CN114317748A

CN114317748A - 一种基于ddPCR的AML微小残留病变监测方法、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN114317748A
Application number: CN202111630011.4A
Authority: CN
Inventors: 曹尚志; 李欣宇; 陈永玲; 卜范峰; 丁然; 吴炳耀; 任用; 李诗濛
Original assignee: Nanjing Xiansheng Diagnostic Technology Co ltd; Nanjing Xiansheng Medical Laboratory Co ltd; Jiangsu Xiansheng Medical Diagnosis Co ltd
Current assignee: Nanjing Xiansheng Diagnostic Technology Co ltd; Nanjing Xiansheng Medical Laboratory Co ltd; Jiangsu Xiansheng Medical Diagnosis Co ltd
Priority date: 2021-12-28
Filing date: 2021-12-28
Publication date: 2022-04-12
Anticipated expiration: 2041-12-28
Also published as: CN114317748B

Abstract

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于ddPCR的AML微小残留病变监测方法，试剂盒及其应用，可针对不同患者的FLT3‑ITD突变进行针对检测，检测灵敏度高，可检出低至1‑1000拷贝和10^‑5个细胞，检测特异性好，不能扩增野生型FLT3,但可检出不同患者的FLT3特异性突变，方法适用面更广，针对性更强。

Description

一种基于ddPCR的AML微小残留病变监测方法、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种基于微滴式数字PCR平台的急性髓系白血病AML微小残留病变监测方法及其应用。

背景技术

微小残留病变(minimal residual disease，MRD)是指血液系统肿瘤在接受治疗后获得组织形态学缓解，无临床症状但仍然存在在体内的亚显微镜病变，目前临床多用PCR和流式细胞仪进行检测。

急性髓细胞白血病(AML)是成人白血病中最大一个种类，约占50％-70％，是重要的致死性疾病。近年来随着治疗方法的不断改进，获得形态学缓解的患者比率越来越高，但大部分病人在获得缓解后仍然复发。了解获得显微镜下的形态学缓解患者体内是否存在肿瘤细胞，进而决定是否需要进一步治疗，是预防复发的关键步骤。然而，由于AML 的异质性，对于缓解期的AML患者进行MRD检测没有统一的方法。最常用的方法是利用 AML细胞中的融合基因进行检测。但所有融合基因(如PML-RARA,AML1-ETO)阳性的患者加在一起占AML的比率为30％，大多数AML没有特异性的融合基因。其它基因突变是否可以作为AML跟踪的标志一直存在争论，因为一些突变(如DNMT3A)在获得长期缓解的患者的骨髓细胞中仍然存在⁽⁹⁾。另外，做为MRD跟踪的标志也需在AML患者中有一定的阳性频率。至2016年后，FLT3被公认为少数几个可做为AML MRD跟踪的标志。因为它在AML患者肿瘤细胞中持续存在，且在长期缓解患者中检出率很低，FLT3突变阳性患者占到AML的30％，是AML中主要的基因突变形式。

FLT3基因编码一种调节造血功能的III类受体酪氨酸激酶，其在正常骨髓造血干/祖细胞中表达，调控早期造血。该受体是由与fms相关的酪氨酸激酶3配体结合到胞外区域激活的，它诱导血浆膜中的同质二聚体形成，导致受体的自磷酸化。激活的受体激酶随后磷酸化，激活与骨髓中造血细胞的细胞凋亡、增殖和分化相关的多个细胞质效应

需强调的是，FLT3/ITD突变插入的位点和重复序列通常是多种多样的，长度一般3- 400bp不等，每个患者都存在不同的突变，通常以三倍的倍数出现，保留了转录本的阅读框(ORF)，实践中，这种多样为突变检测带来了极大困难。

目前临床上有多种检测急性髓系白血病(AML)的方法，传统上，形态学完全缓解是急性白血病早期疗效评判的金标准，达到完全缓解的患者较未达完全缓解者有较高的治愈可能性。但事实上形态学检查的灵敏度较差，治疗后达完全缓解患者可能存在残留的形态学不可测的肿瘤细胞，残留的肿瘤细胞是引发疾病复发的“首要元凶”。因此采用灵敏度高、特异性强及温度可靠的实验方法对白血病患者进行定期MRD检测，对于评估疾病状态、诊断疗效、预测复发、指导治疗具有重要临床意义。常用的检测方法包括：流式细胞术(MCF)、RT-qPCR、二代测序技术等，而流式细胞术对送样要求非常严格需要新鲜样本及时检测，且需要经验丰富的技术人员；RT-qPCR峰值灵敏度为0.01％，即1万个正常细胞中有1个癌细胞，但在诊断出可检测到的疾病时，需要基线样品或先前样品的辅助来表征白血病克隆以进行MRD分析；同样二代测序技术检测成本高、周期长，又对实验操作及数据分析人员的技术要求门槛高。

综上，亟需一种灵敏度高、快速、易操作的检测方法，监测亚临床水平的白血病(即微小残留病变MRD)水平，为临床提供强有力的独立预后信息。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

针对上述现有技术问题，本发明是根据FLT3基因在AML患者中的不同突变形式及比例，通过设计专属特异性引物及探针，实现了AML微小残留病变的监测。

具体的，考虑到利用基因突变检测白血病治疗后有无MRD和检测初诊患者有无相关突变的不同点在于：MRD检测必须是突变高度特异，不能有野生型检出。因为在形态学缓解患者体内，大部分相关基因为野生型，只有极少数突变体的存在；如果方法同样可以检出野生型基因，那么PCR扩增后，野生型信号将会覆盖突变信号，从而影响结果判读。所以本发明设计针对突变型的特异引物，引物设计具体策略为：在突变下游的内含子区域设计一条公用下游引物，在下游引物前设计一条同向公用探针，在突变位置设计对患者特异突变型的特异性上游引物。另外，考虑到不同患者的FLT3-ITD 突变的插入序列均不相同，且插入位置不重合，每位患者均需对应各自的特异性引物。经多次测试，我们设计出一套适于不同突变患者设计不同特异性引物的方法，即选取FLT3-ITD突变插入位置的前19-23个碱基以及插入片段的前5-9个碱基作为患者的特异性引物。

当将上述方法放入一个PCR体系，在灵敏度不变的情况下它可以特异性扩增上述患者突变，实验证实该方法特异性良好，仅扩增目的片段。根据类推，这一方法也能扩增患者特异性FLT3-ITD突变，利用这种方法对至少10例患者的测试也达到满意的效果。

基于此，本发明提供了如下技术方案。

本发明提供一种用于检测白血病FLT3基因微小残留病变MRD的引物探针组，以缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明还提供一种用于检测白血病FLT3基因MRD的产品或试剂盒，所述产品或试剂盒包括用于检测突变位点的试剂和/或设备，以及上述的引物探针组，以缓解现有技术中缺少能够高灵敏、易操作且低成本的针对白血病FLT3基因MRD检测产品的技术问题。

本发明提供一种检测白血病FLT3基因MRD的方法，所述方法包括应用上述的引物探针组对待测样品基因组中突变位点的核苷酸进行检测，以缓解现有的检测方法灵敏度较低、操作繁琐、价格昂贵等技术问题。

具体的，本发明技术方案详述如下：

本发明首先提供一种用于检测白血病微小残留病变MRD的引物探针组，所述引物探针组中包含特异专属引物，所述特异专属引物为：包含FLT3-ITD突变型插入位置的前19-23个碱基，以及插入片段的前5-9个碱基；

优选的，所述特异专属引物长度为25-30bp。

进一步的，所述特异专属引物为包含FLT3-ITD突变型插入位置的前20个碱基，以及插入片段的前8个碱基；

优选的，所述特异专属引物长度为28bp。

进一步的，所述引物探针组还包括如下序列：

编号	引物名称	引物序列
			1	FLT3-探针	FAM-ctgcaaagacaaatggtgagtacgtg-MGB
2	FLT3引物(逆向)	AAGCACCTGATCCTAGTACCT
			3	FLT3引物(顺向)	特异专属引物
4	EFTUD2引物(顺向)	TGCCAGACACCAAAGGAAAAT
			5	EFTUD2引物(逆向)	TGAGAGGACACACGCAAAACC
6	EFTUD2-探针	VIC-CTCCAGGTAGGACATC-MGB

进一步的，所述特异专属引物包括SEQ ID NO.1-10所示引物的任一或多个或全部；优选的，为全部。

本发明还提供一种用于检测白血病微小残留病变MRD的产品或试剂盒，包含上述任一所述的引物探针组；

优选的，所述试剂盒为ddpcr试剂盒。

本发明还提供一种上述任一所述引物探针组在检测白血病微小残留病变MRD中的应用。

本发明还提供一种上述任一所述引物探针组在制备检测白血病微小残留病变MRD的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种检测白血病微小残留病变MRD的方法，所述方法包含利用上述任一所述的引物探针组，或上述的产品或试剂盒进行扩增检测步骤。

本发明还提供一种用于检测白血病微小残留病变MRD的引物探针组的设计方法，包括在FLT3-ITD突变下游的内含子区域设计一条公用下游引物，在下游引物前设计一条同向公用探针，在突变位置设计对患者特异突变型的特异性上游引物，所述特异性上游引物的设计包含突变型插入位置的前19-23个碱基，以及插入片段的前5-9个碱基。

进一步的，所述所述特异性上游引物的设计包含突变型插入位置的前20个碱基，以及插入位置后8个碱基，优选的每条特异性上游引物长度在28bp。

本发明的有益技术效果：

1)本发明具有精准治疗特点，可针对不同患者的FLT3-ITD突变进行针对检测，保证准确性和便捷性；

2)本发明检测灵敏度高，可检出低至1-1000拷贝和10^-5个细胞；

3)本发明检测特异性好，经设计优化的引物不能扩增野生型FLT3,但可检出不同患者的FLT3特异性突变。

4)本发明对复发患者的FLT3突变检测简捷方便，更对具有FLT3突变的白血病患者治疗后的微小残留病变跟踪具有明显优势。

5)考虑目前急性粒细胞性白血病(AML)没有统一的微小残留病变跟踪方法，常见的利用融合基因跟踪方法，每种融合基因只能跟踪最多10％AML患者，而FLT3突变阳性患者占AML的30％。因此，本方法适用面更广，针对性更强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的，阳性样本的24+4bp专属引物的FLT3基因ddpcr检测结果图；

图2为本发明实施例1提供的，阴性参考品的24+4bp专属引物的FLT3基因ddpcr 检测结果图；

图3为本发明实施例1提供的，阳性样本的20+8bp专属引物的FLT3基因ddpcr检测结果图；

图4为本发明实施例1提供的，阴性参考品的20+8bp专属引物的FLT3基因ddpcr 检测结果图；

图5为本发明实施例1提供的，阳性样本的18+10bp专属引物的FLT3基因ddpcr 检测结果图；

图6为本发明实施例1提供的，阴性参考品的18+10bp专属引物的FLT3基因ddpcr检测结果图；

图7为本发明实施例2提供的，质控精密度实验阴性参考品的FLT3基因ddpcr检测结果图；

图8为本发明实施例2提供的，质控精密度实验阳性参考品的FLT3基因ddpcr检测结果图；

图9为本发明实施例2提供的，质控精密度实验阴性参考品的一代测序峰图；

图10 FLT3-P-1一代测序正向峰图；

图11 FLT3-P-1一代测序反向峰图；

图12 FLT3-P-2一代测序正向峰图；

图13 FLT3-P-2一代测序反向峰图；

图14 FLT3-P-3一代测序正向峰图；

图15 FLT3-P-3一代测序反向峰图；

图16 FLT3-P-4一代测序正向峰图；

图17 FLT3-P-4一代测序反向峰图；

图18 FLT3-P-5一代测序正向峰图；

图19 FLT3-P-5一代测序反向峰图；

图20 FLT3-P-6一代测序正向峰图；

图21 FLT3-P-6一代测序反向峰图；

图22 FLT3-P-7一代测序正向峰图；

图23 FLT3-P-7一代测序反向峰图；

图24 FLT3-P-8一代测序正向峰图；

图25 FLT3-P-8一代测序反向峰图；

图26 FLT3-P-9一代测序正向峰图；

图27 FLT3-P-9一代测序反向峰图；

图28 FLT3-P-10一代测序正向峰图；

图29 FLT3-P-10一代测序反向峰图；

图30 FLT3-P-1ddpcr检测结果图；

图31 FLT3-P-2ddpcr检测结果图；

图32 FLT3-P-3ddpcr检测结果图；

图33 FLT3-P-4ddpcr检测结果图；

图34 FLT3-P-5ddpcr检测结果图；

图35 FLT3-P-6ddpcr检测结果图；

图36 FLT3-P-7ddpcr检测结果图；

图37 FLT3-P-8ddpcr检测结果图；

图38 FLT3-P-9ddpcr检测结果图；

图39 FLT3-P-10ddpcr检测结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。

除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由… 组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

本发明实施例中用到的主要试剂耗材信息如下表：

本发明实施例中用到的主要仪器信息如下：

实验例1、引物的设计及反应体系建立

本发明拟解决的问题是检测白血病治疗后有无微小残留病变MRD，这个传统检测初诊患者有无相关突变的难度不同：MRD检测必须是突变高度特异，不能有野生型检出，因为在形态学缓解患者体内，大部分相关基因为野生型，只有极少数突变体的存在；如果方法同样可以检出野生型基因，那么PCR扩增后，野生型信号将会覆盖突变信号，从而影响结果判读。因此本发明的引物设计难度要显著高于传统突变检测。

本发明针对FLT3基因突变的复杂性，前期预试验进行了引物设计策略的选取，为确立本发明MRD检测的引物设计策略，进行了如下考量和设计：

1.考虑到FLT3突变的复杂性，特将FLT3-ITD突变检测设置为：在突变下游的内含子区域设计一条公用下游引物，在下游引物前设计一条同向公用探针，在突变位置设计对患者特异突变型的特异性上游引物，通过引物特异性检测不同患者的FLT3-ITD突变，这种设计也可极大的降低了检测成本；

2.考虑到FLT3突变的多变性，每个患者突变情况均不同，患者专属引物需要极高特异性，专属引物应尽量更长；另外，考量到引物退火温度问题，最终设计专属引物长度应在25-30bp内；

3.考虑到FLT3突变的特殊性，即插入序列与FLT3原始序列相同，专属引物覆盖插入片段的范围需经试验效果验证和优化确立；本发明确定专属引物的设计为包含突变型插入位置的前19-23个碱基，以及插入片段的前5-9个碱基，并保证每条特异性上游引物长度在25-30bp，优选28bp左右。

4.本申请同时以EFTUD基因引物作为内参设计。

本实施例具体设计优化过程如下：

设计了非专属引物和专属引物体系，其中专属引物设计诸如24+4bp，22+5bp， 20+8bp,20+9bp，18+10bp等不同长度和覆盖的形式，最后经ddpcr检测验证。

编号	引物名称	非专属引物序列
			1	FLT3-探针	FAM-ctgcaaagacaaatggtgagtacgtg-MGB
2	FLT3引物(逆向)	AAGCACCTGATCCTAGTACCT
			3	EFTUD2引物(顺向)	TGCCAGACACCAAAGGAAAAT
4	EFTUD2引物(逆向)	TGAGAGGACACACGCAAAACC
			5	EFTUD2-探针	VIC-CTCCAGGTAGGACATC-MGB
编号	引物名称	专属引物序列
			6	FLT3-ITD-24+4	TTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTTGATGA
7	FLT3-ITD-22+5	CCAAGAGAAAATTTAGAGTTTGATGAT
			8	FLT3-ITD-20+8	AAGAGAAAATTTAGAGTTTGATGATCTC
9	FLT3-ITD-20+9	AAGAGAAAATTTAGAGTTTGATGATCTCA
			10	FLT3-ITD-18+10	GAGAAAATTTAGAGTTTGATGATCTCAA

详细试验步骤如下：

(1)将白细胞DNA样本稀释至20ng/μL，按下表配制PCR反应MIX；

vortex混匀30秒，4000rpm离心1分钟；

(2)微滴制备：

1)将DG8 cartridge放置于底座上，将配制好的20μL体系加入到DG8 cartridge中间一排孔内。

2)在DG8 cartridge最底一排8个孔中各加入70μL微滴生成油。加样本及微滴生成油时都要避免产生气泡。

3)盖上密封垫，将DG8 cartridge及底座轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴。运行指示灯常绿时，微滴生成结束。

4)微滴生成于DG8 cartridge最上面一排孔内，转移40μL生成的微滴到96孔板中。

5)打开PCR热封仪，设置温度为180℃，预热。微滴转入96孔板内后，用foil seal封板膜覆盖在96孔板上，红线为正面。然后放入预热好的PCR热封仪中进行封膜，运行程序为：180℃，5s，检查是否封膜完好。

(3)PCR反应：

封好膜后在30分钟内进行PCR反应，或者放于2-8℃冰箱4小时之内进行PCR 反应，程序如下表(注意升降温速度需≤2.5℃/s)：

PCR反应程序

(4)微滴读取：

使用Droplet Reader读取微滴数据。

(5)结果分析：

查看每个样本成功上样的微滴数需保持在10000以上。查看散点图，散点图明确的分为四个象限：灰色-野生型模板，单一VIC；灰色-无模板，单一ROX；灰色-突变型模板，单一FAM；灰色-野生型模板+突变型模板，FAM+VIC。Channe11和Channel2阈值参照阴阳对照以实际实验所得阈值为准，若有偏离进行手动设置；若有明显偏离阈值的点，可通过套索工具进行微调。

示例性的，部分ddpcr检测结果，如组6、8、10，分别代表24+4bp，20+8bp,18+10bp组，参见图1-6。由图1-6的ddpcr检测结果比较，可以明显看出，24+4bp与 18+10bp阴性结果均存在非特异性扩增，而20+8bp组无非特异性扩增现象，20+8bp明显优于24+4bp与18+10bp；实验组7、9效果与组8效果类似，无非特异性扩增现象，整体上组8效果最优。上述结果表明，专属引物序列在插入位点前的序列长度以及插入序列覆盖度上，都影响着检测的特异性和准确性，这可能与FTL3的特定插入形式密切相关。综上，本发明确立专属引物的设计为包含突变型插入位置的前19-23个碱基，和插入片段自身的前5-9个碱基，并保证每条特异性上游引物长度在28个bp左右。

实施例2临床样本检测和反应体系验证

本发明在体系优化过程中，使用100个样本进行Sanger测序的验证，经比对结果都一致，确认本发明检测的结果准确无误。本发明在确认最优反应体系后又进行了一系列的验证实验，包括准确性、精密度以及人员比对和不同批次引物间的比对实验。具体的验证方案如下：

(1)准确性实验验证方案：使用10例临床样本来完成准确性实验，比对sanger测序与ddpcr的结果，一致性100％则验证通过。

(2)精密度实验验证方案：由于使用细胞系作为阴阳性对照，特对阴阳质控进行精密度验证。

质控精密度：阴阳质控重复检测20次；

批内精密度：4例样本同一批次重复5次，比较批内精密度；

结果一致性100％，质控精密度和批内精密度的一致性大于95％则验证通过。

(3)人员比对实验验证方案：2位操作者检测同样样本，比较人员间结果的差异，一致性大于95％则验证通过。

具体的验证过程如下：

首先按照本发明实施例1提供的体系加量表配制PCR反应MIX，然后按照实施例1中的操作步骤，进行PCR扩增和ddPCR上机分析等步骤后进行结果分析。准确性和精密度结果见下表1、表2和表3，准确性一代测序结果互见附录图10-29，ddpcr检测结果图见附录图30-39，质控精密度中质控一代测序结果及ddpcr结果，见图9-10。

表1、准确性验证样本信息及验证结果

经10例样本的ddPCR结果和Sanger结果的比对可知，本发明的体系验证实验的准确性为100％。

表2、质控精密度实验结果

表3、精密度、人员比对结果

经4例样本的5个批次的检测结果比对，可知本发明的体系的质控精密度、批内精密度以及人员间比对的一致性均为100％。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims

1.一种用于检测白血病微小残留病变MRD的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组中包含特异专属引物，所述特异专属引物为：包含FLT3-ITD突变型插入位置的前19-23个碱基，以及插入片段的前5-9个碱基；优选的，所述特异专属引物长度为25-30bp。

2.权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述特异专属引物为包含FLT3-ITD突变型插入位置的前20个碱基，以及插入片段的前8个碱基；优选的，所述特异专属引物长度为28bp。

3.权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括如下序列：

编号引物名称引物序列 1 FLT3-探针 FAM-ctgcaaagacaaatggtgagtacgtg-MGB 2 FLT3引物(逆向) AAGCACCTGATCCTAGTACCT 3 FLT3引物(顺向) 特异专属引物 4 EFTUD2引物(顺向) TGCCAGACACCAAAGGAAAAT 5 EFTUD2引物(逆向) TGAGAGGACACACGCAAAACC 6 EFTUD2-探针 VIC-CTCCAGGTAGGACATC-MGB

4.权利要求3所述的引物探针组，其特征在于，所述特异专属引物包括如SEQ ID NO.1-10所示引物的任一或多个或全部。

5.一种用于检测白血病微小残留病变MRD的产品或试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-4任一所述的引物探针组；优选的，所述试剂盒为ddpcr试剂盒。

6.权利要求1-4任一所述引物探针组在检测白血病微小残留病变MRD中的应用。

7.权利要求1-4任一所述引物探针组在制备检测白血病微小残留病变MRD的试剂盒中的应用。

8.一种检测白血病微小残留病变MRD的方法，其特征在于，所述方法包含利用权利要求1-4任一所述的引物探针组，或权利要求5所述的产品或试剂盒进行扩增检测步骤。

9.一种用于检测白血病微小残留病变MRD的引物探针组的设计方法，其特征在于，在FLT3-ITD突变下游的内含子区域设计一条公用下游引物，在下游引物前设计一条同向公用探针，在突变位置设计对患者特异突变型的特异性上游引物，所述特异性上游引物的设计包含突变型插入位置的前19-23个碱基，以及插入片段的前5-9个碱基。

10.权利要求8所述的设计方法，其特征在于，所述所述特异性上游引物的设计包含突变型插入位置的前20个碱基，以及插入位置后8个碱基，每条特异性上游引物长度在28bp。