CN116656790A - 一种定量检测flt3基因表达的引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量检测FLT3基因表达的引物组、试剂盒及检测方法，包括针对FLT3基因的特异性引物对和探针，所述的特异性引物对由上游引物FLT3‑mF和下游引物FLT3‑mR组成；还包括针对内参基因ABL1设计的特异性引物对和探针，所述的特异性引物对由上游引物ABL1‑F和下游引物ABL1‑R组成；本发明基于实时荧光定量PCR技术，根据所提供的的引物组和探针，可以用于定量检测FLT3基因表达水平，从而用于肿瘤患者的辅助诊断，具有操作简单、成本低、检测周期短的优点。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体为一种定量检测FLT3基因表达的引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术
FLT3基因又称FLK2或STK1,位于染色体13q12.2，与干细胞生长因子受体C-kit、巨噬细胞集落刺激因子受体C-fins及血小板衍化生长因子受体PDGFR同属第3组酪氨酶激酶受体家族。FLT3(FMS样酪氨酸激酶3)基因所编码一种调节造血的III类受体酪氨酸激酶的蛋白，激活的受体激酶磷酸化激活多个信号通路，包括细胞凋亡、增殖及骨髓造血细胞的分化。
FLT3的突变或者高表达可能会造成该蛋白的持续激活，从而导致急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病，据有关研究结果表明FLT3的过表达是白血病的一个潜在危险因素。FLT3突变可能会增加其表达，该突变主要发生在FLT3基因13-15号外显子区域，而重排断裂末端位置主要位于在14号外显子上，插入的重复突变序列长度可以从几bp到几百bp，是激活突变最常见的类型。
目前国内外针对FLT3基因表达量主要为转录组测序(RNA-seq)，根据FPKM和TPM值的高低判断基因的表达水平；目前基于illumina测序平台为代表的第二代高通量测序技术的基因表达分析存在步骤多、成本高、操作过程繁琐，检测周期长等缺点。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是在标准PCR技术基础上演变而成，常用于定量样本中的DNA或RNA。利用序列特异性引物，可测定特定的DNA或RNA序列的拷贝数。通过检测PCR循环的每个阶段中扩增产物的量实现定量。如果样本中存在高丰度的特定序列(DNA或RNA)，则在早期循环中即可观察到扩增；如果序列较少，则在晚期循环中方可观察到扩增。利用荧光探针或荧光DNA结合染料，采用实时荧光定量PCR仪检测荧光并完成PCR反应所需的热循环，实现扩增产物的定量。因此，较为适合用于骨髓中FLT3基因表达量并在化疗过程中实时监测FLT3基因表达量对患者的危险度分层、预后评估以及个体化治疗方案的选择可能具有重要的指导价值。
发明内容
本发明的第一目的在于提供了一种定量检测FLT3基因表达的引物组，
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种定量检测FLT3基因表达的引物组，包括特异性引物对和探针，所述的特异性引物对由上游引物FLT3-mF和下游引物FLT3-mR组成；
其中FLT3-mF：5’-TTTGGACAGTGGGTGTCGAG-3
FLT3-mR：5’-TTGGATGAAAGGGAAGGGGC-3’
所述探针为FLT3-mP：5’FAM-TCGTCTCACAAGATGTGCCA-3’TAMRA。
还包括针对内参基因ABL1设计的特异性引物对和探针，所述的特异性引物对由上游引物ABL1-F和下游引物ABL1-R组成；
其中ABL1-F：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’
ABL1-R：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’
所述探针ABL1-P：5’FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-3’TAMRA。
优选的，所述FLT3基因的特异性引物及探针，以及内参基因ABL1的特异性引物及探针以混合液的形式存在，所述FLT3基因的探针和内参基因ABL1的探针连接荧光标记基团。
本发明的第二目的是提供了一种定量检测FLT3基因表达的试剂盒，包括上述引物组。
本发明的第三目的是提供了一种定量检测FLT3基因表达的方法，包括以下步骤：
S1：采用试剂盒对待测样本的总RNA进行提取；
S2：对S1中提取的总RNA进行逆转录获得cDNA；
S3:将FLT3基因插入pUC57-T质粒的EcoRV酶切位点间得到含有FLT3基因片段的阳性对照质粒；将ABL1基因插入pUC57-T质粒的EcoRV酶切位点间得到含有ABL1基因片段的内参对照质粒；以pUC57-T作为阴性对照质粒；
S4：以S2中所得cDNA为模板，对上游引物FLT3-mF、下游引物FLT3-mR和探针FLT3-mP进行PCR扩增，获得FLT3基因的PCR产物；以S2中所得cDNA为模板，对上游引物ABL1-F、下游引物ABL1-R和探针ABL1-P进行PCR扩增，获得内参基因ABL1的PCR产物；
S5：以Ct值为X轴，荧光信号强度为Y轴，制作在不同浓度下的标准品的扩增曲线，对实验可行性进行分析：即当相关系数R2越接近1，结果可信度越高；
S6：用内参基因ABL1的不同浓度标准品作标准曲线，通过线性拟合得到各样本FLT3基因和ABL1基因的拷贝数，以FLT3基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值表示FLT3基因的相对表达水平。
优选的，S4中PCR反应体系为20μL：反应预混液10μL、上游引物1μL、下游引物μL、探针0.4μL、cDNA模板3μL、无核酸酶水补足至20μL。
优选的，S4所述的PCR扩增程序为：50℃反应2min；95℃反应10S；95℃反应15S；60℃反应1min。
优选的，S4中每批PCR扩增结果分析阈值为0.1。
优选的，S5中FLT3及ABL1基因标准曲线均包含标准品(3×107～3×102)6个log范围。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明基于实时荧光定量PCR技术，根据所提供的的引物组和探针，可以用于定量检测FLT3基因表达水平，从而用于肿瘤患者的辅助诊断，操作简单、成本低、检测周期短。
2、本发明基于FLT3-ITD基因突变的序列，设计并优选确定了能够全面覆盖该位点的引物组和探针，特异性强、覆盖面广、检测结果更加准确。
3、本发明用FLT3目标基因序列和ABL1内参基因序列的引物进行扩增，根据拷贝数对RQ—PCR实验进行可行性分析，通过拟合标准曲线，证明了CT值与标准品cDNA的log值线性相关，因此RQ—PCR定量这种mRNA的方法可靠。
附图说明
图1为实施例1的引物组下FLT3基因扩增图谱；
图2为实施例2的引物组下FLT3基因扩增图谱；
图3为本发明标准品进行PCR绘制的扩增曲线；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、总RNA的提取：
用QIAsymphony RNA Kit试剂盒(购自QIANGEN公司)参照说明书在PCR实验室提取总RNA。待测样本包括但不限于急性髓系白血病患者(AML)或骨髓增生异常综合征(MDS)患者的骨髓或外周血临床样本、AML或MDS靶向药物筛选模型细胞样本。
二、cDNA的合成:
用LF酶05高效转录酶(厦门致善生命科学有限公司)依照说明书操作，包括以下步骤：
1、配制高效转录酶混合物和反应体系，待检样本总RNA加入量应在0.1ug-1ug之间，具体比例如下。
| 试剂 | 体积(μL) |
| LF RT反应液05 | 8.5 |
| LF RT酶混合液05 | 1.5 |
| 总RNA | 10 |
2、向分装好的PCR反应管中加入10μL稀释后的RNA。
3、盖好管盖后，震荡混匀，短暂离心，转移至RNA逆转录区。
4、置PCR管放于PCR仪上，反应程序设置如下：
三：引物探针设计
针对人白血病FLT3基因(NCBI基因库序列号：NM_004119.3)表达量检测的引物探针组合，序列如下：
上游引物FLT3-mF：5’-TTTGGACAGTGGGTGTCGAG-3
下游引物FLT3-mR：5’-TTGGATGAAAGGGAAGGGGC-3’
探针FLT3-mP：5’FAM-TCGTCTCACAAGATGTGCCA-3’TAMRA。
针对内参基因ABL1设计的特异性引物探针组合，序列如下：
上游引物ABL1-F：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’
下游引物ABL1-R：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’
探针ABL1-P：5’FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-3’TAMRA。
优选的，所述FLT3基因的特异性引物及探针，以及内参基因ABL1的特异性引物及探针以混合液的形式存在，所述FLT3基因的探针和内参基因ABL1的探针连接荧光标记基团。
三、质粒制备
1、将FLT3基因插入pUC57-T质粒的EcoRV酶切位点间得到含有FLT3基因片段的阳性对照质粒；
2、将ABL1基因插入pUC57-T质粒的EcoRV酶切位点间得到含有ABL1基因片段的内参对照质粒；
3、以pUC57-T作为阴性对照质粒。
四、PCR定量扩增
以cDNA为模板，对上游引物FLT3-mF、下游引物FLT3-mR和探针FLT3-mP进行PCR扩增，获得FLT3基因的PCR产物；以cDNA为模板，对上游引物ABL1-F、下游引物ABL1-R和探针ABL1-P进行PCR扩增，获得内参基因ABL1的PCR产物。实验在荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司-ABI 7500型)上进行RQ-PCR，分析每批RQ-PCR结果时阈值均固定为0.1。
具体步骤如下：
1、准备若干PCR反应管，将适当比例的原料试剂取出平衡至室温；
2、反应体系的配比如下：
| 试剂名称 | 每管加入体积(μL) |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | 10 |
| 无DNase/RNase PCR级水 | 4.6 |
| Former Primer | 1 |
| Reverse Primer | 1 |
| Probe | 0.4 |
| 总共 | 17 |
3、向分装好的PCR反应管中加入3μL cDNA模板，包括阳性对照质粒、内参对照质粒、阴性对照质粒及各样本。
4、PCR扩增(实时荧光定量PCR)
将PCR管放于ABI 7500荧光定量PCR仪上，反应程序设置如下：
实施例2
与实施例1的差别之处在于：
针对人白血病FLT3基因(NCBI基因库序列号：NM_004119.3)表达量检测的引物探针组合，序列如下：
上游引物FLT3-mF：5’-AAACCTCAAGTGCTCGCAGA-3
下游引物FLT3-mR：5’-GAGTACTGCTCGACACCCAC-3’
探针FLT3-mP：5’FAM-GAAGGGGCCTGGAGAGTTTA-3’TAMRA。
其他步骤与实施例1相同。
试验例1
分别对实施例1和实施例2两组不同的引物对进行PCR扩增，得到两组不同引物组下FLT3基因扩增图谱，参照图1和图2。
其中图1为4例相同样本(TR1-TR4)使用引物对1实验后的FLT3基因扩增图谱，图2为使用实施例2实验后的FLT3基因扩增图谱。由图1和图2可知：图1的扩增曲线明显光滑、曲线清晰、信号值高，由此可看出图1的扩增效率明显优于图2。故选用引物对1进行后续实验，该组引物位于FLT3基因内含子序列，覆盖了FLT3-ITD基因突变的全部热点区域。
试验例2可信性分析
每个样品用FLT3目标基因序列以及ABL1内参基因序列的引物进行扩增，根据拷贝数分析RQ—PCR实验可信性。其中阈值循环数Ct值(Cycle threshold)为每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。Ct值与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始模板浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。
以Ct值为X轴，荧光信号强度为Y轴，在3×107拷贝、3×106拷贝、3×105拷贝、3×104拷贝、3×103拷贝、3×102拷贝6个不同浓度下绘制标准品的扩增曲线如图3所示。
试验例3结果分析
以参考基因ABL1的6个不同浓度标准品分别为3×107拷贝、3
×106拷贝、3×105拷贝、3×104拷贝、3×103拷贝、3×102拷贝作标准曲线，根据线性拟合方程得到各样本FLT3基因和ABL1基因的拷贝数。
下述编号为不同样本采集后所得数据结果见表1：其中每组样本编号的上行为FLT3基因拷贝数，下行为ABL1基因的拷贝数。以FLT3基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值表示FLT3基因的相对表达水平(％)，阈值水平设置为0.1。
表1：
由表1可知，样本编号为R1-R7共7例患者数据结果比值明显上调，证明R1-R7共7例患者经RNAseq分析为FLT3 mRNA表达上调的患者，与本次检测相对定量百分比的结果一致，证明该试验方法可靠；G1-G12为正常供者骨髓扩增数据，由表1数据可知FLT3基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值均在正常数据范围内。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
Claims (9)
1.一种定量检测FLT3基因表达的引物组，其特征在于：包括特异性引物对和探针，所述的特异性引物对由上游引物FLT3-mF和下游引物FLT3-mR组成；
其中FLT3-mF：5’-TTTGGACAGTGGGTGTCGAG-3
FLT3-mR：5’-TTGGATGAAAGGGAAGGGGC-3’
所述探针为FLT3-mP：5’FAM-TCGTCTCACAAGATGTGCCA-3’TAMRA。
2.根据权利要求1所述的定量检测FLT3基因表达的引物组，其特征在于：还包括针对内参基因ABL1设计的特异性引物对和探针，所述的特异性引物对由上游引物ABL1-F和下游引物ABL1-R组成；
其中ABL1-F：5’-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3’
ABL1-R：5’-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3’
所述探针ABL1-P：5’FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-3’TAMRA。
3.根据权利要求1或2所述的定量检测FLT3基因表达的引物组，其特征在于：所述FLT3基因的特异性引物及探针，以及内参基因ABL1的特异性引物及探针以混合液的形式存在，所述FLT3基因的探针和内参基因ABL1的探针连接荧光标记基团。
4.一种定量检测FLT3基因表达的试剂盒，其特征在于：包括权利要求3所述的引物组。
5.一种定量检测FLT3基因表达的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：采用试剂盒对待测样本的总RNA进行提取；
S2：对S1中提取的总RNA进行逆转录获得cDNA；
S3:将FLT3基因插入pUC57-T质粒的EcoRV酶切位点间得到含有FLT3基因片段的阳性对照质粒；将ABL1基因插入pUC57-T质粒的EcoRV酶切位点间得到含有ABL1基因片段的内参对照质粒；以pUC57-T作为阴性对照质粒；
S4：以S2中所得cDNA为模板，对上游引物FLT3-mF、下游引物FLT3-mR和探针FLT3-mP进行PCR扩增，获得FLT3基因的PCR产物；以S2中所得cDNA为模板，对上游引物ABL1-F、下游引物ABL1-R和探针ABL1-P进行PCR扩增，获得内参基因ABL1的PCR产物；
S5：以Ct值为X轴，荧光信号强度为Y轴，制作在不同浓度下的标准品的扩增曲线，对实验可行性进行分析；
S6：用内参基因ABL1的不同浓度标准品作标准曲线，通过线性拟合得到各样本FLT3基因和ABL1基因的拷贝数，以FLT3基因的拷贝数与ABL1基因的拷贝数的比值表示FLT3基因的相对表达水平。
6.根据权利要求5所述的定量检测FLT3基因表达的方法，其特征在于：S4中PCR反应体系为20μL：其中反应预混液10μL、上游引物1μL、下游引物μL、探针0.4μL、cDNA模板3μL、无核酸酶水补足至20μL。
7.根据权利要求5所述的定量检测FLT3基因表达的方法，其特征在于：S4所述的PCR扩增程序为：50℃反应2min；95℃反应10S；在95℃反应15S；60℃反应1min条件下进行40个循环，在PCR循环第二步时收集荧光信号。
8.根据权利要求4所述的定量检测FLT3基因表达的方法，其特征在于：S4中每批PCR扩增结果分析阈值为0.1。
9.根据权利要求4所述的定量检测FLT3基因表达的方法，其特征在于：S5中FLT3及ABL1基因标准曲线均包含标准品(3×107～3×102)6个log范围。
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