KR20120137910A - 마이크로ＲＮＡ-１０ｂ를 유효성분으로 함유하는 위암 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마이크로 RNA(microRNA, miR)-10b를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 마이크로 RNA(microRNA, miR)-10b 또는 마이크로 RNA-10b의 발현을 증가시키는 물질을 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물, 마이크로 RNA-10b 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 과메틸화된 CpG 영역을 포함하는 위암 진단용 바이오마커를 포함하는 키트, 대조군에 비하여 마이크로 RNA-10b의 발현 수준이 감소, 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준이 증가 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준이 증가된 피검체를 위암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법 및 대조군에 비하여 마이크로 RNA-10b의 발현 수준을 감소, 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준을 증가 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준을 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 위암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 마이크로 RNA-10b는 위암 억제 역할을 하기 때문에 위암 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 또한 마이크로 RNA-10b 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화는 위암 발생의 위험을 탐색하기 위한 분자적 바이오마커로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

마이크로ＲＮＡ-１０ｂ를 유효성분으로 함유하는 위암 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising microRNA-10b for prevention and treatment of gastric cancer}
본 발명은 마이크로RNA(microRNA; 이하 miRNA라 한다)-10b를 유효성분으로 함유하는 위암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
마이크로 RNA(MicroRNA, miRNAs)는 mRNA 번역의 억제 또는 mRNA 분해를 촉진함으로써, 유전자 발현의 음성 조절 인자로서의 역할을 하는 ~22 뉴클레오티드 길이의 작은 비-암호화 RNA(small noncoding RNA)이다(Nature 2003; 425:415-9). 또한, 마이크로 RNA는 발생, 분화, 세포사멸 및 증식(Cell 2004; 116:281-97, Curr Opin Genet Dev 2005; 15:410-5)과 관련된 결정적인 생물학적 과정뿐만 아니라 당뇨병, 신경변성의 질환 및 암과 같은 인간의 질환들과 관련되어 있다(Nature 2004; 432:226-30, Nat Cell Biol 2004; 6:1048-53, Nature 2005; 435:834-8).
특히, miRNA의 비정상적인 발현은 다양한 종류의 암에서 발견되고, 인간의 암의 개시 및 진행에 관련된다(Annu Rev Med 2009; 60:167-79.). 단백질을 암호화하는 유전자와 같이, miRNA는 종양 억제자로서 작용할 수 있지만, 또한 그것의 정상 기능을 상실한다면 정상 세포의 악성 전환을 개시하거나 이에 기여한다. 이와 같이, 정상 세포와 비교하여 악성에서 miRNA의 기능의 상실은 암과 관련된 게놈 영역(genomic regions)의 miRNA를 발현하는 부위에서 일어난다. 게다가, miRNA 기능의 상실은 후성적(epigenetic) 메커니즘 및 miRNA-가공(processing) 기구의 변성 때문이다(Nat Rev Cancer 2006; 6:857-66). 게다가, 몇몇 miRNA는 종양 유전자로서 기능할 수 있다(J Pathol 2005; 207:243-9).
몇몇 miRNA는 암 세포 타입에 따라 상반되는 활성을 보인다. 예를 들어, miR-22는 유방암에서 과발현되나, 간암에서는 하향조절되므로(Mol Cell Biol 2009; 29:3783-90, Br J Cancer; 103:1215-20), miR -22는 발암에서 종양유전자 또는 종양 억제자로서 역할을 한다. miR -29a의 과발현은 유방암 시료에서 발견되었고 이는 종양유전자인 Ras(rat sarcoma) 신호전달과 함께 상피-중간엽 세포의 전환(transition) 및 전이(metastasis)를 유도한다(EMBO Rep 2009; 10:400-5). 이와 반대로, miR -29a의 하향조절(downregulation)은 신경아세포종(neuroblastomas), 육종(sarcomas), 및 뇌종양을 포함하는 다양한 고형 종양의 광범위한 스펙트럼에서 발견되었다(Cancer Res 2009; 69:6275-81). 따라서 miRNA는 상황에 따라 종양 유전자 또는 종양 억제자로써 역할을 하기 때문에, 비정상적인 miRNA 발현은 다양한 종양의 치료를 고려할 때 중요하다(J Clin Oncol 2009; 27:5848-56).
위암은 세계에서 2 번째로 빈번히 일어나는 암으로 사망의 주요 원인이나, 위암 발생의 정확한 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았다(BMC Cancer 2002; 2:37, Nat Rev Cancer 2003; 3:592-600). DNA 메틸화는 암과 관련된 주된 후성적 변화이고, 종양 억제 유전자의 전사 사일런싱(transcriptional silencing)을 유도할 수 있다(Curr Opin Cell Biol 2007; 19:273-80, Cell Cycle 2007; 6:1040-3, Nat Genet 2007; 39:237-42). DNA 메틸화는 발암의 발생 메커니즘에 있어서 연구되었고, 종양 억제 유전자 및 이외에 암과 관련된 유전자를 확인하기 위하여 사용되었다. 게다가, DNA 메틸화 마커는 암 진단, 종양 분류 및 예후, 및 항암 화학 요법에 대한 분석에 이용되었다(Nat Rev Cancer 2003; 3:253-66). 위암에서 DNA 메틸화 마커를 확인하기 위하여, 이전에 제한적 표지 유전체 스캐닝(restriction landmark genomic scanning)을 통해 위암 세포 및 조직에서 광범위한 메틸화 패턴을 연구하였다. 몇몇 유전자의 비정상적인 메틸화를 확인하였고, 위(gastric)의 발암(carcinogenesis)에 있어서, 상기 유전자들의 역할을 제시하였다(Cancer Res 2008; 68:7147-55, Carcinogenesis 2008; 29:1623-31, Carcinogenesis 2008; 29:629-37, Mol Cancer Res 2008; 6:222-30, Carcinogenesis; 31:1685-93).
본 발명에서 위암에서 miRNA의 비정상적인 메틸화를 검출하기 위하여 메틸화 어레이 기술(methylation array technology)을 이용하였고 miR -10b의 프로모터 CpG에서 메틸화가 많은 것(heavy methylation)을 확인하였으며, 이것은 miR -10a와 관련된 암 생물학의 다양한 측면의 조절자이다(J Biol Chem 2010; 285:7986-94, Nature 2007; 449:682-8). miR -10b 메틸화는 종양유전자인(oncogenic) 미세소관(microtubule)-관련 단백질, RP/EB 패밀리, 멤버 1을 암호화하는, MAPRE1의 발현 증가와 관련되어 있고, 이는 miR -10b가 MAPRE1 전사를 표적으로 한다는 것을 제시한다. miR -10b의 전구체를 위암 세포에 형질감염시킨 후, MAPRE1 mRNA 및 단백질이 극적으로 감소하고 콜로니 형성율과 세포 성장이 현저히 감소한다는 것을 확인하였다.
이에 본 발명자들은 miR -10b가 위 발암과정에서 종양-억제 역할을 할 수 있고 miR -10b가 위암 치료를 위한 치료 표적이 될 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 위암에서 비정상적으로 메틸화된 miRNA를 표적으로 하는 위암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 위암에서 비정상적으로 메틸화된 miRNA를 표적으로 하는 위암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 위암에서 비정상적으로 메틸화된 miRNA를 표적으로 하는 위암 진단 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법을 제공하는 것이다.
아울러, 본 발명의 다른 목적은 위암에서 비정상적으로 메틸화된 miRNA를 표적으로 하는 위암 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로 RNA(microRNA, miR)-10b를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 마이크로 RNA-10b 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 과메틸화된 CpG 영역을 포함하는 위암 진단용 바이오마커를 포함하는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 피검체에서 유래한 시료에서 마이크로 RNA-10b의 발현 수준, 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준 중 어느 하나를 측정하는 단계; 및
2) 대조군에 비하여 마이크로 RNA-10b의 발현 수준이 감소, 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준이 증가 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준이 증가된 피검체를 위암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 피검 물질을 마이크로 RNA-10b 발현 세포에 처리하는 단계; 및
2) 대조군에 비하여 마이크로 RNA-10b의 발현 수준을 감소, 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준을 증가 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준을 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 위암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 마이크로 RNA-10b는 위암 억제 역할을 하기 때문에 위암 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다. 또한 마이크로 RNA-10b 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화는 위암 발생의 위험을 탐색하기 위한 분자적 바이오마커로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 miR -10 및 이의 게놈 구조의 확인에 대한 그림이다.
(A) 메틸화 마이크로어레이 결과의 볼케이노 플롯(Volcano plot) 분석. x 축은 메틸화 평균 비율(ΔAVG Beta)의 차이(종양 빼기 정상)를 나타내고, y 축은 정상 및 종양 조직 샘플에서 평균 P 값을 나타낸다. 수평 및 수직 점선은 컷오프 값(각각 P < 0.01 또는 ΔAVG Beta > 10%)을 나타낸다. 8개의 큰 점은 후보 CpG 프로브를 나타낸다. 화살표로 나타낸 것은 miR -10b 프로모터에서 CpG 프로브, CG12127282을 나타낸다.
(B) 11 개의 위암 세포주 및 32 쌍의 정상과 종양 조직으로부터의 임상 시료에 메틸화 마이크로어레이를 수행하여 확인한 CG12127282의 상세한 메틸화 상태.
(C) miR -10b 프로모터의 메틸화상태 확인. 영역 1 및 2(도 1D)의 CG12127282을 포함하는 6 개의 CpG를 중아황산염 파이로시퀀싱(bisulfate pyrosequencing) 분석을 통해 확인하였다. SNU016를 제외한 모든 위암 세포주에서 높은 메틸화를 확인하였다.
(D) miR -10b 및 이의 인근 부위의 게놈 구조. miR -10b 유전자를 커버하는 CpG 섬(island)은 HOXD4의 1.5 kb 상류(upstream) 영역에 위치하고 miR -10b의 공지된 프로모터 영역과 중복된다. 메틸화 상태를 확인하기 위하여 프로모터의 2 개의 CpG 영역(영역 1 및 2)로부터 6 개의 CpG에 대하여 중아황산염 파이로시퀀싱 분석을 수해하였다. CpG 프로브(probe) CG12127282는 영역 1에 위치한다.
(E) MAPRE1의 3’말단과 miR -10b의 서열 쌍(Sequential pairing). miR -10b의 예상 표적인 MAPRE1을 miRBase, PicTar, 및 microRNA.org를 포함하는 miRNA 데이터베이스를 기초로 확인하였다.
도 2는 원발성 위 종양(primary gastric tumors)에서 miR -10b 프로모터 메틸화와 HOXD4 및 MAPRE1의 상관관계를 나타낸 그림이다.
(A)와 (B)는 정상 및 종양 조직 간의 메틸화 상태 비교한 것이다. 40 쌍의 임상시료에서 영역 1에 있는 두 CpG에 대하여(A) 또는 100 쌍의 시료에서 영역 2에 있는 4 CpG에 대하여(B) 중아황산염 파이로시퀀싱 분석을 수행하였다. 박스-플롯(box-plot) 분석은 중앙값(median), 25 및 75 백분위(percentile) 수, 및 이상값(outlier)을 나타낸다.
(C)와 (D)는 위 종양(gastric tumors)에서 miR -10b 메틸화와 상대적인 HOXD4(C) 및 MAPRE1(D) 발현 수준간의 상관관계를 나타낸다. 각각의 메틸화 수준은 영역 2에서 4개 각각의 CpG로부터의 평균값으로 계산되었다. miR -10b 메틸화 와 HOXD4 및 MAPRE1 발현 간의 상관관계는 피어슨 상관관계 계수(Pearson’s correlation coefficient; R)을 이용하여 결정되었고, 이의 유의수준(significance)은 P 값으로 추론되었다.
도 3은 miR -10b 메틸화와 위암 세포에서 miR -10b, HOXD4, 및 MAPRE1 발현에 대한 AZA 효과를 나타낸 그림이다.
(A) miR -10b 메틸화 상태는 AZA 처리 후 영역 2에 있는 4 개의 CpG를 중아황산염 파이로시퀀싱으로 분석하였다.
(B) 내지 (D) AZA 처리한 끝에 상대적인 miR -10b(B), HOXD4(C), 및 MAPRE1(D) 발현을 실시간(real-time) RT-PCR로 분석하였다. 각 분석은 3 회 수행하였고, 에러바(error bar)는 표준편차(standard deviation; SD)로 나타내었다.
C, 대조군(비 처리군); A, AZA 처리.
*, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001; ns, 중요하지 않음(not significant).
도 4는 MAPRE1의 세포 내 역할 및 MAPRE1에 대한 miR -10b의 효과를 나타낸 그림이다.
(A) MAPRE1 발현 벡터로 이용한 세포 성장 분석. 이 분석은 두 위암 세포주인 SNU484 및 MKN-1에 대해 수행하였고, pLPCX/MAPRE1 또는 빈 Plpcx 벡터로 형질감염시키고 3 일 동안 배양하였다.
(B) MAPRE1 발현에 대한 miR -10b의 효과. miR -10b 전구체를 두 위암 세포주 SNU638 및 MKN1에 형질감염시켰다. MAPRE1 발현은 실시간 RT-PCR으로 분석하였고, 형질감염시키지 않은 세포(대조군, C) 및 형질감염시킨 세포(miR-10b; 왼쪽 패널)간의 발현 수준을 비교하였다. 또한 MAPRE1 수준도 비교하였다(오른쪽 패널).
(C) 콜로니-형성 분석(colony-forming assay)을 SNU638 및 MKN1 세포로 수행하였다. miR -10b 전구체로 형질감염시킨 세포 또는 형질감염시키지 않은 세포를 10 일 동안 배양한 후, 콜로니 수를 계산하였다.
(D) miR -10b 전구체의 형질감염 후 세포 성장 분석. 대조군 및 전구체 miR -10b를 형질감염시킨 SNU638(왼쪽 패널) 및 MKN1(오른쪽 패널)세포를 3 일 동안 배양한 후, 세포 성장을 조사하였다. 상기 분석은 3 회 수행하였다. 에러 바는 표준 편차(standard deviation, SD)를 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 마이크로 RNA(microRNA, miR)-10b를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 있어서 마이크로 RNA-10b는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물에 있어서 마이크로 RNA-10b는 MAPRE1의 발현을 억제하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물에 있어서 마이크로 RNA-10b는 전-miR 전구체 분자(pre-miR precursor)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 조성물에 있어서 위암은 원발성 위 종양(primary gastric tumors)것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, miR -10b(서열번호 1)가 CpG 섬으로 둘러싸여 있고, CG12127282를 포함하는 miR -10b 프로모터 부위의 잘 특성을 확인하기 때문에 위암에서 miR -10b의 후생유전학적 조절의 역할에 관심을 맞추었다. miR -10b는 5'-GUGUUUAAGCCAAGAUGUCCCAU-3'(서열번호 1)의 염기서열로 기재되었다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, CG12127282가 SNU016을 제외한 모든 위암 세포주에서 심하게 메틸화되었고 원발성 위 종양(primary gastric tumors)에서 평균 메틸화 수준(54 % ± 12)이 인접한 정상 조직들(41 % ± 9)보다 상당히 높기 때문에(P = 1.06641×10-5) CG12127282의 과메틸화에 초점을 맞추었다(도 1B). 또한, miR-10b 프로모터 영역을 조사하였고, 이 상류 부위에서의 메틸화는 HOXD4 유전자 조절과 관련될 수 있다. 6개의 CpG 사이트(영역 1에서 2개 및 영역 2에서 4개; 도 1C)의 중아황산염 파이로시퀀싱(bisulfate pyrosequencing) 분석으로 위암 세포에서 두 개의 miR -10b 프로모터 영역의 메틸화 상태를 확인하였다. 영역 1의 두 번째 CpG 위치는 마이크로어레이 실험으로 분석된 위치와 상응하였다. 6 개의 CpG 위치 모두의 평균 메틸화 상태를 SNU016(5 %)를 제외한 모든 위암 세포에서 73 %에서 90 %의 범위로 측정하였고, 이는 마이크로어레이 실험으로 결정된 메틸화 상태와 잘 부합하였다. miR -10b의 가능한 표적을 데이터베이스를 이용하여 조사하여 MAPRE1이 가능한 표적 유전자로 확인되었다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, miR -10b 프로모터 메틸화가 상응하는 정상 조직과 비교하여 원발성 종양에서 비정상적으로 증가되는지를 평가하기 위하여, 100 쌍의 임상시료에서 영역 1 및 2의 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 분석을 수행하였다. 두 영역의 평균 메틸화 수준은 한 쌍인 정상 조직보다 위 종양에서 상당히 높았고(도 2A 및 도 2B), 이는 miR-10b 프로모터가 위 발암과정(gastric carcinogenesis) 동안 종양에서 과메틸화되는 것을 나타낸다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 성별, 종양 크기, 종양 진행 상태 또는 림프절 전이에 대하여 위(gastric) 종양의 두 서브타입 (정상과 종양간의 메틸화 차이) 간에 차이가 발견되지 않았다. 이와 반대로, ≤10 서브타입의 종양을 가진 환자(54.3 ± 14.6)와 비교하여 >10 서브타입의 위 종양을 가진 환자(61.2 ± 11.2)에서 평균 연령이 상당히 높았고(P = 0.014), 이는 miR -10b 메틸화가 연령과 관련되어 있다는 것을 제안한다. 또한 >10 서브타입은 장내 타입(intestinal-type)에서 상당히 좀더 일반적이고, 분산 타입(diffuse-type) 위암에서 덜 일반적이었다(P = 0.016; 표 2). 평균 HOXD4 발현은 두 개의 서브타입 간에 상당한 차이를 보이지 않았고, 반면에 평균 MAPRE1 발현은 ≤10 서브타입(1.01 ± 0.48) 비교하여 >10 서브타입(1.34 ± 0.67)을 가진 종양에서 상당히 높았다(P = 0.004). 모든 위(gastric) 종양에서 HOXD4 또는 MAPRE1의 발현을 miR -10b 프로모터 메틸화에 대하여 표시했을 때, 상대적인 HOXD4 발현과 miR -10b 메틸화 상태 사이에 상당한 음성(negative) 상관 관계를 확인하였고(R = -0.2181, P = 0.0019), 상대적인 MAPRE1 발현과 miR -10b 메틸화 상태 사이에 양성(positive) 상관관계를 확인하였으며(R = 0.3255, P < 0.0001), 이는 miR -10b 메틸화의 증가가 임상시료에서 감소된 HOXD4 발현 및 증가된 MAPRE1 발현와 관련되었다는 것을 나타낸다(도 2C 및 D).
본 발명의 구체적일 실시예에서, 위암 세포에서 miR -10b 또는 HOXD4의 사일런싱이 miR -10b 프로모터 메틸화와 직접 관련되는지 여부와 그에 따라 miR -10b 발현의 회복이 MAPRE1 발현 억제와 관련되는 지를 확인하기 위하여, 5개의 위암 세포주(SNU601, SNU638, MKN1, MKN74, 및 SNU719)에 DNA 메틸화 억제제 5-아자-2’-데옥시시티딘(5-aza-2′-deoxycytidine; AZA)를 처리하였다. 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 분석을 통해 SNU719 제외한 모든 세포주에서 영역 2의 CpG 위치가 AZA에 의해 부분적으로 탈메틸화(demethylate)된 것을 확인하였다(도 3A). 또한, 실시간 RT-PCR 분석을 통해 AZA 처리 후 4 개의 세포주에서 miR -10b 및 HOXD4 발현의 증가(도 3B 및 C) 및 MAPRE1 발현의 감소(도 3D)를 확인하였다. 상기 결과들은 4 개의 위암 세포주에서 miR -10b 및 HOXD4 발현이 DNA 메틸화와 같은 후성적 메커니즘에 의해 시스로(in cis) 조절되고 MAPRE1 발현은 miR -10b에 의해 트랜스로(in trans) 조절된다는 것을 제시한다. AZA 처리 후 SNU719 세포에서 miR-10b 프로모터 메틸화의 감소는 관찰되지 않았음에도 불구하고(도 3A), 이러한 결과는 같은 세포에서 miR -10b, HOXD4 및 MAPRE1 발현에 유의한 변화가 없는 것과 잘 상응한다(도 3B, C 및 D).
본 발명의 구체적일 실시예에서, miR -10b 표적 유전자로서 MAPRE1의 기능을 조사하기 위하여, 안정한 MAPRE1 -과발현 SNU484 및 MNK1 세포주를 확립하고 MAPRE1-과발현 세포 및 빈 벡터로 형질감염된 세포를 이용하여 3 일 동안 증식 분석을 수행하였다. 세포 성장률은 대조군인 빈 벡터-형질감염된 세포에서보다 MAPRE1-과발현 세포, 특히 MAPRE1 -과발현 MKN1 세포에서 더 빠르고(도 4A), 이는 MAPRE1은 위 발암과정에서 세포 증식을 촉진함으로써 종양유전자(oncogene)로서 역할하는 것을 제안한다.
본 발명의 구체적일 실시예에서, MAPRE1에 대한 miR -10b의 직접적인 효과를 조사하기 위하여, miR -10b 전구체(precursor) 분자(5'-CCAGAGGUUGUAACGUUGUCUAUAUAUACCCUGUAGAACCGAAUUUGUGUGGUAUCCGUAUAGUCACAGAUUCGAUUCUAGGGGAAUAUAUGGUCGAUGCAAAAACUUCA-3': 서열번호 17)를 위암세포에 일시적 형질감염(transient transfection)을 한 후, 콜로니 형성 및 세포 증식 분석과 웨스턴 블롯을 수행하였다. 실시간 RT-PCR 분석은 형질감염되지 않은 대조군 세포와 비교하여 miR -10b 전구체가 형질감염된 SNU638 세포에서 MAPRE1 mRNA 발현 수준이 상당히 감소하였다는 것을 보여준다. 또한 miR-10b 전구체가 형질감염된 MKN1 세포에서도 MAPRE1 발현이 감소하였지만, 이는 형질감염되지 않은 대조군 세포와 비교하여 유의적인 차이를 보이지 않았다(도 4B 왼쪽 패널). 항-MAPRE1 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통하여 miR -10b 전구체가 형질감염된 두 세포주에서 MAPRE1 수준이 강하게 감소하였다(도 4B 오른쪽 패널). 이러한 결과는 miR -10b 전구체 형질감염 전후의 MAPRE1 mRNA 발현 차이와 잘 부합한다. miR -10b 전구체로 형질감염시키고 10 일 동안 배양한 세포는 miR -10b 전구체를 형질감염 하지 않은 대조군 세포에 비해 더 적은 콜로니를 형성하였다(도 4C). 게다가, 증식율은 3 일 후 형질감염되지 않은 대조군 세포와 비교하여 miR -10b 전구체가 형질감염된 위암 세포, 특히 MKN1 세포에서 강하게 감소하였다(도 4D). 이러한 결과들은 위암 세포에서 miR -10b가 MAPRE1를 표적화함으로써 세포 증식 신호를 억제하는 것을 제안한다.
본 발명에 따른 위암 예방 또는 치료용 조성물은 투여하고자 하는 경로에 적합하게 제형화 할 수 있다. 투여 경로의 예로는 정맥내, 혈액내, 피하, 흡입, 경피(국부), 점막 및 직장같은 비경구 투여 또는 경구 투여가 있다. 혈액 또는 피하 투여와 같은 경구 투여에 사용되는 용액 또는 현탁액에는 주사용 용매, 염수액, 고정유, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 그 밖의 합성 용매와 같은 무균 희석제, 벤진 알코올 또는 메틸 파라벤과 같은 항박테리아제; 아스코르브산 또는 아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산과 같은 킬레이트화제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트같은 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스와 같은 증장성 조절제가 포함될 수 있다. 좌제의 제조에 적합한 담체는 천연 및 경화 오일, 왁스, 지방, 반-액체 폴리올 등이다. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산 또는 염기로 조절될 수 있다. 비경구 제제는 앰플, 1회용 주사기, 유리 또는 플라스틱으로 제조된 다중 용량 바이알로 밀봉될 수 있다.
주사용으로 적합한 위암 예방 또는 치료용 조성물은 무균 수용액 또는 분산액 및 무균 주사액 또는 분산액의 즉석 제제용 무균 분말을 포함한다. 정맥내 투여용으로 적합한 담체로는 생리 식염수, 정균수, CremophorELTM(BASF, Parsippany, NJ) 또는 인산염 완충염수(PBS)가 포함된다. 모든 경우에 있어서, 위암 예방 또는 치료용 조성물은 살균되어야하고, 용이하게 주사될 수 있는 정도의 유체여야 한다. 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야 하며, 박테리아 및 균류와 같은 미생물의 오염 작용에 있어서 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액체 폴리레틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분사 매질일 수 있다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 사용하므로써, 부산액의 경우에 요구되는 입도를 유지시킴으로써, 그리고 계면활성제를 사용함으로써 적합한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용은 다양한 항세균제 및 항균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등에 의해 방지될 수 있다. 당, 만니톨, 소르비톨과 같은 다가 알코올, 염화나트륨과 같은 등장제가 질환 치료제 중에 포함되는 것이 바람직하다. 주사용 조성물의 흡수 연장은 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 질환 치료제에 포함시킴으로써 달성될 수 있다.
무균 주사액은 적합한 용매 중에서 상기 기재된 하나 또는 조합된 성분에 필요 활성 성분을 혼입하고, 필요에 따라 여과 살균시킴으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 성분을, 염기성 분산 매질 및 상기 기재된 것들로부터 필요한 다른 성분을 함유할 수 있는 무균 비히클을 혼입하여 제조할 수 있다. 무균 주사액을 제조하기 위한 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조이며, 이들 방법에 의해 활성 성분과 이전에 살균된 여과 용액으로부터 바람직한 성분의 분말을 얻을 수 있다. 주사 액제의 제조에 적합한 담체의 예로는 물, 알콜, 폴리올, 글리세린, 식물성 오일 등이 있다.
경구용 위암 예방 또는 치료용 조성물은 일반적으로 불활성 희석제 또는 식용 담체를 포함한다. 경구 치료적 투여를 위해, 활성 성분은 부형제에 혼입되어 정제, 트로우키(troches), 또는 젤라틴 형태의 캡슐로 사용된다. 또한 경구용 질환 치료제는 구강 세척액으로서 사용하기 위한 유체 담체를 사용하여 제조될 수 있다. 연질 젤라틴 캡슐에 대한 적합한 담체의 예로는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반-고형 및 액체 폴리올등이 있다. 액제 및 시럽의 제조에 적합한 담체의 예로는 물, 폴리올, 사카로즈, 전화당, 글루코스 등이 있다.
약제학적으로 적합한 결합제 및/또는 어주번트 물질이 질환 치료제의 일부로 포함될 수 있다. 약학 제제는 또한 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 풍미제, 삼투압 조절용 염, 완충제, 코팅제 또는 산화방지제를 함유할 수 있다. 정제, 알약, 캡슐, 트로우키 등은 하기의 성분의 어느 하나 또는 유사한 특성의 혼합물을 함유할 수 있다: 미정질 셀루로오스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴과 같은 결합제; 전분 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, PrimogelTM 또는 옥수수 전분과 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 또는 SterotesTM와 같은 윤활제; 콜로이드 상태의 이산화규소와 같은 길던트(gildant); 수크로오스 또는 사카린과 같은 감미제; 또는 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지향과 같은 향미제. 경구 또는 비경구용 질환 치료제는 용량의 투여 밑 균일성을 용이하게 하기 위하여 용량 단위형으로 제형하는 것이 유리하다. 상기 miRNA들은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 통상적인 방법으로 약제로서 제형화시킬 수 있다. 락토오즈, 옥수수 전분 또는 그의 유도체, 활석, 스테아르산 또는 그의 염을 예를들어, 정제 및 경질 젤라틴 캡슐에 대한 담체로서 사용할 수 있다.
위암 예방 및 치료를 위한 투여량은 광범위하게 변화시킬 수 있으며, 물론, 각각의 특별한 경우에 개별적인 필요 조건에 따라 조절될 것이다. 본 발명에 따른 유효성분의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명은 마이크로 RNA-10b 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 과메틸화된 CpG 영역을 포함하는 위암 진단용 바이오마커를 포함하는 키트를 제공한다.
상기 키트에 있어서 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 과메틸화된 CpG 영역은 영역 1(서열번호 2) 또는 영역 2(서열번호 3)을 포함하는 것이 바람직 하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 키트에 있어서 위암은 원발성 위 종양(primary gastric tumors)것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은
1) 피검체에서 유래한 시료에서 마이크로 RNA-10b의 발현 수준, 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준 중 어느 하나를 측정하는 단계; 및
2) 대조군에 비하여 마이크로 RNA-10b의 발현 수준이 감소, 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준이 증가 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준이 증가된 피검체를 위암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로 RNA-10b의 발현 수준의 측정은 실시간 RT-PCR으로 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준의 측정은 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 분석으로 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은
1) 피검 물질을 마이크로 RNA-10b 발현 세포에 처리하는 단계; 및
2) 대조군에 비하여 마이크로 RNA-10b의 발현 수준을 감소, 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준을 증가 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준을 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 위암 치료제 스크리닝 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로 RNA-10b의 발현 수준의 측정은 실시간 RT-PCR으로 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준의 측정은 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 분석으로 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
이하 실시예를 통해 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
메틸롬 프로파일링( methylome profiling )으로 위암에서 과메틸화된 마이크로 RNA 의 동정
<1-1> 세포주 및 조직 시료의 준비
15 가지 인간 위암 세포주(SNU001, -005, -016, -216, -484, -520, -601, -620, -638, -668, 및 -719; Az-521; NUGC-3; MKN1; 및 MKN74)을 한국 세포주 은행(http://cellbank.snu.ac.kr)에서 얻었다. 상기 세포주들은 10 % 우태아 혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 RPMI 1640 배지(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)에 5 % CO2를 포함하는 습윤한 공기로 37 ℃에 유지하였다.
위 종양 및 인접한 정상 조직들은 한구, 대전, 충남 국립 대학교 병원의 조직 은행에서 얻었다. 환자의 위암 표본은 절제 후 즉시 종양에서 본래 얻었고, 인접한 정상 점막 표본은 종양 가장자리에서 ≥3 ㎝ 떨어진 부위에서 얻었다. 신선한 표본을 절제한 후, 종양 표본 부분을 병리학적 관찰을 위하여 포르말린(formalin)이 고정된 파라핀 블록(paraffin block)으로 처리하고, 남은 표본은 조직 은행 시설(Tissue Bank facility)의 80 ℃의 초저온 냉동고에 보관하였다. 본 연구를 위하여, 100 개의 위(gastric) 종양 및 인접한 정상 점막 조직은 2001년부터 2002년까지 충남 국립 대학교 병원의 외과 병리학 파일로부터 소급적으로 확인하였다. 모든 표본은 사전 동의를 받았고, 이것들의 사용은 병원의 내부 심의 위원회에 승인받았다. DNA 및 전체 RNA는 위암 세포 및 임상 시료에서 트리졸(Trizol, Invitrogen, CA, 미국)로 분리하였다.
<1-2> 마이크로 RNA 메틸롬 프로파일링( MicroRNA methylome profiling )
위암 세포 또는 임상 시료에서 얻은 게놈(genomic) DNA (1 ㎍)을 EZ DNA 메틸화 키트(ZYMO Research, CA, USA)을 사용하여 아황산수소나트륨(sodium bisulfate)으로 변형시키고, 변환된 DNA 200 ng을 Infinium Human Methylation 27 Bead Chip kit(Illumina, CA)으로 증폭을 위해 사용하였다. 게놈-전반의(genome-wide) miRNA 상태를 조사하기 위하여, 인간 게놈의 110개 miRNA에 있는 254 CpG 위치를 포함하는 Human Methylation 27 Bead Chip(Illumina)에 증폭된 DNA를 혼성화시켰다. 세척 후, 상기 어레이는 BeadArray™ Reader (Illumina)을 사용하여 스캔하였다.
<1-3> 위암-특이적 과메틸화된 miRNA 의 확인
위암에서 과메틸화된 miRNA를 찾기 위하여 메틸화 마이크로어레이(HumanMethylation27 BeadChip)를 이용하여 위 종양 조직 및 위암 세포의 메틸롬 프로파일링을 수행하였다. 이미지 프로세싱 및 강도 데이터 추출은 일루미나(Illumina) 사의 지시에 따라 수행하였다. 각각 메틸화 신호는 0(CpG 의 모든 시토신(cytosine)이 메틸화되지 않은 경우)에서 1(모든 CpG 시토신이 메틸화된 경우)의 범위에서 DNA 메틸화의 정량적 수치인 β 값(value)을 계산하기 위해 사용되었다. 상기 메틸화 분석은 일루미나의 BeadStudio 소프트웨어의 메틸화 모듈(Methylation Module)로 수행하였고, 배경 강도로부터 표준화된 데이타를 계산하였다. 위암 특이적 과메틸화된 miRNA 확인하기 위하여, 종양 및 정상 점막 조직의 메틸화 값간의 차이를 결정하기 위한 t-검정을 수행하였다.
각 비드칩(BeadChip)에서 27,578 개의 고도로 정보성이 있는 CpG 위치들 중에서, 110 개의 miRNA를 커버하는 254 개의 CpG 위치를 선별하고 프로브 강도(≤3,000) 컷오프(cutoff) 방법을 시행하여 클러스터링하였다(도 1A). P < 0.01의 기본 파라미터와 >10 %의 평균 델타-베타 비율(average delta-Beta ratio, △AVB Beta; 정상 조직과 종양 간의 메틸화 차이를 측정)으로 필터링한 후, 5 개의 miRNA 부근에서 8 개의 암-특이적 과메틸화된 CpG 위치를 확인하였다(도 1A 및 표 1). 표 1에서 *는 제조자가 제공한 각각의 CpG 위치에 대한 코드 번호를 나타내고, **는 NCBI 데이타베이스(Genome Build 36)에 기초한 게놈 좌위(genomic locus)를 의미한다.
인간메틸화27 비드칩(HumanMethylation27 BeadChip) 분석으로 탐지된 miRNA 부근의 위암-특이적 과메틸화 CpG 프로브
miRNA 염색체 표적 ID* 지도 정보** 관련 유전자 P 값 △AVG Beta
hsa-mir-10a 17 CG14458834 44010393 HOXB4 1.69638E-05 0.2581283
hsa-mir-10a 17 CG21546671 44010386 HOXB4 4.14027E-05 0.2414288
hsa-mir-10a 17 CG08089301 44010560 HOXB4 0.001595575 0.1589119
hsa-mir-10a 17 CG06760035 44010244 HOXB4 0.004021522 0.1328445
hsa-mir-10b 2 CG12127282 176722931 HOXD4 3.51587E-05 0.1284359
hsa-mir-34b/c 11 CG22879515 110888725 BTG4 0.000587427 0.2015645
hsa-mir-196b 7 CG01381846 27171310 HOXA9 7.03244E-05 0.1823674
hsa-mir-196b 7 CG01354473 27171328 HOXA9 0.000644217 0.1330545
UCSC 게놈 브라우저(UCSC Genome Browser)에 기초하여, 8 개의 CpG 위치들 중에 4 개(CG14458834, CG21546671, CG08089301, 및 CG06760035)가 miR -10a 영역의 하류(downstream)에 위치하였고, 이것은 호메오박스(homeobox) B4(HOXB4)를 암호화하는 유전자의 약 1.5 kb 상류(upstream)에 위치한다. 두 CpG(CG01381846 및 CG01354473)는 miR -196b의 약 4 kb 상류에 위치하였다. 남은 두개의 과메틸화된 CpG 위치(CG22879515 및 CG12127282)는 각각, miR -34b/c 또는 miR -10b의 상류 영역에 있는 CpG 섬(island) 또는 CpG 섬 근처에 있다는 것을 확인하였다. 특히, CG22879515는 11번 염색체의 miR -34B/C 및 B-세포 전위 유전자 4(B- cell translocation gene 4; BTG4)의 양방향성(bidirectional) 프로모터로서 CpG 섬에서 확인되었고, 이는 상기 두 유전자가 전사 개시 위치가 <1 kb로 반대 가닥에 마주 대하게(head to head) 배치되어 있다는 것을 보여준다. CG22879515를 포함하는 CpG 섬의 과메틸화는 대장암에서 MIR34B /C 및 BTG4의 동시에 발생하는 후생유전학적 사이런싱(epigenetic silencing)과 관련되어 있다. 다른 CpG 사이트인 CG12127282는 miR -10b의 460 bp 상류 부위의 추정(putative) 프로모터에서 확인되었고, 이는 HOXD4의 ~1 kb(974 bp) 상류 영역에 위치하며, 상기 두 유전자가 CG12127282의 하류에 일렬로 배열되어있다는 것을 보여준다(도 1D).
본 발명에서, miR -10b(서열번호 1)가 CpG 섬으로 둘러싸여 있고, CG12127282를 포함하는 miR -10b 프로모터 부위의 잘 특성을 확인하기 때문에 위암에서 miR -10b의 후생유전학적 조절의 역할에 관심을 맞추었다.
miR -10b : 5'-GUGUUUAAGCCAAGAUGUCCCAU-3'(서열번호 1)
위암 세포에서 과메틸화 표적인 miRNA -10b 의 표적 유전자에 대한 예측
<2-1> miR -10b 프로모터 영역의 메틸화 상태 확인
본 발명에서, CG12127282가 SNU016을 제외한 모든 위암 세포주에서 심하게 메틸화되었고 원발성 위 종양(primary gastric tumors)에서 평균 메틸화 수준(54 % ± 12)이 인접한 정상 조직들(41 % ± 9)보다 상당히 높기 때문에(P = 1.06641×10-5) CG12127282의 과메틸화에 초점을 맞추었다(도 1B). 또한, miR -10b 프로모터 영역을 조사하였고, 이 상류 부위에서의 메틸화는 HOXD4 유전자 조절과 관련될 수 있다. 6개의 CpG 사이트(영역 1에서 2개 및 영역 2에서 4개; 도 1C)의 중아황산염 파이로시퀀싱(bisulfate pyrosequencing) 분석으로 위암 세포에서 두 개의 miR -10b 프로모터 영역의 메틸화 상태를 확인하였다.
영역 1: 5'-CTCGCTTCTTTTTCTTCTGCC-3'(서열번호 2)
영역 2: 5'-TGCGGGTGGCTGCGTCGAACGGT-3'(서열번호 3)
두 CpG 영역들(영역 1 및 2; 도 1D)의 파이로시퀀싱을 위한 프라이머는 PSQ Assay Design program(Biotage, Uppsala, Sweden)으로 디자인하였다. 중아황산염으로 변형된 DNA(100 ng)는 영역 1로부터 166 bp 산물을 만들도록 디자인된 비오틴화된 정방향 프라이머(biotin-5′-GGTAGTAGGAAAAGGAGTAGATA-3′: 서열번호 4) 및 역방향 프라이머(5′-ATCCATCCCAAAAATAAC-3′: 서열번호 5)을 포함하는 20 ㎕ 반응액에서 PCR로 증폭시켰다. 영역 2를 위해, 166 bp 산물을 만들도록 정방향 프라이머(5′-AGAAGAATGAGGGAATTTAT-3′: 서열번호 6) 및 비오틴이 결합된 역방향 프라이머(biotin-5′-ACCCCAATCTCTTCCTCT-3′: 서열번호 7)를 사용하였다. 모든 증폭 반응은 다음의 조건에서 수행하였다: 95 ℃에서 5 분; 95 ℃에서 30 초, 56 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 30 초의 35 사이클; 및 72 ℃에서 7 분. 파이로시퀀싱은 PSQ HS 96A System (Biotage AB)에서 시퀀싱(sequencing) 프라이머(영역 1을 위해 5′-AAAAACAAATACCCTCAAC-3′: 서열번호 8, 영역 2를 위해 5′-ATTTGAATTGTTTTAGAAAG-3′: 서열번호 9)를 사용하여 수행하였다.
영역 1의 두 번째 CpG 위치는 마이크로어레이 실험으로 분석된 위치와 상응하였다. 6 개의 CpG 위치 모두의 평균 메틸화 상태를 SNU016(5 %)를 제외한 모든 위암 세포에서 73 %에서 90 %의 범위로 측정하였고, 이는 마이크로어레이 실험으로 결정된 메틸화 상태와 잘 부합하였다.
<2-2> miR -10b 표적 유전자의 예측 및 이의 발현 분석
miR -10b의 가능한 표적을 miRBase (http://www.mirbase.org/), PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de), microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/home.do), 및 TargetScanHuman5.1 (http://www.targetscan.org/)와 같은 데이터베이스를 이용하여 조사하였다. MAPRE1이 가능한 표적 유전자로 확인되었다. miR -10b 메틸화 및 MAPRE1 발현간의 가능한 상관관계를 밝히기 위하여, 실시간 RT-PCR을 수행하여 위암 세포 및 임상 시료들에서 MAPRE1 mRNA 수준을 정량적으로 측정하였다. 217 bp의 엠플리콘을 만드는 사용된 정방향(5′-AGGCCCATCTCAACACAGAG-3′: 서열번호 10) 및 역방향(5′-CGTTCTCCTGGCAAATCAAT-3′: 서열번호 11) 프라이머를 사용한 것을 제외하고는, HOXD4 분석과 동일한 절차로 MAPRE1를 위한 실시간 RT-PCR을 수행하였다.
MAPRE1은 분석된 데이타베이스들 모두로부터 miR-10b와 시드-메치 포인트(7mer-m8에 의한)에 있어서 최상위의 높은 점수를 얻었고, miRBase, PicTar 및 microRNA.org와 같은, miRNA 데이터베이스로부터 상기 miR -10b 결합 위치를 예측하였다(도 1E). 게다가, 그 서열 또한 종(species)들 전반에 걸쳐 고도로 보존되었다.
원발성 위 종양 조직에서 miR -10b 프로모터 메틸화와 miR -10b, HOXD 4 및 MAPRE1 발현의 관련성 확인
<3-1> miR -10b 프로모터 메틸화 분석
miR -10b 프로모터 메틸화가 상응하는 정상 조직과 비교하여 원발성 종양에서 비정상적으로 증가되는지를 평가하기 위하여, 100 쌍의 임상시료에서 영역 1 및 2의 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 분석을 수행하였다. 두 영역의 평균 메틸화 수준은 한 쌍인 정상 조직보다 위 종양에서 상당히 높았고(도 2A 및 도 2B), 이는 miR-10b 프로모터가 위 발암과정(gastric carcinogenesis) 동안 종양에서 과메틸화되는 것을 나타낸다. 편의상, 상응하는 정상 조직과 비교하여 miR -10b 프로모터 메틸화에서 차이(즉, 종양에서 메틸화 백분율에서 정상 조직의 메틸화 백분율를 뺌)에 따라 위(gastric) 종양을 두 개의 서브타입(subtype)으로 나누었다: 주변 정상조직과 비교하여 miR -10b 메틸화 상태에서 차이가 10 또는 그 이하인 서브타입(‘≤10 서브타입’) 및 주변 정상조직과 비교하여 miR -10b 메틸화 차이가 10 이상인 서브타입(‘>10 서브타입’). 위(gastric) 종양에서 miR -10b 메틸화 상태에 대하여 환자의 임상병리학적 특징을 표 2에 요약하였다. 표 2에서 P 값은 스튜던트 t-검정(Student's t-test) 또는 카이 스퀘어-검정(χ2-test)으로 분석하였고, 종양 크기는 각 종양에서 측정된 가장 큰 직경에 기초하여 계산하였다. 종양 및 인접한 정상적인 점막 조직에서 miR -10b 메틸화 및 HOXD4 및 MAPRE1의 발현의 차이를 확인하기 위하여, 스튜던트 t-검정을 이용하였다. 또한 t-검정은 위암 세포주에서 miR-10b 발현, CpG 메틸화, 및 HOXD4 및 MAPRE1 발현을 분석하기 위해 이용하였다. MAPRE1 발현 및 miR -10b CpG 메틸화 수준 사이의 상관관계는 피어슨 상관관계 계수(Pearson’s correlation coefficient; r)를 이용하여 확인하였고, 유의성은 n-2 자유도(degrees of freedom)로 다음 식 t = r((n-2)/(1-r 2))1/2으로부터 계산된 t 값을 이용하여 t-검정을 통해 추론하였다. 환자의 다양한 그룹의 임상병리학적 요인은 χ 2 -검정 또는 스튜던트 t-검정을 이용하여 비교하였다. P < 0.05 결과는 통계적으로 유의성이 있다.
<3-2> miR -10b 발현 분석
PARIS™ 키트(Ambion, CA)를 이용하여, 총 RNA를 위암 세포주로부터 추출하였고, 총 RNA의 5 ng는 특이적 프라이머 및 TaqMan 마이크로RNA 역전사 키트 (Applied Biosystems, CA)을 이용하여 역전사시켰다. 이를 통해 얻어진 cDNA는 TaqMan 마이크로RNA 분석(Applied Biosystems)의 TaqMan 프로브(probes) 및 특이적 스템 루프(stem-loop) 프라이머(5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCACAAA-3': 서열번호 12)를 이용한 실시간 정량적 PCR을 이용하여 검출 및 증폭되었다.
상기 PCR은 CFX96 Real-Time System(Bio-Rad, CA)을 이용하여 수행하였고, 상대적인 ΔCt(발현 값) 분석을 위하여 CFX Manager software(Bio-Rad)를 사용하였다. RNU6B snRNA (Applied Biosystems)을 내부 컨트롤로 사용하였다.
<3-3> HOXD4 유전자 발현 분석
위암세포 및 임상 시료에서 HOXD4 mRNA 수준을 정량적으로 측정하기 위하여 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 188 bp의 엠플리콘을 생산하기 위하여, 각각 RT 반응물 100 ng을 정방향(5′-TGGTCTACCCCTGGATGAAG-3′: 서열번호 13) 및 역방향(5′-CGACAGACACAGGGTGTGAG-3′: 서열번호 14) 프라이머 및 2×SYBR 프리믹스 EX Taq(Takara, 일본)을 포함하는 15 ㎕ 반응물에서 증폭시켰다.
실시간 RT-PCR은 CFX96 Real-Time System을 이용하여 다음 조건에서 수행하였다: 95 ℃에서 1분, 95 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초를 35 사이클 및 최종 연장을 위해 72 ℃에서 10분.
시료들 중에서 많은 개시 RNA의 변형으로부터 발생하는 오류를 최소화하기 위하여, RNA 값을 내부 참조로 쓰이는 β- actin 값으로 정량화하였다. HOXD4의 발현은 실시간 RT-PCR 분석을 이용하여 상대적인 값으로 결정하였고 β- actin 발현에 대한 백분율을 평균하였다.
<3-4> MAPRE1 유전자 발현 분석
위암세포 및 임상 시료에서 MAPRE1 mRNA 수준을 정량적으로 측정하기 위하여 실시간 RT-PCR을 수행하였다. 211 bp의 엠플리콘을 생산하기 위하여, 각각 RT 반응물 100 ng을 정방향(5'-AGGCCCATCTCAACACAGAG-3': 서열번호 10) 및 역방향(5'-CGTTCTCCTGGCAAATCAAT-3': 서열번호 11) 프라이머 및 2×SYBR 프리믹스 EX Taq(Takara, 일본)을 포함하는 15 ㎕ 반응물에서 증폭시켰다.
실시간 RT-PCR은 CFX96 Real-Time System을 이용하여 다음 조건에서 수행하였다: 95 ℃에서 1분, 95 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 30 초를 35 사이클 및 최종 연장을 위해 72 ℃에서 10분.
시료들 중에서 많은 개시 RNA의 변형으로부터 발생하는 오류를 최소화하기 위하여, RNA 값을 내부 참조로 쓰이는 β- actin 값으로 정량화하였다. MAPRE1의 발현은 실시간 RT-PCR 분석을 이용하여 상대적인 값으로 결정하였고 β- actin 발현에 대한 백분율을 평균하였다.
<3-5> miR -10b 프로모터 메틸화와 miR -10b, HOXD 4 및 MAPRE1 발현의 관련성 확인
성별, 종양 크기, 종양 진행 상태 또는 림프절 전이에 대하여 위(gastric) 종양의 두 서브타입 간에 차이가 발견되지 않았다.
이와 반대로, ≤10 서브타입의 종양을 가진 환자(54.3 ± 14.6)와 비교하여 >10 서브타입의 위 종양을 가진 환자(61.2 ± 11.2)에서 평균 연령이 상당히 높았고(P = 0.014), 이는 miR -10b 메틸화가 연령과 관련되어 있다는 것을 제안한다. 또한 >10 서브타입은 장내 타입(intestinal-type)에서 상당히 좀더 일반적이고, 분산 타입(diffuse-type) 위암에서 덜 일반적이었다(P = 0.016; 표 2). 평균 HOXD4 발현은 두 개의 서브타입 간에 상당한 차이를 보이지 않았고, 반면에 평균 MAPRE1 발현은 ≤10 서브타입(1.01 ± 0.48) 비교하여 >10 서브타입(1.34 ± 0.67)을 가진 종양에서 상당히 높았다(P = 0.004).
모든 위(gastric) 종양에서 HOXD4 또는 MAPRE1의 발현을 miR -10b 프로모터 메틸화에 대하여 표시했을 때, 상대적인 HOXD4 발현과 miR -10b 메틸화 상태 사이에 상당한 음성(negative) 상관 관계를 확인하였고(R = -0.2181, P = 0.0019), 상대적인 MAPRE1 발현과 miR -10b 메틸화 상태 사이에 양성(positive) 상관관계를 확인하였으며(R = 0.3255, P < 0.0001), 이는 miR -10b 메틸화의 증가가 임상시료에서 감소된 HOXD4 발현 및 증가된 MAPRE1 발현와 관련되었다는 것을 나타낸다(도 2C 및 D).
임상병리학적 특징에 대한 종양에서 miR -10b 프로모터 메틸화의 상태
임상병리학적 파라미터 주변 정상조직과 비교하여
메틸화 차이에 기초한 위 종양 서브타입		 P 값
≤10 서브타입
(n = 50)		 >10 서브타입
(n = 50)
평균 백분율(연령±SD) 54.3 ± 14.6 61.2 ± 11.2 0.014
성별 남성 24 30 0.229
여성 26 20
종양 크기 (평균±SD; cm) 5.4 ±2.3 6.0 ± 2.6 0.291
조직학 장형(Intestinal type) 16 28 0.016
확산형 (Diffuse type) 34 22
종양 진행 EGC
(early gastric cancer)		 5 6 0.749
AGC
(advanced gastric cancer)		 45 44
림프절 전이
 음성 17 19 0.677
양성 33 31
HOXD4 발현 (평균%±SD) 0.47 ± 0.58 0.53 ± 0.56 0.383
MAPRE1 발현 (평균%±SD) 1.01 ±0.48 1.34 ± 0.67 0.004
위암 세포에서 AZA 처리에 의한 miR -10b 회복과 MAPRE1 전사 저해의 확인
<4-1> AZA 처리
위암 세포에서 miR -10b 또는 HOXD4의 사일런싱이 miR -10b 프로모터 메틸화와 직접 관련되는지 여부와 그에 따라 miR -10b 발현의 회복이 MAPRE1 발현 억제와 관련되는 지를 확인하기 위하여, 5개의 위암 세포주(SNU601, SNU638, MKN1, MKN74, 및 SNU719)에 DNA 메틸화 억제제 5-아자-2’-데옥시시티딘(5-aza-2′-deoxycytidine; AZA)를 처리하였다.
위암 세포주(SNU601, -638, -719; MKN1; 및 MKN74)는 약물 처리 1 일 전에 10 ㎝ 디쉬(디쉬 당 1×106 세포)에 접종하였다. 상기 세포에 3 일 동안 매 24시에 1 μM AZA(Sigma, St Louis, MO)을 처리한 후 수집하였다.
<4-2> AZA 처리에 의한 miR -10b 프로모터 메틸화와 miR -10b, HOXD4 , 및 MAPRE1 의 발현 수준 조사
AZA 처리 후 세포를 수집하고, AZA를 처리하지 않은 세포와 비교하여 처리한 세포에서 miR -10b 프로모터 메틸화와 miR -10b, HOXD4, 및 MAPRE1의 발현 변화를 분석하였다.
전체 RNA를 준비하고, miR -10b, HOXD4, 및 MAPRE1의 발현 수준을 실시예<3-1> 내지 <3-4>에 기재된 방법에 따라 실시간 RT-PCR로 조사하였다. 평균 mRNA 수준은 3번의 독립적인 실험으로 계산하였다.
파이로시퀀싱(pyrosequencing) 분석을 통해 SNU719 제외한 모든 세포주에서 영역 2의 CpG 위치가 AZA에 의해 부분적으로 탈메틸화(demethylate)된 것을 확인하였다(도 3A). 또한, 실시간 RT-PCR 분석을 통해 AZA 처리 후 4 개의 세포주에서 miR -10b 및 HOXD4 발현의 증가(도 3B 및 C) 및 MAPRE1 발현의 감소(도 3D)를 확인하였다. 상기 결과들은 4 개의 위암 세포주에서 miR -10b 및 HOXD4 발현이 DNA 메틸화와 같은 후성적 메커니즘에 의해 시스로(in cis) 조절되고 MAPRE1 발현은 miR-10b에 의해 트랜스로(in trans) 조절된다는 것을 제시한다. AZA 처리 후 SNU719 세포에서 miR -10b 프로모터 메틸화의 감소는 관찰되지 않았음에도 불구하고(도 3A), 이러한 결과는 같은 세포에서 miR -10b, HOXD4 및 MAPRE1 발현에 상당한 변화가 없는 것과 잘 상응한다(도 3B, C 및 D).
위암 세포에서 miR -10b 에 의한 MAPRE1 의 직접 표적화로 세포 성장 지연의 확인
<5-1> MAPRE1 발현 벡터의 제조 및 위암 세포에 형질전환
MAPRE1의 완전한 암호화 서열을 포함하는 cDNA는 SuperScript II 역전사효소(reverse transcriptase) 및 랜덤 헥사머(random hexamers, Invitrogen)를 사용하여 SNU638 세포에서 분리한 전체 RNA로부터 합성하였다. XhoI(CTCGAG) 및 NotI(GCGGCCGC) 제한 위치가 포함된 특이적 프라이머 쌍(정방향 프라이머 5'-CTCGAGCGAAGATGGCAGTGAACGTA-3': 서열번호 15, 역방향 프라이머 5'-GCGGCCGCAATTCCGATGTTGCTCTGCT-3': 서열번호 16)를 사용하여, 총 cDNA를 하기와 같은 조건의 PCR로 증폭시켰다: 95 ℃에서 5 분; 95 ℃에서 30 초, 56 ℃에서 30 초 및 72 ℃에서 30 초의 35 사이클; 및 72 ℃에서 7 분. PCR 산물을 제한 효소 XhoI 및 NotI로 절단하고 pLPCX vector(Invitrogen)으로 서브클로닝하였다. pLPCX/MAPRE1의이 잘 제조되었는지는 직접 DNA 시퀀싱 및 제한 분석(restriction analysis)으로 확인하였다. MAPRE1 발현 벡터로 형질감염된 SNU484 및 MKN1 세포는 96-웰 플레이트에 접종하고(2 × 103 세포/웰) 37 ℃에서 배양하였다.
<5-2> miR -10b 표적 유전자로서 MAPRE1 의 기능을 조사
miR -10b 표적 유전자로서 MAPRE1의 기능을 조사하기 위하여, 안정한 MAPRE1 -과발현 SNU484 및 MNK1 세포주를 확립하고 MAPRE1-과발현 세포 및 빈 벡터로 형질감염된 세포를 이용하여 3 일 동안 증식 분석을 수행하였다.
세포 증식은 EZ-CyTox (DAEILLLAB SERVICE Co. Ltd., Seoul, Korea)를 사용하여 MAPRE1 발현 벡터로 형질감염된 위암 세포의 세포 증식을 모니터하였다. 세포 증식은 매 24 시간마다 측정하였다. 세포 증식을 측정하기 위하여, EZ-CyTox 10 ㎕를 각각에 웰에 첨가하고 3 시간 동안 37 ℃에서 반응시켰다. 흡광도는 ELISA 리더(Bio-Rad)를 이용하여 450-650 ㎚로 측정하였다.
세포 성장률은 대조군인 빈 벡터-형질감염된 세포에서보다 MAPRE1 -과발현 세포, 특히 MAPRE1 -과발현 MKN1 세포에서 더 빠르고(도 4A), 이는 MAPRE1은 위 발암과정에서 세포 증식을 촉진함으로써 종양유전자(oncogene)로서 역할하는 것을 제안한다.
<5-3> MAPRE1 에 대한 miR -10b 의 직접적인 효과 조사
마지막으로, MAPRE1에 대한 miR -10b의 직접적인 효과를 조사하기 위하여, miR-10b 전구체(precursor) 분자(5'-CCAGAGGUUGUAACGUUGUCUAUAUAUACCCUGUAGAACCGAAUUUGUGUGGUAUCCGUAUAGUCACAGAUUCGAUUCUAGGGGAAUAUAUGGUCGAUGCAAAAACUUCA-3': 서열번호 17)를 위암세포에 일시적 형질감염(transient transfection)을 한 후, 콜로니 형성 및 세포 증식 분석과 웨스턴 블롯을 수행하였다.
<5-3-1> miR -10b 전구체 분자의 형질감염
시험관 내에서(in vitro) miR -10b의 치료 효과를 평가하기 위하여, SNU638 및 MKN1 세포를 FuGENE HD 형질감염 시약(Roche, Basel, Switzerland)을 사용하여 100 nmol/ℓ의 최종 농도로 전(pre)-miR miRNA 전구체 분자(Ambion) 또는 전(pre)-miR miRNA 음성 대조군 #1(Ambion)으로 형질감염시켰다. 형질감염으로부터 48 시간 후에, 각각 MAPRE1 mRNA 및 단백질 수준을 측정하기 위하여 총 RNA 및 세포 용해물을 배양된 세포로부터 추출하였다.
<5-3-2> 콜로니 형성 및 세포 증식 분석
세포증식 분석은 상기 실시예 <5-2>에 기재된 방법으로 수행하였다.
콜로니 형성 분석을 위하여, 전(pre )- mir -10b 및 대조군 전구체 분자로 형질감염된 SNU638 및 MKN1 세포는 10 일 후 염색하였다. 클론원성 생존(Clonogenic survival)은 크리스탈 바이올렛 염색법(0.5 % 크리스탈 바이올렛, 3.7 % 포름알데히드, 30 % 에탄올)로 측정하였다.
MAPRE1이 높게 발현되는 2 개의 위암 세포주인 SNU638 및 MKN1를 사용하였다. 실시간 RT-PCR 분석은 형질감염되지 않은 대조군 세포와 비교하여 miR -10b 전구체가 형질감염된 SNU638 세포에서 MAPRE1 mRNA 발현 수준이 상당히 감소하였다는 것을 보여준다. 또한 miR -10b 전구체가 형질감염된 MKN1 세포에서도 MAPRE1 발현이 감소하였지만, 이는 형질감염되지 않은 대조군 세포와 비교하여 유의적인 차이를 보이지 않았다(도 4B 왼쪽 패널).
<5-3-3> 웨스턴 블롯 분석
miR -10b 형질감염 후 MAPRE1 단백질 수준을 조사하기 위하여, PRO-PREP(iNtRON, 한국) 방법을 이용하여 위암 세포주(SNU638, MKN1)로부터 세포 단백질을 추출하였다. 세포는 miR -10b 형질감염 1 일 전, 6-웰 디쉬에 접종하였다(2×105 세포/웰). 웨스턴 블롯 분석은 MAPRE1 및 α-튜불린(BD Biosciences, CA, USA)에 대한 모노클로날 항체를 사용하여 수행하였다. 상기 블롯은 강화된 형광 이미지 분석기 LAS-4000 (FUJI Film, Tokyo, Japan)을 사용하여 시각화하였다.
항-MAPRE1 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 통하여 miR -10b 전구체가 형질감염된 두 세포주에서 MAPRE1 수준이 강하게 감소하였다(도 4B 오른쪽 패널). 이러한 결과는 miR -10b 전구체 형질감염 전후의 MAPRE1 mRNA 발현 차이와 잘 부합한다.
<5-3-4> MAPRE1 에 대한 miR -10b 의 직접적인 효과 조사
miR -10b 전구체로 형질감염시키고 10 일 동안 배양한 세포는 miR -10b 전구체를 형질감염 하지 않은 대조군 세포에 비해 더 적은 콜로니를 형성하였다(도 4C). 게다가, 증식율은 3 일 후 형질감염되지 않은 대조군 세포와 비교하여 miR -10b 전구체가 형질감염된 위암 세포, 특히 MKN1 세포에서 강하게 감소하였다(도 4D). 이러한 결과들은 위암 세포에서 miR -10b가 MAPRE1를 표적화함으로써 세포 증식 신호를 억제하는 것을 제안한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Composition comprising microRNA-10b for prevention and treatment of gastric cancer <130> 11p-02-34 <160> 17 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(23) <223> microRNA-10b <400> 1 guguuuaagc caagaugucc cau 23 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> promoter <222> (1)..(21) <223> Region 1 for microRNA-10b promoter <400> 2 ctcgcttctt tttcttctgc c 21 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> promoter <222> (1)..(23) <223> Region 2 for microRNA-10b promoter <400> 3 tgcgggtggc tgcgtcgaac ggt 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR of microRNA-10b promoter region 1 <220> <221> modified_base <222> (1) <223> biotinylated <400> 4 ggtagtagga aaaggagtag ata 23 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR of microRNA-10b promoter region 1 <400> 5 atccatccca aaaataac 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PCR of microRNA-10b promoter region 2 <400> 6 agaagaatga gggaatttat 20 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PCR of microRNA-10b promoter region 2 <220> <221> modified_base <222> (1) <223> biotinylated <400> 7 accccaatct cttcctct 18 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer for microRNA-10b promoter region 1 <400> 8 aaaaacaaat accctcaac 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sequencing primer for microRNA-10b promoter region 2 <400> 9 atttgaattg ttttagaaag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for real-time RT-PCR of MAPRE1 mRNA <400> 10 aggcccatct caacacagag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for real-time RT-PCR of MAPRE1 mRNA <400> 11 cgttctcctg gcaaatcaat 20 <210> 12 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> specific stem-loop primer for real-time quantitative PCR of microRNA-10b <400> 12 gtcgtatcca gtgcgtgtcg tggagtcggc aattgcactg gatacgacca caaa 54 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for real-time RT-PCR of HOXD4 mRNA <400> 13 tggtctaccc ctggatgaag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for real-time RT-PCR of HOXD4 mRNA <400> 14 cgacagacac agggtgtgag 20 <210> 15 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer incorporating XhoI resrictions sites for PCR of MAPRE1 cDNA <400> 15 ctcgagcgaa gatggcagtg aacgta 26 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer incorporating NotI resrictions sites for PCR of MAPRE1 cDNA <400> 16 gcggccgcaa ttccgatgtt gctctgct 28 <210> 17 <211> 110 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> microRNA-10b precursor molecule <400> 17 ccagagguug uaacguuguc uauauauacc cuguagaacc gaauuugugu gguauccgua 60 uagucacaga uucgauucua ggggaauaua uggucgaugc aaaaacuuca 110

Claims (14)

  1. 마이크로 RNA(microRNA, miR)-10b를 포함하는 위암 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로 RNA-10b는 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로 RNA-10b는 MAPRE1의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로 RNA-10b는 전-miR 전구체 분자(pre-miR precursor)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 위암은 원발성 위 종양(primary gastric tumors)인 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 마이크로 RNA-10b 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 과메틸화된 CpG 영역을 포함하는 위암 진단용 바이오마커를 포함하는 키트.
  7. 제 6항에 있어서, 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 과메틸화된 CpG 영역은 영역 1(서열번호 2) 또는 영역 2(서열번호 3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 위암은 원발성 위 종양(primary gastric tumors)인 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 1) 피검체에서 유래한 시료에서 마이크로 RNA-10b의 발현 수준, 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준 중 어느 하나를 측정하는 단계; 및
    2) 대조군에 비하여 마이크로 RNA-10b의 발현 수준이 감소, 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준이 증가 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준이 증가된 피검체를 위암에 걸릴 위험이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는 위암 진단의 정보를 제공하기 위한 유전자 검출 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 마이크로 RNA-10b의 발현 수준의 측정은 실시간 RT-PCR에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준의 측정은 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 분석에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 1) 피검 물질을 마이크로 RNA-10b 발현 세포에 처리하는 단계; 및
    2) 대조군에 비하여 마이크로 RNA-10b의 발현 수준을 감소, 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준을 증가 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준을 증가시키는 피검 물질을 선별하는 단계를 포함하는 위암 치료제 스크리닝 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 마이크로 RNA-10b의 발현 수준의 측정은 실시간 RT-PCR에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 마이크로 RNA-10b의 메틸화 수준 또는 마이크로 RNA-10b의 프로모터의 메틸화 수준의 측정은 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 분석에 의한 것을 특징으로 하는 방법.



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