CN113549697A

CN113549697A - 一种胃癌热化疗敏感标志物及其应用

Info

Publication number: CN113549697A
Application number: CN202111115077.XA
Authority: CN
Inventors: 崔书中; 曾丽斯; 方淑娴; 何庆军; 唐鸿生; 阮强; 刘高杰; 田云; 杨贤子; 雷子颖; 廖权星
Original assignee: Cancer Center of Guangzhou Medical University
Current assignee: Cancer Center of Guangzhou Medical University
Priority date: 2021-09-23
Filing date: 2021-09-23
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2041-09-23
Also published as: CN113549697B

Abstract

本发明提供检测转录因子ZNF429表达量的试剂在制备用于检测或评估胃癌的试剂或试剂盒中的应用。本发明证实了ZNF429不仅在胃癌组织中明显高表达，且与胃癌患者高级别病理分期（Ⅲ期）、肿瘤最大直径（≥6）、淋巴结分级（N3）和TNM分Ⅲ‑Ⅳ期密切相关，暗示ZNF429有可能是胃癌发生发展中的重要调控因子。

Description

一种胃癌热化疗敏感标志物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种胃癌热化疗敏感标志物及其应用。

背景技术

胃癌（Gastric Cancer，GC）是全球第五大常见的癌症，胃癌的早期诊断率很低，大部分胃癌患者确诊已经为中、晚期。晚期胃癌的主要治疗手段以D2根治术为主，患者术后腹膜转移和复发率仍较高，严重影响了胃癌患者的预后。

腹腔热灌注化疗（Hyperthermic introperitoneal Chemotherapy，HIPEC）是一种预防和治疗腹膜癌的辅助治疗方法，不但能通过提高局部化疗药物浓度，促进化疗疗效，并且43℃的热疗对肿瘤有协同杀伤作用。HIPEC治疗方法，化疗药物用量与NCCN（NationalComprehensive Cancer Network）指南化疗药物用量相仿，通过将化疗药物加入腹腔灌注液中治疗，相比较全身化疗而言，能极大提高腹腔化疗药物浓度。而腹腔灌注液的存在，充分充盈腹腔，能使腹膜紧密贴合处的潜在腔隙打开，方便化疗药物与腹膜转移病灶进行直接接触，从而直接杀伤肿瘤细胞。腹腔灌注液在体外灌注治疗仪和患者腹腔内不断进行循环灌注，灌注液可以对腹腔内游离癌细胞和微小的腹膜肿瘤转移病灶进行液体冲刷，快速的液体冲刷产生的剪切力可以机械杀伤肿瘤细胞，而冲刷游离的肿瘤细胞，由于肿瘤细胞失巢凋亡现象的发生，进一步加深肿瘤细胞的死亡。同时，经腹腔器官表层腹膜吸收的化疗药物，经门静脉进入肝脏，可以预防肝脏微小转移灶的发生，对已经发生肝微小转移的患者，还可以达到一定的治疗效果。

故胃癌热敏基因对于胃癌患者，特别是胃癌发生腹膜转移的患者有重要的临床意义。

转录因子(Transcription Factors， TFs)是指能够以序列特异性方式结合DNA并且调节转录的蛋白质。转录因子通过识别特定的DNA序列来控制染色质和转录，以形成指导基因组表达的复杂系统。人类基因组中35,000多个基因在不同的组织、不同的时间具有表达差异性，转录因子的调控起到重要的作用。转录因子的调控导致基因表达的差异。与此同时，通常它们也是信号转导通路的靶标，也是被调控的对象。

中国专利CN200780023090.4中公开了安全性优异、对核转录因子AP-1表达的抑制活性优异的核转录因子AP-1的表达抑制剂。该发明的罗马春黄菊或德国春黄菊的提取物和春黄菊苷由于在基因水平上抑制上述AP-1的表达，与现有的、阻碍上述AP-1与DNA结合的抑制剂相比，抑制效果更为优异。

中国专利CN200780051417.9中公开了用于检测雄性受试者中的癌症(特别是前列腺癌)的生物标志物，该生物标志物包含至少一种含有转录因子的同源异型域(诸如HOX肽)或其片段。提供了所述生物标志物在检测和/或治疗前列腺癌中的用途，及其方法和试剂盒。

目前针对胃癌和胃癌热化疗敏感相关的转录因子的研究有限，有待进一步开发。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了转录因子ZNF429在检测胃癌热化疗敏感中的应用。本发明证实了ZNF429不仅在胃癌组织中明显高表达，且与胃癌患者高级别病理分期（Ⅲ期）、肿瘤最大直径（≥6）、淋巴结分级（N3）和TNM分Ⅲ-Ⅳ期密切相关，暗示ZNF429有可能是胃癌发生发展中的重要调控因子。

一方面，本发明提供了检测转录因子ZNF429表达量的试剂在制备用于检测或评估胃癌的试剂或试剂盒中的应用。

所述的转录因子ZNF429的序列为SEQ ID NO.1。

所述的试剂盒中包括用于检测ZNF429表达量的试剂。

所述的试剂盒中包括用于检测ZNF429表达量的引物。

另一方面，本发明提供了一组用于胃癌检测或预后评估的引物组。

所述的引物组用于检测转录因子ZNF429的表达量。

所述的引物组中选自以下引物：

正向引物	反向引物
		SEQ ID NO.2	SEQ ID NO.4
SEQ ID NO.3	SEQ ID NO.5

优选地，所述的引物组中包括：

正向引物	反向引物
		SEQ ID NO.2	SEQ ID NO.4
SEQ ID NO.3	SEQ ID NO.5

其中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4为一对正反向引物；SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.5为一对正反向引物。

本发明同时提供了前述引物组在制备用于检测或评估胃癌的试剂或试剂盒中的应用。

本发明同时提供了前述引物组在制备用于胃癌治疗或预防或预后恢复的药物中的应用。

本发明同时提供了前述引物组在制备胃癌热疗敏感患者治疗药物或筛选热灌注治疗敏感患者试剂中的应用。

再一方面，本发明提供了一种用于检测或评估胃癌的试剂或试剂盒。

所述的试剂用于检测转录因子ZNF429的表达量；所述的试剂盒中包括用于检测转录因子ZNF429的表达量的试剂。

所述的试剂盒中包括前述的引物组。

又一方面，本发明提供了抑制转录因子ZNF429表达的siRNA在制备用于胃癌治疗或预防或预后恢复的药物中的应用。

又一方面，本发明提供了抑制转录因子ZNF429表达的siRNA在制备胃癌热疗敏感患者治疗药物或筛选热灌注治疗敏感患者试剂中的应用。

又一方面，本发明提供了一种用于胃癌治疗或预防或预后恢复的药物。

所述的药物为转录因子ZNF429的抑制剂。

本发明的有益效果：

ZNF429在胃癌细胞和胃癌组织中高表达，可以作为判断胃癌患者预后的分子标记物；可以联合TNM分期，能更为准确预测患者预后，有望成为胃癌诊断和治疗的潜在靶点。ZNF429低表达，可以促进胃癌细胞对43℃高温的敏感性，抑制胃癌细胞增殖，促进凋亡。通过检测ZNF429的表达量，可以很好地对胃癌患者选择有效的综合治疗和预后判断。

本发明提供的试剂盒检测限低，准确率高。

附图说明

图1为ZNF429在胃癌组织中的表达。

图2为ZNF429在胃癌组织和胃正常组织免疫组化评分。

图3为ZNF429对MKN28细胞活力的影响。

图4为MKN28细胞中ZNF429转染效率。

图5为ZNF429对MKN45细胞活力的影响。

图6为MKN45细胞中ZNF429转染效率。

图7为MKN28细胞中TUNEL荧光染色图。

图8为TUNEL阳性MKN28细胞占比。

图9为MKN45细胞中TUNEL荧光染色图。

图10为TUNEL阳性MKN45细胞占比。

图11为MKN28细胞和MKN45细胞敲降ZNF429的Trans-well图。

图12为MKN28细胞敲降ZNF429的Trans-well图计数。

图13为MKN28转染ZNF429-siRNA，热疗24h后，细胞LT50的改变。

图14为MKN28转染ZNF429-siRNA，热疗48h后，细胞LT50的改变。

图15为MKN28转染ZNF429-siRNA，热疗72h后，细胞LT50的改变。

图16为MKN28转染ZNF429-siRNA，热疗96h后，细胞LT50的改变。

图17为MKN45转染ZNF429-siRNA，热疗24h后，细胞LT50的改变。

图18为MKN45转染ZNF429-siRNA，热疗48h后，细胞LT50的改变。

图19为MKN45转染ZNF429-siRNA，热疗72h后，细胞LT50的改变。

图20为MKN45转染ZNF429-siRNA，热疗96h后，细胞LT50的改变。

图21为MKN28敲低ZNF429，联合43℃热处理后MKN28细胞TUNEL荧光检测图片。

图22为MKN28敲低ZNF429后MKN28细胞TUNEL荧光计数。

图23为MKN28敲低ZNF429，联合43℃热处理后MKN28细胞TUNEL荧光计数。

图24为MKN45敲低ZNF429，联合43℃热处理后MKN28细胞TUNEL荧光检测图片。

图25为MKN45敲低ZNF429后MKN28细胞TUNEL荧光计数。

图26为MKN45敲低ZNF429，联合43℃热处理后MKN28细胞TUNEL荧光计数。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 ZNF429基因错义突变的筛选

收集18例胃癌伴腹膜转移患者的肿瘤组织样本，参考国内外的HIPEC临床研究数据，以胃癌患者HIPEC治疗后生存时间大于等于11个月为HIPEC疗效好，生存时间小于11个月为HIPEC疗效差，即将18例胃癌患者分为了疗效好与疗效差两组，进行了两组患者基线比较。

经统计学分析，结果显示两组患者在性别（P=0.999）、ECOG评分（P=0.999）、病理分化程度（P=0.999）、腹膜转移P分度（P=0.999）、腹水量（P=0.552）和半年内化疗次数（P=0.751），均无统计学差异（表1）；接着，对两组患者的肿瘤组织进行了全外显子组测序，发现ZNF429基因在疗效好组中发生错义突变，具体见表2。

表1 HIPEC疗效好与疗效差两组患者基线比较

备注：a：t值；

表2

Hugo_Symbol

NCBI_Build

Chromosome

Start_Position

End_Position

Variant_Classification

Variant_Type

Reference_Allele

Tumor_Seq_Allele1

Tumor_Seq_Allele2

dbSNP_RS

Tumor_Sample_Barcode

Matched_Norm_Sample_Barcode

Match_Norm_Seq_Allele1

Match_Norm_Seq_Allele2

ZNF429

GRCh37

19

21720870

Missense

SNP

G

A

rs201032310

FB196R0432-A3A6F18XKF1-H001K832

FC196R0433-A3A6F18XKF1-H001K832

G

ZNF429

GRCh37

19

21719633

Missense

SNP

A

G

FB196R0432-A3A6F18XKF1-H001K832

FC196R0433-A3A6F18XKF1-H001K832

A

ZNF429

GRCh37

19

21720870

Missense

SNP

G

A

rs201032310

FB196R0458-A3A6F17XKF1-H001K832

FC196R0459-A3A6F18XKF1-H001K832

G

A

SLC23A2

GRCh37

20

4850569

Frameshift

DEL

G

-

rs751050083

FB196R0428-A3A6F16XKF1-H001K832

FC196R0429-A3A6F13XKF1-H001K832

G

ZC3H18

GRCh37

16

88691141

Frameshift

DEL

C

-

rs759067171

FB196R0428-A3A6F16XKF1-H001K832

FC196R0429-A3A6F13XKF1-H001K832

C

ZNF429

GRCh37

19

21720870

Missense

SNP

G

A

rs201032310

FB196R0428-A3A6F16XKF1-H001K832

FC196R0429-A3A6F13XKF1-H001K832

G

PTH2

GRCh37

19

49926533

Missense

SNP

G

C

rs200733272

FB196R0428-A3A6F16XKF1-H001K832

FC196R0429-A3A6F13XKF1-H001K832

G

ZNF429

GRCh37

19

21720870

Missense

SNP

G

A

rs201032310

FB196R0474-A3A6F18XKF1-H001K832

FC196R0475-A3A6F18XKF1-H001K832

G

ZC3H18

GRCh37

16

88691141

Frameshift

DEL

C

-

rs759067171

FB196R0464-A3A6F18XKF1-H001K832

FC196R0465-A3A6F18XKF1-H001K832

C

PTH2

GRCh37

19

49926533

Missense

SNP

G

C

rs200733272

FB196R0436-A3A6F16XKF1-H001K832

FC196R0437-A3A6F19XKF1-H001K832

G

实施例2 ZNF429验证

本实施例表明ZNF429在胃癌组织中表达上调，并与胃癌患者临床病理因素相关。

1、采用免疫组化方法，检测90例胃癌患者癌组织和癌旁组织样本中ZNF429的表达情况，进一步对90例胃癌患者临床病理参数与ZNF429的表达进行相关性分析，具体操作如下：

将组织芯片在60摄氏度恒温箱中烘烤3h，（看蜡片有没有溶解掉），紧接脱蜡吸附：环保透明剂1中10min，环保透明剂2中10min，水化：无水乙醇5min，95%乙醇5min，70%乙醇5min，PBS洗3次，每次5min，抗原修复：配制0.01M枸橼酸钠缓冲溶液，定容至2L，放于微波炉中加热沸腾，放组织玻片于其中，10min，一起在放入微波炉中加热沸腾，再调中K,10min（不能干片），取出冷却至室温。PBS洗3次，每次5min，用组化笔圈出组织。滴加A液，10min，PBS洗3遍，每次5min；滴加B液，10min， PBS洗2至3遍，每次5min；一抗4度过夜，次日复温半小时。PBS洗3遍，每次5min，滴C液，10min，PBS洗3次，每次5min；滴D液，10min，（避光，对光敏感），PBS洗3次，每次5min。配新鲜底物液：迈新试剂盒DAB显色液配置1000μL=850μL 蒸馏水+50μL A液+50μL B液+50μL C液。滴加底物液（按配对滴加），显色后放于水中，流水过洗10min。苏木素染色9s左右，流水洗去（若苏木素染色过深，可加1%盐酸酒精水化，注意加后1s立即流水洗去）.脱水：75%酒精-85%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精（时间3至5min）。透明：环保透明剂1中3min，环保透明剂2中3min，中性树脂封片。

结果显示ZNF429在胃癌组织中较癌旁组织显著高表达，且与胃癌患者高级别病理分期（Ⅲ期）、肿瘤最大直径（≥6）、淋巴结分级（N3）和TNM分Ⅲ-Ⅳ期密切相关。

图1-2为ZNF429在胃癌组织中的表达情况。其中图1为肿瘤组织（左）和正常组织（右）中ZNF429的相对表达量，下方为放大200×后的图像；图2为肿瘤组织（T）和正常组织（N）免疫组化评分。表3为ZNF429在胃癌组织和配对癌旁组织的表达情况。

表3

2、为研究胃癌患者临床病理各项参数与患者总生存时间的相关性，采用Cox回归统计方法，分别对患者各项临床病理参数进行单因素分析和多因素分析。分析结果发现肿瘤最大径长度（Hazard Ratio[HR]=2.531，95% confidence interval[CI]=1.348-4.755，P=0.004），TNM分期（Hazard Ratio[HR]=2.2，95% confidence interval[CI]=1.341-3.608，P=0.002）和ZNF429表达量（Hazard Ratio[HR]=0.36，95% confidence interval[CI]=0.17-0.761，P=0.008）与患者总生存时间密切相关。

表4为单因素和多因素Cox回归分析与胃癌患者OS相关的临床病理参数，其中TNM为TNM分期；HR为风险比；95%CI为95%置信区间。

表4

实施例3 ZNF429敲低验证

1、敲降ZNF429，能抑制胃癌细胞活力

通过沉默内源性ZNF429，qPCR检测发现ZNF429的siRNA能够明显降低胃癌细胞株MKN28、MKN45、SNU1（细胞均购买于武汉普诺赛生命科技有限公司）中ZNF429的表达水平。

沉默内源性ZNF429具体操作如下：

转染前一天，用不含抗生素的完全培养基，将胃癌细胞接种至6孔板中，接种密度以保证在转染时细胞密度达到50-80%即可；转染时，先吸弃旧培养基，PBS或生理盐水洗2遍，再每孔加入1.7mL无血清Opti-MEM培养基；在150μL无血清Opti-MEM培养基中加入转染物（siRNA2.5μg），并轻轻混匀，室温静置5min；使用前轻轻混匀Lipofectamine3000，在150μL无血清Opti-MEM培养基中加入5μL Lipofectamine3000（终浓度100nm）,轻轻混匀，室温静置5min；注意：要在30min内混合Lipofectamine3000和siRNA的稀释液；室温静置20min；（溶液混合后可能会看上去浑浊）；注意：混合物在室温下的6h内不会失效；每孔细胞滴加300μL上述混合液，并前后轻柔快速的前后/左右轻微晃动细胞培养板使混合液与孔板中的培养液混匀；将细胞于37℃二氧化碳细胞培养箱中培养，6h后细胞换完全培养基；18-48h后可检测目的基因的表达情况或进行下游实验；48h时可将6孔板中的细胞分一部分提取RNA和蛋白。

siRNA购自吉玛基因。分别在siRNA转染12h、24h、48h、72h和96h后，用CCK-8试剂检测ZNF429的表达降低对胃癌细胞增殖的影响，MKN28和MKN45细胞中，降低ZNF429表达能显著抑制胃癌细胞的生长速度。见图3-6。其中：ZNF429-S1表示ZNF429敲降片段S1，ZNF429-S2表示ZNF429敲降片段S2，ZNF429-S3表示ZNF429敲降片段S3，ZNF429-S4表示ZNF429敲降片段S4，ZNF429-NC表示ZNF429结合无序片段，siRNA-1表示敲降片段结合位点648（SEQ IDNO.6-7），siRNA-2表示敲降片段结合位点874（SEQ ID NO.8），siRNA-3表示敲降片段结合位点963（SEQ ID NO.9-10），siRNA-4表示敲降片段结合位点1389（SEQ ID NO.11-12），NC表示Negative control: （SEQ ID NO.13-14）。

2、敲低ZNF429能促进胃癌细胞凋亡

为验证ZNF429对胃癌细胞凋亡的影响，使用ZNF429的siRNA对ZNF429的表达进行敲低，具体操作如下：

选择生长密度60-70%的胃癌细胞，并于试验前24h进行完全培养基更换，确保细胞状态良好；用胰酶消化贴壁细胞，并及时用完全培养基终止消化，采用细胞计数板对细胞进行计数，按照96孔板每孔1万细胞，进行细胞悬液的配置，并种于96孔板中；细胞计数后，反复吹匀，然后及时吸取细胞进行种板；枪尖伸入悬液即可，避免取样误差，影响实验结果；种板后轻微摇匀，并及时放入细胞培养箱中进行培养；进行siRNA转染，8h后细胞换液，继续培养48h；培养时间结束后，弃掉培养基，并用PBS洗涤一次；如果细胞贴壁不很牢靠，可以在PBS洗涤后，置于室温干燥样品使细胞紧贴培养板；按照每孔100μL的量，吸取加入4%多聚甲醛，固定细胞持续30min；固定时间结束后，弃置固定液，并用PBS洗涤一次；按照每孔100μL的体积，加入含0.3% Triton X-100的PBS，室温孵育5min；细胞通透后，用PBS或HBSS洗涤2次；参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀：

	1个样品	5个样品	10个样品
				TdT酶	5μL	25μL	50μL
荧光标记液	45μL	225μL	450μL
				TUNEL检测液	50μL	250μL	500μL

在样品上加50μL TUNEL检测液，37ºC避光孵育60min。细胞孵育时间结束后，用PBS洗涤孔板3次；用含DAPI染料的抗荧光淬灭剂封片后，于荧光显微镜下观察(绿色荧光)，并进行拍照记录；使用ImageJ进行蓝绿荧光结果整合，观察实验结果。

对胃癌细胞进行TUNEL检测。TUNEL实验结果表明，ZNF429可以影响胃癌MKN28和MKN45细胞凋亡，下调ZNF429后，可促进胃癌细胞凋亡。MKN45和MKN28细胞接受ZNF429的siRNAs敲除后，细胞增殖率明显受到抑制；发挥作用的ZNF429的siRNA片段与CCK-8细胞增殖活力检测结果相一致。见图7-10。其中，siRNA-1表示敲降片段结合位点648，siRNA-2表示敲降片段结合位点874，siRNA-3表示敲降片段结合位点963，siRNA-4表示敲降片段结合位点1389，NC表示Negative control。

3、敲低ZNF429能抑制胃癌细胞迁移能力

胃癌易发生腹膜转移，其本质是胃癌的转移能力得到明显增强，而腹腔热灌注化疗治疗胃癌腹膜转移的疗效显著，探究ZNF429是否影响胃癌细胞的迁移能力具体操作如下：

选择生长密度60-70%的胃癌细胞，并于试验前24h进行完全培养基更换，确保细胞状态良好；用胰酶消化贴壁细胞，并及时用完全培养基终止消化，采用细胞计数板对细胞进行计数，铺6孔板，5-10×10⁵cells/well；细胞过夜贴壁之后，进行siRNA转染，6h后细胞换液，继续培养24h；用含0.25%EDTA的胰酶消化处理细胞，用完全培养基终止消化，细胞离心800rpm，离心5min，小心倾倒离心管中液体，之后将管子放置于15mL管架上一小会，让剩下的液体流到管底，然后用200μL枪头套10μL小枪头将剩下的液体轻轻吸出；用无血清培养基洗涤细胞，并再次离心，如此循环4次，最大限度去除培养基中的血清成份，防止血清影响实验结果；用无血清基础培养基轻柔重悬细胞，根据细胞量加入重悬液；重悬细胞后进行计数，调整细胞至实验浓度：上室加入200μL时有30万细胞，或根据需要取出所需数量的细胞，一般多取出2个孔的细胞数；一般加入Transwell的步骤（下室为10%完全培养基，上室为无血清基础培养基）：在下室加入含10%胎牛血清的完全培养基800μL；把Transwell小室小心放入完全培养基中，把所需小室都放好，确保底部无气泡；混匀实验细胞，用200μL的枪小心吸取细胞，垂直轻柔加入上室中；将Transwell小室细胞，放入培养箱培养24h；时间到后，取样本，用1×PBS洗去培养基，甩掉剩下的液体，放置于预先加了800μL/孔甲醇的24孔板中，固定5min；用1×PBS淋洗一遍，甩掉液体，然后置于预先加了800μL/孔，0.1%的结晶紫的24孔板中，染色15min；在流水中轻轻洗掉多余液体，用棉签轻柔擦掉上室内壁细胞，风干，显微镜下拍照（20×）。

实验结果表明，ZNF429低表达可以明显降低MKN28细胞的迁移能力，MKN45由于本身不具备明显迁移能力，未能有细胞穿透小室。见图11-12，其中：siRNA-1表示敲降片段结合位点648，siRNA-2表示敲降片段结合位点874，siRNA-3表示敲降片段结合位点963，siRNA-4表示敲降片段结合位点1389，NC表示Negative control。

4、敲低ZNF429的表达，能够显著增强胃癌细胞对热的敏感性，加强热杀伤效果

在胃癌MKN28和MKN45细胞中，敲低ZNF429能够显著增强胃癌细胞凋亡，对是否也能够促进癌细胞对热的敏感性进行进一步研究：采用半数致死温度（the median lethaltemperature，LT50）检测胃癌细胞对热的敏感性。对胃癌细胞进行37℃、41℃、43℃、45℃和49℃梯度热疗，并分别在热疗后24h、48h、72h和96h使用CCK8试剂进行检测高温热处理对胃癌细胞生长的影响。热疗后48h和72h，在MKN28细胞中，ZNF429的siRNA-2和siRNA-3片段对LT50改变最为明显；ZNF429的siRNA-1和siRNA-2片段，对MKN45细胞LT50改变最为明显；热疗后96h，LT50改变程度逐渐减小，siRNA敲除ZNF429的效果持续时间基本结束，胃癌细胞ZNF429慢慢回复原始表达水平。见图13-20。

5、敲低ZNF429，联合43℃热处理，进一步促进胃癌细胞凋亡

43℃高温处理，可以显著促进胃癌细胞MKN28和MKN45的凋亡；在热处理的基础上，敲低ZNF429的表达，可以增强43℃高温对胃癌细胞MKN28和MKN45的杀伤作用；43℃高温热处理联合敲低ZNF429基因表达，二者共同促进胃癌MKN28和MKN45细胞凋亡。见图21-26。

根据以上实验结果可知：ZNF429在胃癌细胞和胃癌组织中高表达，可以作为判断胃癌患者预后的分子标记物；可以联合TNM分期，能更为准确预测患者预后，有望成为胃癌诊断和治疗的潜在靶点。ZNF429低表达，可以促进胃癌细胞对43℃高温的敏感性，抑制胃癌细胞增殖，促进凋亡。通过检测ZNF429的表达量，可以很好地对胃癌患者选择有效的综合治疗和预后判断。

序列表

<110> 广州医科大学附属肿瘤医院

<120> 一种胃癌热化疗敏感标志物及其应用

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggaccat tgacatttac agatgtggcc atagaattct ctctggagga gtggcagtgc 60

ctggacacag cacaacagaa cttatataga aatgtgatgt tagagaacta cagaaacttg 120

gtcttcctgg gtattgctgt ttctaagcca gacctaatca cttgtctaga gaaagaaaaa 180

gaaccctgca agatgaagcg acatgaaatg gtggatgaac ccccagttgt gtgttctcat 240

tttgctgaag acttttggcc agagcaagac ataaaagatt ctttccaaaa agtgacactg 300

aggagatatg ataaacgtgg acatgagaac ttacaattaa gaaaaggcta taaaactgta 360

ggtgattgta agctatacaa aggaggttat aatggactta accaatgttt gacacttacc 420

cagagcaaaa tgtatcactg tgatatatat gtaaaagtct tttatgcatt ttcaaatgca 480

gatagataca agacaagaca tactggaaag aaacctttcc agtgtaaaaa atgtggcaaa 540

tcattttgca tgctttcaca actaactcaa cataagaaaa ttcatattag agagaatacc 600

tacagatgta aagaatttgg caatgccttt aatcagtcct cagcccttac taaccataag 660

agaatttatg ttggtgagaa acactacaga tgtgaagaat gtggcaaagc atttaaccac 720

tactcaaccc ttactaacca taagagaatt catactggag agaaacccta caaatgtaaa 780

gaatgtggca aagcctttag caggtactca acccttacta cccataagag aattcattct 840

ggagagaagc cctacaaatg tgatgaatgt ggcaaaacct ttagcatatc ctcaaccttt 900

actaaacata agataattca tactgaagag aaaccctaca aatgtaaaga atgtggcaaa 960

gcctttaacc ggtcctcaac ccttactagc cataagagaa tacatactgg tgagaaaccc 1020

tacaaatgtg aagaatgtgg caaagccttt aactggtctt caactcttac taaacataag 1080

gtaattcata ctggagagaa gccctacaaa tgtgaagaat gtggcaaagc ttttaaccag 1140

tcttcaagac ttactcgaca taaaaaaatt catactggag aggaacccta caaatttgaa 1200

aaatgtggca gagtttttac ctgttcctca acacttactc aagacaagaa aattcatact 1260

ggagagaaac cctacaattg tgaagaatgt ggcaaagttt ttacctattc ctctacactt 1320

actagacata agagaattca tactgaagag aaaccctata aatgtaacga atgtggcaaa 1380

gcttttaacc ggtcctcaca ccttactagc cataggagaa ttcatactgg agagaaaccc 1440

tacaaatgtg aagaatgtgg caaagccttt aagcagtcct caaaccttaa cagtcataaa 1500

aaaattcata gtggagagaa accctacaaa tgtgaagaat gtggcaaagc ttttatcctg 1560

tcctcaagac ttactcaaca taagaaaatt catactggag agaaacctta caaatgtgaa 1620

gaatgtggca aagcttttaa ccggtcctca agacttactc aacataagaa aattcatact 1680

ggagagaaac cctacaaatg taaacaatgt gacaaagctt ttacccactc ctcaaacctt 1740

agtagtcata agaaaattca tagtggagag aaaccctaca aatgtgaaga atgtggcaaa 1800

gcttttaatc ggtcctcaag acttactcaa cataagaaaa ttcatactag agagaaacct 1860

tacaaatgtg aagaatgtgc caaagctttt acccggtctt caagactta 1909

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggacacagca caacagaac 19

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gccaaaagtc ttcagcaaaa tg 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcctcctgt tcgacagtca g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cccaatacga ccaaatccgt t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcagauagau acaagacaat t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

uugucuugua ucuaucugct t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcaaagcauu uaaccacuat t 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gccuuuagca gguacucaat t 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

uugaguaccu gcuaaaggct t 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

accuguuccu caacacuuat t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

uaaguguuga ggaacaggut t 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgugacacg uucggagaat t 21

Claims

1.检测转录因子ZNF429表达量的试剂在制备用于检测或评估胃癌的试剂或试剂盒中的应用，其特征在于，所述的转录因子ZNF429的序列为SEQ ID NO.1。

2.一组用于胃癌检测或预后评估的引物组，其特征在于，所述的引物组用于检测转录因子ZNF429的表达量，所述的引物选自如下序列：

正向引物反向引物 SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.4 SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.5

3.权利要求2所述的引物组在制备用于检测或评估胃癌的试剂或试剂盒中的应用。

4.一种用于检测或评估胃癌的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的试剂用于检测转录因子ZNF429的表达量；所述的试剂盒中包括用于检测转录因子ZNF429的表达量的试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括权利要求2所述的引物组。

6.抑制转录因子ZNF429表达的siRNA在制备用于胃癌治疗或预防或预后恢复的药物中的应用。

7.抑制转录因子ZNF429表达的siRNA在制备胃癌热疗敏感患者治疗药物或筛选热灌注治疗敏感患者试剂中的应用。

8.一种用于胃癌治疗或预防或预后恢复的药物，其特征在于，所述的药物为转录因子ZNF429的抑制剂。