KR20110096294A - 간암 진단용 마커로서의 ｓ100ｐ의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 간암 진단용 마커로서의 S100P의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 S100P 유전자를 이용한 간암 진단용 마커, 이를 이용한 간암 진단용 조성물, 키트, 마이크로어레이 및 간암의 진단 방법에 관한 것이고, 또한 S100P 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하여 간암을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법 및 상기 물질을 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 S100P 유전자는 비-간암 조직 또는 세포에 비해 간암 조직 또는 세포에서 발현양이 증가되는 것으로 확인됨에 따라 S100P 유전자를 간암 진단용 마커로 사용할 경우 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 간암의 예방 또는 치료를 위한 치료제 개발의 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

Description

간암 진단용 마커로서의 Ｓ100Ｐ의 용도{Use of S100P as a hepatocellular carcinomar diagnostic marker}

본 발명은 간암을 조기에 효과적으로 진단 및 예측할 수 있는 신규한 간암 진단용 마커, 간암 진단용 조성물, 간암 진단용 키트, 마이크로어레이 및 상기 간암 진단용 마커를 이용한 간암의 진단 방법에 관한 것이다.

간암(hepatocellular carcinoma; HCC)은 세계적으로 가장 치명적인 암 중 하나이다. 특히 아시아와 사하라 이남 아프리카에서, 해마다 약 오십만명 이상이 간암으로 사망하고 있다. 비록 간암의 위험 요인이 B형 간염 또는 C형 간염 바이러스에 의한 고질적인 감염이라고 할지라도 간암 세포 내의 분자 메커니즘은 아직도 명확히 규명되지 않은 상태이다.

현재 간암 진단을 위해 초음파 검사, CT 검사, MRI 검사 등의 화상 진단 검사, 혈청 검사(AFP, PIVKA-II) 및 생검 재료의 병리 조직 검사가 이용되고 있는데, 혈청 AFP 검사는 환자의 대략 7할 미만에서 높은 값을 나타내지만, 만성 간질환 환자에 있어도 경도의 높은 값을 나타내는 것이 자주 인정되어 그 감별이 중요하다. 한편, 조기 간암에서는 낮은 값을 나타내는 일도 많은데, PIVKA-II(protein induced by vitamin K antagonist II)의 양성율은 5할 미만으로 낮지만, 간암에서의 특이성은 높고 양자의 병용에 의해 진단 정밀도가 상승하는 것으로 알려져 있다. 그렇지만, 위양성 혹은 양자 음성의 증례에 대해 보다 특이적인 종양 마커의 개발이 기대되고 있다.

생검 재료의 병리 조직 검사는 간질환의 확정 진단에 있어 중요한 검사이다. 그러나 병리학적 특징만으로 암, 특히 초기의 간암과 비암부 조직을 식별하는 일도 때때로 곤란하다. 즉, 미소병변은 대재성 결절, 혹은 초기의 고분화형의 간세포암인 경우를 볼 수 있으며, 특히 경피성 침생검에 의해 종양성 조직을 채취했을 경우에는, 채취량이 한정되는 일도 있으므로 보다 확실한 진단 기술이 요구된다. 따라서 이러한 일로부터 조기의 간세포암을 비암부 조직으로부터 식별할 수 있는 암특이적인 항체 또는 마커의 개발이 필요한 실정이다.

간암을 포함한 인간 암과 관련된 유전자를 마이크로 어레이 방법으로 규명하기 위하여 현재까지의 연구들은 유전자 발현의 패턴을 분석하는데 매우 유용한 방법인 언수퍼바이즈드 클러스터링 알고리즘(unsupervised clustering algorithm) 및 수퍼바이즈드 알고리즘을 개발하였다. 언수퍼바이즈드 클러스터링 분석은 샘플 내에 존재하는 내재적인 생물학적 의미를 추출하는데 매우 유용하나, 그 측정결과의 통계적인 정확성을 제공하기 어려울 뿐 아니라, 측정되는 유전자의 수를 적절하게 조절하기 힘든 단점이 있다. 수퍼바이즈드 러닝 알고리즘의 경우 샘플을, 차이를 보고자 하는 군으로 분류하여 분석할 수 있다는 매우 강력한 장점 외에도 분석 결과를 이용하여 신규 샘플을 검증할 수 있다는 특징을 가지고 있다. 최근에는 간암을 포함한 다양한 암의 마이크로 어레이 프로파일링 분석에 이 두가지 방법이 모두 적용되고 있으며, 신규 샘플의 진단 및 예측에 모두 성공적으로 사용되고 있다.

최근의 연구에 의하면 간암 발생에 있어서 변형된 p53, 베타-카테닌, AXINI, p21(WAF1/CIP1) 및 p27 Kip 등의 유전자가 관련된다는 것이 밝혀졌다. 그러나 이러한 개개의 유전자의 변화들은 간암 환자들의 외적 특성과 임상 특성(clinical characteristic)을 정확하게 반영하지 못하고 있다. 개체의 간암 내의 세포와 분자의 다양성은 기존의 유전자 연구 외에 새로운 접근 방식을 요구하고 있다. 따라서 간암의 발암 기작은 여전히 불분명한 상태이다.

본 발명의 목적은 간암(HCC)의 발전 및 진행에 있어서 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 S100P 단백질로 이루어진 마커를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자의 수준 또는 S100P 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트 및 간암 진단용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 S100P 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계를 포함하는 간암을 예측 및 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 간암을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

나아가, 본 발명의 다른 목적은 S100P 유전자의 발현을 억제하는 물질을 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 S100P 단백질로 이루어진 간암 진단용 마커를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 S100P 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자의 수준 또는 S100P 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 S100P 유전자의 수준을 측정하는 물질은 S100P 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 S100P 단백질의 수준을 측정하는 물질은 S100P 단백질을 특이적으로 인식하는 항체일 수 있다.

또한, 본 발명은,

(a) 생물학적 시료에 존재하는 S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 S100P 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 간암을 예측 및 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은,

(a) S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자 또는 S100P 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계;

(b) 상기 S100P 유전자의 발현양, S100P 단백질의 양 또는 S100P 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및

(c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, S100P 유전자의 발현양, S100P 단백질의 양 또는 S100P 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계의 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.

나아가 본 발명은 S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자의 염기서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 siRNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 3의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명에 따른 S100P 유전자는 비-간암 조직 또는 비-간암 세포에 비해 간암 조직 또는 간암 세포에서 발현양이 증가되는 것으로 확인됨에 따라 S100P 유전자를 간암 진단용 마커로 사용할 경우 간암을 조기에 신속하고 정확하게 진단 및 예측할 수 있는 효과가 있으며, 간암의 예방 또는 치료를 위한 치료제 개발의 표적으로 활용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 간암 조직과 비간암 조직 및 간암 세포와 비간암 세포에서 발현되는 S100P 유전자의 발현 정도를 비교한 것으로써, 도 1a는 RT-PCR을 수행하여 확인한 것이고, 도 1b는 웨스턴 블럿을 수행하여 확인한 것이다.
도 2는 인간 간암 조직 및 인접한 정상 조직에서 발현되는 S100P 단백질을 면역조직화학염색법을 통해 염색한 이미지는 나타낸 것으로서, 2a 및 2c는 정상 조직을 관찰한 것이고, 2b 및 2d는 간암 조직을 관찰한 것이다.
도 3a는 siRNA S100P 올리고뉴클레오티드 및 대조군으로서 스크램블 siRNA를 농도별로 간암 세포에 도입시킨 후, RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 통해 S100P 유전자의 발현억제를 확인한 것이며, 도 3b는 MTS 어세이를 통해 각 처리군에 따른 세포의 수를 카운팅한 결과를 그래프로 비교하여 나타낸 것이다.
도 4는 간암 세포에 대해 siRNA S100P 올리고뉴클레오티드 및 대조군으로서 스크램블 siRNA를 각각 처리한 후, 이에 따른 세포사멸 정도를 측정한 것으로서, 4a는 siRNA 처리에 따른 S100P의 발현 억제는 웨스턴 블럿을 통해 확인한 것이며, 4b는 FACS 분석을 통해 세포주기별 세포사멸 정도를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 S100P 유전자에 따른 세포주기와의 상관성을 비교하기 위해 siRNA S100P 올리고뉴클레오티드를 처리한 후, G1/S 전이단계와 관련된 조절 인자인 P15, P16, P21, 사이클린 D1, D3 및 CDK2의 발현정도를 웨스턴 블럿을 통해 확인한 것을 나타낸 것이다.

본 발명은 S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 S100P 단백질을 포함하는 신규한 간암 진단용 마커를 제공함에 특징이 있다.

기존에 간암 진단을 위해 사용되고 있는 대부분의 마커의 경우, 간암을 정확하게 진단하는 비율이 비교적 낮고 간암 이외의 다른 질병들과도 뚜렷한 구분을 보이지 않아 간암에 대한 예민도 및 특이도가 낮은 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 새로운 간암 진단용 마커를 발굴하기 위해 간암의 조직 또는 세포와 정상 조직 또는 정상 세포에서 발현의 차이를 보이는 유전자를 조사한 결과, S100P(S100 calcium binding protein P)가 정상에 비해 간암에서 과다 발현된다는 사실을 확인하였고, 본 발명에 따른 상기 S100P 유전자의 염기서열을 서열목록 1에 나타내었다.

한편, S100 단백질은 칼슘 결합 단백질의 EF-hand 단백질 그룹(EF-hand superfamily)의 일종으로, S100A2, S100A4, S100A6, S100A7, S100B 및 S100P를 포함한다. 이러한 S100P 단백질은 세포주기(cell cycle), 성장(growth), 분화(differentiation) 및 대사(metabolism)와 관련된 칼슘 기반 신호 전달 경로(Ca2+ dependent signal transduction pathway)를 중계하는 것으로 알려져 있다(Zimmer DB, Cornwall EH, Landar A and Song W: The S100 protein family: history, function, and expression. Brain Res Bull 37: 417-429, 1995).

또한, 이러한 S100 단백질 중에서 특히 S100P 단백질은 기능적으로 신경 및 심장 관련 질병들과 관련성이 있는 것으로 알려져 있다. S100P 단백질, 즉, S100 칼슘 결합 단백질 P는 95개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 다른 조직에서 제한된 세포 분화를 갖는 태반으로부터 최초로 정제되었고(Emoto Y, Kobayashi R, Akatsuka H and Hidaka H: Purification and characterization of a new member of the S-100 protein family from human placenta. Biochem Biophys Res Commun 182: 1246-1253, 1992.), EF-hand 타입의 칼슘 결합 단백질로 구성되어 있으며, 최근에 확인된 S100 단백질 그룹 중 하나이다.

이에 본 발명자들은 S100P 단백질이 세포성장 및 분화, 세포주기 제어 및 대사 제어와 관련성 있다는 사실 및 본 발명의 일실시예를 통해 정상조직에 비해 간암조직에서 과다 발현되고 있다는 사실을 기초로 하여 S100P가 간암의 발병을 진단 및 예측할 수 있는 바이오 마커로서 사용할 수 있음을 예측할 수 있었고, 나아가 S100P가 간암의 발병과 관련성이 있다는 사실을 본원에서 최초로 규명하였다.

이러한 예상은 본 발명의 일실시예를 통해 더욱 확실하게 규명 되었는데, 즉, 간암조직 및 정상조직을 대상으로 S100P 유전자의 발현양을 RT-PCR 및 웨스턴 블럿으로 확인한 결과, 정상조직에 비해 간암조직의 경우 S100P 유전자의 발현양이 월등히 증가한 것으로 나타났고(도 1a 및 1b 참조), 이러한 결과는 면역조직화학염색법을 수행한 결과에서도 동일한 결과로 나타났다(도 2 참조).

따라서 상기 결과를 통해 S100P 유전자가 정상에 비해 과다 발현될 경우 간암이 발병된다는 사실을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 S100P 단백질로 이루어지는 간암 진단용 마커를 제공할 수 있다.

본 발명에서, 상기“진단”이라는 용어는 병리 상태를 확인하는 것을 의미하는 것으로서, 본 발명의 목적상 상기 진단은 간암 진단 마커의 발현 유무를 확인하여 간암의 발병 여부를 확인하는 것을 의미하며, 또한, 본 발명에서의 “진단”은 간암 진단 마커의 발현 유무 및 발현 정도를 확인하여 간암의 발병여부, 발전 및 경감 등을 판단하는 것도 포함한다.

또한, 상기 “진단용 마커(diagnosis marker)”란 간암의 세포 또는 조직을 정상 세포 또는 조직과 구분하여 진단할 수 있는 물질을 의미하며, 정상 세포에 비하여 간암의 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예컨대, mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명에서 제공하는 간암 진단용 마커는 정상 세포에 비해 간암의 세포에서 발현양이 증가하는 S100P 유전자 또는 단백질일 수 있으며, 바람직하게 상기 S100P 유전자는 서열번호 1로 기재된 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 S100P 유전자의 수준 또는 S100P 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 S100P 유전자의 수준은, 바람직하게 S100P 유전자가 발현된 mRNA 수준, 즉, mRNA의 양을 의미하며, 상기 수준을 측정할 수 있는 물질로는 S100P 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 S100P 유전자에 특이적인 프라이머 또는 프로브는 서열번호 1로 나타내는 S100P 유전자 전체 또는 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브일 수 있으며, 상기 프라이머 또는 프로브는 당업계에 알려진 방법을 통해 디자인할 수 있다.

본 발명에서 상기“프라이머”란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 S100P 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 서열번호 6 및 7로 이루어진 프라이머 쌍일 수 있다.

상기 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자의 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.

본 발명에서, 상기“프로브”라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아조릴-, 이미다조릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 S100P 단백질의 수준은, 바람직하게 S100P 유전자가 발현된 mRNA로부터 번역과정을 거쳐 생성된 S100P 폴리펩티드를 의미하며, 상기 S100P 단백질의 수준을 측정할 수 있는 물질로는 S100P 단백질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 다클론 항체, 단일클론 항체 및 재조합 항체 등의 “항체”를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 간암을 진단할 수 있는 마커 단백질로서 S100P 단백질이 규명되었으므로, 상기 단백질을 이용하여 항체를 생성하는 방법은 당해 기술분야의 일반적 기술자가 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 예컨대, 다클론 항체의 경우에는 S100P 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있으며, 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조가능하다. 단일클론 항체의 경우에는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마(hybridoma) 방법(Kohler et al., European Jounral of Immunology, 6, 511-519, 1976)을 이용하여 제조할 수 있거나 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352, 624-628, 1991, Marks et al, J. Mol . Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또한, 본 발명은 S100P 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 키트를 제공할 수 있다.

본 발명의 간암 진단용 키트에 포함되는 간암 진단용 조성물은 S100P 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체를 포함할 수 있으며, 이들의 정의는 앞서 기술된 바와 같다.

본 발명의 간암 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 간암 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 S100P 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 간암 진단용 조성물을 포함하는 간암 진단용 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에 있어서, S100P 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 프라이머, 프로브 또는 항체는 혼성화 어레이 요소(hybridizable array element)로서 이용되며, 기질(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기질은 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기질 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기질에 결합될 수 있다.

한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료가 핵산일 경우에는 표지(labeling)될 수 있고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.

또한, 본 발명은 S100P 유전자의 발현수준 또는 S100P 단백질 수준을 측정하여 간암을 진단하는 방법을 제공할 수 있는데, 상기 방법은 (a) 생물학적 시료에 존재하는 S100P 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 S100P 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기에서 S100P 유전자의 발현수준 또는 S100P 단백질 수준을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 검출 또는 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"란 간암 발생 또는 진행 정도에 따른 상기 S100P 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있다.

상기 S100P 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 S100P 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우, 생물학적 시료 내의 S100P 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 이에 제한되지는 않으나, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있다.

따라서 본 발명은 상기와 같은 검출 방법들을 통하여, 대조군의 S100P mRNA 발현양 또는 단백질의 양과 간암 환자 또는 간암 의심환자에서의 S100P mRNA 발현양 또는 단백질의 양을 확인할 수 있고, 상기 발현양의 정도를 대조군, 즉, 정상인의 샘플과 비교함으로써 간암의 발병여부, 진행단계 또는 예후 등을 예측 및 진단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 간암 환자로부터 수득한 조직 및 간암세포를 용해시켜 세포내 단백질들을 포함하는 용해물을 수득한 다음, S100P에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 방법을 수행하여 각 간암시료로부터 S100P의 단백질 양을 측정한 다음, 상기 측정치를 정상의 대조군과 비교 분석하는 과정을 통해 수행하였다.

나아가 본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해 간암이 발병할 경우 세포 또는 조직내에서 S100P의 발현이 증가되므로 간암세포에서 S100P의 발현을 억제할 경우 간암을 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 예상하였고, S100P의 발현을 억제할 수 있는 물질을 간암 치료제로 사용할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명은 (a) S100P 유전자 또는 S100P 단백질을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; (b) 상기 S100P 유전자의 발현양, S100P 단백질의 양 또는 S100P 단백질의 활성을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 측정 결과, S100P 유전자의 발현양, S100P 단백질의 양 또는 S100P 단백질의 활성이 감소되는 경우에 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정하는 단계를 포함하는, 간암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 먼저 S100P 유전자 또는 S100P 단백질을 포함 또는 발현하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킬 수 있다. 여기서 상기“시료”는 S100P 유전자의 발현양, S100P 단백질의 양 또는 S100P 단백질의 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후, 시료가 처리된 세포에서 S100P 유전자의 발현양, S100P 단백질의 양 또는 S100P 단백질의 활성을 측정할 수 있으며, 측정 결과, S100P 유전자의 발현양, S100P 단백질의 양 또는 S100P 단백질의 활성이 감소되는 것이 측정되면 상기 시료는 간암을 치료 또는 예방할 수 있는 물질로 판정될 수 있다.

상기에서 S100P 유전자의 발현양, S100P 단백질의 양 또는 S100P 단백질의 활성을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 이에 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)등을 이용하여 수행할 수 있다.

또한, 본 발명은 S100P 유전자의 발현을 억제하거나 또는 S100P 단백질의 발현 및 활성을 감소시키는 물질을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 실제로 S100P 유전자의 발현을 억제하거나 또는 S100P 단백질의 발현을 억제할 경우, 간암을 예방 또는 치료할 수 있는지를 확인하는 실험을 수행하였는데, 즉, S100P 유전자에 대한 siRNA를 이용하여 간암세포에서 S100P의 발현을 억제한 결과, 간암 세포의 세포성장이 억제되는 것으로 나타났고(도 3 참조), 나아가 간암세포의 세포사멸이 촉진되는 것을 확인할 수 있었다(도 4 참조).

한편, 정상세포는 세포가 스스로 성장 및 분화 조절기능과 자기사멸기능 간의 균형을 유지하지만, 암세포는 이 균형이 깨져 세포의 수가 기하급수적으로 빠르게 증가하고 성장한다. 세포의 성장과 분화를 위한 세포주기의 과정은 크게 간기(Interphase)와 분열기(Mitotic phase)로 나뉘며, 간기는 다시 세포들이 세포분열에 필요한 각종 단백질의 합성이 일어나는 G(1)-phase와 DNA 합성이 일어나는 S-phase, 세포분화 과정인 유사분열(Mitosis-phase) 단계로 이루어져 있다.

또한, 세포분열에는 이를 조절할 수 있는 조절요소들이 필요한데, 특히 각종 사이클린(Cyclin) 단백질은 사이클린 의존성 키나아제(Cyclin Dependent Kinase, CDK)라고 불리는 인산화 효소와 cyclin/CDK 복합체를 형성하여 세포주기의 단계를 조절하는 역할을 하며, 특히 사이클린 키나제 억제제(cyclin kinase inhibitors, CKIs)인 p21은 G1-phase의 cyclin/CDK 복합체에 붙어서 이 복합체가 활성화되는 것을 막고, 세포주기의 진행을 억제시킴으로써 결국 세포의 성장을 저해시키는 결과를 낳는다.

상기 사이클린 단백질 또한 세포 주기에 있어서 중요한 역할을 하는데, 세포 주기 동안 사이클린의 발현 레벨이 변동하게 되도록 사이클린의 합성 및 분해는 엄격하게 조절되어 있다. 사이클린은 사이클린 의존적 세린/트레오닌 키나제(CDK)에 결합하며, 이러한 결합은 세포내 CDK(예, CDK1 CDK2, CDK4 및/또는 CDK6) 활성에 있어서 필수적인 것이다. 또한, CDK는 다수의 종양유전자 신호전달 경로의 하류에 존재하는 것으로 보고되고 있는데, 사이클린의 상향조절 또는 내인성 억제제의 결실에 의한 CDK 활성의 부조절(disregulation)은 종양 세포의 유사분열촉진성 신호전달 경로와 종양 세포의 증식 사이에서 중요한 축을 이루는 것으로 알려져 있으며, 세포 주기 키나제(CDK)의 억제제는 세포 증식, 예컨대 포유동물 암 세포 성장의 선택적 억제제로서 유용한 것으로 인식되고 있다.

이에 본 발명자들은 간암 세포에서 S100P가 과발현되고 있다는 사실을 통해 S100P가 암 세포의 세포주기 과정에도 관여하고 있을 것으로 예상하였고, S100P에 의해 영향을 받는 세포주기 조절인자를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 의한 결과에 의하면, 간암 세포에 S100P siRNA을 처리하여 S100P의 유전자 발현을 억제하였더니 사이클린 D1 및 CDK2의 발현도 함께 억제되는 것으로 나타난 반면, p21, p16, p15 및 사이클린 D3는 아무런 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(도 5 참조).

상기 결과를 통해 본 발명자들은 S100P가 사이클린 D1 및 CDK2의 조절을 통해 세포 내에서 세포주기 및 성장의 조절에 이상을 초래하여 암을 유발시킨다는 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명자들은 S100P가 사이클린 D1 및 CDK2의 조절을 통해 세포 내에서 세포주기 및 성장의 조절에 이상을 초래하여 암을 유발시킨다는 것을 알 수 있었고, 나아가 세포내에서 S100P의 발현을 억제할 경우, 간암의 발병을 예방하거나 또는 간암을 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명에 따른 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에는 S100P의 발현을 억제할 수 있는 물질이라면 모두 포함할 수 있고, 바람직하게는 화학물질, 뉴클레오티드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 또는 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 본 발명의 S100P 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함할 수 있으며, 더욱더 바람직하게는 서열번호 2 또는 3의 염기서열을 가지는 S100P 유전자에 대한 siRNA 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "안티센스 올리고뉴클레오타이드”란 용어는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 S100P의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 S100P mRNA에 상보적이고 S100P mRNA에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하며, S100P mRNA의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다.

또한, 상기 안티센스 핵산은 효능을 증진시키기 위하여 하나 이상의 염기, 당 또는 골격(backbone)의 위치에서 변형될 수 있다(De Mesmaeker et al., Curr Opin Struct Biol., 5, 3, 343-55, 1995). 핵산 골격은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 단쇄 알킬, 시클로알킬, 단쇄 헤테로아토믹, 헤테로시클릭 당간 결합 등으로 변형될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산은 하나 이상의 치환된 당 모이어티(sugar moiety)를 포함할 수 있다. 안티센스 핵산은 변형된 염기를 포함할 수 있다. 변형된 염기에는 하이포크잔틴, 6-메틸아데닌, 5-메틸피리미딘(특히 5-메틸시토신), 5-하이드록시메틸시토신(HMC), 글리코실 HMC, 젠토비오실 HMC, 2-아미노아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-하이드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6 (6-아미노헥실)아데닌, 2,6-디아미노퓨린 등이 있다. 또한, 본 발명의 안티센스 핵산은 상기 안티센스 핵산의 활성 및 세포 흡착성을 향상시키는 하나 이상의 모이어티(moiety) 또는 컨쥬게이트(conjugate)와 화학적으로 결합될 수 있다. 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 콜릭산, 티오에테르, 티오콜레스테롤, 지방성 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 아다맨탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 옥타데실아민, 헥실아미노-카르보닐-옥시콜에스테롤 모이어티 등의 지용성 모이어티 등이 있고 이에 제한되지는 않는다. 지용성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드와 제조 방법은 본 발명의 기술 분야에서 이미 잘 알려져 있다(미국특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호). 상기 변형된 핵산은 뉴클레아제에 대한 안정성을 증가시키고 안티센스 핵산과 표적 mRNA와의 결합 친화력을 증가시킬 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오타이드는 통상의 방법으로 시험관에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 합성되도록 할 수 있다. 시험관에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 일예는 RNA 중합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 안티센스 RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 인식부위(MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 벡터를 사용하여 안티센스 RNA가 전사되도록 하는 것이다. 이런 안티센스 RNA는 서열 내에 번역 중지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 "siRNA”용어는 RNA 방해 또는 유전자 사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다(국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 및 00/44914 참조). siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운(knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다.

본 발명의 siRNA 분자는, 센스 가닥(S100P mRNA 서열에 상응하는 서열)과 안티센스 가닥(S100P mRNA 서열에 상보적인 서열)이 서로 반대쪽에 위치하여 이중쇄를 이루는 구조를 가질 수 있으며, 또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥을 가지는 단일쇄 구조를 가질 수 있다. 나아가 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 또한, siRNA 말단 구조는 S100P 유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt) 말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하고, 점착 말단 구조는 3'-말단 돌출 구조와 5'-말단 돌출 구조 모두 가능하다.

또한, 본 발명의 siRNA 분자는 자기-상보성(self-complementary) 센스 및 안티센스 가닥 사이에 짧은 뉴클레오티드 서열이 삽입된 형태를 가질 수 있으며, 이 경우 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 형성된 siRNA 분자는 분자내 혼성화에 의하여 헤어핀 구조를 형성하게 되며, 전체적으로는 스템-앤드-루프 구조를 형성하게 된다. 이 스템-앤드-루프 구조는 인 비트로 또는 인 비보에서 프로세싱되어 RNAi를 매개할 수 있는 활성의 siRNA 분자를 생성한다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유래의 siRNA 발현 카세트 등을 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection)시키는 방법이 있다.

또한, 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 본 발명의 조성물은 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있으며, 이러한 예로는, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류 중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수 있다.

또한, 상기 S100P 단백질의 발현 및 활성을 감소시키는 물질로서 S100P 단백질에 특이적인 항체를 사용할 경우, 상기 항체는 기존의 치료제와 직접 또는 링커 등을 통하여 간접적으로 커플링(예를 들어, 공유결합)시킬 수 있다. 항체와 결합될 수 있는 치료제로는 이에 제한되지는 않으나, 131I, 90Y, 105Rh, 47Sc, 67Cu, 212Bi, 211At, 67Ga, 125I, 186Re, 188Re, 177Lu, 153Sm, 123I, 111In 등과 같은 방사성핵종(radionuclide); 메토트렉세이트(methotrexate), 아드리아마이신(adriamycin), 및 인터페론과 같은 림포카인(lympokine) 등의 생물학적 반응 변형체 또는 약물; 리신, 아브린, 디프테리아 등과 같은 독소; 이형기능성 항체(heterofunctional antibodies), 즉 다른 항체와 결합되어서 그 복합체가 암 세포와 효능 세포(예를 들면, T 세포와 같은 K 세포(killer cell) 모두에 결합하는 항체; 및 자연적인, 즉, 비-연관 또는 비-복합된 항체와 결합될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있는데, 상기 “투여”란 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다.

또한, 상기에서 “유효량” 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 환자의 질환 종류 및 중증도, 연령, 성별, 체중, 약물에 대한 민감도, 현재 치료법의 종류, 투여방법, 표적 세포 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

하기 기술되는 실시예들에서 사용된 시약 및 세포들은 다음과 같이 준비하여 사용하였다.

재료준비

하기 실시예들의 실험을 위해 임의로 선택된 5명의 한국인 환자들로부터 얼린 조직들(종양조직 및 정상조직)을 얻었으며, 상기 조직은 한국 카톨릭 대학교 의과대학장의 승인 하에서 수행되었다. 또한 실험에 앞서 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)에 따라 환자들에게 실험에 대해 설명한 후 필요한 동의를 얻었다.

또한, 실시예들에서 사용한 세포주들은 한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank; KCLB)으로부터 구매하여 사용하였으며, 세포주로는 Hep3B, SNU182, SNU354, SNU449 및 SNU475 세포를 구매하였다. 또한, 미국 균주 기탁 및 배포 협회(American Type Culture Collection; ATCC)로부터 THLE-3, HepG2(Acc. No. HB-8065), PLC/PRF/5 및 CHANG liver(Acc. No. CCL-13) 세포들을 구매하여 사용하였다.

세포배지 및 시약 준비

각 세포주들은 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum; Sigma, St Louis, MO, USA)이 보충된 RPMI1640 배지에서 성장시켰고, 세포들을 트립신 처리한 후 100mm 디쉬에 5x10⁵ cells/plate로 분주한 다음, 37℃, 5% CO²의 습식 인큐베이터에서 하루 밤 동안 배양시켰다.

통계적 분석

본 실시예에서 수행한 각 실험은 3회씩 반복 수행하였으며, 통계학적 의의는 P<0.05에서의 unpaired student's t-test 및 카이 제곱 검정(Chi squared test)을 통해 정의되었다.

< 실시예 1>

간암 세포에서 S100P 의 발현정도 측정

본 발명자들은 간암 세포와 정상 세포에서 S100P의 발현 정도가 어떠한 차이를 나타내고 있는지 조사하기 위해 다음과 같이 RT-PCR 및 웨스턴 블럿을 수행하였다. 먼저, RT-PCR을 위해 앞서 기술한 간암 세포주 및 환자로부터 수득한 간암조직과 정상 조직들로부터 당업계에 사용되고 있는 트리졸 시약(trizole reagent; Invitrongen)을 사용하여 전체 RNA를 각각 분리하였고, NanoDrop(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)을 사용하여 분리한 RNA의 농도를 측정하였다. 이후, Superscript II enzyme(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA)와 0.5㎍의 oligo(d)T(Amersham biosciences, Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 1㎍의 전장 RNA를 역전사 하였다. 이때 역전사를 위한 반응 혼합물은 42℃에서 60분, 72℃에서 15분 동안 배양되었다. 이때, 각 반응에 부가된 전체 cDNA의 양적 차이를 보정하기 위해 GAPDH를 대조군으로 사용하였고, 반응 조건은 초기 변성(denaturation)을 95℃에서 10분간 행한 다음, 95℃에서 15초, 58℃에서 5초 및 72℃에서 5초를 40회 반복 수행하였다. 이후 PCR 반응 산물은 폴리-아크릴아미드 겔 전기영동(poly-acrylamide gel electrophoresis)을 통해 발현양을 비교 측정하였다. 또한, S100P DNA의 증폭을 위해 사용한 프라이머는 하기 서열번호 6 및 7의 프라이머 쌍을 이용하여 수행하였다.

S100P Forward 프라이머(서열번호 6): 5'-AGCTCAAGGTGCTGATGGAG-3'

S100P Reverse 프라이머(서열번호 7): 5'-ACTTGTGACAGGCAGACGTG-3'

또한, 상기 웨스턴 블럿은 상기 간암 세포주 및 환자로부터 수득한 간암조직과 정상조직들로부터 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포 또는 조직들의 용해물을 수득한 다음, 다음과 같은 항체들을 사용하여 당업계에 공지된 웨스턴 수행방법에 따라 웨스턴 블럿을 수행하였다. 상기 항체들로는 항-S100P(BD Biosciences, San Jose, CA, USA), 항-PARP, 항-α-튜블린(Sigma), 항-mouse IgG(Amersham biosciences),항-rabbit IgG(Bio-rad Laboratories, Hercules, CA, USA)을 사용하였고, ECL 플러스 웨스턴 블럿 분석 시스템(Amersham biosciences)을 사용하여 각 세포 및 조직에서의 S100P의 발현정도를 측정하였다. 이때 웨스턴 블럿 밴드들의 강도는 LAS 3000(Fuji Photo Film Co., Tokyo, Japan)을 사용하여 측정하였다. 또한, 상기 실험에서 대조군으로 사용한 THLE-3 세포는 일반적인 헤파토사이트(hepatocyte)를 통해 불활성화된 세포로서 이러한 실험에서 대조군으로 종종 사용되고 있다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 인간 간암(HCC)에서 유래된 대부분의 암 세포주에서는 대조군에 비해 높은 수준으로 S100P 단백질이 발현되는 것으로 나타났으며(도 1a 참조), 특히 간모세포종(hepatoblastoma)에서 유래된 HepG2 세포의 경우 매우 많은 양의 S100P 단백질이 발현되는 것으로 나타났다.

또한, 간암조직 및 정상조직을 대상으로 각 조직에서의 S100P 단백질 발현 양상을 측정한 결과, 간암조직의 경우 정상조직에 비해 S100P 단백질이 과다발현되고 있는 것으로 나타났다(도 1b 참조).

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 S100P 단백질이 정상세포 및 정상조직에 비해 간암세포 또는 간암조직에서 특이적으로 과다 발현되고 있는 현상을 확인함으로써 이러한 S100P을 간암 진단을 위한 마커로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

< 실시예 2>

면역조직화학염색법을 이용한 간암조직에서 S100P 의 발현정도 측정

상기 실시예 1를 통해 S100P 단백질이 정상세포에 비해 간암세포 또는 조직에서 과발현되고 있다는 사실을 확인하였는데, 이러한 결과를 보다 확실히 확인하기 위해 면역조직화학염색법을 수행하였다. 이를 위해 본 발명자들은 인간 간암(HCC)에 대한 조직 마이크로어레이(Tissue Micro Array; TMA) 슬라이드를 사용하였다. 즉, 상기 기술된 방법으로 준비된 간암 조직 및 정상조직을 이용하여 당업계에 공지된 방법으로 조직 마이크로어레이 슬라이드를 제작한 다음, S100P 단백질에 대한 일차 항체가(primary antibody) 1:25의 비율로 희석된 용액을 상기 슬라이드에 처리하였으며, 이때 디아미노벤즈아이다인(Diaminobenzidine(DAB); DAKO, Copenhagen, Denmark)을 색소원(chromogen)으로 사용하였고, 상기 슬라이드들에는 대조 염색을 위해 메이어의 해마톡실린(Mayer's hematoxylin)을 사용하였다. 염색처리한 조직들은 각각 현미경을 사용하여 관찰하였으며, 상기 조직 마이크로 어레이에 대한 기록은 2명의 병리학자가 각각 독립적으로 행하였다. 만일 서로 의견이 다른 경우에는 멀티 해드 마이크로스코프를 사용하여 함께 상기 조직 마이크로 어레이에 대한 평가를 행하여 합의점을 찾았다. 평가는 염색 정도에 따라 음성(negative), 약 양성(weak positive), 1+ (양호; moderate), 2+ 및 3+(강함; strong)으로 행하였다. 만일 염색이 10% 미만인 경우에는 음성으로 평가하였고, 그 결과를 하기 표 1 및 도 2에 나타내었다.

면역조직화학염색 결과

	정상조직 (n=25)	간암조직 (n=25)
p value		p = 0.0209*
S100P, n(%)
S100P Negative	14(56)	6(24)
S100P Positive	11(44)	19(76)

* 카이 스퀘어 검정(Chi-square test)

그 결과, 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 25개의 간암(HCC) 조직들 중에서 19개의 경우, 즉 76%가 S100P 양성 결과를 나타낸 반면 약 24%가 음성 결과를 보였고, 정상조직의 경우에는 음성이 56%로 양성에 비해 우월한 비율을 보였다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 정상조직에 비해 간암조직의 경우, S100P이 염색 정도가 더 강한 것으로 나타났다.

따라서 본 발명자들은 이와 같은 결과를 통해 간암 세포 또는 조직의 경우 S100P 단백질이 비정상적으로 조절되어 정상에 비해 과다 발현되고 있음을 알 수 있었으며, 나아가 S100P 단백질은 간암의 발병이나 암세포 증식에 연관이 있을 수도 있음을 예상할 수 있었다.

< 실시예 3>

siRNA S100P 처리시 간암 세포의 세포성장 억제 활성 분석

본 발명에 따른 S100P 단백질이 정상세포에 비해 간암세포에서 과다 발현되고 있다는 사실을 통해 본 발명자들은 S100P이 간암세포의 세포증식에 어떠한 영향을 주고 있는지를 확인하기 위하여 siRNA S100P을 간암세포에 처리한 다음, 암 세포의 증식 정도를 측정하였다. 즉, Opti-MEM(Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)에서 배양한 Hep3B 세포에 대해 S100P 유전자에 대한 특이적인 siRNA(S100P-specific siRNA)를 각각 도입시켰으며, siRNA는 Silencer(Ambion, Austin, TX, USA)로부터 구매하여 사용하였고, 상기 이식은 제조자의 사용 설명서에 따라 올리고펙타민 시약(oligofectamine reagent; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 수행하였으며, 사용한 S100P siRNA의 서열 및 대조군으로 사용한 스크램블(scr) siRNA의 서열은 하기 표 2에 기재한 바와 같다. 또한, 본 발명에서 사용한 상기 S100P siRNA의 정확성을 확인하기 위해 S100P siRNA 및 대조군 siRNA을 처리한 각각의 세포주들에 대해 상기 <실시예 1>의 방법과 같이 웨스턴 블럿 및 PCR을 수행하여 S100P 유전자의 발현이 차단되었는지를 확인하였다. siRNA를 세포내로 도입한 이후, 세포 증식의 측정은 Cell Titer 96 Aqueous One Solution cell proliferation assay(MTS; Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 측정하였는데, 즉, siRNA가 도입된 B형 간염 바이러스 유전체를 포함하는 간암 세포주인 Hep3B 세포들을 웰당 2x10⁴의 세포수로 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 분주한 다음, 5%의 CO² 및 37℃에서 한 시간 동안 MTS로 배양한 다음, VICTOR3TM Multilable Plate Reader(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 통하여 흡광도를 측정함으로써 세포의 성장률을 관찰하였다, 이때 모든 실험은 3번씩 수행하였으며, 각각 3차례씩 반복하였다.

siRNA의 서열

	siRNA 염기서열	서열번호
S100P siRNA 센스	5‘-GCCGUGGAUAAAUUGCUA dTdT-3’	2
S100P siRNA 안티센스	5‘-UGAGCAAUUUAUCCACGGC dAdT-3'	3
스크램블 siRNA 센스	5‘-GAUAUAGGAAGUCCAUACU dTdT-3’	4
스크램블 siRNA 안티센스	5‘-AGUAUGGACUUCCUAUAUC dTdT-3’	5

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 사용한 S100P siRNA의 경우 간암 세포내에서 S100P의 발현을 거의 완벽하게 차단하고 있음을 알 수 있었으며(도 3a 참조), 흡광도 측정을 통한 세포 성장률 관찰 결과, 대조군에 비해 S100P siRNA을 처리한 간암 세포의 경우 세포의 성장률은 감소하는 것으로 나타났으며, 세포 성장 감소율은 S100P siRNA의 처리 농도에 비례하는 것으로 나타났다(도 3b 참조).

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 S100P 유전자의 발현을 억제할 경우 간암 세포 또는 조직의 성장을 억제할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

siRNA S100P 처리시 간암 세포의 세포사멸 촉진 효과 분석

상기 실시예 3의 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 S100P의 발현을 억제할 경우, 암세포의 성장을 억제할 수 있음을 확인함에 따라 이러한 항암 효과가 세포주기의 조절 또는 세포사멸에 의한 것인지를 조사하기 위해 유세포 분석기를 통한 세포 사멸 정도를 분석하였다. 즉, 간암 세포주인 Hep3B 세포에 S100P siRNA을 처리한 다음, 48시간이 경과 후, 트립신 처리를 통해 Hep3B 세포를 수확하고, 1x PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척한 다음, -20℃에서 하루 동안 70% 알코올로 고정시켰다. 고정된 세포들은 차가운 1x PBS로 두번 세척하고 나서, RNaseA (10mg/ml)를 포함한 PBS에서 37℃로 30분간 배양시켰다. RNaseA로 처리한 다음, 유세포 분석기(flow cytometer analysis; BD Biosciences)를 이용하여 세포사멸을 측정하였고, 측정 전에 5mg/ml의 요오드화 프로피디움(Propidium iodide; PI)으로 핵을 염색하였다. 또한, 아넥신 V-FITC Apoptosis Detection Kit I(BD Biosciences)를 사용하여 세포 사멸의 양적 수준을 측정하였는데 트립신 처리한 세포들을 차가운 PBS로 2번 세척하고 나서 1x10⁶cells/ml 농도의 1x 바인딩 버퍼로 재서스팬드 시킨 다음, 100ul 수용액(1x10⁵ cells)을 5ml 배지 튜브로 옮긴 후, 5ul의 아넥신 V-FITC 용액을 첨가하였다. 이후 각각의 튜브에 10ul의 PI를 첨가한 다음 유세포 분석법(flow cytometry analysis)을 통해 분석하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, S100P siRNA를 처리한 간암 세포의 경우, 처리하지 않은 대조군 또는 스크랩블 siRNA를 처리한 군에 비해 세포사멸이 현저히 증가한 것으로 나타났으며, 세포사멸의 정도는 처리한 S100P siRNA의 농도에 비례하여 증가하는 것으로 나타났다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명의 S100P siRNA를 간암 세포에 처리하면 암 세포의 세포사멸을 촉진함을 통해 항암활성을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

G1 /S 세포주기 과정에서 S100P 단백질의 조절 메커니즘 분석

나아가 본 발명자들은 상기 실시예를 통해 S100P 단백질의 발현을 억제하면 간암세포인 Hep3B 세포의 성장이 억제된다는 사실로부터 S100P가 세포주기 과정에도 관여하고 있음을 예상할 수 있었으며, 특히 S100P 단백질의 발현 억제 효과가 세포 주기에서 G1/S 단계의 조절 인자에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, S100P siRNA를 간암 세포에 도입시킨 후, G1/S 단계의 조절 인자들인 p21, p16, p15, 사이클린 D1, D3 및 CDK2의 발현양상을 이들의 항체를 이용하여 웨스턴 블럿을 통해 각각 확인하였다. 이때 웨스턴 블럿은 상기 실시예 1에서 항체로서 항-S100P(BD Biosciences, San Jose, CA, USA), 항-p15/16/21, 사이클린D1/D3(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), 항-α-튜블린(Sigma), 항-CDK2(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)을 사용한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, S100P siRNA을 간암 세포주에 도입시켜 S100P 단백질의 발현을 억제시켰을 경우, 세포주기 조절 인자들 중에서 p21, p16, p15, 사이클린 D3의 발현에는 거의 아무런 영향을 미치지 않는 것으로 나타난 반면, 사이클린 D1 및 CDK2의 발현은 억제되는 것으로 나타났다.

따라서 본 발명자들은 상기 결과를 통해 S100P 단백질이 CDK2 및 사이클린 D1을 동시에 조절함을 통해 암의 진행과정에서 세포 성장의 조절에 이상을 초래하여 암의 성장을 촉진한다는 사실을 알 수 있었다.

이상 상기와 같은 실시예들을 통해 본 발명자들은 S100P 단백질이 정상군에 비해 간암세포 또는 조직의 경우 그 발현양이 현저하게 증가되어 있다는 사실을 확인하고 간암 세포에서 S100P의 발현을 억제하였을 경우, 암 세포의 성장이 억제됨과 동시에 세포사멸이 촉진된다는 사실을 통해 본 발명의 S100P을 간암 진단을 위한 새로운 마커로 사용할 수 있으며, 나아가 S100P의 발현 억제를 통해 간암을 예방 또는 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> Use of S100P as a hepatocellular carcinomar diagnostic marker <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 510 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S100P gene sequence <400> 1 tgaggctgcc ttataaagca ccaagaggct gccagtggga cattttctcg gccctgccag 60 cccccaggag gaaggtgggt ctgaatctag caccatgacg gaactagaga cagccatggg 120 catgatcata gacgtctttt cccgatattc gggcagcgag ggcagcacgc agaccctgac 180 caagggggag ctcaaggtgc tgatggagaa ggagctacca ggcttcctgc agagtggaaa 240 agacaaggat gccgtggata aattgctcaa ggacctggac gccaatggag atgcccaggt 300 ggacttcagt gagttcatcg tgttcgtggc tgcaatcacg tctgcctgtc acaagtactt 360 tgagaaggca ggactcaaat gatgccctgg agatgtcaca gattcctggc agagccatgg 420 tcccaggctt cccaaaagtg tttgttggca attattcccc taggctgagc ctgctcatgt 480 acctctgatt aataaatgct tatgaaatga 510 <210> 2 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S100P siRNA sense <400> 2 gccguggaua aauugcua 18 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S100P siRNA antisense <400> 3 ugagcaauuu auccacggc 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scr siRNA sense <400> 4 gauauaggaa guccauacu 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scr siRNA antisense <400> 5 aguauggacu uccuauauc 19 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S100P Forward primer <400> 6 agctcaaggt gctgatggag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S100P reverse primer <400> 7 acttgtgaca ggcagacgtg 20

Claims (10)

1. S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자 또는 상기 유전자로부터 코딩되는 S100P 단백질로 이루어진 간암 진단용 마커.
2. 제1항에 있어서,
   상기 S100P 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 간암 진단용 마커.
3. S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자의 수준 또는 S100P 단백질의 수준을 측정하는 물질을 포함하는 간암 진단용 조성물.
4. 제3항에 있어서,
   상기 S100P 유전자의 수준을 측정하는 물질은 S100P 유전자를 증폭할 수 있는 프라이머 또는 프로브인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
5. 제3항에 있어서,
   상기 S100P 단백질의 수준을 측정하는 물질은 S100P 단백질을 특이적으로 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 간암 진단용 조성물.
6. (a) 생물학적 시료에 존재하는 S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자의 발현양 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및
   (b) 상기 (a) 단계의 측정결과를 정상대조군 시료의 S100P 유전자의 발현양 또는 단백질의 양과 비교하는 단계를 포함하는 간암을 예측 및 진단하는 방법.
7. 제6항에 있어서,
   상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암을 예측 및 진단하는 방법.
8. 제6항에 있어서,
   상기 측정은 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcriptase-polymerase chain reaction), 실시간 중합효소 연쇄반응(real time-polymerase chain reaction), 웨스턴 블럿, 노던 블럿, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion) 및 면역침전분석법(immunoprecipitation assay)으로 이루어진 군중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 간암을 예측 및 진단하는 방법.
9. S100P(S100 calcium binding protein P) 유전자의 염기서열에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 또는 siRNA(small interference RNA) 올리고뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 siRNA 올리고뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 3의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 간암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.

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