JP2021113176A - 骨腫瘍の治療剤及び骨腫瘍等の治療のためのイオンチャネル作用薬の評価方法 - Google Patents

骨腫瘍の治療剤及び骨腫瘍等の治療のためのイオンチャネル作用薬の評価方法 Download PDF

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Abstract

【課題】骨腫瘍の予防又は治療剤及び骨腫瘍等の予防又は治療のためのイオンチャネル作用薬の評価方法等を提供する。【解決手段】KCa3.1イオンチャネルの活性を抑制する抑制剤を有効成分とする、骨腫瘍の予防又は治療剤。【選択図】なし

Description

本明細書は、骨肉腫などの骨腫瘍の治療剤及び骨腫瘍等の治療のためのイオンチャネル作用剤の評価方法等に関する。
骨腫瘍のなかでも、骨肉腫は、転移や薬物耐性の発現などのため、根治が困難な難治性希少疾患の一つとなっている。各種のがん治療のための有望な標的分子について、種々の研究がなされている。例えば、Ca2+シグナルを制御するイオンチャネルであるKCa3.1(別名として、中コンダクタンスカルシウム活性化カリウム、IKチャネル、遺伝子名としてKCNN4)チャネルは、各種の上皮系がんの治療の標的分子であることが報告されている(非特許文献1〜3)。
また、がんの転移や薬剤耐性化には、がん幹細胞が関連している可能性があるとされている。がん幹細胞は、がん細胞のうち、幹細胞としての性質を備えており、自己複製能、多分化能及びマウスなどの生体移植時においてもとのがんと同じ表現型のがんを形成する能力である。がん幹細胞は、高度な薬剤耐性能や酸化ストレス耐性能を有する。このためがん幹細胞を治療標的とすることは、根本的ながん治療の実現に向けた課題である。
D'Alessandro G, et al.,KCa3.1 channels are involved in the infiltrative behavior of glioblastoma in vivo. Cell Death Dis 4: e773, 2013. Faouzi M, et al.,Functional cooperation between KCa3.1 and TRPC1 channels in human breast cancer: Role in cell proliferation and patient prognosis. Oncotarget 7: 36419-36435, 2016. Wulff H, et al., Therapeutic potential of KCa3.1 blockers: recent advances and promising trends. Expert Rev Clin Pharmacol 3: 385-396, 2010.
しかしながら、間葉系の腫瘍である骨腫瘍については、KCa3.1チャネルが関連するという報告はなされていない。また、現在までのところ、がん幹細胞におけるイオンチャネルの関連性については報告されていない。さらに、がん幹細胞の性質を維持する分子機構、抗がん剤等に対する治療抵抗性などの分子機構の解明は進んでいないのが現状である。
本明細書は、骨腫瘍の予防又は治療剤及び骨腫瘍等の予防又は治療のためのイオンチャネル作用薬の評価方法等を提供する。
本発明者らは、骨腫瘍の一つである骨肉腫のがん幹細胞モデルにおいて、がん幹細胞の通常のがん細胞への分化に、イオンチャネルの関連を想定した。がん幹細胞と腫瘍化した細胞とについて、イオンチャネルの発現スクリーニングにより、特定のイオンチャネル、KCa3.1(KCNN4)チャネルの発現量が、がん幹細胞においては少ないのに対して腫瘍化した細胞では増大しているという知見を得た。さらに、このイオンチャネルの発現増強が、腫瘍化した細胞の悪性化及びがん転移にも関連するという知見を得た。本明細書は、かかる知見に基づき以下の手段を提供する。
[1]骨腫瘍の予防又は治療剤であって、
Ca3.1イオンチャネルの活性を抑制する抑制剤を有効成分とする、治療剤。
[2]前記抑制剤は、前記イオンチャネルの活性を阻害するブロッカーである、[1]に記載の予防又は治療剤。
[3]前記抑制剤は、前記イオンチャネルの発現を抑制する発現抑制剤である、[1]に記載の予防又は治療剤。
[4]前記抑制剤は、前記イオンチャネルに結合する抗体である、[1]に記載の予防又は治療剤。
[5]前記骨腫瘍は、骨肉腫である、[1]〜[4]のいずれかに記載の予防又は治療剤。
[6]腫瘍の予防又は治療剤の評価のための剤であって、
脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Naイオンチャネルと、
静止膜電位を負方向に深くするKイオンチャネルと、
Ca3.1イオンチャネルと、
を備える細胞を含む、剤。
[7]前記腫瘍は、骨腫瘍である、[6]に記載の剤。
[8]イオンチャネル作用薬の評価方法であって、
前記イオンチャネル作用薬は、骨腫瘍等の間葉系腫瘍を予防又は治療するための薬剤であり、
標的イオンチャネルがKCa3.1イオンチャネルであり、
被験化合物の前記標的イオンチャネルの抑制活性を評価工程、
を備える、方法。
[9]前記評価工程は、請求項6又は7に記載の剤を用いて前記抑制活性を評価する工程である、[8]に記載の方法。
[10]イオンチャネル作用薬の評価方法であって、
前記イオンチャネル作用薬は、がん幹細胞の腫瘍細胞への分化、腫瘍細胞の悪性化、及びがん転移を抑制するための薬剤であり、
標的イオンチャネルがKCa3.1イオンチャネルであり、
被験化合物の前記標的イオンチャネルの抑制活性を評価する工程、
を備える、方法。
[11]骨腫瘍についての病態の検査のためのマーカーであって、
Ca3.1イオンチャネル、そのmRNA又はそのpre−mRNAに結合する化合物を含む、マーカー。
[12]骨腫瘍についての病態の検査方法であって、
被験者の対象部位から採取された細胞における、KCa3.1イオンチャネル活性を測定する工程、
を備える、方法。
骨肉腫がん幹細胞(AO細胞)と前駆細胞様細胞(AX細胞)についての、KCa3.1イオンチャネルのmRNA発現解析結果を示す図である。 骨肉腫がん幹細胞(AO細胞)と前駆細胞様細胞(AX細胞)についての、KCa3.1イオンチャネルの阻害剤(TRAM−34)に対して感受性を示す電流の比較結果を示す図である。 骨肉腫がん幹細胞(AO細胞)と前駆細胞様細胞(AX細胞)におけるKCa3.1イオンチャネルの活性化剤(DCEBIO)と阻害剤(TRAM−34)による膜電位変化の検討結果を示す図である。 骨肉腫がん幹細胞(AO細胞)と前駆細胞様細胞(AX細胞)についての、静止時の細胞内Caイオン濃度[Ca2+]iの比較結果を示す図である。 骨肉腫がん幹細胞(AO細胞)と前駆細胞様細胞(AX細胞)について、KCa3.1イオンチャネルの活性化剤と阻害剤を用いて静止時の細胞内Caイオン濃度[Ca2+]iに対するKCa3.1イオンチャネルの寄与の評価結果を示す図である。 骨肉腫がん幹細胞(AO細胞)と前駆細胞様細胞(AX細胞)の細胞増殖に対するKCa3.1イオンチャネルの寄与の比較結果を示す図である。 前駆細胞様細胞(AX細胞)の遊走能に対するKCa3.1イオンチャネルの寄与の評価結果を示す図である。 骨肉腫がん幹細胞(AO細胞)と前駆細胞様細胞(AX細胞)をマウス大腿骨に移植した際の、KCa3.1イオンチャネルmRNAの発現解析結果を示す図である。
本明細書の開示は、骨腫瘍の予防又は治療剤、腫瘍の予防又は治療のための化合物の評価のための剤、当該評価方法等に関する。
本発明者らは、骨肉腫のがん幹細胞モデルを用いて、がん幹細胞の腫瘍化、腫瘍細胞の悪性化及びがん転移にKCa3.1イオンチャネル、すなわち、別名として、中コンダクタンスカルシウム活性化カリウム、IKチャネル、遺伝子名としてKCNN4(以下、本Kイオンチャネルともいう、が関連していることを初めて見出した。すなわち、がん幹細胞における本Kイオンチャネル発現及び活性増大は、細胞内カルシウムイオン(Ca2+)の増大を介して、がん幹細胞から非がん幹細胞への分化能の低下、細胞増殖、転移などの悪性化機構に関与することを初めて見出した。これにより、がん幹細胞の腫瘍化、腫瘍細胞の悪性化及びがん転移を抑制する薬剤の標的分子として、本Kイオンチャネルを利用できることが初めてわかった。したがって、明細書によれば、腫瘍の予防又は治療剤、腫瘍の予防又は治療のための剤の評価のために用いる剤、腫瘍の予防又は治療のためのイオンチャネル作用薬の評価方法等が提供される。
以下、新たに見出された知見に基づく種々の実施形態について、腫瘍の予防又は治療剤、その評価のための剤、評価方法等について説明する。
(腫瘍の予防又は治療剤)
本明細書に開示される腫瘍の予防又は治療剤(以下、単に、本剤ともいう。)は、KCa3.1イオンチャネルの活性を抑制する抑制剤を有効成分とすることができる。既述のとおり、がん幹細胞の腫瘍化、腫瘍細胞の悪性化及び腫瘍細胞の転移には、本Kイオンチャネルが関連していることがわかっている。
ここで、本Kイオンチャネルは、Ca2+により活性化されるKイオンチャネルであり、細胞内のカルシウムイオン濃度に依存して活性化するカリウムチャネルである。このイオンチャネルは、骨肉腫の細胞内カルシウムイオンを増加させる現象に対して促進的に作用するイオンチャネルである。
例えば、ヒトにおける本Kイオンチャネル遺伝子(KCNN4遺伝子)のcDNAの塩基配列及びイオンチャネルタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号1及び2で表される。配列番号1及び2のNCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)(GenBank及びGenPept)のアクセッション番号は、それぞれ、NM_002250及びNP_002241である。また、他の動物における本Kイオンチャネルタンパク質をコードする塩基配列及びタンパク質のアミノ酸配列は、いずれも、例えば、NCBI等の公知のデータベースにおいて検索される。例えば、マウスの本Kイオンチャネルタンパク質のcDNAの塩基配列及びイオンチャネルタンパク質のアミノ酸配列のアクセッション番号は、それぞれ、NM_008433及びNP_032459(配列番号3,4)である。
本Kイオンチャネルとしては、上記した遺伝子によってコードされるタンパク質以外に、以下の各種態様を含むことができる。本Kイオンチャネルのホモログとしては、KCNN1、KCNN2、KCNN3等が挙げられる。また、同じCa2+活性化K+チャネルとして、KCNM1、KCNM4、KCNM5も含まれる。以下に、これらのタンパク質をコードするDNAの塩基配列及び当該タンパク質のアミノ酸配列のアクセッション番号の一部を例示する。
ヒトKCNN1(塩基配列、アミノ酸配列):NM_002248、NP_002239(配列番号5、6)
ヒトKCNN2(塩基配列、アミノ酸配列):NM_021614、NP_067627(配列番号7,8)
ヒトKCNN3(塩基配列、アミノ酸配列):NM_002249、NP_002240(配列番号9,10)
ヒトKCNMA1(塩基配列、アミノ酸配列):NM_002247、NP_002238(配列番号11,12)
マウスKCNN1(塩基配列、アミノ酸配列):NM_032397、NP_115773(配列番号13,14)
マウスKCNN2(塩基配列、アミノ酸配列):NM_080465、NP_536713(配列番号15,16)
マウスKCNN3(塩基配列、アミノ酸配列):NM_080466、NP_536714(配列番号17,18)
マウスKCNMA1(塩基配列、アミノ酸配列):NM_010610、NP_034740(配列番号19,20)
本明細書において開示する塩基配列及びアミノ酸配列については、その塩基配列又はアミノ酸配列が配列番号又はアクセッション番号により特定されたときには、当該配列と一定以上の同一性を有する配列を当該配列と同等の機能又は活性を有する以上、当該配列に替えて用いることができる。前記一定以上の同一性としては、特定される塩基配列又はアミノ酸配列と、例えば、80%以上、また例えば、85%以上、また例えば、90%以上、また例えば、95%以上、また例えば、96%以上、また例えば、97%以上、また例えば、98%以上、また例えば、99%以上、また例えば、99.5%以上である。
また、本明細書において、塩基配列又はアミノ酸配列の同一性又は類似性とは、当該技術分野で知られているとおり、配列を比較することにより決定される、2 以上のタンパク質あるいは2以上のポリヌクレオチドの間の関係である。当該技術で“同一性”とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きのそのような配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の配列不変性の程度を意味する。また、類似性とは、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間のアラインメントによって、あるいは場合によっては、一続きの部分的な配列間のアラインメントによって決定されるような、タンパク質またはポリヌクレオチド配列の間の相関性の程度を意味する。より具体的には、配列の同一性と保存性(配列中の特定アミノ酸又は配列における物理化学特性を維持する置換)によって決定される。なお、類似性は、後述する BLAST の配列相同性検索結果において Similarity と称される。同一性及び類似性を決定する方法は、対比する配列間で最も長くアラインメントするように設計される方法であることが好ましい。同一性及び類似性を決定するための方法は、公衆に利用可能なプログラムとして提供されている。例えば、Altschul らによるBLAST (Basic Local Alignment Search Tool) プログラム(たとえば、Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ., J. Mol. Biol., 215: p403-410 (1990), Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Miller W, Lipman DJ., Nucleic Acids Res. 25: p3389-3402 (1997)) を利用し決定することができる。BLAST のようなソフトウェアを用いる場合の条件は、特に限定するものではないが、デフォルト値を用いるのが好ましい。
本Kイオンチャネルの活性を抑制する抑制剤としては、特に限定することなく、本Kイオンチャネルの活性を抑制するものであればその態様を問わない。一つの態様として、本Kイオンチャネルに対するブロッカーが挙げられる。本明細書において、ブロッカーとは、概ね、分子量500以下の低分子有機化合物であり、概して、ペプチド結合やポリヌクレオチド骨格を有しない化合物である。
ブロッカーとしては、公知の本Kイオンチャネルに対する阻害剤である以下に示すTRAM−34、ICAー17043などの三環性化合物を含む多環性化合物が挙げられる。より具体的には、以下の化合物が挙げられる。これらはいずれも商業的に入手可能か又は有機合成可能である。
Figure 2021113176
Figure 2021113176
Figure 2021113176
他のブロッカーとしては、後段で説明する評価方法ほか、公知の、イオンチャネルに対するブロッカーの評価方法(スクリーニング方法)に基づいてスクリーニングすることができる。
他の1つの態様として、本Kイオンチャネルをコードする遺伝子の発現を抑制する抑制剤が挙げられる。かかる抑制剤としては、本Kイオンチャネル遺伝子の発現を抑制する核酸医薬が挙げられる。核酸医薬は、その標的としてDNA及び/又はRNAとするかの他、医薬自体がDNA、RNAなどの天然型ヌクレオチドや化学修飾ヌクレオチドを基本骨格として備えることができるなどによって種々の形態を採ることができる。核酸医薬が採りうる骨格自体は、当業者において公知であり、当業者であれば、必要に応じて公知の骨格をそのままあるいは適宜修飾して本明細書に開示される発現抑制剤として用いることができる。
核酸医薬としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的分子として、mRNA、pre−mRNA等が挙げられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、概して、DNA又はその修飾体を基本骨格とする。ハイブリダイゼーション能との関係から、糖鎖部分がRNA又はその修飾体である場合もある。アンチセンスオリゴヌクレオチドによる作用機序は様々であり、RNaseH依存性のmRNAの分解、スプライシング調節部位に結合して選択的スプライシングを誘導するエクソンスキップ、mRNAに強固に結合して翻訳を阻害する翻訳阻害等が挙げられる。
また例えば、RNA干渉剤が挙げられる。RNA干渉は、二本鎖RNAによって、配列特異的にmRNA等の標的RNAを分解して、遺伝子の発現を抑制する方法である。RNA干渉(RNAi)の標的分子としては、mRNA、pre−mRNA等が挙げられる。RNA干渉剤は、典型的にはsiRNAである。siRNAの設計については、当業者において公知であり、当業者であれば、ターゲットの選定、末端構造等を適宜考慮して、適切な構造及び配列のsiRNAを設計することができる。
なお、RNA干渉剤としては、siRNA他、一本鎖RNAであって切断により、siRNAとなる二本鎖RNAほか、siRNAの各鎖又はsiRNA前駆体であるRNA一本鎖をDNAからの転写によって生成可能なDNAコンストラクトの形態を採ることもできる。
各種の核酸医薬については、後段で説明する評価方法等に基づいてスクリーニングすることができる。
また例えば、他の1つの態様として、本Kイオンチャネルに特異的に結合する抗体が挙げられる。抗体としては、本Kイオンチャネルに特異的に結合する限り、ポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよい。
本明細書において抗体とは、また、本Kイオンチャネルの少なくとも一部を抗原として認識して結合能を有するインタクトな抗体又は当該結合能を有する抗原結合部分を含む部分を包含する。
なお、抗体の「抗原結合部分」とは、特異的に任意の抗原に結合する能力を保持するインタクトな抗体の1つ以上のフラグメントを意味する。したがって、例えば、「抗原結合部分」は、特に限定するものではなく、Fabフラグメント、V、V、CおよびCH1ドメインからなる一価フラグメント;F(ab)フラグメント、ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された2つのFabフラグメント(一般的に重鎖および軽鎖から1つ)を含む二価フラグメント;VおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;抗体の単一のアームのVおよびVドメインからなるFvフラグメント;Vドメインからなる単一ドメイン抗体(dAb)フラグメント;および単離された相補性決定領域(CDR)など各種形態のフラグメント又はその組合せを含むことができる。また、抗原結合部分は、組換え方法を使用して、VおよびV領域が対になって一価分子を形成する一本のタンパク質鎖として作製可能とする人工ペプチドリンカーにより連結することができる。
このほか、抗原結合部分は、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、v−NARおよびビス−scFvに組み込まれていてもよい。
抗体の由来生物種は特に限定するものではないが、適用する生物体や目的によっても異なるが、ヒト抗体、マウス抗体、ヤギ抗体等とすることができる。なお、ヒト抗体というときには、抗体のフレームワークおよびCDR領域の両方がヒト起源の配列に由来している可変領域を有する抗体を含むことを意味している。さらに、抗体が定常領域を含むとき、定常領域は、また、このようなヒト配列、例えば、ヒト生殖細胞系列配列または突然変異型のヒト生殖細胞系列配列に由来することを意味している。また、2以上の生物種に由来するフラグメントに基づく抗体をキメラ抗体ということができる。
抗体がモノクローナル抗体であれば、抗原に対して安定した結合性能を発揮することができる。モノクローナル抗体の取得は、当業者において周知である。後述する方法のほか、例えば、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合させた遺伝子導入非ヒト動物(例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子導入マウス)から得られたB細胞を含むハイブリドーマにより製造される。
また、抗体は、例えば、組換えヒト抗体などの組換え抗体であってもよい。組換えヒト抗隊は、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子を遺伝子導入または染色体導入された動物(例えば、マウス)またはそれから製造されたハイブリドーマから単離された抗体;ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離された抗体;組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体;およびヒト免疫グロブリン遺伝子配列の全部または一部の他のDNA配列へのスプライシングを含む他の手段により製造、発現、作製または単離された抗体を含む。このような組換えヒト抗体はフレームワークおよびCDR領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来している可変領域を有する。
抗体は、公知の方法で取得された抗体が本Kイオンチャネルに対する結合能を有している限り、その変異体であってもよい。例えば、出発物質としての抗体の少なくとも一部、例えば、全長重鎖および/または軽鎖配列、Vおよび/またはV配列またはそれに結合した定常領域に変異を導入するなどの修飾することにより、新たな抗体を取得することもできる。また、取得した抗体に対していわゆるペグ鎖を導入するなどもできる。こうした抗体の改変の手法自体は、当業者において周知である。
抗体の製造は、当業者において周知であり、本Kイオンチャネルタンパク質、当該タンパク質から取得可能なエピトープ又はこれらと適合なハプテンとのコンジュゲートを用いて、適宜動物を免疫することにより、その脾臓からポリクローナル抗体を取得し、取得したポリクローナル抗体を精製するなどして好適なポリクローナル抗体を得ることができる。また、モノクローナル抗体も周知の方法にて取得することができる。さらに、各種の抗体については、後段で説明する評価方法等に基づいてスクリーニングすることができる。
こうして得られるモノクローナル抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするDNAなどのポリヌクレオチドも、本開示の一態様である。また、こうした発現ベクターを保持する宿主細胞も、本開示の一態様である。なお、発現ベクターは、宿主の種類に応じて当業者に周知の適切な形態のほか、プロモーター、ターミネーター等の制御領域も適宜選択することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、DNAであり、また例えば、cDNAである。
本Kイオンチャネルの活性を抑制する抑制剤のさらに他の1つの態様としては、アプタマーが挙げられる。アプタマーは、特定分子と特異的に結合しうる核酸アプタマー又はペプチアプタマーである。核酸アプタマーは、DNA及び/又はRNAで構成され、ペプチドアプタマーは、ペプチドで構成される。核酸アプタマーは、例えば、SELEX法により、また、ペプチドアプタマーは、酵母のTwo−Hybrid法により行われうるほか、後段で説明する評価方法を利用してスクリーニングすることができる。
本Kイオンチャネルの活性を抑制する抑制剤のさらに他の1つの態様としては、本Kイオンチャネルの活性を抑制すると考えられるmiRNA等が挙げられる。例えば、本KイオンチャネルmRNAi発現を減少させるmiRNAとして、miR−497、miR407が挙げられる(文献5,6、2)。
抑制剤であって、本Kイオンチャネルタンパク質又はそれをコードするDNAや翻訳産物であるmRNAに結合性を有する抑制剤は、必要に応じて標識要素を備えることができる。標識要素は、特に限定するものではないが、従来公知の標識物質を適宜選択して用いることができる。標識物質は、特に限定しないが、典型的には、蛍光、放射能、酵素(例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等)、燐光、化学発光、着色などを利用した標識物質が挙げられる。
標識要素として、標識要素と結合可能な物質を備えていてもよい。最終的に標識物質による識別が可能にこれらを結合可能な分子ないし物質を備えていてもよい。こうした物質等としては、タンパク質−タンパク質相互作用、低分子化合物−タンパク質相互作用等を利用できる。例えば、抗原抗体反応における抗体や、アビジン(ストレプトアビジン)−ビオチンシステムにおけるビオチン、抗ジゴキシゲニン(DIG)−ジゴキシゲニン(DIG)システムにおけるジゴキシゲニン、又は抗FITC−FITCシステムにおけるFITC等に代表されるハプテン類などが挙げられる。この場合、最終的に検出のために用いられる標識物質は、こうした標識物質に結合性を有する物質と相互作用する他方の分子又は物質(例えば、抗原、すなわち、ストレプトアビジン、抗FITCなど)を、標識物質結合物質との結合のための部位として備えるように修飾される。
こうした各種態様の標識要素は、商業的に入手できるほか、標識要素で抗体を修飾する方法も当業者において周知である。したがって、当業者であれば、種々の標識要素を取得して、抗体などのタンパク質、DNAやRNAなどの核酸に対してアミノ基やカルボキシル基等の官能基を介して適宜可能である。
本剤は、それ自体、本来の分化能を有しており腫瘍形成能が低い潜在的がん細胞であるがん幹細胞の腫瘍化、すなわち、分化能が低下して腫瘍形成能が高くなった前駆細胞様細胞への変化に際して発現又は発現が増大する本Kイオンチャネルの抑制剤を有効成分とする。このため、がん幹細胞が関連する腫瘍全般の予防又は治療に有効である。また、高い腫瘍形成能を持つに至った又は既に持っている腫瘍細胞による腫瘍の改善や治療にも有効である。
特に限定するものではないが、本剤は、骨腫瘍などの間葉系細胞の腫瘍の予防又は治療に有用である。骨腫瘍には、良性骨腫瘍と悪性骨腫瘍とがある。良性骨腫瘍には、骨軟骨腫、内軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、巨細胞腫などがある。また、悪性骨腫瘍には、多発性骨髄腫、骨肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、リンパ腫、悪性巨細胞腫、脊索腫等が挙げられる。本剤は、例えば、骨肉腫の予防又は治療に有用である。
(腫瘍の予防又は治療剤の評価のための剤)
本明細書に開示される、腫瘍の予防又は治療剤の評価のための剤(以下、単に、本評価剤ともいう。)は、脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Naイオンチャネルと、静止膜電位を負方向に深くするKイオンチャネル(以下、他のKイオンチャネルという。)と、KCa3.1イオンチャネル(本Kイオンチャネル)と、を備える細胞を含むことができる。本評価剤は、上記NaイオンチャネルとKイオンチャネルと本Kイオンチャネルとを備えることで、本来的には細胞死が誘導されるような脱分極が惹起されるとき、被験化合物の存在によって、本Kイオンチャネルが静止膜電位を負方向に深くすることが抑制されるときには、細胞死傾向が増強される(細胞の生存率が低くなる)。このとき、被験化合物は、本Kイオンチャネルの抑制剤といえる。
こうした細胞については、本発明者らは、既に、WO2012/002460及びWO2018/084221において開示している。これらは、引用によりその全てが本明細書に組み込まれるものとする。
本評価剤に用いる細胞は、イオンチャネルのスクリーニング用として用いることができるものであれば特に限定しないで、各種の動物細胞を用いることができる。動物細胞としては、哺乳動物や昆虫など特にその種類は限定されない。細胞が、ヒトのほか、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、トリ、イヌ、ネコ、ウサギ等の細胞の場合には、これらの動物における疾患の予防又は治療のための薬剤の評価剤を取得できる。動物細胞としては、典型的には、ヒト胎児腎由来細胞(HEK細胞)、アフリカミドリザル腎由来細胞(COS細胞)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、ベビーハムスター腎細胞(BHK細胞)及びアフリカツメガエル卵母細胞が用いられる。また、各種組織由来培養細胞を用いることもできる。
本評価剤は、本Kイオンチャネルを機能的に備えていればよい。好ましくは、本評価剤は、本Kイオンチャネルを細胞膜などに特異的発現あるいは高発現している。なお、本評価剤の親株として、予め本Kイオンチャネルを高発現している細胞を選択することもできる。また、本評価剤において標的イオンチャネルを発現させるには、本KイオンチャネルをコードするDNAを保持し、発現していることが好ましい。このDNAは、好ましくは、恒常的に作動するプロモーター(構成的プロモーター)の制御下に連結され、定常的に本Kイオンチャネルが発現されるようになっている。本Kイオンチャネルについても既述のとおり、当業者であれば、周知の遺伝子工学技術及び形質転換体の作製技術に基づいて、DNAを含む発現ベクター等を構築し、これをホスト細胞に導入し形質転換することで、所望の定常発現もしくは一過性発現細胞を適宜取得することができる。また、抑制的標的イオンチャネルの発現量も、他のイオンチャネルと同様に調整することができる。
本評価剤は、上記Naイオンチャネル、上記Kイオンチャネル及び本Kイオンチャネルを備えることで、脱分極を惹起する刺激下又は他のKイオンチャネルに対する阻害剤存在下での細胞死誘導系(細胞死の誘導可能な状態で待機する細胞の生存状態)を構築することができる。この細胞死誘導系は、それ自体、本Kイオンチャネルに対する作用剤及び阻害剤の評価系を構成する。すなわち、他のKイオンチャネルに対する阻害剤の存在によって、静止膜電位を負方向に深くすることが阻害されるが、抑制的標的イオンチャネルである本Kイオンチャネルによって、脱分極の惹起が抑制された状態となっている。こうした状態から、本Kイオンチャネルに対する被験化合物の阻害作用や促進作用を簡易に効率的に評価することができる。
本評価剤が備えるNaイオンチャネルは、脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Naイオンチャネルである。かかるNaイオンチャネルは、換言すれば、不活性化を抑制されたNaイオンチャネルということもできる。
ここで電位依存性Naイオンチャネルとは、細胞膜の膜電位に依存して開口してNaイオンの受動拡散を媒介する細胞膜上のタンパク質である。本明細書において用いる電位依存性Naイオンチャネルは、特に限定しないで公知の各種電位依存性Naイオンチャネルを用いることができるが、好ましくは、Nav1.5チャネルである。Nav1.5チャネルは、心筋細胞などに分布しており、活動電位の発生と興奮伝導に関与していると考えられている。例えば、ヒトNav1.5チャネルの塩基配列及びアミノ酸配列(NCBI Accession Number: NM_198056.2、NP_932173.1)は、配列番号21、22で表される。
電位依存性Naイオンチャネルは、膜電位に依存してゲートが開きNaイオン透過性を発揮した後、不活性化機構が働いてNaイオン透過性を失う(不活性化)。これに対して、不活性化を抑制された電位依存性Naイオンチャネルは、こうした不活性化機構を抑制(消失)させたものである。すなわち、不活性化を抑制された電位依存性Naイオンチャネルは、膜電位に依存してゲートが開きイオン透過性を発揮した後、こうした不活性化が生じないNaイオンチャネルを意味している。不活性化を抑制された電位依存性Naイオンチャネルでは、細胞膜において脱分極が惹起されて当該イオンチャネル自身が活性化されるとイオンチャネルを開口してNaイオンの受動拡散を媒介しうる状態をとるが、イオンチャネル自身の不活性化が抑制されているため、イオンチャネルの開口した状態が維持される。この結果、不活性化が抑制された電位依存性Naイオンチャネルでは、刺激を受けて活動電位が一旦発生すると、イオンチャネルの不活性化が遅延されるため、活動電位が本来の電位依存性Naイオンチャネルより長く継続する。
また、不活性が抑制されたNaイオンチャネルは、定常的若しくは比較的に深い静止膜電位でも活性化されやすくなっている(いわゆるウィンドウ電流が大きくなっている)。従ってかかるNaイオンチャネルを発現した細胞では、充分に深い負電位に静止膜電位を保持した場合にのみ、過剰なNaイオンの流入を防ぐことができる。かかる電位依存性Naイオンチャネルを充分に発現した細胞においては、脱分極により容易にNaイオンチャネル活性が増大し、1分以上、好ましくは2分以上、より好ましくは3分以上、さらに好ましくは5分以上程度、活動電位あるいは脱分極が維持される。このため細胞内への過剰なNa流入が生じて細胞を死に至らしめる。
かかる不活性化の抑制は、電位依存性Naイオンチャネルのアミノ酸配列に対してアミノ酸変異を導入することによって適宜実現することができる。Nav1.5チャネルの不活性化を抑制するには、いくつかの具体的な手法が開示されている。たとえば、IFMモチーフを改変すること(Grant et al., Biophys. J., 79: 3019-3035, 2000)、406番目のアスパラギンをグルタミン酸やアルギニン、リシンに変異させること(McNulty et al., Mol. Pharmacol., 70: 1514-1523, 2006)、ドメインIII−IVをつなぐIFM部分を含むリンカー部位を欠損させること(Patton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A , 89: 10905-10909, 1992、West et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,: 10910 - 10914, 1992)が挙げられる。すなわち、hNav1.5アミノ酸配列(変異対象となるIFMを含む領域のみ表示)中、1470-IDNFNQQKKKLGGQDIFMTEEQKKYYNAMKK-1500のIFMをQQQに変異することが挙げられる。
また、ドメインIVのセグメント4のアミノ酸を変異させること(Chen et al., J. Gen. Physiol., 108: 549-556, 1996)などが報告されている。アミノ酸配列に対する変異導入は、当業者であればこれらの文献や周知技術に基づいて適宜実施することができる。
本評価剤は、こうしたNaイオンチャネル(天然タンパク質又は変異体タンパク質)をコードするDNA(以下、第1のDNAともいう。)を保持して発現していることが好ましい。本評価剤は、当該変異体、すなわち、不活性化が抑制された電位依存性Naイオンチャネルを定常的にあるいは一過性的に発現するものであってもよい。すなわち当該DNAは染色体上に組み込まれて娘細胞に伝達されるようになっていてもよいし、染色体外で自律的に増幅するが娘細胞には必ずしも伝達されないプラスミドに組み込まれていてもよい。DNAは、好ましくは、恒常的に作動するプロモーター(構成的プロモーター)の制御下に連結されている。このような本評価剤は、当業者であれば、周知の遺伝子工学技術及び形質転換体の作製技術に基づいて、DNAを含む発現ベクター等を構築し、これを本評価剤の宿主に導入し形質転換することで、定常発現もしくは一過性発現細胞を適宜取得することができる。
また、Naイオンチャネルの発現量は、第1のDNAを制御するプロモーターなどの制御領域の種類や、導入する第1のDNAを含む発現カセット数や、遺伝子導入後の細胞培養条件などを制御することで調整することができる。
なお、電位依存性Naイオンチャネルが2以上のサブユニットからなる場合であって、不活性化のために有効な変異を含むサブユニットが全体の一部であるとき、当該一部のサブユニットのみをそれぞれコードするDNAを1又は2以上のDNAとして本評価剤に発現させることもできるし、当該Naイオンチャネルを構成する他のサブユニットも同時に共発現させるように、これらのサブユニットをコードするDNAをDNAとしてそれぞれ発現可能に保持させるようにしてもよい。さらに、発現される不活性化が抑制された電位依存性Naイオンチャネルを、より効果的に機能させるために必要な酵素や他のタンパク質、化合物などがあれば、これらの物質を適宜発現または供給するようにしてもよい。
本評価剤が備える他のKイオンチャネルは、静止膜電位が負の方向に深くなるように、換言すれば、より負の電位が大きくなるような機能(活性)を有するイオンチャネルである。すなわち、かかる他のKイオンチャネルによれば、その発現や活性によるKイオン透過性の亢進により深い静止膜電位を形成することができる。上記したNaイオンチャネルを備えると、細胞内外におけるNaイオンの濃度差により、Naイオンが細胞内に過剰に流入する状態となり、最終的には細胞内のNaイオン濃度が高まり細胞は死んでしまう。細胞を本評価剤として用いるには、かかる細胞死誘導系が誘導されるまでは細胞が生存している必要がある。そこで、静止膜電位を深く(低く)するために、静止膜電位が負の方向に深くする他のKイオンチャネルを用いる。
細胞の生存に影響しない範囲で静止膜電位は、負の方向に深いほど好ましい。膜電位は、好ましくは、−50mV、より好ましくは−60mV、さらに好ましくは−70mV程度、一層好ましくは−80mV程度とすることが適している。
こうした他のKイオンチャネルとしては、たとえば、内向き整流性Kイオンチャネル(Kirチャネル)、4回膜貫通型及び2ポア型Kイオンチャネル(K2Pチャネル)などが活性化している状態が挙げられる。4回膜貫通型及び2ポア型のKイオンチャネル(K2Pチャネル)は性質が異なる様々な種類が存在し、TWIK、TREK、TASK、TALK、THIK、TRESKなどに分類される。これらのイオンチャネルは電位及び時間依存性が殆どないことからリークチャネルとして機能している。漏洩チャネルの性質上、これらの他のKイオンチャネルは、細胞の静止膜電位の維持(固定)に働いている。
内向き整流性Kイオンチャネルは、特に限定しないが、例えば、Kir2.1、2.2、2.3及び2.4などの各種Kir2xチャネルが挙げられる。Kir2.1は、2回膜貫通型構造を持つ内向き整流性Kイオンチャネル(Kirチャネル)である。電位依存性を持たず、膜電位をKイオンの平衡電位である−80mV付近に近づける性質を持つ。神経や心臓、骨格筋などに発現しており、静止膜電位の形成やその安定化及び維持を行なっている。Kir2.2は、Kir2.1と同様の内向き整流性Kイオンチャネル(Kirチャネル)であるがKir2.1よりも内向き整流性が強い。心臓や脳、骨格筋などにKir2.1とともに発現しており、ヒトの血管内皮細胞においては内向き整流性Kイオンチャネル(Kirチャネル)活性の中で主要な働きをしている。また、Kir2.2は、後述するように、例えば、Baイオンなどによって特異的に阻害される点において本評価剤に好適である。
Kir.2.xイオンチャネルについては、Circ. Res. 94:1332-1339 (2004)及びAm. J. Physiol. Cell Physiol. 289:C1134-C1144 (2005)等に記載されている。例えば、ヒト由来のKir2.xチャネルをコードする遺伝子の塩基配列は、Kir2.1(GenBank accession No. U12507, NM_000891(Human KCNJ2))、Kir2.2(GenBank accession No. AB074970, NM_021012(Human KCNJ12))、Kir2.3(GenBank accession No. U07364, U24056, NM_152868(Human KCNJ4))、Kir2.4(GenBank accession No. AF081466, NM_013348(Human KCNJ14))等が挙げられる。
同様に、G蛋白制御内向き整流性Kイオンチャネル(GIRKチャネル,Kir)が挙げられる。GIRKチャネル(Kir3)は、内向き整流性Kイオンチャネル(Kirチャネル)であるが、Kir2と異なりGタンパク質によって活性化されるKイオンチャネルである。これらのサブユニットには組織特異性があり心臓ではKir3.1/Kir3.4、中枢神経ではKir3.1/Kir3.2で構成する異種四量体を形成している。通常時には活性化せず、アゴニスト刺激により活性化する。しかし、イオンチャネルポアを形成する膜貫通ヘリックスのアミノ酸を変異させることで、常時イオンチャネルが開いたままになることがアフリカツメガエル卵母細胞の実験で報告されている(Claydon et. al., J. Biol. Chem. 278: 50654-50663, 2003)。このことからこの変異体を利用することでKir2.1と同様に深い静止膜電位を形成できると考えられる。例えば、ヒト由来のKir3.xチャネルをコードする塩基配列は、Kir3.1 (GenBank accession No. NM_002239(Human KCNJ3))、Kir3.2 (GenBank accession No.NM_002240(Human KCNJ6))、Kir3.3(GenBank accession No. NM_004983(Human KCNJ9))、Kir3.4 (GenBank accession No.NM_000890(Human KCNJ5))が挙げられる。
さらに、ATP感受性内向き整流性Kイオンチャネル(KATPチャネル、Kir6)が挙げられる。KATPチャネルはATPで抑制され、ADPで活性化される内向き整流性Kイオンチャネル(Kirチャネル)である。KATPチャネルは細胞の代謝状態に応じて細胞の興奮性を制御している。KATPチャネルは4個のKATPチャネルと4個のスルフォニルウレア受容体(SUR)から構成される異種8量体である。KATPチャネルのみでは機能をもたないがKATPチャネルのC末端を欠損させることでKATPチャネルのみで機能をもつようになることが報告されている(Tucker et. al., EMBO J. EMBO J 17: 3290-3296, 1998)。また、この欠損体にさらに変異をかけることでATP感受性を下げ、常時活性化させることができる。この変異体を用いることでも深い静止膜電位を形成できる。ヒト由来のKir6.xチャネルをコードする塩基配列は、Kir6.1(GenBank accession No. NM_004982(Human KCNJ8))、Kir6.2(GenBank accession No. NM001166290(Human KCNJ11))が挙げられる。
また、4回膜貫通型及び2ポア型Kイオンチャネル(K2Pチャネル)としては、例えば、THIKチャネル(HEK293細胞に発現させると膜電位が深くなること;Campanucci et al., Neuroscience, 135: 1087-1094, 2005)、TASK−2チャネル(アフリカツメガエル卵母細胞に発現させると静止膜電位が深くなること;Kindler et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 306: 84-92, 2003.)、電位依存性Kチャネル(平滑筋組織で電位依存性Kチャネルが静止膜電位を深くすること;McDaniel et al., J. Appl. Physiol. (1985) 91: 2322-2333, 2001)などが知られている。
4回膜貫通型及び2ポア型Kイオンチャネル(K2Pチャネル)は、TWIK、TREK、TASK、TALK、THIK及びTRESKの各サブファミリーに分類される。TWIKサブファミリーは、TWIK−1、TWIK−2チャネルを含んでいる(Lotshaw, Cell Biochem. Biophys. 47: 209-256, 2007)。TWIKチャネルは、ヒトでは多くの組織に存在している。例えば、ヒト由来のTWIKイオンチャネルは、TWIK−1(GenBank accession No.NM_002245(KCNK1))及びTWIK−2(GenBank accession No.NM_004823(KCNK6))が挙げられる。
TREKサブファミリーは、TREK−1、TREK−2及びTRAAKチャネルを含んでいる。例えば、ヒト由来のTREKイオンチャネルは、TREK−1(GenBank accession No. NM_014217(KCNK2))、TREK−2(GenBank accession No. NM_138317(KCNK10))及びTRAAK(GenBank accession No. NM_033310(KCNK4))が挙げられる。
TASKサブファミリーは、TASK−1、TASK−3及びTASK−5チャネルを含んでいる。例えば、ヒト由来のTASKイオンチャネルは、TASK−1(GenBank accession No. NM_002246(KCNK3))、TASK-3(GenBank accession No. NM_016601(KCNK9))及びTASK-5(GenBank accession No. NM_022358(KCNK15))が挙げられる。
TALKサブファミリーは、TALK−1、TALK−2及びTASK−2チャネルを含んでいる。例えば、ヒト由来のTALKイオンチャネルは、TALK−1(GenBank accession No. NM_001135106(KCNK16))、TALK−2(GenBank accession No. NM_001135111(KCNK17))及びTASK−2(GenBank accession No. NM_003740(KCNK5))が挙げられる。
THIKサブファミリーは、THIK−1、THIK−2チャネルを含んでいる。例えば、ヒト由来のTHIKイオンチャネルは、THIK−1(GenBank accession No. NM_022054(KCNK13))、THIK−2(GenBank accession No. NM_022055(KCNK12))が挙げられる。
TRESKサブファミリーは、TRESK(GenBank accession No. NM_181840(KCNK18))が挙げられる。
他のKイオンチャネルは、こうした各種の天然のKイオンチャネルのほか、これらを改変した他のKイオンチャネル変異体を用いることもできる。本評価剤は、他のKイオンチャネルに対する阻害剤の存在下で使用することが好適である。当該阻害剤は、他のKイオンチャネルをできるだけ高い選択性で、できるだけ高い感度で(低濃度で)阻害できることが好ましい。したがって、阻害剤に対するより好適な選択性や感受性を他のKイオンチャネルに付与するため、他のKイオンチャネルに適宜改変を加えることもできる。
なお、公知のタンパク質について、意図した機能を付与又は削除、増強又は減弱等するために改変する技術は当業者において公知である。目的のタンパク質について、特に、イオンチャネルなどに関しては膜貫通領域やポア領域などよく研究されていることから、タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを利用して、適切な改変可能部位をある程度特定することは当業者における日常的な作業である。そして、改変可能部位についてのアライメント情報に基づいて可能性あるアミノ酸残基の置換を検討して変異体を取得し、当該変異体の機能を評価することも当業者の日常的な作業である。
本評価剤においては、こうした他のKイオンチャネルによって静止膜電位を深くする目的で、Kイオンチャネル1又は2以上適宜組み合わせて用いることができる。
本評価剤は、Naイオンチャネルと同様に、こうした他のKイオンチャネル(天然タンパク質又は変異体タンパク質)をコードするDNA(以下、第2のDNAともいう。)を保持して発現していることが好ましい。本評価剤は、天然体又は当該変異体であるKイオンチャネルを定常的にあるいは一過性的に発現するものであってもよい。すなわち当該DNAは染色体上に組み込まれて娘細胞に伝達されるようになっていてもよいし、染色体外で自律的に増幅するが娘細胞には必ずしも伝達されないプラスミドに組み込まれていてもよい。また、第1のDNAと同様、第2のDNAは、好ましくは、恒常的に作動するプロモーター(構成的プロモーター)の制御下に連結されている。さらに、他のKイオンチャネルが2以上の異なるサブユニットからなる場合には、Naイオンチャネルにおけるのと同様の態様が適用される。また、他のKイオンチャネルの発現量も、第1のDNAの場合と同様に調整することができる。
本評価剤は、上記Naイオンチャネルを及び上記他のKイオンチャネルを、それぞれ、細胞膜上等に備えることで、不活性化の抑制された変異型電位依存性Naイオンチャネルを有していても、脱分極が惹起されるまでは、Naイオンの細胞内流入による細胞死が回避された細胞となっている。すなわち、細胞死誘導系を備えているが、脱分極の惹起を待って作動する細胞死誘導系が待機した状態となっている。
本評価剤、腫瘍の予防又は治療剤として用いることができるほか、本Kイオンチャネルについての研究用途としても使用することができる。本評価剤を適用することができる腫瘍については、本剤について既に説明した態様が提供される。
(イオンチャネル作用薬の評価方法)
本明細書に開示されるイオンチャネル作用薬の評価方法(以下、単に、本評価方法ともいう。)は、前記イオンチャネル作用薬は、骨腫瘍等の間葉系腫瘍を予防又は治療するための薬剤であり、標的イオンチャネルがKCa3.1イオンチャネルであり、前記標的イオンチャネルの活性を抑制する抑制剤を評価する工程、を備えることができる。本評価方法によれば、本Kイオンチャネルの抑制剤は、間葉系腫瘍のがん幹細胞から腫瘍細胞への変化を抑制できるため、間葉系腫瘍の予防に貢献する薬剤を提供できる。また、本Kイオンチャネルの抑制剤は、腫瘍細胞の悪性化や転移を抑制できるため、間葉系腫瘍の治療や改善や予後の改善に貢献する薬剤を提供できる。
本評価方法は、標的イオンチャネルを本Kイオンチャネルとし、その抑制剤の抑制活性を評価できる方法であればよく特に限定されないが、本評価剤を用いて、WO2012/002460及びWO2018/084221に開示される方法を用いて評価することが好ましい。
例えば、WO2018/084221に記載の方法は、標的イオンチャネルとして、抑制的標的イオンチャネルを用いる。本Kイオンチャネルは、抑制的標的イオンチャネルに相当する。この評価方法は、本評価剤が備える、標的イオンチャネルでない他のKイオンチャネルに対して阻害的に作用して、細胞死誘導系において脱分極を惹起して細胞死を誘導できる阻害剤(以下、Kイオンチャネル阻害剤ともいう。)による脱分極の惹起や細胞死誘導に抑制的に作用することができる。本Kイオンチャネルは、静止膜電位を深くする方向に作用するため、当該阻害剤とは独立して当該阻害剤による作用、すなわち、脱分極の惹起やそれによる細胞死誘導を抑制することができる。こうしたイオンチャネルを選択することで、当該イオンチャネルに関する効率的な評価系を構築できる。
Kイオンチャネル阻害剤は、他のKイオンチャネルの作用を阻害して、静止膜電位を負方向に深くすることを抑制する。こうした阻害剤は、例えば、他のKイオンチャネルの種類によっても異なる。公知情報から、Kイオンチャネル阻害剤を取得できるほか、種々の他のKイオンチャネルを含む細胞死誘導系を備える細胞を準備して、この細胞に対して、可能性ある他のKイオンチャネル阻害剤を供給して脱分極の惹起や細胞死が誘導されるか否かを評価することで、取得することができる。
例えば、Kir2.xに対する阻害薬としては、Baイオンが公知である。Baイオンに対する、本評価系の他の要素、例えば、NaイオンチャネルであるNav1.5や当該変異体、又は後述する標的イオンチャネルとしてのK2Pチャネルの感受性が低いことが好ましい。より具体的には、細胞死誘導系のKイオンチャネル以外の他のイオンチャネルの50%阻害濃度が、細胞死誘導系のKイオンチャネルの50%阻害濃度よりも、好ましくは5倍以上、より好ましくは7倍以上、さらに好ましくは10倍以上、なお好ましくは15倍以上、一層好ましくは20倍以上高いことが好ましい。このような選択阻害性を有することで、高い感度で抑制的標的イオンチャネルに対する被験化合物の作用を検出し評価できる。なお、こうした阻害濃度等も、本明細書に開示される細胞死誘導系を備える細胞を用いて測定することができる。
WO2018/084221に開示されるスクリーニング方法は、本評価剤に対して、Kイオンチャネルの作用を阻害するようにKイオンチャネルの阻害剤を供給する工程と、本評価剤に対して、抑制的標的イオンチャネルを阻害する可能性のある被験化合物を供給する工程と、被験化合物の供給による本評価剤の細胞死への影響を評価する工程と、を備えることができる。本スクリーニング方法によれば、Kイオンチャネルの阻害剤を供給してKイオンチャネルを阻害することで、抑制的標的イオンチャネルに対する被験化合物の作用を簡易に評価することができる。例えば、電気刺激を用いなくても本評価剤の脱分極を惹起することができる。この結果、効率的なスクリーニングが可能となっている。
また、Kイオンチャネル阻害剤によってKイオンチャネルによる作用を抑制する一方、Kイオンチャネル阻害剤による細胞死誘導作用を抑制する抑制的標的イオンチャネルによっても細胞死誘導系が制御されているため、Kイオンチャネル阻害剤の濃度を調節することで、意図する被験化合物の性質、すなわち、抑制的標的イオンチャネルに対する阻害剤か作用剤かによって、好適なスクリーニング環境を構築できる。例えば、細胞死率が50%よりも低くなるようにKイオンチャネル阻害剤を供給することで、抑制的標的イオンチャネルに対する阻害剤に好適なスクリーニング環境を構築できる。また、例えば、細胞死率が50%を超えるようにKイオンチャネル阻害剤を供給することで、抑制的標的イオンチャネルに対する作用剤に好適なスクリーニング環境を構築できる。
さらに、例えば、細胞死率が50%近傍となるようにKイオンチャネル阻害剤を供給することで、抑制的標的イオンチャネルに対する被験化合物が阻害剤であっても作用剤であっても定性的にかつ定量的に評価することができる。
例えば、細胞死率が50%近傍となる濃度のBaイオンを本評価剤に供給した場合、K2Pチャネル開口薬が存在すれば、細胞死率の割合が50%近傍よりも減少し、すなわち生き残る細胞の割合は50%近傍よりも増加する。一方、K2Pチャネル閉口薬が存在すれば、細胞死の割合が50%近傍よりも増加する、すなわち生き残る細胞の割合は50%近傍よりも減少する。この手法により、本評価剤の細胞死/細胞の生存、すなわち細胞の死亡率(又は生存率)によって、被験化合物の抑制的標的イオンチャネルに対する作用(作用剤か阻害剤か)を検出し評価できる。
スクリーニングにあたっては、1又は2以上の被験化合物を本評価剤に供給することができる。単一の被験化合物を用いて当該化合物による作用を検出してもよいし、2以上の被験化合物を用いてこれらの化合物の複合作用あるいは相加作用、相乗作用を検出してもよい。抑制的標的イオンチャネルに対する作用を本評価剤の細胞死(率)によって検出するにあたっては、被験化合物を供給しなかった場合の本評価剤の細胞死(率)を対照群とすることができる。また、抑制的標的イオンチャネルに対する作用が既知である化合物を対照群としてもよい。こうした対照群との比較によって、被験化合物の抑制的標的イオンチャネルに対する作用の有無や、さらにその作用の程度を検出することができる。
被験化合物は、特に限定しない。抑制剤として利用できる可能性のある低分子化合物であるほか、抗体などのタンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドなどの核酸(DNA、RNA)、オリゴ糖、多糖類、脂質等であってもよい。
本評価剤には、必要に応じて、被験化合物のほか、各種刺激が付与されてもよい。これらの刺激との組み合わせで作用が促進又は抑制される場合もあるからである。また、刺激の存在下で活性化するあるいは不活性化する標的イオンチャネルへの作用を評価することもできる。こうした刺激としては、例えば、温度変化(高温、低温)、pH変化、O2/CO2濃度変化、浸透圧変化、容積変化などが挙げられる。
本評価剤をこのスクリーニング方法に適用する場合、以下のような評価工程の態様が挙げられる。すなわち、被験化合物及びKイオンチャネル阻害剤の存在下で、被験化合物の作用を本評価剤の生死を指標として評価することが挙げられる。この場合、被験化合物の非存在下では、本Kイオンチャネルは恒常的に作動して、脱分極を抑制しあるいは活動電位を抑制している。このため、Kイオンチャネル阻害剤の存在下でも、活動電位が発生しない、あるいは延長しない。この結果、本評価剤は生存する。一方、この本評価剤に、被験化合物とKイオンチャネル阻害剤とを付与したとき、本評価剤の細胞死が促進される。かかる態様を示したとき、当該被験化合物は、本Kイオンチャネルに対して阻害性を有する阻害剤として判定できる。
以上のように、WO2018/084221に開示されるスクリーニング方法によれば、Kイオンチャネルに対する阻害剤を用いることで本評価剤の生死を指標として簡易に標的イオンチャネルに対する阻害剤をスクリーニングできる。
本評価方法は、イオンチャネル作用薬として、がん幹細胞の腫瘍細胞への分化及び腫瘍細胞の悪性化を抑制するため薬剤の評価方法としても実施できる。既述のとおり、本Kイオンチャネルは、がん幹細胞の腫瘍細胞への変化、腫瘍細胞の悪性化及びがん転移に貢献しているからである。
(腫瘍の病態検査のためのマーカー)
本明細書に開示されるマーカー(以下、単に、本マーカーともいう。)は、骨腫瘍についての病態の検査のためのマーカーであって、KCa3.1イオンチャネル、そのmRNA又はそのpre−mRNAに特異的に結合する化合物を含むことができる。本マーカーは、がん幹細胞の腫瘍化、腫瘍細胞の悪性化及びがん転移など、骨腫瘍を含む各種腫瘍の病態検査に用いることができる。本マーカーとしては、既に説明した、本抑制剤のほか、本KイオンチャネルのmRNAやタンパク質と特異的に結合するものであれば用いることができる。すなわち、本Kイオンチャネルに特異的に結合する抗体、アプタマー、siRNAなどの抑制剤として機能するもののほか、本KイオンチャネルのmRNAに特異的なオリゴヌクレオチドプローブ等であってもよい。また、本抑制剤について既述したように、公知の標識要素を備えるものが本マーカーとして好ましい場合がある。
本マーカーは、例えば、被験者から採取された血液、骨髄液などの生体液のほか、組織などにおける細胞検体に対して、マーカーの種類に応じて公知の方法で適用することができる。例えば、種々の態様での核酸ハイブリダイゼーション、抗原抗体反応、タンパク質−核酸相互作用などを利用して、本Kイオンチャネルタンパク質、そのmRNA、preーmRNAと結合させることができる。検出形態も、マーカーの種類や標識の種類等に応じて適宜設定することができる。
(骨腫瘍の病態の検査方法)
本明細書に開示される骨腫瘍の病態の検査方法(以下、単に、本検査方法ともいう。)は、骨腫瘍患者の被験者の対象部位から採取された細胞における、KCa3.1イオンチャネル活性を測定する工程、を備えることができる。この検査方法によれば、細胞における本Kイオンチャネルの活性を測定することで、がん幹細胞の腫瘍細胞への変化の度合い、腫瘍細胞の悪性化や転移の可能性や程度、患者の予後などについての情報を取得することができる。
細胞を採取する対象部位は、特に限定されないが、骨腫瘍の原発部位、転移部位等が挙げられる。また、活性化の測定方法は、特に、限定されないが、例えば、本KイオンチャネルのmRNA、タンパク質を特異的に検出して発現レベルの測定、本Kイオンチャネルタンパク質量等を、本マーカーを用いて検出することができる。
以下、本明細書の開示に関する具体例について説明するが、本明細書の開示は、以下の具体的に限定されるものではない。
(人工的骨肉腫がん細胞(AO;潜在的がん幹細胞/AX;前駆細胞様細胞)におけるKCaイオンチャネルの発現)
人工的骨肉腫がん細胞(AO細胞及びAX細胞、以下、まとめてAO/AX細胞とも称する。)は、慶應義塾大学佐谷教授と清水博士(現星薬科大学准教授)らより入手した。これらの細胞は、いずれも、Ink4a/Arf KOマウスの骨髄間質細胞から樹立されたものである。ここで、AO細胞は、脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞への分化能を有し、AX細胞と比較して腫瘍形成能が低いが、高い薬剤耐性能を示す細胞である。そして、AO細胞は、マウスに移植すると脂肪細胞への分化に重要なPPARγの発現が低下してAO細胞から脂肪細胞への分化能が低下して腫瘍化する性質を持ったAX様細胞になることで腫瘍化することが報告されている(文献10,11)。
これらのがん細胞は、Antibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution(Nacalai)、GlutaMAXTM Supplement(Gibco)及び20%FBS(Nichirei)添加IMDM培地(Nacalai)で培養した。実験に用いる際には使用する1〜2日前にシャーレ又はガラス片に蒔いた。AX細胞をマウスに植えて生じた腫瘍組織から得た骨肉腫腫瘍細胞は、Antibiotic-Antimycotic Mixed Stock Solution(Nacalai)及び10%FBS(Nichirei)添加IMDM培地(Nacalai)で培養し、mRNAと染色標本を得た。
これらの細胞につき、RNA抽出及びリアルタイムPCR法を行い、KCaイオンチャネル(マウスKCNN4)の発現を確認した。AO/AX細胞をシャーレ培養し、コンフレントに達した後RNAisoPlus(Takara)を用いてAGPC(Acid Guanidium Thiocyanate-Phenol Chloroform)法により総RNAを細胞から抽出し、OD260値からtotal RNA濃度を計算した。0.5μgのtotal RNAを用いてRevertraAce (TaKaRa)とRamdom Primers (Invitrogen)によりcDNAを合成し、リアルタイムPCRを行った。リアルタイムPCRはPCR検出定量システムLightCycler(登録商標)96 System(Nihon genetics)を用いて行った。SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)を用い、サイバーグリーンアッセイ法よりサイクル毎の蛍光を測定し、その蛍光強度から、あらかじめ作成した検量線を元にして、GAPDH mRNA発現量を内在性標準物質として相対的な対象イオンチャネルmRNAの発現量をGAPDHに対する比として算出し、その値を示した。結果を図1Aに示す。
PCRの具体的な操作は、以下の通りに行った。1)前熱変性反応(94℃,10分間)、2)熱変性反応(94℃,30秒間)、3)アニーリング反応(58℃,30秒間)、4)伸長反応(72℃,1分間)。2)〜4)はサイクル反応であり、35サイクルで行った。使用したプライマーは以下のとおりである。
Figure 2021113176
(電気生理学的実験)
AO/AX細胞の膜電流測定にはHamillらにより確立されたホールセルパッチクランプ法(Hamill et al., 1981)を用いた。外径1.04−1.08mmの芯入ガラス管から2段式電極製作機(PB-7; Narishige, Tokyo, Japan)を用いて記録電極を作製し、顕微鏡下で先端を熱加工により滑らかに整え実験に用いた。実験には先端の直径が約1μm、細胞内液充填時の電気抵抗が2−5MΩの記録電極を使用した。倒立顕微鏡(TMD; Nikon, Tokyo, Japan)のステージ上に固定したチャンバーに細胞を定着させたガラス片を固定し、Normal HEPES溶液で灌流した。細胞に対し、水圧式微動マニュピレーター(MHW-3; Narishige)を用いて記録電極を押し当て、電位固定法により膜電流を測定した。測定した電流は微小電流用増幅器CEZ-2400; Nihonkoden, Tokyo)を用いて増幅し、AD変喚器(Digidata 1440A; Axon Instruments)、Clampex10.2 (Axon Instruments)を用いて記録した。データ解析はClampfit10.2 (Axon Instruments)を用いて行った。結果を図1Bに示す。
(膜電位感受性色素Oxonol Vを用いた膜電位測定法)
オキソノール系膜電位感受性色素Oxonol Vは細胞膜が脱分極すると蛍光強度が増加し、膜が過分極すると蛍光強度が減少する色素であることが知られている。チャンバーに細胞を蒔いたガラス片を固定し、1μM Oxonol V(Sigma)を約30分間室温で負荷し、その後灌流しながら細胞に約30分間負荷した。画像測定・解析装置として、共焦点レーザー顕微鏡(A1R/Ti-E, Nikon)を用いた。Oxonol Vは640nmの波長で励起させ、KCaイオンチャネル阻害薬(TRAM-34, ICA-17043、化1参照)を添加した際の蛍光強度変化を解析した。結果を図1Cに示す。
(細胞内Caイオン濃度([Ca2+)測定法)
[Ca2+変化の測定には高速CCDカメラ蛍光画像解析システムARGUS/HiSCA(Hamamatsu Photonics)を用い、[Ca2+変化を画像解析した。本実験ではCa2+蛍光指示薬としてfura-2 acetoxymethyl ester (fura-2 AM, Invitrogen)を使用した。測定用チャンバーに細胞を付着させたガラス片を固定し、10μM fura−2 AMを添加し、約30分間室温で放置して細胞に負荷した。その後、HEPES溶液で過剰のfura−2 AMを10分間、洗浄した後、測定を開始した。一度の測定によりガラス片上の存在する約10細胞に対し、細胞内Caイオン濃度変化を計測した。測定条件は細胞内の色素をキセノンランプにより励起波長340nm及び380nmの光で励起させ、放出された520nm以上の各々の蛍光を高感度カメラで取得し(それぞれF340及びF380)、その蛍光強度比(F340/F380)を1枚の画像として取得した。結果を図1D及び同Eに示す。
図1Aに示すように、AO細胞に比較してAX細胞において顕著にKCaイオンチャネルの発現が増加していることがわかった。また、図1Bに示すように、KCaイオンチャネルの選択的阻害薬であるTRAM−34によって阻害されたTRAM−34感受性電流を比較した。その結果、AO細胞と比較してAX細胞において顕著にTRAM−34感受性電流が増加することが明らかとなった。
また、図1Cは、AO/AX細胞の膜電位に対するKCaイオンチャネルの寄与の解析結果であるが、KCaイオンチャネル活性化薬であるDCEBIOによる膜電位変化、阻害薬TRAM−34による膜電位変化を検討したところ、AX細胞におけるKCaイオンチャネルが膜電位を過分極方向にシフトさせていることがわかった。さらに、図1Dは、静止時における細胞内カルシウムイオン濃度の解析結果であるが、図1Dに示すように、静止時において、AO細胞と比較してAX細胞における静止時の細胞内カルシウムイオン濃度が増大していることがわかった。また、図1Eは、細胞内カルシウムイオン濃度に対するKCaイオンチャネルの寄与の解析結果であるが、図1Eに示すように、AO細胞においては、KCaイオンチャネル阻害剤存在下及び不存在下ではKCaイオンチャネル活性剤を供給しても、なんら変化が起きなかったのに対して、AX細胞においては、KCaイオンチャネル阻害剤不存在下でKCaイオンチャネル活性剤を供給すると、細胞内カルシウムイオン濃度が増大したことから、AX細胞における細胞内カルシウムイオン濃度には、KCaイオンチャネルの存在及びその活性化が寄与していることがわかった。
(AO/AX細胞の細胞増殖に対するKCaイオンチャネルの寄与)
細胞増殖の測定にはhigh content cell analyzer system (Operetta, PerkinElmer)を用いた。実施例1で用いたAO/AX細胞を1.5×10cells/wellになるように96wellプレートに蒔き、37°C,5%COでインキュベートした。細胞接着後(約2時間後)に薬物を培地に懸濁した薬物溶液に置換した。その時間を0時間とし、24,48時間培養後に測定を行った。測定は各時間経過したプレートに10μg/ml Hoechst33342 (Molecular Probe)入り2.2mM Ca2+HEPES溶液を添加し、室温で10分間放置させた。その後、Operettaを用いて励起波長:350nm、蛍光波長:461nmにおけるHoechst陽性細胞数を測定した。各測定時間において、同じ条件で実験を行った3wellの細胞数を平均したものを一例とした。結果を図2に示す。
図2によれば、KCaイオンチャネル阻害剤TRAM−34の添加は、AX細胞の細胞増殖の更新をAO細胞の増殖率と同等程度までに抑制することがわかった。
(AX/AO細胞の遊走能に対するKCaイオンチャネルの寄与)
実施例1で用いたAO/AX細胞につき、細胞遊走実験を行った。細胞遊走実験には、8.0μm pore size Cell Culture Insert (Corning, 以下chamberと呼称) を用いたTranswell assayを行った。24wellプレートに、1%FBS(Nichirei) 及び薬物(DMSO、TRAM−34、ICA−17043)入りのIMDM培地を用意した。Chamberを24wellプレートに設置し、Chamberの上部と下部にSerum free IMDM培地を添加し、数回chamberを揺らすことで、空気抜きを行った。その後、上部、下部の培地を抜いた。次に、各薬物(DMSO、TRAM−34、ICA−17043)を添加したSerum FreeのIMDM培地にAO/AX細胞を1.0×10cells/mlになるように懸濁させ、培地を抜いたchamberの上部に0.5mlずつ添加し、すぐに、1%FBS入りのIMDM培地が浸っている24wellプレートに設置した。AX細胞は37°C,5%COで4時間インキュベート、AO細胞は4時間で遊走細胞数が薬物の有無に関わらず少なかったため、8時間インキュベートした。
その後、綿棒で、Chamber上部にある非遊走性細胞を除去した。Diff-Quick kit (Sysmex)を用い、Transwellを通過し、上部から下部へと移動した遊走細胞を固定・染色した(IMDM培地を抜き、固定液を15分、染色液1.2を10分浸した)。ChamberのTranswell部分をカッターでくりぬき、スライドガラスに接着させ、顕微鏡で透過画像を取得した。1画像当たりに写る遊走細胞数を測定し、1chamberで無作為に3枚の画像を取得し、細胞数を平均化したものを1chamber当たりの遊走細胞数とした。各試行(n)において、DMSO、TRAM−34、ICA−17043を3chamberずつ行い、3chamber分の細胞数を更に平均し、これを一例分とした。TRAM-34、ICA-17043群の遊走細胞数を、DMSO群における遊走細胞数で規格化し、薬物による遊走率の変化を算出した。結果を図3に示す。
図3に示すように、KCaイオンチャネル阻害剤であるTRAM−34及びICA−17043の添加は、AX細胞の細胞遊走の亢進を顕著に抑制した(図3のA及びB)。また、AO細胞に対して同様の阻害剤を添加しても影響はなかった。
(AO/AX細胞及び骨肉腫採取細胞におけるKCaイオンチャネルの発現)
AX細胞[1]、AO細胞[2]及び骨肉腫腫瘍細胞[3](AX細胞を一度マウスに移植し、形成した腫瘍から細胞を採取し培養したもの。腫瘍形成能がAX細胞より高い。)をtriplicateで細胞培養皿に播種した。翌日、培養皿に細胞が付着したことを確認して、Nucleospin RNA(Takara)を用いてRNAを抽出・回収した。
また、腫瘍からのサンプル[7]、[8]は、骨肉腫腫瘍細胞[3]をマウスに皮下移植し、それぞれ、26日後に形成した原発巣(皮下腫瘍)、肺転移巣より、腫瘍片を回収したものである(n=3)。腫瘍片はNucleospin RNAの組織溶解液と混ぜ、Biomasher(Nippi)を用いてRNAを含む溶液を回収し、以後はNucleospinRNAのプロトコールに従ってRNAを抽出した。
(リアルタイムPCRによるKCaイオンチャネルの発現解析)
0.5μgのRNAをPrime Script(Takara)を用いて逆転写し、cDNAを作成した。リアルタイムPCRは、一般的に用いられるプロトコールにて行った。cDNA0.4μgとKcnn4、β−Actinの各プライマーを使用し、酵素にはThunderbird Premix(TOYOBO)を用いて添付書通りに溶液を調整した。溶液は、48穴のリアルタイムPCR用ディッシュに準備し、StepOne plus(Thermo Fischer Scientific)を用いてPCRを行い(機器のデフォルト設定)、発現を定量化した。結果はKcnn4の発現をβ−Actinの発現で割り、比を算出した。それぞれの増幅に用いたプライマーの配列は以下の通りである。結果を図4に示す。
Kcnn4
(Forward側: CAAGCACACTCGAAGGAAGG(配列番号27)、Reverse側: CTTCCGGTGTTTCAGCCGTA)(配列番号28)
β−Actin
(Forward側: CAACCGTGAAAAGATGACCC(配列番号29), Reverse側: TACGACCAGAGGCATACAG)(配列番号30)
図4のAに示すように、AX細胞[1]ほか、骨肉腫腫瘍細胞[3]、原発巣[7]及び転移巣[8]におけるKCaイオンチャネルの発現量が、AO細胞[1]よりも増大していた。なかでも、転移巣[8]において高い発現量を示していた。
(組織免疫抗体染色法による原発巣及び転移巣におけるKCaイオンチャネルの発現)
図4のAの骨肉腫腫瘍細胞[3]をマウスの大腿骨の骨髄内に移植し、原発巣(皮下腫瘍)、肝臓転移巣及び肺転移巣を形成させた。マウスは致死量のペントバルビタールを腹腔注射することにより安楽死させ、原発巣(皮下腫瘍)、転移巣(肺、肝臓)を取り出し、4%−パラホルムアルデヒドに2日間漬けて固定した。固定した検体はパラフィンに包埋したのち、薄切し、スライドガラスに貼り付けた。免疫抗体染色の手順は一般的な手法を用いて行った。以下に簡単に記す。スライドガラスの検体を、キシレン、100%,90%,80%,70%のエタノールに順次漬けることにより、脱パラフィン、脱キシレンをおこない、クエン酸緩衝液内で熱処理することにより、抗原の賦活化を行った。
次に、3%過酸化水素水入りメタノールにて内因性ペルオキシダーゼの不活化を行い、リン酸緩衝液(PBS)で洗浄後、3%−BSA−PBSでブロッキングを行った。その後、一次抗体(GeneTex社の抗Kcnn4抗体)を4℃で一晩作用させた。PBSで洗浄後、ニチレイ社のヒストファインを2次抗体として作用させ、PBSで洗浄後、DABにて発色させた。流水で洗浄後、ヘマトキシリン液で核を染色し、70%,80%,90%,100%のエタノール、キシレンに順次漬けることにより透徹処理を行った。最後にマリノール液(MUTO)を付けたカバーグラスにて封入した。結果を図4のBに示す。
図4のBに示すように、原発巣(骨髄内)及び転移巣(肝臓及び肺)において、KCaイオンチャネルのタンパク質が発現することを確認した。
以上の結果から、潜在的がん幹細胞であるAO細胞においてKCaイオンチャネルは発現していないが、AO細胞から前駆細胞様細胞であるAX細胞への変化に際して及び腫瘍細胞としての増殖、腫瘍細胞の悪性化及び転移などに際し、KCaイオンチャネルが高発現していることがわかった。
(関連文献の一覧)
以下に記載の文献は、引用により本明細書に組み込まれるものとする。
1. Bednenko J, Harriman R, Marien L, Nguyen HM, Agrawal A, Papoyan A, Bisharyan Y, Cardarelli J, Cassidy-Hanley D, Clark T, Pedersen D, Abdiche Y, Harriman W, van der Woning B, de Haard H, Collarini E, Wulff H, and Colussi P. A multiplatform strategy for the discovery of conventional monoclonal antibodies that inhibit the voltage-gated potassium channel Kv1.3. MAbs 10: 636-650, 2018.
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3. D'Alessandro G, Catalano M, Sciaccaluga M, Chece G, Cipriani R, Rosito M, Grimaldi A, Lauro C, Cantore G, Santoro A, Fioretti B, Franciolini F, Wulff H, and Limatola C. KCa3.1 channels are involved in the infiltrative behavior of glioblastoma in vivo. Cell Death Dis 4: e773, 2013.
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10. Shimizu T, Ishikawa T, Sugihara E, Kuninaka S, Miyamoto T, Mabuchi Y, Matsuzaki Y, Tsunoda T, Miya F, Morioka H, Nakayama R, Kobayashi E, Toyama Y, Kawai A, Ichikawa H, Hasegawa T, Okada S, Ito T, Ikeda Y, Suda T, and Saya H. c-MYC overexpression with loss of Ink4a/Arf transforms bone marrow stromal cells into osteosarcoma accompanied by loss of adipogenesis. Oncogene 29: 5687-5699, 2010.
11. Takahashi N, Nobusue H, Shimizu T, Sugihara E, Yamaguchi-Iwai S, Onishi N, Kunitomi H, Kuroda T, and Saya H. ROCK Inhibition Induces Terminal Adipocyte Differentiation and Suppresses Tumorigenesis in Chemoresistant Osteosarcoma Cells. Cancer research 79: 3088-3099, 2019.
12. Williams WA, Linley JE, Jones CA, Shibata Y, Snijder A, Button J, Hatcher JP, Huang L, Taddese B, Thornton P, Schofield DJ, Thom G, Popovic B, Dosanjh B, Wilkinson T, Hughes J, Dobson CL, Groves MA, Webster CI, Billinton A, Vaughan TJ, and Chessell I. Antibodies binding the head domain of P2X4 inhibit channel function and reverse neuropathic pain. Pain 2019.
13. Wulff H, and Castle NA. Therapeutic potential of KCa3.1 blockers: recent advances and promising trends. Expert Rev Clin Pharmacol 3: 385-396, 2010.
14. Yamazaki D, Aoyama M, Ohya S, Muraki K, Asai K, and Imaizumi Y. Novel functions of small conductance Ca2+-activated K+ channel in brain endothelial cells. J Biol Chem 281: 38430-38439, 2006.
配列番号23〜30:プライマー

Claims (12)

  1. 骨腫瘍の予防又は治療剤であって、
    Ca3.1(KCNN4)イオンチャネルの活性を抑制する抑制剤を有効成分とする、治療剤。
  2. 前記抑制剤は、前記イオンチャネルの活性を阻害するブロッカーである、請求項1に記載の予防又は治療剤。
  3. 前記抑制剤は、前記イオンチャネルの発現を抑制する発現抑制剤である、請求項1に記載の予防又は治療剤。
  4. 前記抑制剤は、前記イオンチャネルに結合する抗体である、請求項1に記載の予防又は治療剤。
  5. 前記骨腫瘍は、骨肉腫である、請求項1〜4のいずれかに記載の予防又は治療剤。
  6. 腫瘍の予防又は治療剤の評価のための剤であって、
    脱分極に伴う活動電位の持続時間を延長する電位依存性Naイオンチャネルと、
    静止膜電位を負方向に深くするKイオンチャネルと、
    Ca3.1イオンチャネルと、
    を備える細胞を含む、剤。
  7. 前記腫瘍は、骨腫瘍である、請求項6に記載の剤。
  8. イオンチャネル作用薬の評価方法であって、
    前記イオンチャネル作用薬は、骨腫瘍等の間葉系腫瘍を予防又は治療するための薬剤であり、
    標的イオンチャネルがKCa3.1イオンチャネルであり、
    被験化合物の前記標的イオンチャネルの抑制活性を評価工程、
    を備える、方法。
  9. 前記評価工程は、請求項6又は7に記載の剤を用いて前記抑制活性を評価する工程である、請求項8に記載の方法。
  10. イオンチャネル作用薬の評価方法であり、
    前記イオンチャネル作用薬は、がん幹細胞の腫瘍細胞への分化、腫瘍細胞の悪性化、及びがん転移を抑制するための薬剤であり、
    標的イオンチャネルがKCa3.1イオンチャネルであり、
    被験化合物の前記標的イオンチャネルの抑制活性を評価する工程、
    を備える、方法。
  11. 骨腫瘍についての病態の検査のためのマーカーであって、
    Ca3.1イオンチャネル、そのmRNA又はそのpre−mRNAに結合する化合物を含む、マーカー。
  12. 骨腫瘍についての病態の検査方法であって、
    被験者の対象部位から採取された細胞における、KCa3.1イオンチャネル活性を測定する工程、
    を備える、方法。
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