的および病理学的変化を模倣しなければならない。本開示は、前十字靭帯切断術（ａｎｔｅｒｉｏｒｃｒｕｃｉａｔｅｌｉｇａｍｅｎｔｔｒａｎｓｅｃｔｉｏｎ、ＡＣＬＴ）の骨関節症のウサギモデルを使用し、このモデルは、骨関節症の病因を究明するために使用されたことがあり、また、幹細胞治療を含む骨関節症治療法のためにも使用されたこともある。これまで、この動物モデルは、エキソソーム治療法に関する研究がなされていなかった。

以下、特定の具体的な実施形態により本開示の実施形態を説明するが、当業者は本開示の内容に基づいて、本開示の利点および効果を容易に理解することができる。本開示は、他の異なる実施形態によっても実施または適用することができ、本明細書における詳細は、異なる観点および用途に基づいて、本開示の精神から逸脱することなく、異なる修正および変更を行うこともできる。以下の実施例は、例示のみを目的としており、本開示の限定として解釈されるべきではない。

実施例１：動物モデルの確立

この実施例では、１２匹の１４ヶ月齢ニュージーランド白ウサギ（ＮｅｗＺｅａｌａｎｄＷｈｉｔｅ、ＮＺＷ）を使用した。ウサギの膝関節を、（１）ＯＡ群：骨関節症を誘発し、未治療、ｎ＝６、および（２）実験群（ＯＡ＋ＥＸＯ）：骨関節症を誘発し、エキソソームによる治療を施し、ｎ＝６という２つの群に分けた。

すべてのウサギをケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（８ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射で麻酔した。両膝を剃毛して、ポビドンヨード液（Ｂｅｔａｄｉｎｅ（Ｒ））で消毒した。経皮的に内側膝蓋骨の切り口を作り、関節切開術を行って、膝蓋骨を横方向に転位させ、膝を完全に屈曲させ、前十字靭帯（ａｎｔｅｒｉｏｒｃｒｕｃｉａｔｅｌｉｇａｍｅｎｔ、ＡＣＬ）が見られるようになった後、１５番の刃でクロスカットし、関節を滅菌食塩水で洗浄して、縫合した。関節包および関節腔滑膜を４−０ポリプロピレン縫合糸で縫合し、皮膚を３−０ナイロン縫合糸で縫合した。手術後、すべてのウサギをケージに戻し、自由に動かせて、痛みを緩和するために７日間０．２ｍｇ／ｋｇ／日のメロキシカムを経口で投与した。

前十字靭帯切断術の２ヶ月後、各群のウサギ膝関節の変化を以下の方法で調べた。

まず、関節の表面を目で検査した。ウサギを安楽死させた後、大腿骨遠位端および脛骨近位端の表面を露出させて目で検査し、２ｍＬのインディアンインクをシリンジで脛骨プラトーに注入し、２分間後、表面を食塩水で洗浄し、脛骨プラトーの染色パターンを目で観察した。その結果、図１に示すように、ＯＡ群の軟骨内側は軟骨が激しく破壊されたことを示し（矢印箇所）、また、ＯＡ群の膝関節は有意な軟骨破壊を示した（矢印箇所）。

組織変化を顕微鏡で直接観察し、軟骨破壊箇所をランダムに６点を選んでそれらの厚さを測定し、その結果は、図６におけるＯＡ群で示した通りであった。図６の全てのデータは、中央値および範囲として表されている。

組織学的評価は以下の通りであった。大腿骨遠位端および近位脛骨近位端のプラトーを除去し、１０％緩衝ホルマリン（Ｓｉｇｍａ）で４８時間固定した後、試料を１０％ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、グランドアイランド、ＮＹ、米国）で２週間脱灰し、４つの切片に切った。全ての切片をパラフィンに包埋し、連続的な矢状切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆ｅｏｓｉｎ、Ｈ＆Ｅ、Ｓｉｇｍａ）およびサフラニンＯ（ｓａｆｒａｎｉｎＯ、Ｓｉｇｍａ）で染色した。

免疫組織化学的分析の方法は以下の通り行われた。各群の２つの大腿骨遠位端を得た後、最適切断温度（ｏｐｔｉｍａｌｃｕｔｔｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、ＯＣＴ）化合物（Ｍｉｌｅｓ、Ｅｌｋｈａｒｔ、ＩＮ）に急速に包埋し、液体窒素中で急速凍結し、使用するまで−８０℃で保存した。

大腿骨関節の切片を補水した後、内在性ペルオキシダーゼを３％過酸化水素（Ｓｉｇｍａ）でブロックし、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｓｉｇｍａ）中の２．５％ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）および１ｍｇ／ｍＬプロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）の混合物を３７℃で１時間処理し、ＩＩ型コラーゲンを回収し、また、Ｘ型コラーゲンの回収は、３７℃で０．１ユニット／ｍｌのコンドロイチナーゼＡＢＣ（Ｓｉｇｍａ）で１時間処理し、トリス−ＨＣｌ（ｐＨ３．０、ＭＤＢｉｏ、台北、台湾）中の１ｍｇ／ｍＬペプシン（Ｓｉｇｍａ）で３７℃で１５分間処理した。次に、ＵｌｔｒａＶＢｌｏｃｋ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、フレモント、ＣＡ）を用いて切片を１０分間ブロックし、一次抗体（ＩＩ型コラーゲンは、マウスモノクローナル抗体であり、１：２００、ＣＰ１８、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ。Ｘ型コラーゲンは、ラットポリクローナル抗体であり、１：２００、ａｂ５８６３２、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）と３７℃で４時間反応した。

二次抗体と３０分間反応した後、ＩＩ型コラーゲンは、ビオチン化ヤギ抗マウス免疫グロブリン（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ）を使用し、また、Ｘ型コラーゲンは、ビオチン化ヤギ抗ラット免疫グロブリン（ＢｉｏｃａｒｅＭｅｄｉｃａｌ、ＷａｌｎｕｔＣｒｅｅｋ、ＣＡ）を使用し、続いてワサビペルオキシダーゼ結合したストレプトアビジン（ＢｉｏｃａｒｅＭｅｄｉｃａｌ）を使用して反応した。

０．０１％過酸化水素を含有する３，３−ジアミノベンジジン溶液で切片を染色した後、ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ）で対比染色し、Ｉｍａｇｅ−ＰｒｏＰｌｕｓ５．０版ソフトウェアを用いて、各大腿骨の関節軟骨において総面積に対するＩＩ型コラーゲンおよびＸ型コラーゲン染色領域の比率を測定した。

結果は図２に示すように、Ｈ＆Ｅ染色、サフラニンＯ染色およびＩＩ型コラーゲン免疫組織化学的分析では、ＯＡ群関節においては有意な軟骨破壊を示したため、この動物モデルは、ＯＡの病原性メカニズムを模倣し、類似の疾患特徴を示すことができると考えられるので、ＯＡ療法を効果的に評価するためのモデルとすることができる。

実施例２：ヒト臍帯間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）の増幅

ヒト臍帯の入手および使用方法は、仏教慈済総合病院の人体試験委員会（ＩＲＢ１００−１６６）によって承認され、本実験方法は、ヘルシンキ宣言に従って行われ、地域の倫理審査委員会の許可も得られ、また、実験の前に全被験者のインフォームド・コンセントが得られた。ヒト臍帯間葉系幹細胞を得るための詳細な方法は、当技術分野において公知であり、この実施例の具体的な実施形態は以下の通りであった。

簡単に説明すると、ヒト臍帯試料（長さ２０ｃｍ、重量２０ｇ）を、ハンク平衡塩溶液（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ１４１８５−０５２、グランドアイランド、ＮＹ、米国）を含む滅菌容器に収集し、２４時間以内に血管および羊膜からウォートンゼリー（Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓｊｅｌｌｙ、ＷＪ）を単離した。

まず、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋を含まないリン酸緩衝液（ＰＢＳ、Ｂｉｏｅｓｔ、Ｎｕａｉｌｌｅ、フランス）でヒト臍帯を３回洗浄し、正中方向にハサミで切断し、臍動脈、静脈血管および輪郭膜をウォートンゼリーと解離し、ウォートンゼリーを０．５ｃｍ^３未満の断片に切断し、Ｉ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）で処理し、３７℃、９５％空気および５℃ＣＯ_２の加湿環境で１４〜１８時間反応させた。

次に、上記の外植片を、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ、ＦＢＳ。ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、ＫｉｂｂｕｔｚＢｅｉｔＨａｅｍｅｋ、イスラエル）と抗生物質とを含有する低グルコースＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ、ＬＧ、Ｓｉｇｍａ）中に、３７℃、９５％空気および５℃ＣＯ_２の加湿環境で培養した。細胞を外植片から移行させるように５〜７日間静置し、得られたヒト臍帯間葉系幹細胞を第１継代とした。培地を週に２回交換し、細胞が９０％コンフルエントに達したときに、細胞を継代培養した。

実施例３：ヒト臍帯間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）の特徴および分化能

第３継代または第４継代の培養したヒト臍帯間葉系幹細胞の表面分子特徴をフローサイトメトリーによって測定した。Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｒ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、米国）を使用して、細胞をＰＢＳ中で単離し、２％ウシ胎児血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）と０．１％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）とを含有するＰＢＳで洗浄し、続いてＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＨＬＡ−ＡＢＣおよびＨＬＡ−ＤＲ（ＢＤＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、フランクリンレイクス、ＮＪ、米国）などを含んでフルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリスリンに結合した種々な抗体と一緒に反応し、フローサイトメーター（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ、米国）を使用して細胞を分析した。

その結果、図３Ａに示すように、ヒト臍帯間葉系幹細胞が示す細胞表面マーカーは、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＨＬ−ＡＢＣがあり、一方、示さない細胞表面マーカーは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびＨＬＡ−ＤＲがあった。

ヒト臍帯間葉系幹細胞の脂肪細胞に分化する能力は、脂質生成の誘導という方式によって試験した。合計５×１０^４個のヒト臍帯間葉系幹細胞を、脂肪生成培地（１０％ＦＢＳ、５μｇ／ｍＬのインスリン、０．５ｍｍｏｌ／Ｌのイソブチルメチルキサンチン、１μｍｏｌ／Ｌのデキサメタゾンおよび６０μｍｏｌ／Ｌのインドメタシンを添加したＤＭＥＭ。全ての化合物はＳｉｇｍａから購入）を含む１２ウェルプレート上に接種した。ヒト臍帯間葉系幹細胞を脂肪生成培地で１４日間培養し、培地を３日ごとに交換した。分化を行った１４日間後、分化した脂肪細胞をオイルレッド（ｏｉｌｒｅｄＯ、Ｓｉｇｍａ）で染色し、写真撮影した。

その結果、図３Ｂに示すように、分化したヒト臍帯間葉系幹細胞は、細胞質においてオイルレッド染色された大きな油滴を示した。

ヒト臍帯間葉系幹細胞の骨細胞に分化する能力は、誘導という方式によって試験した。合計１×１０^４個のヒト臍帯間葉系幹細胞を、骨生成培地（１０％ＦＢＳ、０．１μｍｏｌ／Ｌのデキサメタゾン、１０ｍｍｏｌ／Ｌのβ−グリセロリン酸エステルおよび５０μｍｏｌ／Ｌのアスコルビン酸を添加したＤＭＥＭ）を含む１２ウェルプレート上に接種した。培地を３日ごとに交換し、分化を行った１４日間後、骨細胞をアリザリンレッド（ａｌｉｚａｒｉｎｒｅｄ、Ｓｉｇｍａ）で染色し、写真撮影した。

その結果、図３Ｃに示すように、分化したヒト臍帯間葉系幹細胞は、細胞形態が直方体形状に変換され、アリザリンレッド染色が陽性を示した。

ヒト臍帯間葉系幹細胞の軟骨細胞生成能は、微小集積培養（ｍｉｃｒｏｍａｓｓｃｕｌｔｕｒｅ）という方式によって試験した。密度が２５×１０^６個細胞／ｍＬであり、総体積が３０μＬであるヒト臍帯間葉系幹細胞を、乾燥した１５ｍＬチューブ（ＢＤＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の底に接種し、３７℃の加湿環境でＣＯ_２インキュベーターに２時間置いて、各チューブに追加の軟骨生成培地（０．７５ｍＬ）を加えた。培地を４８時間ごとに交換し、３週間培養後、微小集積軟骨細胞が生成された。微小集積軟骨細胞を回収して写真撮影した後、微小集積軟骨細胞を４％パラホルムアルデヒドで４℃で２４時間固定した。次に、ＰＢＳで洗浄し、７０％エタノールに移し、組織処理を行って、パラフィン切片した（５μｍ）後、アグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ、１：１００、ＧｅｎｅＴｅｘ、ＩｒｖｉｎｅＣＡ、米国）を用いて免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）の染色を行うことにより、軟骨細胞の生成を評価した。

その結果、図３Ｄに示すように、ヒト臍帯間葉系幹細胞は、軟骨生成誘導した２１日間後、集合して集団状に凝集し、アグリカン染色が陽性を示した。

上記の結果は、ヒト臍帯間葉系幹細胞が、脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞に分化できることを示した。

実施例４：ヒト臍帯間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）エキソソームの精製

ヒト臍帯間葉系幹細胞の馴化培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉａ、ＣＭ）からＨＰＬＣによりＭＳＣ−ＥＶエキソソームを精製することは、当技術分野において公知の技術である（Ｌａｉ，Ｒ．Ｃ．ｅｔａｌ．，ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓ．，４，２１４−２２２，（２０１０）；Ｓｚｅ，Ｓ．Ｋ．ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，６，１６８０−１６８９，（２００７））。簡単に説明すると、馴化培地の調製方法は以下の通りであった。第３継代〜第６継代まで培養した８０％コンフルエントのヒト臍帯間葉系幹細胞をＰＢＳで３回洗浄し、化学的に規定された培地中で一晩培養した。前記培地は、フェノールレッドフリー低グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からなり、インスリン−トランスフェリン−セレノプロテイン（Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−Ｓｅｌｅｎｉｕｍ、ＩＴＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦＡＢ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ、ＮＪ）、グルタミン酸−ペニシリン−ストレプトマイシンおよびβ−メルカプトエタノールを添加し、ＰＢＳで培養物を３回洗浄し、新鮮な化学的に規定された培地を添加した。３日後、培地を収集して５００×ｇで遠心分離し、上清液を０．２μｍフィルターを用いて濾過した。馴化培地の調製過程において、血清を使用しておらず、また、細胞を分化誘導していなかった。ヒト臍帯間葉系幹細胞培養物からの無血清馴化培地は、１００ｋＤａのＭＷＣＯ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＣｕｔＯｆｆ）膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）で接線流濾過により収集し、５０倍に濃縮した。

濃縮した馴化培地を収集し、３０００×ｇで１５分間遠心分離することにより、細胞および細胞断片を除去した。上清液を滅菌容器に移し、適切な体積のＥｘｏＱｕｉｃｋ−ＴＣ（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ、米国）を加え、十分に混合するように容器をひっくり返すかまたはフリックし、４℃で一晩（少なくとも１２時間）冷蔵した。反応の期間においては、容器を直立させたままで、回転させたり混合したりしなかった。ＥｘｏＱｕｉｃｋ−ＴＣ／馴化培地の混合物を１５００×ｇで３０分間遠心分離した（遠心分離は室温または４℃で実施することができる）。遠心分離した後、エキソソームは、容器の底にベージュ色または白色の沈殿物として表示された。上清液を吸引し、１５００×ｇで５分間遠心分離し、残ったＥｘｏＱｕｉｃｋ−ＴＣ溶液を収集し、沈殿したエキソソームの集団状物資を壊さないように残りの液体をすべて吸引して除去した。エキソソームの沈殿物を１００〜５００μｌの滅菌した１×ＰＢＳで再懸濁し、関節に注射した。

マイクロビシンコニン酸タンパク質アッセイ（ｍｉｃｒｏ−ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄａｓｓａｙ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒｅｉｅｉｃｈ、ドイツ）を用いてエキソソーム試料のタンパク質濃度を測定し、また、精製されたエキソソームをウエスタンブロッティングによって測定した。５μｇの濃縮したエキソソーム試料を用いて、試料緩衝液（ジチオトレイトール、０．１％ＳＤＳ、０．１Ｍトリス−ＨＣｌ。ｐＨ７．０）で処理し、９５℃で５分間煮沸し、次いで、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で単離した。試料をＰＶＤＦ膜（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄ、ドイツ）に移し、エキソソームのマーカータンパク質ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはネガティブマーカーＧＭ１３０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を認識できる抗体を使用した。

その結果、図４に示すように、上記の方法によって精製されたヒト臍帯間葉系幹細胞エキソソームは、典型的なエキソソームの細胞表面マーカーの特徴（ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１は陽性を示し、ＧＭ１３０は陰性を示すことを含む）を示した。

実施例４：ヒト臍帯間葉系幹細胞（ＨＵＣＭＳＣｓ）のエキソソームによる修復

ＡＣＬＴ手術した８週間後に、０．４ｍＬのエキソソームをＯＡ＋ＥＸＯ群の膝関節に注射した。各群のウサギは、ＥＸＯ治療した１２週間後に、１５〜４０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタール（３％）で鎮静され、ＣＯ_２を吸入させて犠牲にさせた。目で検査すると、エキソソームで修復されたＯＡ＋ＥＸＯ群の膝軟骨は軟骨損傷が少ないと示すことが確認された（図１）。

各群における膝軟骨のアグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）含有量を上記の免疫組織化学的分析法により調べ、その結果は図５に示すように、エキソソームで修復されたＯＡ＋ＥＸＯ群（図５Ｂ、図５Ｄ、図５Ｆ）は、エキソソームで修復されていないＯＡ群に比べて（図５Ａ、図５Ｃおよび図５Ｅ）、軟骨内側に有意な量のアグリカン（ａｇｇｒｅｃａｎ）を含んでいた。エキソソームで修復されたＯＡ＋ＥＸＯ群（図５Ｆ）の軟骨の厚さは、エキソソームで修復されていないＯＡ群（図５Ｅ）の２．５倍であった。

実施例において、各群の軟骨破壊箇所をランダムに６点を選んでそれらの厚さを測定した後、以下の方法で統計し、結果を図６に示した。図６における全てのデータは、中央値および範囲として表され、また、ノンパラメトリック検定（例えば、マン−ホイットニーのＵ検定）病理組織学的等級を用いて統計的に比較され、ｐ値が＜０．０５の場合、差は有意と見なされ、全ての統計分析はＳＳＰＳを用いて行った。その結果、ＯＡ＋ＥＸＯ群の軟骨の厚さは、修復されていないＯＡ群とは有意な差があることを示した。

上記の実施形態は、本開示の例示に過ぎず、限定を意図するものではなく、当業者は本発明の精神および範囲から逸脱することなく上記実施形態に修正および変更を加えることができる。したがって、本開示の保護範囲は、下記の特許出願の範囲に記載されたとおりであるべきである。

Claims

関節疾患を予防または治療する医薬組成物を調製するための、間葉系幹細胞のエキソソームの使用。
上記の間葉系幹細胞は、分化誘導されていない、請求項１に記載の使用。
上記の間葉系幹細胞は、未分化多能性間葉系幹細胞である、請求項１に記載の使用。
上記の間葉系幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−ＡＢＣのうちの少なくとも１つの細胞表面マーカーを示す、請求項１に記載の使用。
上記の間葉系幹細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびＨＬＡ−ＤＲの細胞表面マーカーを示さない、請求項１に記載の使用。
上記の間葉系幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５およびＨＬＡ−ＡＢＣの細胞表面マーカーを示し、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６およびＨＬＡ−ＤＲの細胞表面マーカーを示さない、請求項１に記載の使用。
上記の間葉系幹細胞は、臍帯間葉系幹細胞、胎児間葉系幹細胞、臍帯血間葉系幹細胞、胎盤間葉系幹細胞、羊水間葉系幹細胞、骨髄間葉系幹細胞または脂肪間葉系幹細胞である請求項１に記載の使用。
上記の間葉系幹細胞は、ヒト臍帯間葉系幹細胞である、請求項１に記載の使用。
上記の間葉系幹細胞は、第３継代〜第６継代まで培養される、請求項１に記載の使用。
上記の間葉系幹細胞は、血清を含まない培地で培養される、請求項９に記載の使用。
上記のエキソソームは、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１のうちの少なくとも１つの細胞表面マーカーを示す、請求項１に記載の使用。
上記のエキソソームは、ＧＭ１３０の細胞表面マーカーを示さない、請求項１に記載の使用。
上記のエキソソームは、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１の細胞表面マーカーを示し、ＧＭ１３０の細胞表面マーカーを示さない、請求項１に記載の使用。
上記の医薬組成物は、軟骨組織の保持のために使用されることにより、関節疾患を予防または治療する、請求項１に記載の使用。
上記の医薬組成物は、軟骨再生の増進のために使用されることにより、関節疾患を予防または治療する、請求項１に記載の使用。
上記の関節疾患は、関節軟骨欠損、骨関節症、慢性関節リウマチ、変形性関節症、肩関節周囲炎、軟骨退化または前十字靭帯損傷である、請求項１に記載の使用。
上記の関節疾患は、骨関節症である、請求項１６に記載の使用。
上記の医薬組成物は、必要とする対象に注射で投与される、請求項１に記載の使用。