JP4196592B2 - 免疫系細胞吸着材料およびそれを用いた体外循環用カラムおよび免疫系細胞の除去方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｔｈ２細胞吸着材料およびそれを用いたＴｈ２細胞吸着カラムに関する。特にヒト血液中のＴｈ２細胞を吸着除去する事により、アレルギーによる炎症、アトピー性疾患、喘息あるいは全身性エリテマトーデス、腫瘍等の病態を改善させる用途に好適に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
免疫系細胞は液性因子であるサイトカインの産生を介して免疫応答を始めとする種々の生体応答を調節していることが知られている。ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞はサイトカインの産生パターンの違いにより少なくとも２種類の亜集団、Ｔヘルパータイプ１（以下、Ｔｈ１と呼ぶ。）とＴヘルパータイプ２（以下、Ｔｈ２と呼ぶ。）とに分類される。インターフェロンガンマを産生するＴｈ１細胞は主として遅延型過敏症や炎症反応等の細胞性免疫応答を担っており、細菌やウイルス等の細胞内病原体に対する感染免疫応答に重要な役割を果たしていると考えられている。一方、ＩＬ−４を産生するＴｈ２細胞はＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させることにより体液性免疫応答を誘導したり好酸球の増殖・機能発現を調節しており、寄生虫等の細胞外病原体に対する防御反応に関与しているものと考えられている。Ｔｈ１やＴｈ２細胞から分泌されるサイトカインはそれぞれ他方のＴ細胞亜集団の機能をお互いに制御していることから、Ｔｈ１及びＴｈ２サイトカインを中心にした種々の免疫応答の調節機構に関する研究がめざましく展開され、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが免疫調節の中枢として位置づけられている。このＴｈ１／Ｔｈ２バランスはアレルギー、癌、感染症、自己免疫疾患など多くの分野において発症の原因を考えるうえで重要な因子である。
【０００３】
Ｔｈ１、Ｔｈ２への分化のメカニズムは、複雑であるために、その全貌が明らかにされていないが、ヘルパーＴ細胞によって調節されるＴｈ１／Ｔｈ２破綻は、多くの免疫病発症の原因になっていると考えられている。Ｔｈ１に偏向した場合は、細胞性免疫増強により癌や感染症に対する免疫応答が高まるが、同時に自己組織障害性も高まり、臓器特異性の自己免疫疾患の原因となる。このようなＴｈ１主導の免疫病としては、糖尿病、肝障害、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、潰瘍性大腸炎、あるいは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などがあげられる。一方Ｔｈ２に偏向した場合は、ＴＧＦβやＩＬ−１０、４の過剰産生により、細胞性免疫の低下を引き起こし、結果として感染症に対する感受性が高まり、自己抗体の過剰産生および全身性の免疫疾患の発症につながる。このＴｈ２によって産生されるＩＬ−４はＩｇＥクラススイッチに不可欠である。このようなＴｈ２主導免疫の過剰増強はアレルギー発症原因になると考えられている。また、Ｔｈ２から産生されるＩＬ−５は好酸球を炎症部位に誘導し、さらに好酸球を刺激し活性化することによって炎症を引き起こすと考えられている。
【０００４】
Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞はサイトカイン産生パターンで分類されているが、Ｔｈ２に特異的に発現している細胞表面抗原としてはＣＣケモカインレセプター４（以下、ＣＣＲ４と呼ぶ。）、chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on Th2 cells(以下、CRTH2と呼ぶ。)、ST2L 、ＣＣＲ８などが報告されている。ＣＣＲ４はＴｈ１細胞には発現されず、Ｔｈ２細胞のみに発現すると報告されている（ J.Immunol.161,5111-5115,1998）。またアトピー性皮膚炎患者の末梢血ヘルパ−Ｔ細胞にはＣＣＲ４が発現しているという報告がある（J.Leukoc. Biol.Vol.68,568-574,2000）。これらの事実からＣＣＲ４を指標にＴｈ２細胞を吸着除去することにより、アレルギー性の炎症、アトピー性疾患、喘息等の病態を改善できることが示唆される。CRTH2はEur.J.Immunol.30,2972-2979,2000にST2LはJ.Exp.Med.Vol.187,No.5,787-794,1998にＴｈ２細胞に特異的に発現していることが示されている。
【０００５】
上記の知見からＣＣＲ４発現細胞（遺伝子組み換えによりＣＣＲ４遺伝子を挿入した細胞）が吸着する材料はＴｈ２細胞を吸着することが示唆される。
【０００６】
これまでは特開平1-332594に示されているように、ＣＤ４陽性細胞（ヘルパーＴ細胞）を吸着する方法は示されていたが、さらに分類されるサブクラスであるＴｈ２を特異的に吸着することはできなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はＴヘルパー細胞のバランスがＴｈ２細胞に傾いたことによって引き起こされる疾患患者血液から特異的にＴｈ２細胞を吸着するための材料、およびそれを用いた吸着カラムを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、Ｔｈ２細胞の表面抗原と親和性を有する物質が水不溶性担体に固定化されてなるＴｈ２細胞吸着材料である。
【０００９】
また本発明は、上記の材料を内蔵してなる体外循環用カラムである。
【００１０】
また本発明は、上記のカラムに血液を通過させてＴｈ２細胞を吸着する、免疫系細胞の除去方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明においては、Ｔｈ２細胞を吸着し得る材料を提供することができる。
【００１２】
本発明においては、Ｔｈ２細胞表面抗原としてはＣＣＲ４、ＣＲＴＨ２、ＳＴ２Ｌなどが用いられる。
本発明においてＴｈ２細胞表面抗原と親和性を有する物質としては抗体、ポリペプチド、多糖類、核酸等をいい、具体的には、抗体は抗ＣＣＲ４ポリクローナル抗体、抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体などが用いられ、ポリペプチドとしては３０アミノ酸以下が好ましく、特に１５から３０アミノ酸が好適に用いられる。
【００１３】
本発明に用いられる不溶性担体の材料は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリ（芳香族ビニル化合物）、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリテトラフルオロエチレンなどの合成高分子や、セルロース、コラーゲン、キチン、キトサン、デキストランおよびそれらの誘導体を含む天然高分子、などが好適に用いられる。さらに、金属、セラミックス、ガラスなどの無機材料を適当な高分子で被覆したり、表面を直接修飾したものも好適に用いられる。
【００１４】
本発明の材料の形状は、繊維状、中空糸状、ビーズ状、平膜状、粉状などを用いることができるが、繊維状、中空糸状あるいはビーズ状のものが好ましく用いられる。吸着率を上げるには、接触面積の大きい材料が好ましい。繊維状の場合は２０μｍ以下が好ましく、特に１０μｍ以下が好適に用いられる。また、ビーズとしては、カラムに充填した際の圧損が少なくかつ表面積の大きいものが良いので、粒径が５０〜１０００μｍのものが好ましく、２００〜７００μｍのものがさらに好ましい。
【００１５】
繊維状材料の成分としては、特に限定されるものではないが、ポリスチレン繊維、架橋ポリスチレン繊維、アクリル酸・アクリロニトリル共重合体繊維、カルボキシル基を有するポリビニルアルコール繊維が官能基の導入が特に容易な点で好ましく用いられる。さらに、加工性と耐久性の点で、島成分で補強された、いわゆる海島状繊維が好ましく用いられ、例えば、海成分としてはポリスチレン、島成分としてはポリプロピレン等を用いた海島状繊維が好ましく用いられる。
【００１６】
繊維状材料の表面積は、体外循環に用いることを想定した場合、0.1〜100m2/gの表面積を有するものが好ましい。表面積はベット法によって測定されるものとする。
【００１７】
得られた吸着カラムに、処理液を通過させることによりＴｈ２細胞を吸着することができる。かかる処理液としては、Ｔｈ２細胞が含まれる血液が用いられる。吸着方法としては、上記カラムのうち、例えば、本発明材料を布の形にし、中心軸に巻き付けてカラムに詰めた形態の場合には、中心軸内部に血液を注入し、中心軸に形成された孔から処理液を外部に流出することにより、Ｔｈ２を吸着する方法が効率よくＴｈ２細胞を吸着する点で好ましい。
【００１８】
本発明材料は、Ｔｈ２細胞を好適に除去することができ、Ｔヘルパー細胞のバランスがＴｈ２細胞に傾いたことによって生じるアレルギーによる炎症、アトピー性疾患、喘息あるいは全身性エリトマトーデス、腫瘍等の患者に体外循環等で用いることによって、Ｔｈ２細胞増加にかかわる疾患を改善するなどの用途に好適に用いることができる。
【００１９】
【実施例】
以下に実施例を用いて詳細な検討を加えるが、発明の内容が実施例に限定されるものではない。
【００２０】
（実施例１）
ＣＮＢｒ活性セファロース６ＭＢ（ファルマシア）１．５ｇを１ｍＭＨＣｌ、１０ｍｌに膨潤させ、さら１ｍＭＨＣｌ、１０ｍｌで２回デカンテーション法で洗浄した。最後に０．１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液で手早く洗浄し上清を除去した。このビーズに０．１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液に溶解した１ｍｇ／ｍｌ濃度の抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体（ＣＣＲ４発現細胞をマウスに免疫し、ＣＣＲ４発現細胞とのみ反応するものをスクリーニングして得た。）、あるいは正常マウスＩｇＧを４．５ｍｌを添加し、４℃一昼夜ローテーターで反応させた。上清を除去し、０．１ＭＣＨ3ＣＯＯＨ（ｐＨ４．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液１０ｍｌと０．１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液１０ｍｌで交互に洗浄した。この操作を２回繰り返しおこない最後は０．１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液とし上清を除去した。ここへ０．２Ｍグリシンを含む０．１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液２ｍｌを加え、室温で２時間ローテーターで反応させた。反応後０．１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液１０ｍｌで３回洗浄した。得られた抗ＣＣＲ４抗体固定化ビーズ、あるいはマウスＩｇＧ固定化ビーズをそれぞれ容量１．５ｍｌカラムに充填し、０．２５％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ（ハンクスバッファー）溶液で洗浄した。このカラムそれぞれに１０5／ｍｌのＣＣＲ４発現細胞を含有する０．２５％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ溶液１ｍｌを１ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で流し、そのあとさらに０．２５％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ溶液を１ｍｌを１ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で流した。それぞれの濾液を分取、混合し、１２００ｒｐｍ５ｍｉｎ遠心後上清を除去した。細胞に０．２５％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ溶液２００μｌを添加し分散させ、細胞を計測した。この時カラムに添加する前の１０5／ｍｌの細胞も、細胞数を計測した。（カラム添加前細胞数−濾液細胞数）／カラム添加前細胞数×１００から細胞吸着率を算出した。
【００２１】
ＣＣＲ４発現細胞は抗ＣＣＲ４抗体固定化ビーズによく吸着され、マウスＩｇＧビーズには吸着されなかった。
【００２２】
【表１】
【００２３】
（実施例２）
健常者ボランティアより採血した血液から、リンフォプレップ（ＮＹＣＯＭＥＤ社）を用いて密度勾配法でリンパ球を分離した。このリンパ球を０．２５％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ溶液に１０5／ｍｌの分散液とした。実施例１で用いた抗ＣＣＲ４抗体固定化ビーズ、あるいはマウスＩｇＧ固定化ビーズを充填したカラムそれぞれにリンパ球分散液２ｍｌを１ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で流した。次に０．２５％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ溶液２ｍｌを１ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で流した。それぞれの濾液を分取、混合し、１２００ｒｐｍ５ｍｉｎ遠心後上清を除去した。細胞に０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3／ＰＢＳ２００μｌ添加し分散させた。この時、カラムを通す前のリンパ球分散液２ｍｌも同じ操作を行った。この細胞分散溶液５０μｌを新しいチューブに分取し、抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体２０μｇ／ｍｌを含む０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3溶液５０μｌを添加し４℃で１時間反応させた。０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3／ＰＢＳ １ｍｌを添加し細胞を分散させた後、１２００ｒｐｍ５ｍｉｎ．遠心し上清を除去した。この操作を洗浄という。次にＦＩＴＣラベル抗マウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社）を０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3／ＰＢＳで１００倍に希釈した溶液を５０μｌ添加し、４℃１時間反応させた。次に洗浄操作を２回行った。最後に０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3／ＰＢＳ溶液３００μｌに細胞を分散させた。この細胞分散溶液をフローサイトメーターで測定した。カラム通過前の細胞中と、通過後の細胞中の抗ＣＣＲ４抗体と反応する細胞の割合の変化を比較した。［カラム通過前抗ＣＣＲ４抗体反応細胞(Ｔｈ２)の割合−カラム通過後抗ＣＣＲ４抗体反応細胞(Ｔｈ２)の割合］／カラム通過前抗ＣＣＲ４抗体反応（Ｔｈ２）細胞の割合×１００を吸着率とする。
【００２４】
抗ＣＣＲ４抗体と反応する細胞（Ｔｈ２細胞）はマウスＩｇＧ固定化ビーズへの吸着率は低く、抗ＣＣＲ４抗体固定化ビーズによく吸着された。
【００２５】
【表２】
【００２６】
【発明の効果】
本発明により、Ｔｈ２細胞吸着材料を提供することができた。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｔｈ２細胞吸着材料およびそれを用いたＴｈ２細胞吸着カラムに関する。特にヒト血液中のＴｈ２細胞を吸着除去する事により、アレルギーによる炎症、アトピー性疾患、喘息あるいは全身性エリテマトーデス、腫瘍等の病態を改善させる用途に好適に用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
免疫系細胞は液性因子であるサイトカインの産生を介して免疫応答を始めとする種々の生体応答を調節していることが知られている。ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞はサイトカインの産生パターンの違いにより少なくとも２種類の亜集団、Ｔヘルパータイプ１（以下、Ｔｈ１と呼ぶ。）とＴヘルパータイプ２（以下、Ｔｈ２と呼ぶ。）とに分類される。インターフェロンガンマを産生するＴｈ１細胞は主として遅延型過敏症や炎症反応等の細胞性免疫応答を担っており、細菌やウイルス等の細胞内病原体に対する感染免疫応答に重要な役割を果たしていると考えられている。一方、ＩＬ−４を産生するＴｈ２細胞はＢ細胞を抗体産生細胞へ分化させることにより体液性免疫応答を誘導したり好酸球の増殖・機能発現を調節しており、寄生虫等の細胞外病原体に対する防御反応に関与しているものと考えられている。Ｔｈ１やＴｈ２細胞から分泌されるサイトカインはそれぞれ他方のＴ細胞亜集団の機能をお互いに制御していることから、Ｔｈ１及びＴｈ２サイトカインを中心にした種々の免疫応答の調節機構に関する研究がめざましく展開され、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが免疫調節の中枢として位置づけられている。このＴｈ１／Ｔｈ２バランスはアレルギー、癌、感染症、自己免疫疾患など多くの分野において発症の原因を考えるうえで重要な因子である。
【０００３】
Ｔｈ１、Ｔｈ２への分化のメカニズムは、複雑であるために、その全貌が明らかにされていないが、ヘルパーＴ細胞によって調節されるＴｈ１／Ｔｈ２破綻は、多くの免疫病発症の原因になっていると考えられている。Ｔｈ１に偏向した場合は、細胞性免疫増強により癌や感染症に対する免疫応答が高まるが、同時に自己組織障害性も高まり、臓器特異性の自己免疫疾患の原因となる。このようなＴｈ１主導の免疫病としては、糖尿病、肝障害、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、潰瘍性大腸炎、あるいは移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などがあげられる。一方Ｔｈ２に偏向した場合は、ＴＧＦβやＩＬ−１０、４の過剰産生により、細胞性免疫の低下を引き起こし、結果として感染症に対する感受性が高まり、自己抗体の過剰産生および全身性の免疫疾患の発症につながる。このＴｈ２によって産生されるＩＬ−４はＩｇＥクラススイッチに不可欠である。このようなＴｈ２主導免疫の過剰増強はアレルギー発症原因になると考えられている。また、Ｔｈ２から産生されるＩＬ−５は好酸球を炎症部位に誘導し、さらに好酸球を刺激し活性化することによって炎症を引き起こすと考えられている。
【０００４】
Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞はサイトカイン産生パターンで分類されているが、Ｔｈ２に特異的に発現している細胞表面抗原としてはＣＣケモカインレセプター４（以下、ＣＣＲ４と呼ぶ。）、chemoattractant receptor-homologous molecule expressed on Th2 cells(以下、CRTH2と呼ぶ。)、ST2L 、ＣＣＲ８などが報告されている。ＣＣＲ４はＴｈ１細胞には発現されず、Ｔｈ２細胞のみに発現すると報告されている（ J.Immunol.161,5111-5115,1998）。またアトピー性皮膚炎患者の末梢血ヘルパ−Ｔ細胞にはＣＣＲ４が発現しているという報告がある（J.Leukoc. Biol.Vol.68,568-574,2000）。これらの事実からＣＣＲ４を指標にＴｈ２細胞を吸着除去することにより、アレルギー性の炎症、アトピー性疾患、喘息等の病態を改善できることが示唆される。CRTH2はEur.J.Immunol.30,2972-2979,2000にST2LはJ.Exp.Med.Vol.187,No.5,787-794,1998にＴｈ２細胞に特異的に発現していることが示されている。
【０００５】
上記の知見からＣＣＲ４発現細胞（遺伝子組み換えによりＣＣＲ４遺伝子を挿入した細胞）が吸着する材料はＴｈ２細胞を吸着することが示唆される。
【０００６】
これまでは特開平1-332594に示されているように、ＣＤ４陽性細胞（ヘルパーＴ細胞）を吸着する方法は示されていたが、さらに分類されるサブクラスであるＴｈ２を特異的に吸着することはできなかった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明はＴヘルパー細胞のバランスがＴｈ２細胞に傾いたことによって引き起こされる疾患患者血液から特異的にＴｈ２細胞を吸着するための材料、およびそれを用いた吸着カラムを提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
すなわち本発明は、Ｔｈ２細胞の表面抗原と親和性を有する物質が水不溶性担体に固定化されてなるＴｈ２細胞吸着材料である。
【０００９】
また本発明は、上記の材料を内蔵してなる体外循環用カラムである。
【００１０】
また本発明は、上記のカラムに血液を通過させてＴｈ２細胞を吸着する、免疫系細胞の除去方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明においては、Ｔｈ２細胞を吸着し得る材料を提供することができる。
【００１２】
本発明においては、Ｔｈ２細胞表面抗原としてはＣＣＲ４、ＣＲＴＨ２、ＳＴ２Ｌなどが用いられる。
本発明においてＴｈ２細胞表面抗原と親和性を有する物質としては抗体、ポリペプチド、多糖類、核酸等をいい、具体的には、抗体は抗ＣＣＲ４ポリクローナル抗体、抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体などが用いられ、ポリペプチドとしては３０アミノ酸以下が好ましく、特に１５から３０アミノ酸が好適に用いられる。
【００１３】
本発明に用いられる不溶性担体の材料は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリ（芳香族ビニル化合物）、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリエチレン、ポリビニルアルコール、ポリテトラフルオロエチレンなどの合成高分子や、セルロース、コラーゲン、キチン、キトサン、デキストランおよびそれらの誘導体を含む天然高分子、などが好適に用いられる。さらに、金属、セラミックス、ガラスなどの無機材料を適当な高分子で被覆したり、表面を直接修飾したものも好適に用いられる。
【００１４】
本発明の材料の形状は、繊維状、中空糸状、ビーズ状、平膜状、粉状などを用いることができるが、繊維状、中空糸状あるいはビーズ状のものが好ましく用いられる。吸着率を上げるには、接触面積の大きい材料が好ましい。繊維状の場合は２０μｍ以下が好ましく、特に１０μｍ以下が好適に用いられる。また、ビーズとしては、カラムに充填した際の圧損が少なくかつ表面積の大きいものが良いので、粒径が５０〜１０００μｍのものが好ましく、２００〜７００μｍのものがさらに好ましい。
【００１５】
繊維状材料の成分としては、特に限定されるものではないが、ポリスチレン繊維、架橋ポリスチレン繊維、アクリル酸・アクリロニトリル共重合体繊維、カルボキシル基を有するポリビニルアルコール繊維が官能基の導入が特に容易な点で好ましく用いられる。さらに、加工性と耐久性の点で、島成分で補強された、いわゆる海島状繊維が好ましく用いられ、例えば、海成分としてはポリスチレン、島成分としてはポリプロピレン等を用いた海島状繊維が好ましく用いられる。
【００１６】
繊維状材料の表面積は、体外循環に用いることを想定した場合、0.1〜100m2/gの表面積を有するものが好ましい。表面積はベット法によって測定されるものとする。
【００１７】
得られた吸着カラムに、処理液を通過させることによりＴｈ２細胞を吸着することができる。かかる処理液としては、Ｔｈ２細胞が含まれる血液が用いられる。吸着方法としては、上記カラムのうち、例えば、本発明材料を布の形にし、中心軸に巻き付けてカラムに詰めた形態の場合には、中心軸内部に血液を注入し、中心軸に形成された孔から処理液を外部に流出することにより、Ｔｈ２を吸着する方法が効率よくＴｈ２細胞を吸着する点で好ましい。
【００１８】
本発明材料は、Ｔｈ２細胞を好適に除去することができ、Ｔヘルパー細胞のバランスがＴｈ２細胞に傾いたことによって生じるアレルギーによる炎症、アトピー性疾患、喘息あるいは全身性エリトマトーデス、腫瘍等の患者に体外循環等で用いることによって、Ｔｈ２細胞増加にかかわる疾患を改善するなどの用途に好適に用いることができる。
【００１９】
【実施例】
以下に実施例を用いて詳細な検討を加えるが、発明の内容が実施例に限定されるものではない。
【００２０】
（実施例１）
ＣＮＢｒ活性セファロース６ＭＢ（ファルマシア）１．５ｇを１ｍＭＨＣｌ、１０ｍｌに膨潤させ、さら１ｍＭＨＣｌ、１０ｍｌで２回デカンテーション法で洗浄した。最後に０．１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液で手早く洗浄し上清を除去した。このビーズに０．１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液に溶解した１ｍｇ／ｍｌ濃度の抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体（ＣＣＲ４発現細胞をマウスに免疫し、ＣＣＲ４発現細胞とのみ反応するものをスクリーニングして得た。）、あるいは正常マウスＩｇＧを４．５ｍｌを添加し、４℃一昼夜ローテーターで反応させた。上清を除去し、０．１ＭＣＨ3ＣＯＯＨ（ｐＨ４．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液１０ｍｌと０．１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液１０ｍｌで交互に洗浄した。この操作を２回繰り返しおこない最後は０．１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液とし上清を除去した。ここへ０．２Ｍグリシンを含む０．１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液２ｍｌを加え、室温で２時間ローテーターで反応させた。反応後０．１ＭＮａＨＣＯ3 （ｐＨ８．５）、０．５ＭＮａＣｌ溶液１０ｍｌで３回洗浄した。得られた抗ＣＣＲ４抗体固定化ビーズ、あるいはマウスＩｇＧ固定化ビーズをそれぞれ容量１．５ｍｌカラムに充填し、０．２５％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ（ハンクスバッファー）溶液で洗浄した。このカラムそれぞれに１０5／ｍｌのＣＣＲ４発現細胞を含有する０．２５％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ溶液１ｍｌを１ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で流し、そのあとさらに０．２５％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ溶液を１ｍｌを１ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で流した。それぞれの濾液を分取、混合し、１２００ｒｐｍ５ｍｉｎ遠心後上清を除去した。細胞に０．２５％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ溶液２００μｌを添加し分散させ、細胞を計測した。この時カラムに添加する前の１０5／ｍｌの細胞も、細胞数を計測した。（カラム添加前細胞数−濾液細胞数）／カラム添加前細胞数×１００から細胞吸着率を算出した。
【００２１】
ＣＣＲ４発現細胞は抗ＣＣＲ４抗体固定化ビーズによく吸着され、マウスＩｇＧビーズには吸着されなかった。
【００２２】
【表１】
（実施例２）
健常者ボランティアより採血した血液から、リンフォプレップ（ＮＹＣＯＭＥＤ社）を用いて密度勾配法でリンパ球を分離した。このリンパ球を０．２５％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ溶液に１０5／ｍｌの分散液とした。実施例１で用いた抗ＣＣＲ４抗体固定化ビーズ、あるいはマウスＩｇＧ固定化ビーズを充填したカラムそれぞれにリンパ球分散液２ｍｌを１ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で流した。次に０．２５％ＢＳＡ添加ＨＢＳＳ溶液２ｍｌを１ｍｌ／ｍｉｎ．の流速で流した。それぞれの濾液を分取、混合し、１２００ｒｐｍ５ｍｉｎ遠心後上清を除去した。細胞に０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3／ＰＢＳ２００μｌ添加し分散させた。この時、カラムを通す前のリンパ球分散液２ｍｌも同じ操作を行った。この細胞分散溶液５０μｌを新しいチューブに分取し、抗ＣＣＲ４モノクローナル抗体２０μｇ／ｍｌを含む０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3溶液５０μｌを添加し４℃で１時間反応させた。０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3／ＰＢＳ １ｍｌを添加し細胞を分散させた後、１２００ｒｐｍ５ｍｉｎ．遠心し上清を除去した。この操作を洗浄という。次にＦＩＴＣラベル抗マウスＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ社）を０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3／ＰＢＳで１００倍に希釈した溶液を５０μｌ添加し、４℃１時間反応させた。次に洗浄操作を２回行った。最後に０．１％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ3／ＰＢＳ溶液３００μｌに細胞を分散させた。この細胞分散溶液をフローサイトメーターで測定した。カラム通過前の細胞中と、通過後の細胞中の抗ＣＣＲ４抗体と反応する細胞の割合の変化を比較した。［カラム通過前抗ＣＣＲ４抗体反応細胞(Ｔｈ２)の割合−カラム通過後抗ＣＣＲ４抗体反応細胞(Ｔｈ２)の割合］／カラム通過前抗ＣＣＲ４抗体反応（Ｔｈ２）細胞の割合×１００を吸着率とする。
【００２４】
抗ＣＣＲ４抗体と反応する細胞（Ｔｈ２細胞）はマウスＩｇＧ固定化ビーズへの吸着率は低く、抗ＣＣＲ４抗体固定化ビーズによく吸着された。
【００２５】
【表２】
【発明の効果】
本発明により、Ｔｈ２細胞吸着材料を提供することができた。
Claims (13)
- 抗ＣＣケモカインレセプター４抗体が合成高分子又は天然高分子からなる水不溶性担体に固定化されてなるＴヘルパータイプ２細胞吸着材料。
- 前記合成高分子は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、ポリイミド、ポリ（芳香族ビニル化合物）、ポリエステル、ポリメチルメタクリレート、ポリスルホン、ポリビニルアルコール又はポリテトラフルオロエチレンである、請求項１記載のＴヘルパータイプ２細胞吸着材料。
- 前記天然高分子は、セルロース、コラーゲン、キチン、キトサン、若しくはデキストラン又はそれらの誘導体である、請求項１記載のＴヘルパータイプ２細胞吸着材料。
- 前記水不溶性担体は、ＣＮＢｒ活性セファロースである、請求項１記載のＴヘルパータイプ２細胞吸着材料。
- 前記水不溶性担体が繊維状の形態を持つ、請求項１〜４のいずれか一項記載のＴヘルパータイプ２細胞吸着材料。
- 前記水不溶性担体がビーズ状の形態を持つ、請求項１〜４のいずれか一項記載のＴヘルパータイプ２細胞吸着材料。
- 前記水不溶性担体は、ポリスチレン繊維、架橋ポリスチレン繊維、アクリル酸・アクリロニトリル共重合体繊維又はカルボキシル基を有するポリビニルアルコール繊維である、請求項５記載のＴヘルパータイプ２細胞吸着材料。
- Ｔヘルパー細胞のバランスがＴヘルパータイプ２細胞に傾いたことによって生じる疾患の治療に用いる、請求項１〜７のいずれか一項記載のＴヘルパータイプ２細胞吸着材料。
- 前記疾患は、アレルギーによる炎症、アトピー性疾患又は喘息である、請求項８記載のＴヘルパータイプ２細胞吸着材料。
- 前記疾患は、全身性エリテマトーデス等の自己免疫疾患である、請求項８記載のＴヘルパータイプ２細胞吸着材料。
- 前記疾患は、腫瘍である、請求項８記載のＴヘルパータイプ２細胞吸着材料。
- 請求項１〜１１のいずれか一項記載のＴヘルパータイプ２細胞吸着材料を内蔵してなる体外循環用カラム。
- 請求項１２記載の体外循環用カラムにヒト以外の動物の血液を通過させてＴヘルパータイプ２細胞を吸着する、免疫系細胞の除去方法。
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