JP2000501949A - 体外搬出法のための患者特異性免疫吸着剤およびその製出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 免疫系調節不全に起因する患者を有する患者の体外搬出法に用いる、忠者特異性の多用途免疫吸着剤の製造に関する発明。患者の血液から住来訪により免疫複合体を分離したのち、これを適切な方法により抗原と抗体に分離する。こうして活性化した抗原と抗体を個々に、あるいは混合として適切な担体に共有結合させることにより、免疫複合体分離のために採血した前記患者のための免疫吸着剤として用いることができる。これにより、まれな自己免疫疾患を有する患者にも特異性に作用する免疫吸着剤を製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】 体外搬出法のための患者特異性免疫吸着剤およびその製出法 説明 本発明は、免疫病理学的プロセスに起因する種々の疾患を発現させ、あるいは これを持続させる特異性抗体および（または）抗原から免疫吸着剤を製出する方 法に関するものである。この発明は、臨床的結果に関与する免疫病理学的制御回 路に−たとえば従来の薬物による免疫制御療法におけるように−免疫系全体に作 用することなく、選択的に影響を及ぼすことを可能とする。 この発明における方法はさらに、免疫病理的に関与する生体固有の物質の濃縮 と純化を可能とし、原因の研究と療法の開発に新しい可能性をもたらす。 免疫反応の機能的基本は複雑であり、非特異的防御の局所的および全身的に作 用する細胞性および体液性要素の良好に調節された相互作用、ならびに活性化し たリンパ造成系細胞とこれが生成する伝達物質および抗体とからなる特異的防御 を根底とする。 主要な防御能は、剌激の種類により多様でありうる。 この上昇した防御状態は自然的には感染の経過、人工的には薬物によって獲得 される。 この獲得は全身的にも局所的にも呼吸器、消化器および泌尿生殖器の粘膜を介し て行われる。 生体は感染に対しただちに反応する。この即時反応の質および量は、抗原の種 類およびその進入部位に依存する。同じ反応は原則として、ワクチンその他の生 体異質物質の投与によっても起こる。特異的防御（たとえば特異的抗体の証明に よって測定できる）は、数日後にはじめてその効果を現す。原因が取り除かれれ ば、特異性抗体の生成は下方調節され、いずれ停止する。抗体の生物学的分解の のちには、特異性“記憶細胞”の存在だけが、「生体が過去にいかなる抗原と対 決したか」を示すにすぎない。特定の条件下では（多くの場合、個々には因果関 係の同定はもはや不可能である）生体は体固有の構造に過剰に反応する。発展す る自己免疫反応は体固有組織を持続的に破壊し、その破壊産物がさらに免疫系を 剌激する。この病的制御回路が中断されなければ、その結果は少なくとも当該組 織にとり致命的である。 免疫病理学的に起因する、またはこれが関与する疾患の頻度は高い。その臨床 的経過お よび治療の難しさは患者の生活の質を低下させ、国民経済的にも多大な損害をも たらす。リューマチ様関節炎は高頻度自己免疫疾患の１つであり、国民の１％が これに罹患する。主要な発現年齢は４０歳前後で、その１０年後には患者のおよ そ５０％が労働不能となり、１０〜２０％が重度障害者となる。従来の免疫抑制 療法とこれを補う補助療法で達成させる成果は不十分であり、治療の中止が治療 の終了を意味する例が多い。基礎治療薬による初期治療を受けた患者のうち、３ 年後に効果的投薬を受ける患者は５０％にすぎない。 従来の免疫抑制療法は効果が不十分であることが多く、副作用が強いため、自 己免疫疾患 の新しい治療法がつねにもとめられてきた［J.Sany:Early approaches to Immun otherapyof rheumatoid artheritis.EUR-J-RHEUMAT0L-INFLAM:11(1991),139−14 7]。 これらの療法は体液および細胞性免疫メカニズム、ならびに伝達物質系に影響 を与えることを目的とする。これは実験的な試みの療法であり、動物実験および 臨床実験で最初の成果がもたらされたが、自己免疫疾患の予後の決定的な前進に は至っていない。 プラズマ交換法およびプラズマ吸収法が様々な自己免疫疾患および免疫病理学 的関連疾患の治療に適用され、効果をあげた[R.T.Baldwin,R.R.Pierce and O.H. Frazier：Guillan−Barre syndrome after heart transplantation.J-HERRT-LUN GTRANSPLANTATI0N:11(1992),817-819;J.Braun.J.Sieper，A.Schwarz,F.Keller,J .Heitz and H.V.Amln: Sever lups crisis with aganulocytosis and anuric re nalfailu redue to amesangial lesion(WH0 IBB)-succesful treatment with cy clophosamide pluse fol-lowed bei plasmapheresis in acute multiple sclero sis(2).BR-J-RHEUMAT0L:30(1991),312-313;P.C.Dau:Plasmapheresis in acute m uitiple sclerosis:Ratioaleandresults.J-CLIN-AHERESIS:6(1991),200−204;H. H.Euler,J.O.Schroeder,R.A.Zeuner and E.Teske: Arandomized trail of plasm apheresis and subsequent pulsecyclophosphamide in severe lupus:Design of the LPSG trail．INT-J-ARTIF-0RGANS:14(1991),639−646;D.C.Hess,K.Sethi a nd E.Awad:Thrombitic throm-bocytopenicpurpura in systemic lupus erythema stosus and antiphospholipid anti-bodies: Effective treatment with plasma exchange and immunosupression.J-RHEUMA-T0L:19(1992),1474-1478;R.Korinth enberg and M.Sauer:The Guillain-BarresyndromIn childhood.Clinical course and therapeutic measures.M0NATSSCHRKINDERHEILK: 40 (1992),792−798]。 プラズマ交換法はプラズマ吸収法より古い治療法で、分離したプラズマ（膜プラ ズマ搬出法または遠心分離法）を廃棄し、同時に提供者のプラズマまたはヒト・ アルブミンと交換する。１回の治療で患者のプラズマと等量または２倍量を交換 する。この方法は選択的ではない。１つはまたは複数の病因的に重要な成分を除 去するため、プラズマをすべて廃棄するから、患者に必須の物質も除去される。 これが患者にとり重大な結果をもたらすため、様々な置換療法による補充が試み られる。このほかHIV あるいは肝炎病原体のような病原体に感染する危険も存在 する。 プラズマ吸収法においては、あらかじめ分離しておいたプラズマを吸着材に導 く。吸着材には、プラズマの特定成分と結合し、これを患者のプラズマから除去 する物質が結合している。プラズマ吸収法が免疫学的に重要な物質の除去に用い られる場合は免疫吸着法と呼ばれる。この免疫吸着法は、使用する吸着剤により 選択性と用途が異なり、これがまた治療の効果と副作用を決定する。プラズマか ら分離した免疫グロブリンを吸着するため、様々なリガンドおよび担体が臨床的 に用いられている。 表１ 体外搬出法に臨床的に用いられるリガンドの例 − ブトウ球菌プロテインＡ − 疎水性アミノ酸（トリプトファンないしフェニルアニリン） − 硫酸デキストラン − 凝集免疫グロブリンＧ − 抗ヒト免疫グロブリンＧ − 血液型抗原 以下の表で体外搬出法による療法が有効な自己免疫疾患を概観する。表２： 搬出／免疫吸着療法が有効な自己免疫疾患 − 急性進行性糸球腎炎、病巣性糸球体硬化症 − 全身性紅斑性狼瘡 − 抗燐脂質症候群 − 脈肝炎；たとえば動脈周囲炎、ワグナー − リューマチ様関節炎 − 免疫病理学的小板性紫斑病 − 凝血因子に対する抑制体 − 超免疫化した、ないしABO不適合の移植体受容者 − 多筋炎 − 神経性疾患；たとえばギラン・バレー症候群、多発性神経病、筋萎縮性側索 硬化症、重傷性筋無力症、多発性硬化症 自己免疫疾患の薬物療法における短所 薬物による免疫抑制は非選択的、非特異的である。新しい免疫学的療法（免疫 細胞および伝達物質の活性化マーカあるいはレセプター構造に対するモノクロナ ーナルまたはポリクローナル抗体）も免疫応答を選択的に抑制せず、あるいは療 法そのものが生体の免疫現象を誘発する。 自己免疫疾患の従来の搬出/吸着療法における短所 これまで知られている搬出法ないし吸着法にはすべて、薬物による免疫抑制法 と同様に選択性が不十分であるという短所がある。これは、すでに用いられてい る Balnt およびHargreavens の黄色ブドウ球菌プロテインＡを適切な担体に固 定化する方法（米国特許第4,681,870号）について言えることである。この方法 では、患者の血液から非特異性IgGを除去する。同様のことは、Davis（ＰＣＴ− 出願WO86/07152）が報告した担体に結合した非特異性蛋白（様々な免疫グリブリ ンの種が好んで用いられる）を免疫複合体の吸着剤に用いる方法についても言え る。 この方法ではたしかに免疫複合体は除去されるが、自己免疫疾患においてつねに 、あらたに生成する個々の反応性成分は除去されない。 Liberti およびPoollora（米国特許第4,551,435号）は、血液から物質と免疫 複合体を除去する方法を報告した。この方法では患者の血液を特定濃度の特異性 抗体と混合し、除 去すべき物質と免疫複合体を生成させる。これを固体担体に固定化した Fc 受容 体を持つ細胞、リューマチ因子、Fc 受容体などの因子とともに血液から除去す る。この方法は解放される誘因が知られていること（自己免疫疾患症例のほとん どは誘因が不明である）、および誘因となる抗原が精製され、用意されているこ とを前提とする。免疫複合体の除去そのものは非特異的因子的でプロテインＡを 介さず、免疫グロブリンと生理的に高い親和性を有する生体分子によりおこなう 。 ここでは、個々の自己免疫疾患に病理生理学的に関与する免疫構造が、たとえ それが同一の疾患である場合でも多様であることに注意する必要がある。従来の 搬出システムは免疫病理学的に重要な免疫グリブリンだけでなく、生理的な一生 体固有の防御に必須の一免疫グリブリンまで除去する。その結果として、敗血性 合併症のリスクをともなう免疫系全体の弱化をもたらす。 本発明は、免疫系の調節不全に起因する疾患、あるいは免疫病理学的プロセス により慢性の治療困難な経過形態を示す疾患に苦しむ患者のための治療法を提供 することを目的とする。 発明の根底となる課題は、個々の患者に特異の免疫吸着剤を開発し、これにより 病因論的に意昧を持つ免疫複合体、自己抗体および抗原を患者に血液またはプラ ズマから吸着、除去することにある。この課題は請求項１および７の方法により 解決される。従属項は優利な変法である。 このためには公知の方法、たとえばプロテインＡ免疫吸着剤を用いる方法で患 者のプラズマから免疫複合体を除去し、所定の溶出ののち生物学的に活性の成分 要素に分解する。これら成分要素は公知の方法たとえばゲル・クロマトグラフィ ーにより分離し、個々に、または抗体と抗原の混合物として担体にカップリング させることができる。この免疫吸着剤を用いることにより、患者のプラズマから 疾患に重要な意味を持つ免疫複合体、抗体および抗原をプラズマ搬出法で除去す ることができる。これらカラムは再活性化が可能であり、繰り返し使用される。 このような患者特異性の免疫吸着剤は通常、自己免疫複合体が病理学的に関与す る疾患すべてにおいて製造が可能である。 この課題の解決法は、本発明の特許の請求項から導き出すことができる。 本発明においては、患者特異性の免疫吸着剤は患者の病理学的に関与する免疫 因子の複合体から分離した抗原および／または抗体からなり、活性化した個体担 体に結合させたも のである。この免疫吸着剤は調節不全に起因する、あるいはこれを持続する疾患 を有する患者の分離した抗原および／または抗体を含む。自己免疫疾患あるいは 免疫病理的反応状態には、特に以下のものがある。 リューマチ様関節炎、急性進行性系球腎炎、全身性紅斑性狼瘡、抗燐脂質症候 群、脈肝炎、組織非適合性移植体受容体、多筋炎、神経性自己免疫疾患または感 染症に起因する免疫調節不全。担体材料としては、その表面に十分に多量の免疫 複合体を共有結合するあらゆる生体親和性材料が適する。特に好ましいものはセ ロファーズおよびパールセルローズである。 患者特異性免疫吸着剤の製造法は以下のようなステップを特徴とする。 まず免疫複合体を周知の非選択的方法、たとえばプロテインＡ免疫吸着剤を用 いて患者のプラズマから分離し、所定の溶出ののちに生物学的に活性な諸成分に 分解する。これら成分は周知の方法、たとえばゲル濾過法により分離され、また は個々に、ないしは抗体と抗原の混合物として担体材料にカップリングさせるこ とができる。免疫複合体は通常、酸性またはアルカリ性環境（特にｐＨ２〜５ま たは１０〜１２の範囲）で個々の成分に分解する。これは場合によっては分別し 、場合によってはNaCl₂、MgCl₂、LiCl等の塩もしくは尿素またはグアニジン塩酸 （特定濃度以上で反応体を解離状態に保つのに適する）を加えたのち、pH範囲２ 〜１２で周知の方法により個体材料にカップリングさせることができる。 この免疫吸着剤を用いて患者のプラズマから特異的に、患者に関与する免疫複 合体、抗体および抗原を体外免疫吸着剤により除去することができる。このカラ ムは再活性化が可能で、くり返し使用することができる。このような患者特異性 免疫吸着剤は通常、自己免疫複合体が病因論的に関与するあらゆる疾患において 製造可能である。 この方法は治療への応用のほか、免疫学的調節不全に少なくとも共同して関与 する物質の患者の血液からの分離を可能にする。これにより自己免疫疾患、ない し免疫学的不調の継続により増強される疾患における病因の検査が単純化される 。従来の方法との比較における長所は： １、免疫複合体のほか、従来法では確認不可能であった個々の反応パートナーを も除去することができる。 ２、異種免疫グブリンを有する代替物を必要としない（HIVなどへの感染を排除 し、付 加的コストを回避することができる。 ３、病因を解明することなく、患者特異性免疫吸着剤を製造できる。したがって コスト上の理由から医療産業が開発を躊躇するような罹患率の低い疾患について も特異的な治療手段を用意することができる。 ４、個々の自己免疫疾患の発現ないし持続に関与する抗原および／または抗体を 特異的に濃縮し、分離して以後の検査のため用意することができる。 以下に、本発明について詳しく説明する。 たとえばリューマチ様関節炎、紅斑性狼瘡あるいは多発性硬化症などの自己免 疫疾患に罹患した患者に対し、葡萄球菌Ａプロテイン免疫吸着剤を用いる体外搬 出法を実施する。搬出サイクル終了後、カラムを洗浄剤を加えた緩衝剤で十分に 洗い、あるいはイオン濃度を高め（たとえば１〜３mol/NaCl)、吸着結合したプ ラズマ成分をカラムから除去する。吸着したプラズマ成分が除去されたことを電 気誘導法または洗浄緩衝剤の免疫分析法でチエックしたのち、免疫グロブリン、 免疫複合体ならびに解離した免疫反応パートナーをpH勾配（たとえばｐＨ７〜２ のクエン酸または酢酸緩衝液）もしくは様々なpH値の塩溶液（pH４〜７）で溶出 する。電気泳動、クロマトグラフィーなど適切な解離法により、溶出したフラク ションを免疫複合体のそのプロテインのスペクトルおよび解離度について検査す る。 固体担体への固定化には、免疫複合体を反応性成分に分解したフラクションを 使用する。これは、必要に応じ、固定前に適当な分離法により分離することがで きる。免疫複合体の各成分は個々にあるいは混合物として、周知の方法により、 ONBカルボネート・エチルエステルあるいはＮヒドロキシスクシンイシド・エチ ルエステルで活性化した担体材料にカップリングする。結合しない成分すべてを 除去すると、患者に特異的な、再生可能な免疫吸着剤が得られる。この免疫吸着 剤を用いることにより、患者の血液から免疫病因性、液性調節不全に関与する物 質だけが選択的に除去される。 以下に本発明の実施例を詳しく説明する。実施例 １ 固定化したヒト免疫ブロブリンG(IgG)の生物学的活性を抗ヒトIgG（ヤギ）と の結合 により測定するモデル検査 -----（表３） ヒトIgGの担体（セファロース６FFおよびパールセルロース）へのカップリン グは溶出条件のもとで行った。カップリングには ONB カルボネート群1ml当たり およそ３０molのCL-C0-NBO活性化ゲルを使用した。 抗血清（抗ヒトIgG５．３mg）を１mlPBSで希釈し、それぞれの担体上に加えた (流量:０．１ml/min)。カラムはその容積の数倍のPBSおよび３Ｍ NaCL pH ５． ０にて洗浄した。溶出は０．１Ｍグリシン-HCL０．０５％のトウィーン２０pH２ ．０で行った(流量:１．０ml/min，２〜６℃)。プロテイン濃度の測定は溶出液 の０．５MK₂PO₄による中和後、分光測光法により波長２８０nmにて行った。ゲル １mlあたりの相対的抗体結合容量はヒトIgGの標準条件（０．５Ｍ燐酸塩緩衝液 、トウィーン２０ ０．０５％、pH７．２）下におけるカップリングに関連する 。 実施例 ２ アルカリ活性化ＯＮＢカルボネート・セファロース６FF pH３.０で固定化した ヒトIgG（抗原抗体）の結合容量を測定するための、抗ヒトIgG（抗体）を過剰に カップリングのためヒトIgG（Sigma）をカップリング緩衝液に溶解し、濾過し た(０.２μm)。この溶液を溶剤に湿した活性化したセファロースに加えた。カッ プリングは室温にて注意深く攪拌しながら行った(１h)。ブロッキング（０．１M の硼酸塩中のエタノールアミン１M、pH8．０/１h）ののち、ゲルをたとえば，そ れぞれカラム容積の１０倍のフリットを用い、カップリング緩衝液-水-０．０１ N HCL-水-０．１酸塩緩衝液２４h ｐＨ８．３/１h-水の順で十分に洗った。 親和性クロマトグラフィーによる検査はEC0N0-Systemと0mnifitカラム（５． ０X０．３cmI.D．（３５０μ１ゲル）を用い、２〜６℃で行った。流量は０．２ ５〜0．１ml/minとした。溶出はUV流出フォトメーター（２８０nm）で測定した 。抗体を結合し、PBSで洗ったのち、抗体を以下のプログラムで溶出した： １、PBSで30 min ２、３Ｍ NaCl pH 5で60 min ３、PBSで30 min ４、Glycin^*HCL pH 2.0で30min ５、PBSで30 min 流量:0.25 ml/min 実施例 ３ a）HSA被覆した微量測定プレートを用いてHSA抗体（ウサギ）を抗体抗原複合体H SA から溶出し、親和性クロマトグラフィーのための理想的な溶出条件を求める 。 （表５） 96孔の微量測定プレートをHSA で被覆した。各孔では0.1μgの抗HSAをイン キュベートさせた。 検出システム（ELIS）としては、アルカリ性フォスファターゼ（基質：ニトロ フェニールフォスフエート、λ_405nm)で抱合した抗ウサギIgGを用いた。 それぞれの溶出緩衝液200tμ1をピペットで孔に敵下した。溶出は室温にて １時間、微量測定プレートを常に動かしながら行った。孔を十分に洗ったのち、 抗 HSA を検出 した。 その分析のため、各８の孔の測定値の平均を求めた(％=4.4)。溶出した抗 HSA 抗体のPBSに対するパーセンテージは０％に ^a0.05%のトウィーン20と共に ｂ）塩基性触媒に反応させ、活性化した 0NB カルボネート 6FF（免疫親和性ク ロマトグラフィーの溶出媒質として使用される）のカップリング媒質中における 固定化−（表６） カップリングするプロテインを混合し、濾過（0.45μm）したカップリング媒 質を湿らせ、活性化したONBカルボネート・セファロースに加えた。カップリン グは室温で１時間、かるく攪拌しながら行った。こののち室温にて、エタノール アミンとともに硼酸塩緩衝液(pH8.1)中でブロッキングした。ONBカルボネート群 を分光光度計(λ_WAXおよそ267nm)により定量した。 洗浄は実施例２と同様に行った。 前実験で親和性クロマトグラフィー（0.05〜0.1Ｍクエン酸pH2.0）により抗 H AS 抗体を用意し、0.5ＭＫ₂HPO₄で中和し、−20℃で保存しておいた。これを解 凍し、カップリングのため希釈した BCL でpH 3.0ないし4.0に調節した。 抗原抗体混合物のカップリングのための HSA を PBS に溶解し、希釈した HCL で所定のpH値に調節し、抗体溶液に加えた。 カップリング緩衝液中でのプロテインは分光光度計0D₂₈₀nmで定量した（抗体E E^0.1%＝１．３８HAS E^0.1%＝０．６７)。不動化したプロテインは、ゲルを1N Na 0H で処理したのちの上澄みをLowryの方法で定量した。 カップリングの結果(％)は供したプロテイン量に対する固定化プロテインの 相対量である。実施例４ 免疫複合体の分解条件で固定化した抗 HSA/HSA をモデルとする抗原および抗 塩基性触媒に反応させ、活性化した ONB カルボネート・セファロース6FF を 溶出条件 下（pH３．０;pH４．０；4Mグアニジン^*HCL）で実施例１および３b の説明と同 様に抗HSA / HSAとカップリングした。カラムを洗ったのち HSA ないし抗 HSA を結合緩衝液に供した。カラムをPBSで再度洗ったのち、溶出（pH2.0）とフォト メトリーによるプロテイン濃度の測定を行なった。 このモデル実験により、分解条件下で担体に固定化した免疫複合体（抗HSA / HSA）からの抗体（抗 HSA）も抗原（抗原 HSA）も結合能を維持することが証明 された。免疫複合体から固定化したHSAはつねに抗HSA を結合し、ELISA中で再度 溶出したのちHSA と強い反応を示した。（結果の説明は省く）。１Mol のHSAが １Mol の抗HSA と結合するという前提のもとで、2.1mg抗HSA と結合した免疫複 合体(実施例３)0.9mg HSA / MLゲルを固定化した。免疫複合体から抗HSA（抗ウ サギIgG）は、このモデルで標準カップリング条件下でも効率的に固定化し、そ の成果は抗ウサギIgGで証明できる。しかしこの場合、前提とするカップリング はHSAの結合を立体的に障害する分子領域で行なわれることになる。抗体そのも のはその生物学的活性を維持する。実施例５ 紅斑性狼瘡患者のプラズマ親和性クロマトグラフィー（同時に標準法） 紅斑性狼瘡に罹患した患者のプラズマが用意された。総γグロブリンを得るた めプロテインＡカラム（PHARMACIA）を使用した。抗体は 0NB カルボネートで活 性化したセファロース６FF（20μ Mol／ml）を介して固定化した。免疫吸着法のための緩衝液 緩衝液 PA pH 7.O 1000 ml pH値はHCI1たはNaOHで調節 クエン酸三ナトリウム 3.30ｇ 酢酸ナトリウム×3H₂O 5.45ｇ 塩化ナトリウム 4.90ｇ 燐酸水素二ナトリウム 2.91ｇ 燐酸二水素カリウム 0.26ｇ 溶出物PA pH 2.2 1000 ml pH値はHC1またはNaOHで調節 クエン酸×H₂0 6.12ｇ 塩化ナトリウム 9.00ｇ 洗浄緩衝液３MNaCl pH7.0 1000ml pH値はHC1またはNa0Hで調節 クエン酸三ナトリウム 3.30ｇ 酢酸ナトリウム×3H₂ 5.45ｇ 塩化ナトリウム 175.00ｇ 燐酸水素二ナトリウム 2.91ｇ 燐酸二水素カリウム 0.26ｇ トウィーン20 0.50ml クエン酸緩衝液 0.1M pH2.2 250ml pH値はHC1またはNa0Hで調 節 クエン酸 5.25ｇ方法 プロテインＡをカップリングしたカラム（５ml ゲル、Pharmacia）を緩衝液 P A で平衡化した。高速で遠心分離した新鮮なプラズマ 20 ml を１：２で緩衝液 PA と混合し、塗布した。クロマトグラフィーにはEcono システム（BIORAD）を 使用した。完全な吸着を達成するため、カラム通過後再びプラズマを塗布した。 吸着されなかった物質を除去するため、カラム容量の５倍の PA で十分に洗浄す る必要があった。非特異的に結合したプロテインは３MNaCl を含む洗浄緩衝液で 除去した。0.1Mクエン酸塩、pH 2.2 0.05％のトウィーン 20で免疫グロブリンと プロテインを免疫複合体からシャープなピークとして溶出した。溶出物の量は6. 5mlであった。プロテイン濃度はλ_280nm、17.6mg/mlのUV吸着を介して測定した 。溶出後ただちに、個々に分離したIgGおよびプロテインを0NBカルボネートで活 性化したセファロースにカップリングした。このためには製造者の指示にしたが って準備し、吸引したゲル６mlを加え、1hの攪拌を行った。溶出物のpH値は、こ れに含まれるプロテインの緩衝作用により３〜４を示した。自由結合は0.1M pH8 .0の硼酸塩緩衝剤中の１Mエタノールアミンで飽和させる必要があった。合わせ た洗浄液中のプロテイン濃度とプロテインA溶出物との比較から57％の結合効率 を確認した。十分な洗浄後のゲルは親和性クロマトグラフィーによる実験に供す る。 このためには患者のプラズマ40ml を遠心分離し、１：２で PA により希釈し 、カラム上に加える。結合しなかった、ないし非特異的に結合した物質はそれぞ れカラム容量の10倍のPA、洗浄緩衝剤およびPAの順で除去した。特異的に結合し たプロテインを0.1Mクエン酸pH 2.2で溶出した（図１）。 プラズマプロテインおよびクロマトグラフィー法で得たフラクションはSDSポ リアクリルアミド電気水泳動（SDS-PAGE）規格法により分析した(ミニプロテア ン(Miniprotean)II、BioRad)。ゲルはモノマー濃度10〜25%の勾配ゲルであった 。染色には Coomassie Grillant Blue R-250 を使用した（図２および３）。 図２から明らかなように、プロテインＡ溶出物には抗体のほか、他のプロテイ が含まれている。これらは、固定化ののち患者のプラズマ中の対応する反応パー トナーと特異性に結合することができる。親和性クロマトグラフィー（図１）後 の溶出ピーク２（0.1Mクエン酸、pH 2.2）では PAGE 中に種々のプロテインを同 定することができた。免疫グロブリンおよび多くの高分子プロテインとならび３ 種のプロテインが決定的に濃縮されている。これは、プロテインA溶出物の PAGE にはかすかに見える程度の帯状として証明できるにすぎない（図３）。その相 対的モル濃度は40 kD前後である。実施例 ６ 多発性硬化症患者のプラズマの親和性クロマトグラフィー プラズマの処理、プロテインAの溶出、および溶出プロテインのカップリング は実施例５と同様に行った。吸着性結合したプロテインを免疫吸着剤から洗い落 としたのち（図６のピーク１)、特異的に結合したプロテインを溶出緩衝剤でマ トリックスから分離する。これは主として免疫グロブリンからなる混合プロテイ ンであることが証明される。実施例 ７ リューマチ様関節炎患者のプラズマの親和性クロマトグラフィー プラズマの処理、プロテインAの溶出、および溶出プロテインのカップリング は実施例５と同様に行った。吸着性結合したプロテインを免疫吸着剤から洗い落 としたのち（図６のピーク１)、特異的に結合したプロテインを溶出緩衝剤でマ トリックスから分離する。これは主として免疫グロブリンからなる混合プロテイ ンであることが証明される。 図１〜６の説明 図１： 規格法で均一抗体および抗原をカップリングさせたセファロース6FF に吸着後の 患者のプラズマの溶出プロフィル。 マークは洗浄および溶出時の緩衝液交換を示す（カラムの装荷は表さない）： No１＝洗浄緩衝液、No.２＝０．１Mクエン酸緩衝液pH２．２ 図２： 0NB カルボネートで活性化させたセファロースとのカップリング前および後のプ ロテインAカラムの溶出物のPAGE。 No.１/２＝カップリング前の材料５ないし１０μl、No.３＝１０kD導体、No.４ ＝γグロブリン・スタンダード、No.５〜８＝１〜４に同じ（ただしカップリン グ後、なわち非結合物） 図３： pH２．２で免疫吸着剤カラムから均一プラズマの濾過後に得た溶出物のPAGE。 No.１〜７/９〜１５＝ピーク分留、No.８/１７=kDプロテイン・マーカー、No.１ ６＝後洗浄 図４： 規格法で均一抗体および抗原をカップリングさせたセファロース６FF に吸着後 の患者のプラズマの溶出プロフィル。 マークは洗浄時および溶出時の緩衝液交換を示す（カラムの装荷は示さない）： No.１--- 洗浄緩衝液、No.2--- ０．１Mクエン酸緩衝液pH２．２ 図５： 免疫吸着剤カラムからpH２．２で均一プラズマの濾過後に得た溶出物のPAGE。 No.１＝１０kDスタンダード、No.２＝γグロブリン・スタンダード、No.３＝ピ 図６： 規格法で均一抗体および抗原をカップリングさせたセファロース６FF に吸着後 の患者のプラズマの溶出プロフィル。 マークは洗浄および溶出時の緩衝液交換を示す（カラムの装荷は示さない）： No.１--- 洗浄緩衝液、No.2--- ０．１Mクエン酸緩衝液pH６．０/ツイーン、No. ３--- 0.1Mクエン酸緩衝液pH２．２ 図７ 免疫吸着剤カラムからpH２．２で均一プラズマの濾過後に得た溶出物のPA GE。 No.１〜４＝洗浄緩衝液からのプロテイン、No.５/６＝ピークフラクション（ピ ーク３図６)、No.７＝１０kDスタンダード、No.８＝γグロブリン・スタンダー ド

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｚ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ボエデン，ハンス−フリードリッヒ ドイツ連邦共和国 ディー−13187 ベル リン，ブレハムシュトラーセ 50 (72)発明者 ニューマン，ハンス−ゲオルグ ドイツ連邦共和国 ディー−18146 ロス トック，ダブリュ．−レーベ−シュトラー セ １ (72)発明者 メイアー，ユド ドイツ連邦共和国 ディー−18239 ハン ストルフ，ミッテルドルフシュトラーセ ４ (72)発明者 テラー，ジョアキム ドイツ連邦共和国 ディー−18273 グー ストロウ，エンゲ シュトラーセ ６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、患者の病因に関連する免疫因子の免疫複合体から分離した抗原および／また は抗体からなる患者特異の免疫吸着剤であって、活性化した固体担体に結合した もの。 ２、請求項１記載の患者特異性の免疫吸着剤であって、免疫系調節不全に起因ま たはこれが持続させる疾患を有する患者の分離した抗原および／または抗体を含 むもの。 ３、請求項１および２記載の患者特異性の免疫吸着剤であって、リューマチ様関 節炎、急性進行性糸球体腎炎、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、抗燐脂質症候 群、脈管炎、組織不適合移植組織の受容者、多筋炎、神経性自己免疫疾患あるい は感染症の後遺症としての免疫病理学的調節不全などの自己免疫疾患の患者また は免疫病理学的反応状態にある患者の分離した抗原および／または抗体を含むも の。 ４、請求項１〜３記載の患者特異性の免疫吸着剤であって、リューマチ様関節炎 、紅斑性狼瘡あるいは多発性硬化症の患者の分離した抗原および（または）抗体 を含むもの。 ５、請求項１〜４記載の患者特異性の免疫吸着剤であって、免疫複合体成分をそ の表面に十分に多く共有結合することができる生体親和性物質に結合したもの。 ６、セファローゼまたはパールセルロースに結合した患者特異性の免疫吸着剤。 ７、請求項１〜６記載の患者特異性の免疫吸着剤の製法であって、患者の血液ま たは他の体液、たとえば髄液から周知の方法、たとえばプロテインA免疫吸着剤 を介するプラズマ搬出法（血漿分離法）で免疫複合体を分離し、これを臨床使用 のため体外浄血法で洗浄し、活性の成分である抗体および抗原に分解し、これら 成分を固体の担体に共有結合させることを特徴とする製法。 ８、請求項７の方法で、酸性ないしアルカリ性環境、特に pH 領域２〜５もしく は１０〜１２にてNoCl、MgCl₂、LiCl などの塩または尿素あるいは塩酸グアニジ ンを加え、免疫複合体を個々の成分に分解し、場合によっては分別後、場合によ っては特定濃度以上で反応パートナーを解離状態に保つのに適する NaCl、MgCl₂ 、LiCl などの塩あるいは尿素、あるいは塩酸グアニシジンを加え、周知の方法 により pH２〜１２領域で固体担体にカツプリングさせることを特徴とする請求 項７記載の方法。 ９、請求項１〜６記載の患者特異性の免疫吸着剤の体外搬出法への使用。 １０、請求項１〜６記載の患者特異性の免疫吸着剤の身体固有の免疫学的に有意 な物質の 製造およびその加工への使用。