CN108179193B

CN108179193B - Mettl14基因作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用

Info

Publication number: CN108179193B
Application number: CN201810174187.5A
Authority: CN
Inventors: 陶永光; 王敏; 毛超; 刘双
Original assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2018-03-02
Filing date: 2018-03-02
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2038-03-02
Also published as: CN108179193A

Abstract

本发明公开了METTL14基因作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用。可以检测METTL14基因在肺腺癌患者中的表达水平，为肺腺癌患者预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

Description

METTL14基因作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及METTL14基因作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测试剂中的应用。

背景技术

肺癌是目前死亡率最高的恶性肿瘤，在我国肺癌的发病率逐年上升,已成为发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌占所有肺癌的80％～85％，晚期非小细胞肺癌中位生存期大约10个月左右，至今其治疗和预后尚无突破性进展。非小细胞肺癌根据组织学类型不同主要分为肺腺癌和肺鳞癌，其中肺腺癌是非小细胞肺癌中最常见的类型。尽管随着诊疗技术的进步，特别是靶向药物的应用，改善了肺腺癌的生存期，但其5年生存率仍然很低。肺腺癌多起源于小支气管，为周围型肺癌，故早期临床症状较轻，但肺腺癌细胞增殖转移能力强，部分早期即发生血行转移，故多数患者就诊时已处于中晚期，是造成其生存率低预后差的主要原因。因此，提高肺腺癌的诊断和预后判定是降低其死亡率的主要手段。目前，对肺腺癌患者的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对肺腺癌患者进行预后判定的需求。因此，对肺腺癌患者预后进行判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为胸外科领域亟待解决的重要课题。

RNA m6A甲基化修饰是最常见的mRNA修饰方式，占甲基化RNA核苷的80％以上。RNAm6A甲基化是一种动态可逆的修饰方式，在转录后调控中发挥作用，其在调控基因表达、剪接、RNA编辑、RNA稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译等方面扮演重要角色。RNAm6A甲基化修饰是由一个多蛋白复合物介导产生，目前已知这个复合物的成分包括METTL3，METTL14和WTAP；而负责擦除甲基化修饰基团的则由去甲基化酶FTO和ALKBH5所承担。在细胞核中的HNRNPC负责识别m6A修饰基团，并介导mRNA前体的选择性剪接。而另外一个m6A识别蛋白HNRNPA2B1则促进pri-miRNA加工成pre-miRNA。在细胞质中，不同的m6A位点识别蛋白介导不同的功能。YTHDF1和YTHDF3识别m6A修饰mRNA，通过与起始因子及核糖体相互作用促进蛋白质翻译，eIF3识别蛋白也会直接结合到mRNA5’UTR端的m6A位点参与翻译起始。而另外一个识别蛋白YTHDF2与m6A识别将导致mRNA的降解。有研究表明在细胞内敲低甲基转移酶METTL3和METTL14蛋白的表达，可以诱导胶质母细胞瘤干细胞内原癌基因ADAM19、EPHA3和KLF4mRNA的表达，促进其生长、自我更新和分化。相反，过表达METTL3蛋白或者敲低去甲基化酶FTO则抑制胶质母细胞瘤干细胞的生长和分化以及肿瘤的生长，延长移植小鼠的寿命。在急性髓细胞白血病患者体内，去甲基化酶FTO表达水平升高，可以降低抑癌基因ASB2和RARA基因mRNA m6A甲基化修饰水平，调控ASB2和RARA的表达，促进白血病原癌基因介导的白血病细胞转化，FTO还可以抑制全反式维A酸介导的细胞分化作用。在肺癌细胞中，METTL3的表达有显著地上调，抑制METTL3表达后，肺癌细胞的增殖能力明显下降，有更多的肿瘤细胞凋亡，并且其侵袭能力也显著降低，因此METTL3可以作为肺癌病人的预后标志物。由此可见，RNA m6A甲基化修饰相关调控基因作为肿瘤诊断、预后和治疗的分子标志物具有巨大潜力。

目前，对肺腺癌患者的预后判定没有参考标准，也没有特异性的指标，远远不能适应对肺腺癌患者进行预后判定的需求。因此，对肺腺癌患者预后进行判定，以便选择最佳治疗方案，显著提高患者生存率，成为胸外科领域亟待解决的重要课题。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供METTL14基因作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用。

METTL14基因定位于染色体4q26，GeneBank登录号：KJ894454.1(METTL14基因序列见SEQ NO.1)。在前期研究工作中，发明人在肺腺癌组织中提取RNA，逆转录后进行实时荧光定量PCR分析METTL14基因的表达，发现：METTL14基因在肺腺癌组织中表达下调，与正常人肺组织中的表达差异显著(P<0.0001)(图1)。且METTL14基因表达水平不同的肺腺癌患者中预后存在明显差异，经Kaplan-Meier生存分析发现METTL14基因低表达的肺腺癌患者生存率明显低于高表达的患者(P＝0.0395)(图2)，比率风险模型预后分析发现METTL14基因的风险率>1(HR＝2.6300)，表明METTL14基因低表达的患者预后较高表达的患者预后差，METTL14基因的低表达是肺腺癌患者预后风险预测的独立危险因素。因此，METTL14基因能作为肺腺癌预后的判断标准，作为生物标志物用于制备肺腺癌患者的预后制剂，更进一步能够提供一种性价比高，易于推广应用的肺腺癌预后预测试剂盒。

所述肺腺癌预后检测试剂盒中包括METTL14基因实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物：5′-CTGAAAGTGCCGACAGCATTGG-3′(SEQ ID NO.2)；反向引物：5′-CTCTCCTTCATCCAGATACTTACG-3′(SEQ ID NO.3)。

优选地，所述试剂盒中还包括GAPDH内参实时荧光定量PCR特异性引物：正向引物：5′-GGTCGTATTGGGCGCCTGGTCACCAG-3′(SEQ ID NO.4)；反向引物：5′-GTGCCATGGAATTTGCCATGGGTGG-3′(SEQ ID NO.5)。

将METTL14基因用于肺腺癌患者预后的检测方法如下：(1)收集待测个体术后切除的肺腺癌组织，抽提总RNA；(2)以总RNA为模板将METTL14基因逆转录为cDNA；(3)用METTL14基因特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增，获得相对表达量2^ΔΔCT，当2^ΔΔCT>0.28时提示METTL14基因为高表达。

综上，利用本发明的检测制剂可以检测METTL14基因在肺腺癌患者中的表达水平，为肺腺癌患者预后预测提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

附图说明

图1为实时荧光定量PCR分析METTL14基因在肺腺癌组织与正常肺组织中的表达差异；

图2为METTL14基因与35例肺腺癌患者预后的关系。

具体实施方式

实施例1制备METTL14基因用于肺腺癌预后检测试剂盒(50次反应)

1.RNA稳定溶液50ml

2.异丙醇100ml

3.三氯甲烷100ml

4.Trizol 50ml

5.无酶水10ml

6. 1μM随机逆转录引物50ul

7. 5×逆转录缓冲液200ml

8. 10mM三磷酸碱基脱氧核苷酸100ul

9. 40U/μl RNA酶抑制剂500ul

10. 200U/μl MMLV逆转录酶50ul

11.Premix Ex Taq 50ul

12. 10μM METTL14基因实时荧光定量PCR特异性引物：

正向引物5′-CTGAAAGTGCCGACAGCATTGG-3′(SEQ ID NO.2)，

反向引物5′-CTCTCCTTCATCCAGATACTTACG-3′(SEQ ID NO.3)，

13. 10μM内参GAPDH实时荧光定量PCR特异性引物：

正向引物为5′-GGTCGTATTGGGCGCCTGGTCACCAG-3′(SEQ ID NO.4)，

反向引物为5′-GTGCCATGGAATTTGCCATGGGTGG-3′(SEQ ID NO.5)。

实施例2肺腺癌组织中METTL14基因检测

1、肺腺癌组织的保存：收集待测肺腺癌组织存放于盛有RNA稳定溶液的冻存管中，放至-80℃冰箱备用。

2、组织中RNA的抽提：取适量标本于经180℃烘烤6-8h后的研钵中加入液氮研磨标本，研磨至粉末状后于研钵中加入1ml Trizol研钵标本，研磨成液体状后用移至离心管管，加氯仿200μl/ml于离心管中，用手震荡15-30s，冰上放置5min，4℃12000g离心15min；小心取上层水相入新离心管中，加入预冷的异丙醇0.5ml混匀，-20℃冰箱静置20min，4℃12000g离心10min；弃上清，加入75％无核酶水稀释的乙醇1-2ml混匀，4℃7500g离心5min，尽量弃上清，室温干燥5-10min，加入无核酶水10-20μl溶解RNA。分光光度计测RNA的浓度及质量，OD260/280比值在1.8-2.0之间，-80℃保存。

3、METTL14基因转录：使用Thermo公司的逆转录试剂盒。20μL逆转录反应的体系如表1：

表1

成分	剂量/管
		随机逆转录引物(1uM)	1ul
RNA样本	2ug
		无核酶水	To 12ul

逆转录第一步条件：65℃5分钟，如表2：

表2

成分	剂量/管
		5×逆转录缓冲	4μl
三磷酸碱基脱氧核苷酸(10mM)	2μl
		RNA酶抑制剂(40U/μl)	1μl
MMLV逆转录酶(200U/μl)	1μl
		第一步PCR的产物	12μg

逆转录第二步程序：25℃5分钟，42℃60分钟，70℃5分钟。

4、METTL14基因特异性引物进行实时定量PCR：METTL14基因特异性引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

转录产物稀释5倍，混匀。20μL反应体系如表3：

表3

成分	剂量/管
		SYBR Premix Ex Taq	10μl
METTL14特异性引物(10μM)	0.5μl
		cDNA产物	1μl
无酶水	To 20μl

实时荧光定量PCR反应程序：95℃3分钟，40个循环，95℃10秒，60℃30秒。

METTL14基因特异性引物序列为：

正向引物5′-CTGAAAGTGCCGACAGCATTGG-3′(SEQ ID NO.2)，

反向引物5′-CTCTCCTTCATCCAGATACTTACG-3′(SEQ ID NO.3)，

5、-2^ΔΔCT指标的测定：本实验数据采用相对定量的分析方法，GAPDH作为内参基因，数据利用软件GraphPad Prism进行分析。分析发现，与METTL14基因正常肺组织中的表达相比，35例肺腺癌患者中METTL14基因表达明显下调，且有显著性差异(P<0.0001)。

6、预后判断

通过对实验所采用的35例肺腺癌患者或家属随访，我们详细询问了这些患者首次发病的时间，治疗情况，复发状况及死亡时间等，随访时间为1-60个月。在所选取的肺腺癌患者中，选取荧光定量PCR分析的表达值为参考标准，所得结果降序排列后高于中位数的为METTL14基因高表达，共18例，其他为METTL14基因低表达，共17例。经Kaplan-Meier生存分析，METTL14基因低表达患者的生存期较METTL14基因高表达的患者短，预后差。差异有统计学意义(P＝0.0395)。比率风险模型预后分析发现METTL14基因的风险率>1(HR＝2.6300)，表明METTL14基因低表达的患者预后较高表达的患者预后差，METTL14基因的低表达是肺腺癌患者预后风险预测的独立危险因素。

以上研究还表明，METTL14基因可作为肺腺癌患者预后的特异性分子标志物。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大学湘雅医院王敏

<120> METTL14基因作为生物标志物在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1371

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

atggatagcc gcttgcagga gatccgggag cggcagaagt tacggcgaca gctcctcgcg 60

cagcagttgg gagctgaaag tgccgacagc attggtgccg tgttaaatag caaagatgag 120

cagagagaaa ttgctgaaac aagagaaact tgcagggctt cctatgatac ctctgctcca 180

aatgcaaaac gtaagtatct ggatgaagga gagacagatg aagacaaaat ggaagaatat 240

aaggatgaac tagaaatgca acaggatgaa gaaaatttgc catatgaaga agagatttac 300

aaagattcta gtacttttct taagggaaca cagagcttaa atccccataa tgattactgc 360

caacattttg tagacactgg acatagacct cagaatttca tcagggatgt aggtttagct 420

gacagatttg aagaatatcc taaactgagg gagctcatca ggctaaagga tgagttaata 480

gctaaatcta acactcctcc catgtactta caagccgata tagaagcctt tgacatcaga 540

gaactaacac ccaaatttga tgtgattctt ctggaacccc ctttagaaga atattacaga 600

gaaactggca tcactgctaa tgaaaaatgc tggacttggg atgatattat gaagttagaa 660

attgatgaga ttgcagcacc tcgatcattt atttttctct ggtgtggttc tggggagggg 720

ttggaccttg gaagagtgtg tttacgaaaa tggggttaca gaagatgtga agatatttgt 780

tggattaaaa ccaataaaaa caatcctggg aagactaaga ctttagatcc aaaggctgtc 840

tttcagagaa caaaggaaca ctgcctcatg gggatcaaag gaactgtgaa gcgtagcaca 900

gacggggact tcattcatgc taatgttgac attgacttaa ttatcacaga agaacctgaa 960

attggcaata tagaaaaacc tgtagaaatt tttcatataa ttgagcattt ttgtcttggt 1020

agaagacgcc ttcatctatt tggaagagat agtacaattc gaccaggctg gctcacagtt 1080

ggaccaacgc ttacaaatag caactacaat gcagaaacat atgcatccta tttcagtgct 1140

cctaattcct acttgactgg ttgtacagaa gaaattgaga gacttcgacc aaaatcgcct 1200

cctcccaaat ctaaatctga ccgaggaggt ggagctccca gaggtggagg aagaggtgga 1260

acttctgctg gccgtggacg agaaagaaat agatctaact tccgaggaga aagaggtggc 1320

tttagagggg gccgtggagg agcacacaga ggtggctttc cacctcgata a 1371

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ctgaaagtgc cgacagcatt gg 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ctctccttca tccagatact tacg 24

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ggtcgtattg ggcgcctggt caccag 26

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gtgccatgga atttgccatg ggtgg 25

Claims

1.METTL14基因在制备肺腺癌预后检测制剂中的应用。

2.METTL14基因在制备肺腺癌预后检测试剂盒中的应用。