PL184541B1

PL184541B1 - Sposób wytwarzania immunoadsorbentów specyficznych dla pacjenta i zastosowanie immunoadsorbentów specyficznych dla pacjenta do pozaustrojowej aferezy

Info

Publication number: PL184541B1
Application number: PL96325897A
Authority: PL
Inventors: Heinrich@Hans@Werner; Ramlow@Wolfgang; Boeden@Hans@Friedrich; Neumann@Hans@Georg; Meyer@Udo; Teller@Joachim
Original assignee: Privates Inst Bioserv Gmbh
Priority date: 1995-10-05
Filing date: 1996-10-03
Publication date: 2002-11-29
Also published as: JP3930564B2; US6866846B1; HUP9900462A2; DE19538641C2; WO1997014964A2; CA2234088A1; NO981530D0; NO981530L; DE19714913A1; ATE215697T1; AU1716297A; NZ330102A; HU226017B1; WO1997014964A3; EP0859957B1; RU2167705C2; DK0859957T3; EP0859957A2; DE19714913B4; NO321159B1

Abstract

1. Sposób wytwarzania specyficznych dla pacjenta immunoadsorbentów, znamien- ny tym, ze najpierw wydziela sie stosujac bialko A, kompleksy immunologiczne obejmu- jace antygeny i przeciwciala, z krwi, plynu mózgowo-rdzeniowego lub innych plynów ustrojowych pacjenta, nastepnie oczyszcza sie te kompleksy immunologiczne, po czym rozdziela sie na aktywne skladniki takie jak przeciwciala i antygeny, a nastepnie sprzega sie kowalencyjnie te skladniki z materialami nosnikowymi. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania immunoadsorbentów na podstawie specyficznych przeciwciał i ewentualnie antygenów, które na skutek procesów immunopatologicznych są odpowiedzialne za powstawanie lub utrzymywanie się wielu chorób, co umożliwia celową ingerencję w patologiczną regulację układu immunologicznego. W wyniku tej

184 541 ingerencji uzyskuje się działanie kliniczne, które nie niesie ze sobą oddziaływania na cały układ odpornościowy, jak to często bywa w przypadku zwykłej terapii drogą farmaceutycznej immunosupresji.

Sposób według wynalazku umożliwia ponadto zwiększanie poziomu i otrzymywanie w stanie czystym immunopatologicznych, swoistych dla organizmu substancji i prowadzi do uzyskania w ten sposób nowych możliwości badania przyczyn i opracowania sposobu leczenia.

Mechanizm reakcji odpornościowej jest złożony i opiera się na prawidłowej regulacji oddziaływań lokalnych i układowych komórkowych i humoralnych elementów niespecyficznej obrony oraz na układzie specyficznej obrony, składającym się ze zaktywowanych komórek układu wytwarzania limfocytów oraz na produkowanych przez nie czynnikach pośredniczących i przeciwciałach.

W zależności od stymulacji sprawność obronna może być różna.

Taki wzrost możliwości obronnych nabywa się w sposób naturalny, podczas pojawienia się infekcji, albo w sposób sztuczny, to jest za pomocą leków. Odbywa się to zarówno układowo, jak i miejscowo poprzez błony śluzowe przewodu oddechowego, trawiennego i moczopłciowego.

Organizm natychmiast reaguje na infekcję w sposób naturalny. Jakość i wielkość natychmiastowej reakcji zależy od rodzaju antygenu oraz miejsca wnikania. W zasadzie takie same reakcje pojawiają się przy podawaniu szczepionek, jak i innych substancji obcych. Specyficzna obrona, dająca się mierzyć na przykład przez wykrycie specyficznych przeciwciał, skuteczna jest dopiero po kilku dniach. Jeżeli usunięta jest przyczyna powodująca chorobę, to wytwarzanie specyficznych przeciwciał prowadzone jest w coraz mniejszym stopniu i ostatecznie ustaje. Po biologicznym rozkładzie przeciwciał jeszcze tylko istnienie specyficznych komórek „pamięci” wskazuje na to, z którymi antygenami rozprawił się organizm w przeszłości. W określonych okolicznościach, przeważnie niemożliwe jest szczegółowe określenie przyczyny, organizm reaguje nadmiernie na swoiste dla niego struktury. Rozwijająca się reakcja autoirhmunologiczna prowadzi do postępującej destrukcji tkanki własnej organizmu, której produkty rozkładu ponownie stymulują układ odpornościowy. Jeżeli taki patologiczny układ regulacji nie zostanie przerwany, to skutki przynajmniej dla ostatnio dotkniętej tkanki są fatalne.

Zachorowania o podłożu lub przy udziale immunopatologicznym są częste. Na skutek ich chronicznego przebiegu oraz małej podatności na leczenie, wpływają one bardzo niekorzystnie na jakość życia dotkniętych nimi ludzi i powodują olbrzymie straty w gospodarce narodowej. Jedną z najczęstszych chorób autoimmunologicznych jest reumatoidalne zapalenie stawów, na które choruje około 1% ludności. Wiekiem, w którym u pacjentów ujawniania się ta choroba jest około 40 rok życia. Po 10 latach od zachorowania około 50% pacjentów staje się niezdolna do podjęcia zatrudnienia, a 10-20% dotknięta jest najcięższym kalectwem. Dotychczas uzyskane wyniki leczenia drogą immunosupresji i terapii wspomagającej są niewystarczające i kończą się często przerwaniem leczenia. Najwyżej po trzech łatach jeszcze tylko u około 50% pacjentów leczonych początkowo zgodnie z terapią podstawową jest leczonych skutecznie.

Z powodu często niewystarczającej skuteczności i dużych skutków ubocznych zwykłej terapii immunosupresyjnej wciąż istnieje potrzeba opracowywania nowych sposobów leczenia chorób autoimmunologicznych (patrz J. Sony: Early approches to immunotherapy of rhematoid arthritis, Eur. J. Rheumatol. Inflam: 11 (1991), strony 139-147).

Takie terapie mają na celu uruchomienie humoralnych i komórkowych mechanizmów odpornościowych, jak również układów pośredniczących. Obejmuje to doświadczalne wyniki terapeutyczne, które przyniosły pierwsze sukcesy w próbach na zwierzętach i w praktyce klinicznej. Decydujący przełom w prognozowaniu pacjentów z chorobami autoimmunologicznymi nie mógł być dotychczas osiągnięty.

W wielu chorobach autoimmunologicznych i schorzeniach immunopatologicznych stosowano z powodzeniem wymianę osocza i sorpcję osocza (R. T. Baldwin, R. R. Pierce oraz O. H. Frazier: Guillan-Barre syndrome after heart implantation. J. Heart. Fungtransplan: 11 (1992), 817-819; J. Braun, J. Sieper, A. Schwarz, F. Keller, J. Heitz oraz Η. V. Amein: Severe

184 541 lupus crisis with agranulocilosis and anuric renal failure due to a mesangial lesion (WHO TIB) Succesful treatment with cyclophosphamid pulse followed by plasmapheresis (2). Br. J. Rheumatol: 30 (1991), 312-313; P. C. Dau: Plasmapheresis in acutemultiple sclerosis: Rationale and resuits. J. Clin.Apheresis: 6 (1991), 200-204; H. H. Euler, J. O. Schroeder, R. A. Zeuner i E. Teske: a randomized trial of plasmapheresis and subsequent pulsecyclophosphamide in severe lupus: Design of the LPSG trial. Int-J-Artif-Organs: 14 (1991), 639-646; D. C. Hess,

K. Sethi i E. Awad: Thrombotic thrombocytopenic purpura in systemie lupus erythematosus and antiphospholipid antibodies: Effective treatment with plasma exchange and iminunosuppresion. J-Rheumatol: 19 (1992), 1474-1478; R. Korithenberg iM. Sauer; The GuillainBarre syndrome in childhood. Clinical course and therapeutic measures. Monatsschr-Kinderheilkd: 140 (1992), 792-798).

Wymiana osocza jest najstarszą metodą terapeutyczną, w której oddzielone osocze (plazmafereza membranowa lub wirowanie) jest usuwane i jednocześnie zastępowane przez osocze dawcy lub albuminę ludzką. Podczas leczenia wymienia się pojedynczą lub podwójną ilość osocza pacjenta. Taki sposób nie jest jednak selektywny. Aby usunąć jeden lub kilka patogennie ważnych składników odrzuca się całe osocze i substancje, które mają podstawowe znaczenie dla pacjenta. Ma to dotkliwe skutki dla pacjenta, które próbuje się wyrównać różnymi terapiami zastępczymi. Obok tego istnieje niebezpieczeństwo przeniesienia wirusów, tókich jak HIV lub wirus zapalenia wątroby.

Przy sorpcji osocza wcześniej oddzielone osocze przepuszcza się przez materiał adsorbentu. Z materiałem adsorbentu sprzęgają się materiały, które z określonymi składnikami osocza tworzą połączenie i w wyniku czego usuwa się je z plazmy. Jeżeli sorpcję osocza wykorzystuje się do usuwania immunologicznie ważnych substancji, to taki sposób określa się jako immunoadsorpcję. W zależności od stosowanego materiału adsorbentu proces ma różną selektywność i specyficzność. To z kolei warunkuje skuteczność terapii i skutki uboczne. Do adsorpcji immunoglobulin i immunokompleksów z oddzielonego osocza zastosowano klinicznie różne ligandy i nośniki.

Tabela 1

Przykłady ligandów z klinicznym zastosowaniem w aferezie pozaustrojowej

Białko P paciorkowców

Hydrofobowe aminokwasy (tryptofan względnie fenyloalanina) Siarczan dekstranu

IgG poddany agregacji, - ludzki anty-LgG Antygen grup krwi

Następująca tabela podaje przegląd chorób autoimmunologicznych leczonych skutecznie za pomocą pozaustrojowej immunoadsorpcji.

Tabela 2

Schorzenia autoimmunologiczne skutecznie leczone drogą aferezy/adsorpcji immunologicznej:

Szybko postępujące zapalenie kłębuszkowe nerek, skupione stwardnienie kłębuszków, układowy toczeń rumieniowaty, zespół antyfosfolipidowy

Zapalenie naczyń, na przykład guzkowe zapalenie tętnic, M. Wegener Reumatoidalne zapalenie stawów Immunologiczna plamica małopłytkowa

184 541

c.d. tabeli 2

Zahamowanie czynników koagulacyjnych

Hiperiminunizowani względnie niekompatybilni ABO, ewentualni biorcy przeszczepów Zapalenie wielomięśniowe

Choroby neurologiczne, na przykład zespół Guillaina Barre'a, choroba wielonerwowa, stwardnienie boczne rozsiane, dotkliwe osłabienie mięśni, stwardnienie rozsiane

Niedogodności terapii farmaceutycznej przy chorobach autoimmunołogicznych

Immunosupresja farmaceutyczna jest nieselektywna i niespecyficzna. Także terapie immunologiczne nowego rodzaju (monoklonalne lub wieloklonalne przeciwciała przeciwko znacznikom aktywacji lub strukturom receptorowym) tłumią reakcję immunologiczną nieselektywnie i ewentualnie indukują ze swojej strony zjawiska immunologiczne w organizmie.

Niedogodności dotychczasowego sposobu aferezy/adsorpcji przy leczeniu schorzeń autoimmunologicznych

Niedogodność wszystkich dotychczas znanych układów aferezy/adsorpcji polega analogicznie do farmaceutycznej immunosupresji na ich niedostatecznej selektywności. Dotyczy to już stosowanych sposobów (znanych z amerykańskiego opisu patentowego nr US 4 681 870, w których na odpowiednim nośniku utrwala się białko A Staphyllococcus aureus. Takim sposobem z krwi pacjenta uzyskuje się niespecyficznie IgG i kompleksy IgG. Odnosi się to także do opisanego przez Davisa (zgłoszenie PCT nr WO 86/07152) sposobu wykorzystania niespecyficznych białek sprzężonych z nośnikiem, zwłaszcza immunoglobulin różnych gatunków jako immunoadsorbentów immunokompleksów. Takim sposobem eliminuje się z niego immunokompleksy, ale nie poszczególne reaktywne składniki, które stale tworzą się na nowo przy chorobach autoimmunołogicznych.

Z amerykańskiego opisu patentowego nr US 4 551 435 dla Liberii i Pollora znany jest sposób usuwania z krwi substancji i immunokompleksów, traktując krew pacjenta specyficznymi przeciwciałami o określonym stężeniu, które z usuwaną substancja tworzą następnie immunokompleksy. Te z kolei eliminuje się z krwi za pomocą takich czynników, jak C1g, czynniki reumatoidalne, receptory Fc i komórki zawierające receptory Fc, utrwalone na stałym nośniku. W sposobie tym zakłada się, że znana jest przyczyna powodująca schorzenie, co nie ma miejsca w większości przypadków chorób autoimmunołogicznych oraz że przyczynowy antygen do wytwarzania przeciwciał występuje w stanie oczyszczonym. Samo usuwanie immunokompleksów odbywa się niespecyficznie, nie poprzez białko A, lecz przez biocząsteczki, które fizjologicznie wykazują wysokie powinowactwo do immunoglobulin.

Należy mieć na uwadze, że struktury immunologiczne związane patofizjologicznie, a nawet same zjawiska odpornościowe w jednym i tym samym schorzeniu mogą być różne w przypadku poszczególnych schorzeń autoimmunołogicznych. Stosowanie dotychczas znanych sposobów aferezy prowadzi nie tylko do wyeliminowania ważnych immunopa-tologiczme, lecz także fizjologicznych, koniecznych do obrony organizmu immunoglobulin. Wynikiem jest ogólne osłabienie układu odpornościowego z niebezpieczeństwem komplikacji septycznych

Wynalazek ma na celu opracowanie sposobu terapii dla pacjentów, którzy cierpią na choroby uwarunkowane nieprawidłową regulacja układu odpornościowego, które na skutek procesów immunopatologicznych rozwijają się w chroniczne, trudne do leczenia postacie chorób. Podstawą wynalazku jest opracowanie immunoadsorbenta, specyficznego dla danego pacjenta, z pomocą którego można usunąć z krwi lub osocza pacjenta drogą adsorpcji patogenne immunokompleksy, autoprzeciwciała i antygeny.

W sposobie według wynalazku immunokompleksy usuwa się z osocza pacjenta, na przykład za pomocą immunoadsorbentów, białka A i po odpowiedniej elucji prowadzi się rozdział na biologiczne składniki. Składniki można rozdzielić znanymi sposobami, na przykład chromatografią w żelu, po czym osobno lub w postaci mieszaniny przeciwciał i B antygenów

184 541 można przeprowadzić sprzęganie z odpowiednim materiałem nośnikowym. Za pomocą takich immunoadsorbentów można specyficznie drogą plazmafcrezy usunąć immunokompleksy przeciwciała i antygeny mające znacznie dla choroby z osocza pacjenta. Kolumny z immunoabsorbentami według wynalazku można powtórnie aktywować i wielokrotnie używać. Wytwarzanie takich immunoadsorbentów specyficznych dla pacjenta jest w ogólności możliwe dla każdej choroby, w której rolę patogenetyczną pełnią autoimmunokornpleksy.

Bardziej szczegółowo: immunokompleksy usuwa się początkowo z osocza pacjentów znanym nieselektywnym sposobem, na przykład za pomocą immunoadsorbentów - białka A, a po odpowiedniej elucji rozkłada na biologicznie czynne składniki. Z kolei składniki można rozdzielić znanymi sposobami, na przykład drogą chromatografii na żelu, albo w postaci mieszaniny przeciwciał i antygenów związać z odpowiednim materiałem nośnikowym. Korzystny jest rozdział immunokompleksów w środowisku kwaśnym względnie alkalicznym, korzystnie w zakresie pH 1-5 lub 10-12, na składniki, które korzystnie po frakcjonowaniu i korzystnie po dodaniu soli, takich jak NaCl, MgCl₂, LiCl, albo mocznika lub chlorowodorku guanidyny, dodaje się w celu utrzymywania reagentów od określonego stężenia w stanie zdysocjowania, sprzęga się w zakresie pH od 2 do 12 znanymi sobie sposobami z materiałami stałymi.

Za pomocą takich immunoadsorbentów można usunąć z osocza pacjentów specyficznie „swoiste”, istotne dla choroby immunokompleksy, przeciwciała i antygeny drogą pozaustrojowej immunoadsorpcji. Takie kolumny nadają się do reaktywacji i przewidziane są do wielokrotnego wykorzystania. Wytwarzanie takich specyficznych dla pacjenta immunoadsorbentów możliwe jest w ogólności przy każdej chorobie, w której patogenetyczną rolę odgrywają autoimmunokompleksy.

Sposób według wynalazku umożliwia oprócz wykorzystania terapeutycznego także wydzielanie substancji z krwi pacjenta, które są przynajmniej współodpowiedzialne za spowodowanie nieprawidłowej regulacji układu odpornościowego. Upraszcza to badania patogenezy chorób autoimmunologicznych względnie schorzeń, które w swoim przebiegu wzmagają się przez nieprawidłowe działania immunologiczne.

Przewaga nad znanymi rozwiązaniami polega na tym, że:

1. usuwa się nie tylko immunokompleksy, lecz także inne reagenty;

2. nie zachodzi wprowadzenie obcych immunoglobulin (wykluczone jest przeniesienie choroby, takiej jak HIV oraz unika się dodatkowych kosztów);

3. bez znajomości przyczyny choroby można wytwarzać tanio immunoadsorbenty specyficzne dla pacjenta. W ten sposób można przygotować specyficzne narzędzia terapeutyczne także dla takich chorób autoimmunologicznych, dla których z powodu rzadkości zachorowań - zbyt wysokie koszty, odrzuca się kierunkowe badania w przemyśle;

4. można specyficznie zwielokrotniać, wydzielać, a przez to przygotowywać do dalszych badań antygeny i ewentualnie przeciwciała, które są odpowiedzialne za wywoływanie, względnie utrzymywanie się choroby autoimmunologicznej poszczególnego pacjenta.

Wynalazek wyjaśniono bliżej poniżej.

Pacjentów, którzy cierpią na choroby autoimmunologiczne, takie jak na przykład reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń rumieniowaty lub stwardnienie rozsiane, poddaje się pozaustrojowej aferezie przy wykorzystaniu immunoadsorbentów na bazie białka A paciorkowców. Po zakończeniu cyklu aferezy kolumnę przemywa się dokładnie buforem, do którego dodane są detergenty, albo drogą podwyższonego stężenie jonów (na przykład 1-3 mole/l NaCl) usuwa się z kolumny składniki osocza związane adsoipcyjnie. Uwolnienie adsorpcyjnych składników osocza kontroluje się drogą elektroforezy lub za pomocą próby immunologicznej buforu płuczącego. Na koniec ma miejsce elucja immunoglobulin, immunokompleksów i zdysocjowanych reagentów za pomocą gradientów pH (na przykład buforu cytrynianowego lub octanowego, pH 7,2) albo stężonych roztworów soli o różnych wartościach pH (od 4 do 7). Drogą elektroforezy, chromatografii lub innych odpowiednich sposobów rozdzielania bada się wyeluowane frakcje pod względem widma ich białek i stopnia dysocjacji immunokompleksów.

Do utrwalenia na stałych nośnikach wykorzystuje się frakcje, w których immunokompleksy rozdzielone są na reaktywne składniki. Te z kolei jeśli jest to wskazane przed sprzężeniem rozdziela się. Składniki immunokompleksów sprzęga się albo oddzielnie albo w postaci mieszaniny

184 541 z materiałami nośnikowymi aktywowanymi estrem metylowym węglanu ONB lub kwasu N-hydroksybursztynowego. Po usunięciu wszystkich niezwiązanych składników uzyskuje się specyficzny dla pacjenta i dający się regenerować immunoadsorbent, za pomocą którego usuwa się selektywnie z krwi pacjenta tylko te substancje, które są odpowiedzialne za immunopatologię, nieprawidłowo regulowanego humoralnego układu odpornościowego.

Wynalazek będzie bliżej wyjaśniony na przykładach.

Przykład I

Badania modelowe w celu określenia aktywności biologicznej utrwalonego ludzkiego IgC przez wiązanie ludzkiego anty-IgC (koza) - tabela 3.

Sprzężenie ludzkiego IgC z danymi nośnikami (Sefaroza 6FF i celuloza perełkowa) odbywa się przez elucję. Do sprzężenia ludzkiego IgG wykorzystano żel aktywowany za pomocą Cl-CO-ONB z około 30 pmolami grup ONB-węglanowych na ml.

ml surowicy odpornościowej (5,3 mg ludzkiego anty-IgC) rozcieńczono za pomocą 1 ml PBS i przepuszczono przez dany nośnik (prędkość przepływu 0,1 ml/min). Kolumny przemyto kilkoma objętościami kolumnowymi PBS i 3 M NaCl o pH 5. Elucję prowadzono 0,1 M chlorowodorkiem glicyny, 0,05% Tween 20, pH 2,0 (prędkość przepływu 1,0 ml/minutę, 2-6°C). Oznaczanie stężenia białek prowadzono spektrofotometrycznie przy długości fali 280 nm po zobojętnieniu wycieku za pomocą 0,5 M K₂HPO₄. Względna zdolność wiązania przeciwciał na ml żelu odniesiona jest do sprzężenia ludzkiego IgG w warunkach standardowych (0,5 M bufor fosforanowy, 0,05% Tween 20, pH 7,2).

Tabela 3

Określenie aktywności biologicznej utrwalonych ludzkich IgG (związanych w warunkach elucji) drogą prób wiązania/elucji z przeciwciałem (kozim) ludzkiego IgG drogą chromatografii powinowactwa

ONB-aktywowany	Warunki wiązania	Ilość sprzężonego ludzkiego IgG	Zdolność wiązania ludzkiego anty-IgG	Wydajność wiązania utrwalonego IgG na 1 pg przeciwciała na mg żelu	Względna aktywność nośników
Celuloza perełkowa	0,5 Fosforan, pH 7,2	2,3	4,1	1800	100
Celuloza perełkowa	0,5 Fosforan, pH 7,2	6,2	4,1	660	100
Celuloza perełkowa	0,1 Cytrynian, pH 3,0	6,2	2,2	360	54
Celuloza perełkowa	0,1 Cytrynian, pH 3,0	3,8	4,3	1100	105
Celuloza perełkowa	4,5 M MgCl₂, pH 6,0	1,4	2,5	1790	61
Sefaroza 6FF	0,5 Fosforan, pH 7,2	3,5	3,2	910	78
Sefaroza 6FF	0,1 Cytrynian, pH 3,0	1,2	2,5	2080	61
Sefaroza 6FF a)	0,1 Cytrynian, pH 3,0	5,0	3,3 b)	660	80
Sefaroza 6FF a)	0,1 Cytrynian, pH 3,0	5,0	3,8 c)	760	93
Sefaroza 6FF	0,1 Fosforan, pH 12	2,8	3,2	1140	78
Sefaroza 6FF	4 M Guanidyna, HCl	2,0	3,7	1850	90

a) Zaktywowany za pomocą Cl-CO-ONB w obecności trzeciorzędowej aminy kataliza zasadowa; stopień aktywacji: 20 pmole grup ONB-węglanowych/ml żelu; współczynnik związania: 57%.

b) 53 mg przeciwciał oczyszczonych drogą chromatografii powinowactwem w 9,2 ml zobojętnionego buforu elucyjnego; prędkość przepływu 0,1 ml/minutę; bufor przepłukujący: PBS, 3 M NaCl (pH 5,0); elucja przy prędkości przepływu 1 ml/minutę; wyeluowano 63% wprowadzonych przeciwciał.

c) 53 mg przeciwciał oczyszczonych drogą chromatografii powinowactw w 9,2 ml zobojętnionego buforu elucyjncgo; prędkość przepływu 0,1 ml/minutę; bufor przepłukujący: PBS, 3 M NaCl (pH 5,0); elucja przy prędkości przepływu 0,5 ml/minutę; wyeluowano 70% wprowadzonych przeciwciał.

184 541

Przykład II

Badania modelowe do określenia zdolności wiązania ludzkiego IgG (antygen), utrwalonego za pomocą aktywowanego zasadami węglanu Sefaroza 6FF przy pH 3,0 drogą chromatografii powinowactwa przy wykorzystaniu nadmiaru ludzkiego anty-IgG (przeciwciała) - tabela 4.

Do sprzężenia rozpuszczono ludzki IgG w roztworze sprzęgającym i przefiltrowano (0,2 pm). Roztwór ten dodano do zwilżonej rozpuszczalnikiem, zaktywowanej sefarozy. Sprzęganie prowadzono w temperaturze otoczenia (w ciągu 1 godziny) z ostrożnym poruszaniem. Po zablokowaniu (IM etanoloamina w 0,1 M boranie, pH 8,0) przemywano intesywnie żel w ciągu 1 godziny, na przykład na spieku ceramicznym z 10-krotną objętością kolumny w kolejności: bufor sprzęgający - woda - 0,01 N HCl - woda - 0,1 bufor boranowy w ciągu 24 godzin, pH 8,3 - woda.

Chromatografię powinowactwa prowadzono w temperaturze 2-6°C za pomocą układu ECONO (Bio-Rad) przy użyciu kolumny Omnifit 5,0 x 0,3 cm I.D. (350 pl żelu). Prędkości przepływu dobrano w granicach od 0,25 do 1,0 ml/minutę. Elucję mierzono za pomocą przepływowego fotometru w (280 nm). Po związaniu przeciwciał i przemyciu za pomocą PBS przeciwciała eluowano według następującego programu:

1. 30 minut PBS

2. 60 minut 3M NaCl, pH 5

3. 30 minut PBS

4. 60 minut 0,1 Clycin · HCl, pH 2,0

5. 30 minut PBS.

Prędkość przepływu 0,25 ml/minutę.

Tabela 4

Określenie zdolności wiązania ludzkich IgG [antygen (Ag)], utrwalonych za pomocą aktywowanego zasadami węglanu Sefarozy 6FF przy pH 3,0, drogą chromatografii powinowactwa przy zastosowaniu w nadmiarze ludzkich anty-1gG [przeciwciało (Ak)]

Warunki wiązania Ak	Zdolność wiązania
Nr pró- by	Utrwalony Ag mg/ml żel	Doprowadzony Ak mg/przebieg	Stężenie Ak μ/ml	Stosunek Ak:Ag	Przepro- wadzenie	Prędkość przepływu ml/min	Przemywanie PBS Objętość żelu	Wyeluowana ilość Ak mg/ml żel	%h) Ak/Ag
1	5,0	6,2	1030	2,5	BA	3h RT	20	10,4	104
2	5,0	—	...	2,5	BAE	okresowo	400a)	7,1	71
3	5,0	—	—	2,6	BAE	okresowo	320a)	7,5	75
4	5,0	3,1	210	4,2	BAL	0,02	22	13,7	37
5	5,0	4,1	1050	2,3	ML	0,1	22	7,1	71
6	5,0	4,1	210	2,3	ML	0,1	86	7,7	77
7	5,0	5,7	300	3,3	ML	0,02	22	11,4	114
8	5,0	5,6	925	3,2	MC	0,5	200a)	9,7	97
9	5,0	7,2	210	4,1	MC	0,5	300a)	9,7	97
10	5,0	9,2	525c)	2,4	MCAC	0,5	400a)	9,7	97

RT Temperatura otoczenia

BA Proces okresowy

BAE Elucja Ak związanego w procesie okresowym (Próba 1) po przemyciu PBS w kolumnie

BAL Dodatkowe podanie przeciwciał do przeciwciał związanych w procesie okresowym; przemywanie i elucja na kolumnie

ML #Mikrochromatografia powinowactwa ze zwykłym obciążeniem oczyszczonymi przeciwciałami

184 541

MC #Mikrochromatografia powinowactwa z obciążeniem kolumny przez cyrkulację oczyszczonych przeciwciał MCAC #Mikrochromatografia powinowactwa drogą cyrkulacji z surowicą odpornościową rozcieńczoną w PBS

a) w celu usunięcia nadmiaru podanych przeciwciał i ewentualnie adsoipcyjnie związanych białek, zastosowano przemywanie za pomocą PBS Przemywanie przerywano na kilka godzinowych przedziałów czasowych (względnie 16 godzin) zanim rozpoczęto program elucji

b) Ilość ludzkiego anty-IgG (Ak) określono spektofotometrycznie przy długości fail λ^ (EO²% = 1,38) po zobojętnieniu za pomocą 0,5 M K₂HPO₄. Przyjęto zdolność wiązania 100%, gdy każda utrwalona cząsteczka IgG wiąże 2 cząsteczki anty-IgG.

c) Surowica odpornościowa, rozcieńczona 1:8 w PBS.

Przykład III

a) Elucja przeciwciał anty-HSA (królik) z kompleksów przeciwciało-antygen zHSA przy użyciu płytek mikrofiltracyjnych pokrytych HSA do ustalenia optymalnych warunków elucji w chromatografii powinowactwa (tabela 5).

Płytki mikrofitracyjne z 96 studzienkami pokryto HSA. Każde wgłębienie poddawano inkubacji z 0,1 pg anty-HSA. Jako układ detekcyjny (ELISA) służył anty-IgG królika, sprzężony z fosfatazą alkaliczną (substrat: fosforan 4-nitrofenylu, λ_4<)5_ηη,). Do studzienek odpipetowano po 200 pl buforu elucyjnego. Elucję prowadzono w temperaturze otoczenia w ciągu 1 godziny przy stałym poruszaniu płytką mikrofitracyjną. Po dokładnym przemyciu wgłębienia prowadzono detekcję anty-HSA. W celu oceny utworzono średnią wartość pomiarów z danych 8 studzienek (%CV = 4,4). Ilość procentową wyeluowanych przeciwciał anty-HSA z PBS przyjęto jako 0%.

Tabela 5

Bufor elucyjny roztworu kompleksów Ak-Ag eluowany anty-HSA-AK (%)
PBS, pH 7,3	0
PBS+ 1% SDS, pH 7,3	51
0,10 M cytrynian, pH 2,5“	100
0,1 OM cytrynian, pH 3,0“	73
0,10 M cytrynian, pH 3,5“	27
0,10 M cytrynian, pH 4,0	8
0,05 M cytrynian, pH 2,5“	100
0,10 M cytrynian/fosforan, pH 7,3	0
0,10 M cytrynian/fosforan, pH 6,0	0
0,10 M cytrynian/fosforan, pH 5,0	0
0,10 M cytrynian/fosforan, pH 4,0	2
3,00 M KSCN, pH 7,3	41
3,00 M NaCl, 5,0“	0
3,00 M Guanidyna*HCl, pH 7,3	66
4,00 M Guanidyna*HCl, pH 7,3	90
6,00 M Mocznik, pH 7,3	7
0,10 M Boran, pH 11,0,	35
0,10 M Fosforan, pH 11,5	49
0,10 M Fosforan, pH 12	91

z 0,05% Tween 20

b) Utrwalenie anty-HSA-HSA na katalizowanym zasadami, aktywowanym węglanie Sefaroza 6FF w środowiskach sprzęgających, które wykorzystuje się jako roztwory elucyjne do chromatografii immunopowinowactwa (tabela 6).

Roztwory sprzęgające przefiltrowane (0,45 pm) i potraktowane sprzęganymi białkami dodano do wilgotnego, aktywowanego ONB-węglanu Sefaroza 6FF. Sprzęganie odbywało się w ciągu 1 godziny w temperaturze otoczenia z lekkim poruszaniem. Następnie dokonywano blokady w ciągu 1 godziny w temperaturze otoczenia za pomocą etanoloaminy w buforze

184 541 boranowym (pH 8,1). Grupy OBN-węglanowe oznaczano spektrofotometiycznie (max. około 267 nm).

0,5 M bufor fosforanowy, pH 7,3 służył do określenia wartości odniesienia dla maksymalnego utrwalenia. Przemywanie odbywało się jak w przykładzie II. Przeciwciała anty-HSA otrzymano w próbie wstępnej drogą chromatografii powinowactwa (0,05-0,1 M cytrynian, pH 2,0), zobojętniono za pomocą 0,5 M K3PO4, przechowywano w temperaturze -20°C, a po odmrożeniu w celu sprzęgnięcia ustawiono pH 3,0 za pomocą rozcieńczonego HCl.

W celu sprzężenia mieszaniny Ag-Ak rozpuszczono HSA w PBS, doprowadzono wartość pH za pomocą rozcieńczonego HCl i dodano do roztworu przeciwciał.

Oznaczanie białek w buforze sprzęgającym prowadzono spektrofotometrycznie przy OD_{380 nm} (przeciwciało E^o,1= = 1,38 i HSA E^o,1= = 0,67). Utrwalone białka oznaczano po potraktowaniu żelu za pomocą 1 N NaOH w nadmiarze według Lowry'ego.

Wynik sprzęgania (%) jest ilością względną utrwalonych białek w odniesieniu do podanej ilości białek.

Tabela 6

Utrwalenie anty-HSA-HSA na katalizowanym zasadami ONB-węglanie Sefaroza 6FF w roztworach sprzęgających, które wykorzystuje się jako roztwory elucyjne w chromatografii immunopowinowactwa

pmole grup ONB- węglanowych na ml żelu	Medium sprzęgające	pH	Podana ilość w żelu mg/ml	Ilość białek roztworu mg/ml	Utrwalone białka w żelu mg/ml	Wynik sprzęgania
19,8	0,5 M Fosforan	7,3	1,6 A	0,3	1,1	70
31,6	0,5 M Fosforan	7,3	3,9 HSA	3,9	1,7	43
5,1	0,1 M Fosforan	7,3	7,3 A	0,3	0,6	34
22,3	Bufor elucyjny	3,0	3,2 A	0,6	2,3	70
20,3	Bufor elucyjny	3,0	5,0 D	1,6	3,4	67
10,8	Bufor elucyjny	3,0	3,8 B	0,5	2,3	60
19,8	Bufor elucyjny	4,0	3,8 B	0,7	1,2	32
22,3	Bufor elucyjny	3,0	5,7 C	0,9	2,9	50
19,8	4M Guanidyna*HCl	7,3	11,3 B	11,3	4,9	43
22,3	0,1 M Fosforan	12,0	4,8 B	2,0	1,3	28

A anty-HSA C anty-HSA-HSA 1: 2 B anty-HSA/HSA (1:1)

D ludzki anty-IgG/ludzki IgG (1:1)

Przykład IV .....

Wykrywanie aktywności biologicznej (zdolności wiązania) antygenów i przeciwciał na modelu anty-HSA/HSA po utrwaleniu w waruricach rozdzielenia immunokompleksów (tabela 7)

Na katalizowanym zasadami, aktywowanym ONB-węglanie Sefaroza 6FF sprzęgnięto w warunJkach elucji (pH 3,0; pH 4,0; 4 M guanidyna*HCl), jak opisano w przykładach I i IIIB), z anty-HSA/HSA. Po przemyciu kolumny HSA względnie anty-HSA wprowadzono do buforu wiążącego. Po ponownym przemyciu kolumny za pomocą PBS prowadzono elucję (pH 2,0) i oznaczenie fotometryczne stężenia białek.

Za pomocą takich prób modelowych wykazano, że zarówno antygen (HSA), jak i przeciwciała (anty-HSA) z immunokompleksów (anty-HSA/HSA), które utrwalono w warunkach rozdzielenia na nośniku, zachowują swoją zdolność wiązania. HSA utrwalony z immunokompleksów wiązał stale anty-HSA, który po nowej elucji w FLISA odznaczał się wysoką

184 541 reaktywnością względem HSA (wyniki nie pokazane). Przy założeniu, że 1 mol HSA wiąże 1 mol anty-HSA, z immunokompleksów (próba 3), które wiązały 2,1 mg anty-HSA, utrwalono 0,9 mg HSA/ml żelu. Podobne wyniki powtórzono z próbami 5, 7, 13 i 16. Anty-HSA utrwalony z immunokompleksów (IgG królika) utrwalono w tym modelu wprawdzie także skutecznie w standardowych warunkach sprzęgania i można wykazać skuteczność przy anty-IgG królika, lecz widocznie następuje tu sprzężenie w jednym obszarze cząsteczki, które prowadzi do sferycznych przeszkód dla wiązania HSA. Same przeciwciała zachowują swoją aktywność biologiczną.

Tabela 7

Wykrywanie aktywności biologicznej (zdolności wiązania) antygenów i przeciwciał na modelu anty-HSA/HSA po ich utrwaleniu na katalizowanym zasadami, zaktywowanym węglanie Sefaroza 6FF w warunkach rozdzielenia immunokompleksów

Warunki utrwalania a)	Podawanie białek/ml żelu	Stężenie pg/ml	Warunki wiązania	Przemywanie za pomocą PBS	Zdolność wiązania pg/ml żelu
1	2	3	4	5	6
1. 10,8/xmola anty-HSA/HSA 1:1, pH 3, 2, 3 mg/ml	3,0 mg HSA	1055	0,3 ml/min, 43 min, obieg	0,028 ml/min, 43 min	100-200
2. 10.8 pmola anty-HSA/HSA 1:1, pH 3, 2,3 mg/ml	13,4 mg HSA	937	0,5 ml/min, 120 min, obieg	0,5 ml/min, 60 min	100-200
3.10,8 pmola anty-HSA/HSA 1:1, pH3, 2,3 mg/ml	3,7 mg anty-HSA	164	0,5 ml/min, 135 min, obieg	0,5 ml/min, 60 min	2100 (= 0,9 mg HSA)
4. 19,8 pmola antyHSA, pH 7, 1,1 mg/ml	6,1 mg HSA	531	0,5 ml/min, 120 min, obieg	0,5 ml/min, 60 min	100-200
5. 19,8 pmola anty- HSA/HSA 1:1, pH 4, 12 mg/ml	4,2 mg antyHSA	368	0,5 ml/min, 180 min, obieg	0, 5 ml/min, 60 min	1211 (= 0,5 mg HSA)
6. 19,8 pmola antyHSA/HSA 4,9 mg/ml	8,3 mg HSA	578	0,5 ml/min, 90 min, obieg	0,5 ml/min, 60 min	ślady
7. 19,8 pmola antyHSA/HSA 1:1, 4 M guan. 4,9 mg/ml	7,3 mg antyHSA	470	0,5 ml/min, 180 min, obieg	0,5 ml/min, 60 min	4714 (-2,1 mg HSA)
8. 19,8 pmola antyHSA/HSA 11, 4 M guan. 4,9 mg/ml	5,1 mg antyIgG królika	360	0,5 ml/min, 120 min, obieg	0,5 ml/min, 60 min	1977 (36%)
9. 10,8 pmola antyHSA, pH 3, 2,3 mg/ml	5,1 mg antyIgG królika	360	0,5 ml/min, 120 min, obieg	0,5 ml/min, 60 min	.1480 (54%)

184 541

c.d. tabeli 7

1	2	3	4	5	6
10. 19,8 pmola antyHSA, pH 7, 1,1 mg/ml	5,1 mg anty-IgG królika	360	0,5 ml/min, 120 min, obieg	0,5 ml/min, 60 min	2246 · (100%)
11. 22,3 pmola antyHSA, pH 3, 2,3 mg/ml	5,1 mg anty-IgG królika	360	0,5 ml/min, 120 min, obieg	0,5 ml/min, 60 min	2246 (100%)
12. 22,3 pmola antyHSA, pH 3, 2,3 mg/ml	13, 8 mg antyIgG królika	926	0,5 ml/min, 120 min, obieg	0,5 ml/min, 60 min	100-200
13. 22,3 pmola antyHSA/HSA 12, pH 3, 2,9 mg/ml	6,9 mg antyHSA	477	0,5 ml/min, 120 min, obieg	0,5 ml/min, 60 min	3586 (= 1,6 mg HSA)
14. 22,3 μ mola antyHSA/HSA 12, pH 3, 2,9 mg/ml	11,2 mg	784	0,5 ml/min, 120 min, obieg	0,5 ml/min, 60 min	100-200
15.22,3 μ mola antyHSA/HSA1:1, pH 12, 13 mg/ml	6, 8 mg HSA	600	0,5 ml/min, 70 min, obieg	0, 5 ml/min, 60 min	100-200
16. 22,3 μ mola 16 antyHSA/HSA, 1:1, pH 12, 1,3 mg/ml	4,4 mg HSA	424	0,5 ml/min, 120 min, obieg	0,5 ml/min, 90 min	1579 (= 0,7 mg HSA)

a) dane w pmolach: grupy aktywne na ml żelu

Przykład V

Chromatografia powinowactwa osocza pacjentów z toczniem rumieniowatym (jednocześnie sposób standardowy). Pobrano osocze pacjenta cierpiącego na toczeń rumieniowaty. Dla uzyskania całej globuliny wykorzystano kolumnę z białkiem a (PHARMACIA). Utrwalenia przeciwciał dokonano na aktywowanej ONB-węglanem Sefarozie 6FF (20 pmole/ml).

Roztwory buforowe do immunoadsorpcji

Bufor PA, pH 7,0	1000 ml	Wartość pH doprowadzono za pomocą HCl lub NaOH
Cytrynian trój sodowy	3,30 g
Octan sodowy x 3H₂O	5,45 g
Chlorek sodowy	4,90 g
Wodorofosforan dwusodowy	2,91 g
Dwuwodorofosforan potasowy	0,26 g
Eluent PA, pH 2,2	1000 ml	Wartość pH doprowadzono za pomocą HCl lub NaOH
Kwas cytrynowy x H₂O	6,12 g
Chlorek sodowy	9,00 g
Bufor przemywający	1000 ml	Wartość pH doprowadzono za pomocą HCl lub 3 M NaCl, pH 7,0 NaOH
Cytrynian trójsodowy	3,30 g
Octan sodowy x 3H₂O	5,45 g
Chlorek sodowy	175,00 g
Wodorofosforan dwusodowy	2,91 g
Dwuwodoroibsforan potasowy	0,26 g
Tween 20	0,50 g

184 541

Bufor cytrynianowy	250 ml	Wartość pH doprowadzono za pomocą HCl lub 0,1 M, pH 2,2, NaOH
Kwas cytrynowy	5,25 g

Sposoby:

Kolumnę sprzężoną z białkiem A (5 ml żelu, Pharmacia) doprowadzono do równowagi za pomocą buforu PA. Następnie 20 ml świeżego osocza wirowanego z dużą prędkością zmieszano z buforem PA (1 :2) i naniesiono na kolumnę.

Do chromatografii posłużono się systemem Economo (STORAD). Po opuszczeniu kolumny osocze naniesiono ponownie w celu uzyskania pełnej adsorpcji. Intensywne przemywanie za pomocą PA o objętości 5 kolumn było konieczne dla usunięcia niezaadsorbowanego materiału. Niespecyficznie związane białka usunięto buforem przemywającym, który zawierał 3 M NaCl. Immunoglobuliny i białka eluowały z 0,1 M buforem cytrynowym, 0,05% Tween 20, pH 2,2, z immunokompleksów w postaci ostrego piku. Objętość wycieku wynosiła 6,5 ml. Stężenie białek oznaczano przy z 17,6 mg/ml. Natychmiast po elucji następowało sprzężenie rozdzielonych występujących IgG i białek z aktywowaną ONB-węglanem Sefarozą. W tym celu 6 ml przygotowanego według przepisu producenta żelu dodano do eluatu i wstrząsano w ciągu 1 godziny. Eluat z powodu buforowego działania rozpuszczonych w nim białek miał wartość pH od 1 do 4. Wolne produkty wiązania musialy być odprowadzone z 1 M etanoloaminą w 0,1 M buforze boran owym, pH 8,0. Przez porównanie stężeń białek w połączonych roztworach przemywających z odciekiem białka A ustaliliśmy współczynnik wiązania na 57%. Po dokładnym przemyciu uzyskano żel w postaci nośnika do doświadczeń chromatografii powinowactwa.

W tym celu odwirowano 40 ml osocza pacjenta, rozcieńczono go za pomocą PA w stosunku 1:2 i przepuszczono dwukrotnie przez kolumnę. Niezwiązany, względnie niespecyficznie związany materiał usuwano drogą kolejnych przemywań za pomocą PA o pojemności 10 kolumn, buforu przemywającego i PA. Specyficznie związane białko eluowano za pomocą 0,1 M buforu cytrynianowego, pH 2,2 (fig. 1). Białka osocza i frakcje uzyskane chromatograficznie eluowano według standardowej procedury drogą elektroforezy (SDS-PAGE) w żelu SDS-poliakryloamidowym (Miniprotean II, BioRad). Żele były żelami gradientowymi o stężeniu monomerów od 10 do 25%. Barwienie prowadzono za pomocą barwnika Coomassie Brillant Blue R-250 (fig. 2 i 3).

Na figurze 2 widać, że w eluacie białka A obok przeciwciał znajdują się jeszcze inne białka. Po utrwaleniu mogą one wiązać się specyficznie z odpowiednimi reagentami z osocza pacjenta. W piku elucyjnym 2 (0,1 M bufor cytrynianowy, pH 2,2) po chromatografii powinowactwa (fig. 1) można zidentyfikować w PAGE więcej białek. Oprócz immunoglobulin i kilku wyżej cząsteczkowych białek wyróżniają się zdecydowanie 3 białka, które po analizie PAGE eluatu białka A mogą być wykryte tylko w postaci ledwie widocznych pasm (fig. 3). Mają one względną masę cząsteczkową około 40 kD.

Chromatografia powinowactwa osocza pacjenta ze stwardnieniem rozsianym

Przygotowanie osocza, elucja białka A oraz sprzęganie białek elucyjnych odbywało się analogicznie, jak w przykładzie V. Po wymyciu adsorpcyjnic związanych białek od immunoadsorbenta (pik 1, fig. 4) od matrycy za pomocą buforu elucyjnego odrywa się specyficznie związaną białko, które po PAGE (fig. 5) okazuje się być mieszaniną białek, w której obecne są głównie immunoglobuliny.

Przykład VII

Chromatografia powinowactwa osocza pacjenta z reumatoidalnym zapaleniem stawów

Przygotowanie osocza, elucja białka A oraz sprzęganie białek elucyjnych odbywało się analogicznie, jak w przykładzie V. Po wymyciu adsoipcyjrue związanych białek z immunoadsorbenta (pik 1, fig. 6) z matrycy za pomocą buforu elucyjnego odrywa się specyficznie związane białko, które w wyniku analizy PAGE (fig. 7) okazuje się być mieszaniną białek, w której obecne są głównie immunoglobuliny.

Wynalazek przedstawiono na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia profil elucyjny osocza pacjenta po adsorpcji na Sefarozie 6FF sprzężonej z homologicznymi przeciwciałami i antygenami według standardowego sposobu.

184 541

Odnośniki oznaczają wymianę buforową, przy przemywaniu i elucji (nie wskazuje się załadowania kolumny):

Nr 1 - bufor przemywający, Nr 2 - 0,1 M bufor cytrynianowy', pH 2,2;

Figura 2 przedstawia obraz analizy PAGE eluatu kolumny białka A przed i po sprzężeniu na zaktywowanej ONB-węglanem Sefarozie;

Nr 1/2-5 względnie 10 ul materiału przed sprzężeniem;

Nr 3 - przewodnik 10 kD, Nr 4 - standardy-globulina, Nr 5-8 - jak 1-4, ale po sprzężeniu (to jest materiał niezwiązany);

Figura 3 przedstawia obraz analizy PAGE eluatu, który uzyskano przy pH 2,2 z kolumny immunosorpcyjnej po przejściu osocza homologicznego;

Nr 1-7/9-15 - trakcje szczytowe, Nr 8/17 - odnośnik białkowy 10 kD, Nr 16 - płukanie dodatkowe;

Figura 4 przedstawia profil elucyjny osocza pacjenta po adsorpcji na Sepharozie 6FF sprzężonej z homologowymi przeciwciałami i antygenami zgodnie ze standardową procedurą.

Odnośniki oznaczają wymianę buforu przy przemywaniu i elucji (nie wskazuje się załadowania kolumny):

Nr 1 - bufor przemywający, Nr 2 - 0,1 M bufor cytrynianowy, pH 2,2;

Figura 5 przedstawia obraz analizy PAGE eluatu, który uzyskano przy pH 2,2 z kolumny immunosorpcyjnej po przepuszczeniu osocza homologicznego Nr 1 - standardy 10 kD, Nr 2 - standard γ-gobuulinowy. Nr 3 - frakcta zzzzytowa(pik2, fig. 4), Nr 4-rrakjaa zzczytowa po zagęszczeniu w wirówce Amicon centrifree®;

Figura 6 przedstawia profil elucyjny osocza pacjenta po adsorpcji na Sefarozie 6FF sprzężonej z homologicznymi przeciwciałami i antygenami zgodnie ze standardową procedurą.

Odnośniki oznaczają wymianę buforową przy przemywaniu i elucji (nie wskazuje się załadowania kolumny):

Nr 1 - bufor przemywający, Nr 2 - 0,1 M bufor cytrynianow-y, pH 6,0/Tween Nr 3 - 0,1 M, bufor cytrynianowy, pH 2,2;

Figura 7 przedstawia obraz analizy PACE eluatu, który uzyskano przy pH 2,2 z kolumny immunnsnrpcyjnej po przepuszczeniu osocza homologicznego Nr 1 - 4 - białka z buforu przemywającego, Nr 5/6 -frakcje szczytowe (pik 3, fig. 6). Nr 7 - standardy 10 kD, Nr 8 - standard --globulina.

184 541

Abb. 4:

2

Abb. 5:

3 4

184 541

Abb. 6:

Abb. 7:

2 3 4 5 6 7 8

184 541

Abb. 1:

2

Abb. 2

Abb, 3.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania specyficznych dla pacjenta immunoadsorbentów, znamienny tym, że najpierw wydziela się stosując białko A, kompleksy immunologiczne obejmujące antygeny i przeciwciała, z krwi, płynu mózgowo-rdzeniowego lub innych płynów ustrojowych pacjenta, następnie oczyszcza się te kompleksy immunologiczne, po czym rozdziela się na aktywne składniki takie jak przeciwciała i antygeny, a następnie sprzęga się kowalencyjnie te składniki z materiałami nośnikowymi.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wydziela się kompleksy immunologiczne z płynów ustrojowych pacjentów, którzy cierpią na schorzenia, spowodowane przez nieprawidłową regulację układu odpornościowego lub utrzymują się.
3. Sposób zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że wydziela się kompleksy immunologiczne z płynów ustrojowych pacjentów, którzy cierpią na choroby autoimmunologiczne lub stany immunopatologiczne, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów, szybko postępujące zapalenie kłębuszkowe nerek, systemowy toczeń rumieniowaty, stwardnienie rozsiane, zespół antyfosfoidowy, zapalenie naczyń biorcy przeszczepu z niezgodnością tkanki, zapalenie wielomięśniowe, neurologiczne choroby autoimmunologiczne lub nieprawidłową regulację, immunopatologiczne na skutek chorób infekcyjnych.
4. Sposób zastrz. 3, znamienny tym, że wydziela się kompleksy immunologiczne z płynów ustrojowych pacjentów, którzy cierpią na reumatoidalne zapalenie stawów, toczeń rumieniowaty lub stwardnienie rozsiane.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, że jako materiał nośnikowy stosuje się podłoże zgodne biologicznie, które wiąże kowalencyjnie na swojej powierzchni wiele różnych składników iminunokompleksów.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako materiał nośnikowy stosuje się sefarozę lub celulozę perełkową.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że kompleksy immunologiczne rozdziela się na składniki w kwaśnym lub alkalicznym środowisku, w zakresie pH 2-5 lub 10-12, ewentualnie z dodatkiem soli, takich jak NaCl, MgCl₂, LiCl albo mocznika, albo chlorowodorku guanidyny oraz sprzęganie z materiałami stałymi prowadzi się w zakresie pH 2 od 2 do 12, korzystnie po frakcjonowaniu i po dodaniu soli, takich jak NaCl, MgCl₂, LiCl, albo mocznika, albo chlorowodorku guanidyny, które stosuje się od pewnego określonego stężenia utrzymując reagenty w stanie zdysocjowania.
8. Zastosowanie do aferezy pozaustrojowej specyficznych dla pacjenta immunoadsorbentów otrzymanych według sposobu, w którym najpierw wydziela się stosując B białko A, kompleksy immunologiczne obejmujące antygeny i przeciwciała, z kiwi, płynu mózgowordzeniowego lub innych płynów ustrojowych pacjenta, następnie oczyszcza się te kompleksy immunologiczne, po czym rozdziela się na aktywne składniki takie jak przeciwciała i antygeny, a następnie sprzęga się kowalencyjnie te składniki z materiałami nośnikowymi.