JP2009530422A - 抗体のヒト化方法及びそれによって得られるヒト化抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASSSVSYIHWYQQKPGRAPKPLMYEASSRATGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQSDDFATYYCQQWNYPFTFGQGTKLEIK(配列番号1)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が示される。
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIFHGSDNTEYNDAVKGRFSITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVFYCARWGPHWYFDAWGRGTLVTVS(配列番号2)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASSSVSYIHWYQQKPGRAPKPLMYEASSRATGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQSDDFATYYCQQWNYPFTFGQGTKLEIK(配列番号1)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が示される。
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIFHGSDNTEYNEKFKSKATITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVFYCARWGPHWYFDAWGRGTLVTVS(配列番号3)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASSSVSYIHWYQQKPGRAPKPLMYEASSRATGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQSDDFATYYCQQWNYPFTFGQGTKLEIK(配列番号1)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が示される。
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYRFSNFYIHWVRQAPGQGLEWIGWIFHGSDNTEYNEKFKSKATITADESTSTAYMELSSLRSEDTAPFTFGQGTKLEIK(配列番号4)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASSSVSYIHWYQQKPGRAPKPLMYETSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQSDDFATYYCQQWNYPFTFGQGTKLEIK(配列番号5)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が示される。
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWlGWlFHGSDNTEYNDAVKGRFSITADESTSTAYMELSSLRSEDTAPFTFGQGTKLEIK(配列番号2)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASSSVSYIHWYQQKPGRAPKPLMYETSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQSDDFATYYCQQWNYPFTFGQGTKLEIK(配列番号5)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が示される。
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIFHGSDNTEYNEKFKSKATITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVFYCARWGPHWYFDAWGRGTLVTVS(配列番号3)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASSSVSYIHWYQQKPGRAPKPLMYETSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQSDDFATYYCQQWNYPFTFGQGTKLEIK(配列番号5)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が示される。
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDYYIHWVRQAPGQGLEWIGWIFHGSDNTEYNDAVKGRFSITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVFYCARWGPHWYFDAWGRGTLVTVS(配列番号6)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASSSVSYIHWYQQKPGRAPKPLMYETSNLASGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQSDDFATYYCQQWNYPFTFGQGTKLEIK(配列番号5)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が示される。
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYRFSNFYIHWVRQAPGQGLEWIGWIFHGSDNTEYNEKFKSKATITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVFYCARWGPHWYFDAWGRGTLVTVS(配列番号4)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASSSVSYIHWYQQKPGRAPKPLMYEASSRATGVPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQSDDFATYYCQQWNYPFTFGQGTKLEIK(配列番号1)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が示される。
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYRFSNFYIHWVRQAPGQGLEWIGWIFHGSDNTEYNDAVKGRFSITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVFYCARWGPHWYFDAWGRGTLVTVS(配列番号6)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSKSLLYSNGITYLYWYQQKPGKAPKLLIYQMSNLASGVPSRFSSSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCAQNLEVPWTFGQGTKVEIK(配列番号7)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含む抗ルイスXモノクローナル抗体が示される。
QVQLVESGGGVVQPGKSLRLSCAASGFTFSGYWMSWVRQAPGKGLEWVAEINPDSSTINYTPSLKDKFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKETGTRFDYWGQGTLVTVSS(配列番号8)
QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSSSKSLLYSNGITYLYWYQQHPGKAPKLMIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLDISGLQSEDEADYYCAQNLEVPWLFGTGTKLTVLGQPK(配列番号9)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含む抗ルイスXモノクローナル抗体が示される。
GVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARETGTRFDYWGRGTMVTVSS(配列番号10)
ELTQPPSVSVSPGQTARITCSSSKSLLYSNGITYAYWYQQKPGRAPVMVIYQMSNLASGIPQRFSSSTSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCAQNLEVPWIFGGGTKLTVLGQPK(配列番号11)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含む抗ルイスXモノクローナル抗体が示される。
AVKLVQAGGGVVQPGRSLRLSCIASGFTFSNYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPD SSTINYTPSLKDRFTISRDNSKRTLYMQMNSLRTEDTAVYYCARETGTRFDYWGQGVLVTVSS(配列番号12)
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSVSYLAWYQQKPGRAPKPLMFEISSLKSG VPSRFSGSGSGTEYTLTISSLQSDDFATYYCQQWNYPFTFGQGTKLEIK(配列番号13)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が示される。
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFTNFYIHWVRQAPGQGLEWMGWIFHGSDNTEYNERFQGRVSITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVFYCARWGPHWYFDLWGRGTLVTVS(配列番号14)
IALTQSPGTLSLSPGERATLSCRASSSVSYMAWYQQKPGQAPRLLIFEISTRATGIPDRFSGSGSGTDYTLTISRLEPEDFAVYYCQQWNYPFTFGQGTRLEIK(配列番号15)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が示される。
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELYIHWVRQAPGKGLEWVGWIFHGSDNTEYNEKFQGSVTMTADTSTNIAYMELSSLRSDDTAVYYCARWGPHWYFDVWGQGTMVTVSS(配列番号16)
SIELTQPPSVSVAPGKTARITCGASSSVSYMHWYQQKPGQAPVPVVYEDSDRPSGIPERFSGSGSGNTYTLTISRVEAGDEADYYCQQWNYPFVFGTGTKVTVLGQPK(配列番号17)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が示される。
QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFYIHWVRQAPGQGLEWMGWIFHGSDNTEYNQKFQGRVTITTDESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARWGPHWYFDVWGQGTTVTVSS(配列番号18)
IQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQDVSYMAWYQQKPGKAPKPWIFEISTLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTINSLQPEDFATYYCQQWNYPFTFGGGTKVEIK(配列番号19)
以下のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域を含むモノクローナル抗体が示される。
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKASGYIFSDFYIHWVRQAPGKGLEWMGWIFHGSDNTEYNEKFRGRVTITADTSTDTGYLELSSLRSEDTAVYYCARWGPHWYFDVWGQGTLVSVSS(配列番号20)
RTSKSXLYSNGITYLY、ここでXはLもしくはI;RTSKSLXYSNGITYLY、ここでXはLもしくはS;RTSKSLLYSNGIXYLY、ここでXはTもしくはS;又はRTSKSLLYSNGITYXY、ここでXはLもしくはA。
QMXNLAS、ここでXはSもしくはT;QMSXLAS、ここでXはN,S,KもしくはQ;又はQMSNXAS、ここでXはLもしくはR。
AXNLEVPW、ここでXはQ又はA。
IXPDSSTINYTPSLKDK、ここでXはNもしくはS;INPDXSTINYTPSLKDK、ここでXはSもしくはE;INPDSSXINYTPSLKDK、ここでXはT,N,K,もしくはR;INPDSSTXNYTPSLKDK、ここでXはI,KもしくはT;INPDSSTINYTPSXKDK、ここでXはLもしくはV;又はINPDSSTINYTPSLKDX、ここでXはKもしくはR。
XEISSLKS、ここでXはFもしくはY、又はFEXSSLKS、ここでXはI,A,もしくはD。
FXNFYIH、ここでXはTもしくはS;FTXFYIH、ここでXはNもしくはD;FTNXYIH、ここでXはFもしくはL;又はFTNFYXH、ここでXはI,M,もしくはV。
WXFHGSDNTEYNE、ここでXはIもしくはF、又はWIFHGSDNTEYNX、ここでXはEもしくはQ。
RWGPHWXFD、ここでXはYもしくはA、又はRWGPHWYXD、ここでXはFもしくはK。
本発明では、ある新規抗体の特徴を規定するためのコンピューターによる一連の工程が適用される。本発明には二つの異なる方法が含まれ、各々については以下に要点が述べられる。修飾型抗体について、ヒトにおける医療上許容される形態(本明細書では以後「ヒト化」又は「マウス抗体のヒト化」のことを指す)にまで開発する各々の方法には、コンピューターによる主要な四工程が含まれる。それらの方法では本質的に、抗体の可変領域の軽鎖及び重鎖のヘテロダイマーの三次元構造が用いられる。両方法とも第一工程には、軽鎖及び重鎖から成る親抗体の可変領域セグメントの三次元構造の究明が含まれる。それらの方法では特に、可変領域の軽鎖及び重鎖のコンポーネントから成る親抗体の可変ドメインの三次元構造が用いられる。これらの方法については、当業者であるならば実施されることが明らかと思われる。親抗体の蛋白質構造については、完全抗体、Fv、Fab(Fab)2及びそれ以外の形態から実験的に定めて得てもよく、あるいはProtein Data Baseのようなデータベースからも得てもよい。
本発明のStructure Grafting法の方法論による工程では本質的に、原子配位から解明されたマウスFv抗体の三次元的提示が用いられ、次にそれらの配位はヒト抗体のFv領域構造のデータベース上に重ね合わされる。本発明ではデータベースの抗体、及びそのデータベースの評価方法が図で説明される。本発明では抗体データベースは、パターン認識で親抗体の構造に最も近いものを用いて評価される。その評価には、構造関連蛋白質のランキング及び優先性のための手段が含まれる。その方法では、当業者にとって実際的である蛋白質構造比較のためのニューメリックコンベクションが用いられる。本発明では、構造上等価な原子についての自乗平均分散(rmsd)の利用といったコンピューターの手助けを借りている。本発明では、データベースにより得られる事項と本発明の実施事項との比較のための原子が特定される。そのようなアプローチの例としては、DeepView/Swiss‐PDBViewerで行われ、当業者であるならば分かると思われるIterative Magic Fitコマンド(IMF)のようなコンピューターによる方法が挙げられる。
この方法の次の工程には、最も適合したヒト抗体構造(受容体構造)のどれが親抗体とアミノ酸配列類似性が高いかを求める工程が含まれ、その求める工程は重鎖及び軽鎖の両方の可変領域遺伝子セグメントから得られる入力の組合わせに基づき行われる。BLASTプログラムのようなコンピューターによる方法は、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列の同一性及び類似性を求めるのに用いられ、得られたそれらの結果の各々は、アミノ酸配列比較データベースとして包含される。一般には、両鎖での同一率が85%超であって類似率が85%超である構造が得られると思われる。それより同一率が低く(80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%)類似率も低い(80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%)である構造の配列比較については、この方法で求められると思われる。この方法によると、アミノ酸の同一率%及び類似率%が共にさらに高いと確認されたヒト抗体は、アミノ酸の同一率%及び類似率%が共に低いヒト抗体に比較してランキングが高くなると思われる。次に、構造及び配列においてともに最も適合するヒト構造は、親構造由来CDR配列のグラフト用受容体として選択される。
本発明は、抗体の特異性決定残基(SDR)のコンピューターによる評価の条件を規定する。特異性決定残基とは、抗体分子によってエピトープと認識され得るハプテン、小分子、蛋白質抗原、及びそのほかの分子構造との結合相互作用を仲介するのに必須な決定部分のことである。SDRはハプテン結合性の決定部分に限定されず、抗体への結合の際のハプテンの化学反応に必要な抗体の触媒活性を決定づける部分も含んでいる。これらの機能には、一般的な酸/塩基触媒作用、立体配置触媒作用、静電的触媒作用、金属イオン触媒作用、及び共有結合に関する触媒作用が含まれる。これらのSDRは、一般に抗体のCDR領域内に存在するが、それらの領域には限定されず、その構造によって規定されるようなフレームワーク領域由来の残基も含めることができる。逆に言えば、すべてのCDRには必ずしもSDRが含まれない。
この方法によると、第四ステップは、親抗体CDRの原子配位で受容体構造内のヒトCDRの原子配位を置換えることによって修飾型抗体の初期モデルが創出されるコンピューター処理である。最初に、Clothiaの標準規定による標準的な規定を特徴とし、評価される重鎖及び軽鎖の蛋白質セグメントの各々についてのアミノ酸配列の旧名に基づき、親抗体CDRのアミノ酸残基の位置が決定される。この方法によると、CDRにおけるアミノ酸配列を同定するステップは、Kabat評価基準又はChothia評価基準によって行われる。当業者であるならば、軽鎖可変領域の遺伝子セグメント由来の3CDRの知識、及び重鎖可変領域の遺伝子セグメント由来の3CDRの知識を持ち得るであろう。各々のCDRの境界における12個の残基については、初期グラフトジャンクションと規定される。さらに、親構造及び受容体構造は重ね合わされる。次に、グラフトジャンクションと規定された残基の各々はパターン認識され、以下に述べる方法によって新たなグラフトジャンクションが規定される。対象となる残基で重ね合せ構造がずれている場合(残基の主鎖の原子についてのrmsd値が0.5Å超)、そのジャンクションはループの中央から一残基分離れて移動される。重ね合せ構造がうまくオーバーレイしている場合(残基の主鎖の原子についてのrmsd値が0.5Åに等しいか又はそれ未満)、その残基はSDRリストに対するチェックが入れられる。その残基がSDRである場合、ジャンクションはその残基と規定され、そのジャンクションについてはそれ以上のパターン認識ステップは行われない。残基がSDRでない場合、ジャンクションはループの中央に向かって一残基分近づけて再規定される。これらのステップは、各ジャンクション残基ごとに繰返して適用され、そのステップは、グラフトされ得る配位が親構造及び受容体構造の両方によく重なり、かつリストのすべてのSDRを含むようにすべての残基が規定されるまで行われる。次に、受容体構造内のジャンクション残基によって規定される配位は、親構造由来の対応する配位と置換えられる。
第一ステップには、対象構造のグラフト化領域における親アミノ酸の数をさらに低減する工程も含まれる。ステップ4から得られる最適モデルは、親抗体の構造、ならびに第一ステップで得られた最高スコアのヒト抗体及びヒト化抗体の構造に重ね合わされる。その際、SDRリストには存在しないグラフト化領域内の残基については、個々に修飾が可能と考えられる。各残基について重ね合せが参照されることで、親残基との重なり合いが良好である(主鎖原子を用いて計算されるrmsd値が1.0Å未満)ヒト構造及びヒト化構造のCDRループ内の残基が見出される。それらの残基は、第一ステップで得られた構造に基づく配列比較の表にまとめられる。次に、可能な置換の各々について検定を行い、モデルへの適合性が優れたものが求められる。親残基は最初に、低いエネルギーの立体配置の回転異性体ライブラリーから得られた配位を持つ親側鎖配位を置換することによって、ヒトアミノ酸又はヒト化アミノ酸の側鎖に変えられる。残基のいくつかでは、モデルを用いても重大な立体的不調和を示さない回転異性体がライブラリー内に存在しないと思われる。それらの可能性のある置換基については、この観点から除かれる。親構造がハプテンを含む場合、可能な置換基については、抗原結合へのその寄与の可能性についてさらに解析される。抗原への接触度が低い置換基は、考慮から除かれる。次に修飾型モデルは、200サイクルの共役グラジエント最小化の処理が行われる。修飾された残基の計算されたエネルギーについては、表にまとめられ、さらに親残基の計算されたエネルギーと比較される。うまくいった置換基とは、エネルギー値がゼロ未満であって、好適には親残基に近いものと思われる。置換基のいくつかについては、親の場合よりもスコアが向上すると思われる。それらについては、考察した上で親残基に可能な置換基のリストに加えられる。正のエネルギーのスコアを示す置換基については、置換可能なリストには加えない。このようにすると、可能な残基の各々が順番に考察され、グラフト化領域への変異ライブラリーを含むリストが得られる。
親抗体の構造は、始めに7個の部分、すなわち6個のCDRループ、及び重鎖と軽鎖との両方を含むフレームワーク領域に分けられる。本発明はその際、ほかの抗体の対応する三次元のCDRループ構造及びフレームワーク構造の規定されたデータベース上に、親抗体の対象領域の三次元構造を重ね合わせるためのコンピューターによるアプローチを提供する。本発明は、データベースの抗体、及びデータベースの評価方法を明示する。本発明では抗体データベースは、親抗体に構造が最も近いもののパターン認識によって評価される。その評価には、構造が関連した蛋白質のランキング及び優先づけの手段が含まれる。その方法では、当業者にとって実際的である蛋白質構造比較用のニューメリックコンベクションが利用される。本発明は、構造上等価な原子の自乗平均分散(rmsd)のようなコンピューターツールの使用が適する。本発明は、原子についてデータベースから得られる場合と本発明の実施で得られる場合とを比較して明らかにする。
本発明は、抗体の特異性決定残基(SDR)のコンピューターによる評価を明記する。特異性決定残基とは、ハプテン、小分子、蛋白質抗原、及び抗体分子によってエピトープと認識されるようなそのほかの分子構造との結合相互作用を仲介するのに必須な決定部分である。SDRはハプテン結合の決定部分に限定されないが、抗体への結合時にハプテンの化学反応に必要な交代の触媒活性の決定部分も含まれる。それらの機能には、一般的な酸/塩基触媒作用、立体配置触媒作用、静電的触媒作用、金属イオン触媒作用、及び共有結合触媒作用が含まれる。それらのSDRは、一般に抗体のCDR領域内に存在するが、その領域に限定されず、対象構造によって規定されるようなフレームワーク領域由来の残基が含まれることができる。逆に言えば、すべてのCDRは必ずしもSDRを含まないと思われる。
本質的に、本発明の方法論的ステップでは、原子配位から解明されたFvマウス抗体構造の三次元提示が用いられる。次にそれらの配位については、テキストエディターを用いて6個のCDRループ及びフレームワーク領域に分けられる。それら7個の分割領域は次に、それらの成分ユニットにすでに同様に分けられたヒト抗体の構造の対応するデータベース上に重ねられる。そのようなアプローチの例としては、当業者であれば分かるであろうDeepView/Swiss‐PDBViewerで実施されるようなインテラティブ・マジック・フィットコマンド(IMF)を用いるコンピューターによる方法の使用が挙げられる。
完全な修飾型抗体を組立てるための最終構造を選択するためには、その群で配列比較された主鎖の原子の数が最も多いトップスコアリングソリューションのrmsd値が0.15Å以内である、データベース検索から得られたCDR構造が選択用に考慮される。いくつかの場合では、トップスコアリングソリューションは、rmsdスコアが二番目であるループよりもかなり低いrmsdスコアを示し、その場合、スコアが最高なループのみが考慮される。その選択については、DeepViewにおいてIMFを用い、ヒトループで親ループを重ね合わせることによって行われる。構造に基づく配列比較は、この解析から得られる。次に、それらのループについては親ループと配列が比較され、対象ループについてのすべてのSDRが最終構造内に提示されるように変える必要があると思われるループ内のアミノ酸の数が求まる。導入の必要があるアミノ酸変化の数については、ゼロ(データベースのループが親ループと同一の場合)から全ループに至る(親ループに類似した適当な構造をデータベース内に見出すことができない場合)にまで変動することができる。導入されるアミノ酸変化は、点突然変異又はグラフトのいずれかであり、前者ではデータベースループ内の単一の残基の側鎖が変更され、ループ構造の重ねあわせがうまくいく(rmsd値が0.4未満)領域において親の側鎖にマッチし、後者では親構造由来の一個又は複数の残基が導入される。適合度が高く、かつ要導入残基数が最小であるループが、最終組立て用に選択される。特定のループについては、この観点でのデータベースから得られる適当な選択肢が一個以上存在してもよい。それらの多重選択については、試験可能な抗体の小ライブラリーに取込むことができる。処理の最終ステップは、対象残基の側鎖の立体配置が充分に保存されていることが保証されるように、新規ループ内で保存されるSDRのパターン認識である。側鎖が親構造とデータベース構造との間で異なる場合、データベース構造の側鎖は、捻れ結合の回転によって、親の構造にマッチするように変更される。それらのループは同じフォールディングクラスのCDRに属し、かつデータベースループへの変更数が最小に維持されるため、ループの構造の完全性は新規構造でも維持されると思われる。この解析に最後には、親構造と同様にフォールディングすることが知られているヒトデータベースのループに関連した親SDRを含む少なくとも6個のCDRループが創出される。
この方法によれば、第五ステップは、受容体構造内のヒトCDRの原子配位を親抗体のCDRの原子配位と置換えることによって、修飾型抗体の初期モデルが創出されるコンピューター処理である。最初に、親抗体のCDRアミノ酸残基について、Clothiaの正規規定に従い、かつ評価される重鎖及び軽鎖の蛋白質セグメントの各々についてのアミノ酸配列決定に基づいた標準的な規定を特徴とする位置確定が行われる。この方法によれば、CDR内のアミノ酸配列の同定ステップは、Kabat評価基準又はChothia評価基準を用いて行われる。当業者であるならば、軽鎖可変領域の遺伝子セグメント由来の3CDR、及び重鎖可変領域の遺伝子セグメント由来の3CDRの知識を持ち合わせているであろう。各CDRの境界における12個の残基については、グラフトジャンクションと規定される。これらのジャンクションは構造内での位置が示され、その位置では以前のステップで得られた修飾型CDRループが、選択されたヒトフレームワーク領域に組合される。それらの位置については、構造内の残基の末端が自動的結合の生成にあまりに程遠い場合では、最小化の前に、ペプチド結合を創出する必要があってもよい。
本発明はさらに、アミノ酸を規定してテンプレートの相補性決定領域(CDR)のアミノ酸置換を教唆する。また本発明は、非CDRフレームワーク領域由来のアミノ酸、及び抗体活性に不可欠なそれらの原子配位も詳しく示す。
本発明では、トリガーとなる免疫反応となりえる抗体鎖内の残基及び残基群を同定するための一連のコンピューターによるステップが用いられる。その場合、免疫反応は免疫レパートリーにおける細胞を介した変化、たとえば医療用抗体が「外部の」物質として認識されるようなことによって限定される。当業者によれば、すべての蛋白質のエピトープが、異なるクラスの抗原提示細胞を介した代謝蛋白質断片の提示によって体内の免疫系に明示されてもよいことは明らかなことである。抗体はそれ以外の蛋白質と同様に、細胞が介在するプロセスで蛋白質断片に代謝される。主要組織適合抗原(MHC‐I及びII)が、ペプチド結合の決定要素であり、コンピューターによる方法がクラスI及びクラスIIの受容体に対する結合の親和性及び選択性に関するペプチドのランクづけに実用的であることは明らかと思われる。
本発明は上述のような一連のコンピューターによるステップからなり、それらのステップの出力によって抗体のアミノ酸組成が創出される。この方法は、対での組合わせで提示される軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインの成分を構成する一群の抗体アミノ酸配列を規定する。この方法は、親構造に関連した構造の抗体組成を創出する。本発明は、抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列のライブラリーを形成し、そのライブラリーは「コンビナトリアルライブラリー」と呼ばれる。アミノ酸配列のコンビナトリアルライブラリーは、蛋白質の三次元構造の考察に基づくコンピューターによる関連性のランクづけから導かれる方法及び利点に関係する。そコンビナトリアルライブラリーはさらに、本発明によって単一残基又は残基群の同定の改善が可能になる方法にも関係する。この方法の一部を成す改善評価基準には、構造の保全性の特徴、ハプテンへの高い結合親和性、特異性事由、及び免疫原性が含まれる。
本発明は、抗体変異が抗体の可変ドメイン内に主に存在する二次抗体、及び/又は抗体関連抗体ファミリーを創出する。本発明の方法は、ネズミ、たとえばマウス又はラットのようなヒト以外のソース由来の親抗体に対して適用される。またこの方法は、ネズミ以外の哺乳類、たとえばラクダ又はラマ、由来の親抗体に対しても適用される。また本発明は、親抗体のソースと同じヒト以外の抗体の使用に対しても適用される。またこの方法は、親抗体が合成体からなる場合、及びDNA配列ライブラリーから形成され得るように合成され得る場合でも適用される。本発明によると、親抗体はヒト化抗体であり得る。あるいは、親抗体はヒト抗体であり得る。
この方法によると、コンピューターによる出力は、軽鎖ポリペプチドを含むアミノ酸配列、及び対応する重鎖アミノ酸配列を形成する。この方法にはさらに、指定抗体可変領域遺伝子セグメントライブラリーの選択されたメンバーのアミノ酸配列をコードするDNAセグメントを含む核酸ライブラリーの構築ステップも含まれる。この方法によると、このライブラリーは、軽鎖及び/又は重鎖の遺伝子セグメントのいずれかについての残基の選択においての、一個又は複数の変異を持つ一種又は複数の変異体から構成され得る。同様に、縮重ライブラリーも規定され、その場合の縮重レベルは厳密に制限されてもよい。
抗原に対する修飾型抗体の結合親和性については、試験対象の抗体の型によって変わってもよい。試験対象の修飾型抗体は、本発明の方法論を用いてデザインされるVHとVLとを含む単鎖抗体(scFv)の形であってもよい。場合により、試験対象の選択された抗体は本発明の方法論を用いてデザインされたVHとVLとを含むFabの形であってもよい。立体配置上のフレキシビリティー及び安定性がより高いことを考慮すると、scFvの形の選択された抗体の結合親和性は、Fabの形のそれと比較して1/2−1の低強度を示してもよい。
この方法は、ヒト疾患に介入するための医療上有用な抗体の形成に適用される。本発明は新規抗体の誘導化から構成されるため、新に創出された抗体の有用性は、ヒト疾患における抗原、ハプテン、蛋白質又はそのほかのマクロ分子の役割りによって指向させることができる。本発明の抗体については一般に、モノクローナル抗体に基づく治療に感受性があるいずれの疾患の治療においても個別に使用されることが分かる。治療用抗体については、受動免疫化、又は補体介在リシスのような望まれない細胞又は抗原の除去に用いることができ、それらは抗体に基づく免疫原性を生じさせるこれまでの多くの抗体に伴う本質的な免疫反応(たとえばアナフィラキシショック)を全く伴わない。
ネズミの抗ルイスX抗体の修飾には、本発明の構造グラフト化方法(図1)を用いた。この実施例には、抗原結合性に必須の構造エレメントが保存された抗体修飾における構造情報の有用性の提示が含まれる。特に、構造内のCDRの位置に重要と思われる親抗体のフレームワーク内には、特異的な残基が存在する。これらの相互作用は、この方法によって形成される修飾型抗体内では維持される。親抗体は、Protein Data Bank(コード1UZ8)から得られた解像度1.8Åの固溶型結晶構造を持つ。この構造は、非対称ユニットでの二個の抗体分子を含む。それらの二個の分子についてのrmsdは、430個の炭素原子を用いて計算した結果、0.59Åである。それらの二個の鎖は、構造が極めて類似しているため、修飾におけるすべての連続ステップには第一の鎖を用いた。
本発明の方法は、uPARに結合し、受容体の下流へのシグナル伝達を抑制するネズミのモノクローナル抗体のヒト化体の生成に用いられた。ウロキナーゼ型のプラスミノーデン活性化因子(uPA)は、蛋白質加水分解解裂による活性化の後でuPARに結合する。その活性型uPARは次に、いくつかのエフェクター分子と会合し、エフェクター分子には数種のインテグリン及びビトロネクチン(ウェイ(Wei)ら、1996;サイエンス(Science)273:1551‐5;シュエ(Xue)ら、1997;キャンサーリサーチ(Cancer Res.)57:1682‐9;カリエロ(Carriero)ら、1999;キャンサーリサーチ59:5307、それらのすべての記載は本明細書で参照されることによって取込まれる)が含まれる。それらの下流域のエフェクターは次に、細胞の増殖、遊走、及び侵襲を導く。増殖、遊走、及び侵襲については、癌の進行及び転移に対する統合的プロセスであるため、uPA及びuPARの会合の抑制、あるいはuPARの活性の阻害は、癌の有効な治療として探求されてきた。uPA及びuPARは、乳房、結腸、膵臓、及び前立腺を含む多くのタイプの癌において過剰発現されており、高レベルのuPA及びuPARは、いくつかの癌で予後不良のことと関連性がある(ミズカミ(Mizukami)ら、1994;臨床免疫学及び免疫病理学(Clin.Immunol.Immunopathol.)71:96‐104;Hsuら、1995;アメリカンジャーナルオブパソロジー(Am.J.Pathol.)147;114‐23;de ウィッテ(Witte)ら、1999;ブリティッシュジャーナルオブキャンサー(Br.J.Cancer)79;1190‐8;スティーブンズ(Stephens)ら、1999;ジャーナルオブザナショナルキャンサーインスティチュート(J.Natl.Cancer Inst.)91:869‐74;ガネシュ(Ganesh)ら、1994;ランセット(Lancet)344:401‐2;ペデルセン(Pedersen)ら、1994;Cancer Res.54:4671‐5;Andreasenら、1997;インターナショナルジャーナルオブキャンサー(Int.J.Cancer)72:1‐22;ダフィ(Duffy)、2002;クリニカルケミストリー(Clin.Chem.)48:1194‐7;ルック(Look)ら、2002;ジャーナルオブザナショナルキャンサーインスティチュート94:116‐28;タケウチ(Takeuchi)ら、1993;アメリカンジャーナルオブガストロエンテロロジー(Am.J.Gastroenterol.)88:1928‐33;カンテロ(Cantero)ら、1997;ブリティッシュジャーナルオブキャンサー75:388‐95、それらのすべての記載は、本明細書で参照されることによって取込まれる)。
上記で概要が示されたEPU法(図10及び図11)については、ネズミのモノクローナル抗体ATN‐615を修飾して癌に対抗する治療可能性の価値がある抗体を創出するのに用いられた。可溶性uPAR、及びuPAのN末端断片との複合体の状態の、ATN‐615抗体の、分解能1.9Åの固溶型結晶構造については、Protein Databank(コード2FD6)から得られた。
Claims (37)
- 配列番号1及び配列番号5から成る群から選択されるアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域と、
配列番号2、配列番号3、配列番号4及び配列番号6から成る群から選択されるアミノ酸配列と、
を持つ重鎖可変領域を含むヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号1であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号2である、
請求項1に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号1であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号3である、
請求項1に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号1であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号4である、
請求項1に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号1であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号6である、
請求項1に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号5であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号2である、
請求項1に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号5であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号3である、
請求項1に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号5であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号4である、
請求項1に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号5であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号6である、
請求項1に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 配列番号7、配列番号9及び配列番号11から成る群から選択されるアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域と、
配列番号8、配列番号10、及び配列番号12から成る群から選択されるアミノ酸配列と、
を持つ重鎖可変領域を含むヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号7であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号8である、
請求項10に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号9であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号10である、
請求項10に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号11であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号12である、
請求項10に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 配列番号13、配列番号15、配列番号17及び配列番号19から成る群から選択されるアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域と、
配列番号14、配列番号16、配列番号18及び配列番号14から成る群から選択されるアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域と、
を含むヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号13であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号14である、
請求項14に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号15であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号16である、
請求項14に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号17であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号18である、
請求項14に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号19であって、
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号20である、
請求項14に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 前記ヒト化免疫グロブリンは、抗体テトラマー、Fab又は(Fab)2である、
請求項1〜18のいずれか一項に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 実質的に純粋であることを特徴とする、
請求項1〜18のいずれか一項に記載のヒト化免疫グロブリン。 - 薬学的に許容される担体中に、請求項20に記載のヒト化免疫グロブリンを含む医薬組成物。
- 複数のヒト化免疫グロブリンをデザインする方法であって、
a)親抗体可変ドメイン又はハプテン結合型の親抗体可変ドメインの三次元構造を求める工程と、
b)親構造の複数の特異性決定残基(SDR)を同定する工程と、
c)前記構造を、6個の相補性決定領域(CDR)ループ並びに重鎖と軽鎖とを共に含むフレームワーク領域(FR)を含む複数のセクションに分ける工程と、
d)セクションの前記三次元構造を、複数のヒト受容体抗体の対応する三次元CDRループ及びフレーワーク構造の規定のデータベースに重ね合わせる工程と、
e)親SDRを選択された受容体構造内にグラフトしてヒト化免疫グロブリンのアミノ酸配列のモデルを求める工程と、
f)複数のアミノ酸残基置換に関する前記エネルギー値を計算する工程と、
g)負のエネルギー値を有する複数の残基を選択することによって、前記ヒト化免疫グロブリンの前記アミノ酸配列を最適化する工程と、
h)前記ヒト化免疫グロブリンの複数の可変領域セグメントのアミノ酸配列をデザインする工程と、
を含む、方法。 - 複数のヒト化免疫グロブリンを生成する方法であって、
a)親抗体可変ドメイン又はハプテン結合型の親抗体可変ドメインの三次元構造を求める工程と、
b)親構造の複数の特異性決定残基(SDR)を同定する工程と、
c)前記構造を、6個の相補性決定領域(CDR)ループ並びに重鎖と軽鎖とを共に含むフレームワーク領域(FR)を含む複数のセクションに分ける工程と、
d)セクションの前記三次元構造を、複数のヒト受容体抗体の対応する三次元CDRループ及びフレーワーク構造の規定のデータベースに重ね合わせる工程と、
e)親SDRを選択された受容体構造内にグラフトしてヒト化免疫グロブリンのアミノ酸配列のモデルを求める工程と、
f)複数のアミノ酸残基置換に関する前記エネルギー値を計算する工程と、
g)負のエネルギー値を有する複数の残基を選択することによって、前記ヒト化免疫グロブリンの前記アミノ酸配列を最適化する工程と、
h)ヒト化免疫グロブリンの複数の可変領域セグメントのアミノ酸配列をデザインする工程と、
i)選択された複数の可変領域セグメントの前記アミノ酸配列をコードする複数の核酸断片を含むライブラリーを構築する工程と、
j)核酸断片を宿主生物の複数の細胞内に導入する工程と、
k)複数の組換えヒト化免疫グロブリンが生成されるように前記核酸断片を発現させる工程と、
を含む、方法。 - 標的抗原に対して少なくとも10−5Mの親和性で結合する前記生成されたヒト化免疫グロブリンを同定することをさらに含む、
請求項23に記載の方法。 - 前記生成されたヒト化免疫グロブリンを精製することをさらに含む、
請求項24に記載の方法。 - 複数のヒト化免疫グロブリンをデザインする方法であって、
a)親抗体可変ドメイン又はハプテン結合型の親抗体可変ドメインの三次元構造を求める工程と、
b)前記親の前記三次元構造を、複数のヒト受容体抗体の対応する三次元可変ドメインの規定のデータベースに重ね合わせる工程と、
c)二乗平均平方根偏差(rmsd)値が低い前記複数のヒト受容体抗体を選択する工程と、
d)前記受容体抗体の前記複数の可変ドメインアミノ酸配列を、前記親抗体と比較する工程と、
e)配列の同一性及び類似性の値が高い前記複数のヒト受容体抗体を選択する工程と、
f)rmsd値が低く、配列の同一性及び類似性の値が高い複数の可変ドメインの前記アミノ酸配列をコードする複数の核酸断片を含むライブラリーを構築する工程と、
g)前記親の複数の特異性決定残基(SDR)を同定する工程と、
h)親SDRを選択された受容体構造内にグラフトして前記ヒト化免疫グロブリンの前記アミノ酸配列のモデルを求める工程と、
i)複数のアミノ酸残基置換に関する前記エネルギー値を計算する工程と、
j)負のエネルギー値を有する複数の残基を選択することによって、前記ヒト化免疫グロブリンの前記アミノ酸配列を最適化する工程と、
k)ヒト化免疫グロブリンの複数の可変領域セグメントのアミノ酸配列をデザインする工程と、
を含む、方法。 - 複数のヒト化免疫グロブリンを生成する方法であって、
a)親抗体可変ドメイン又はハプテン結合型の親抗体可変ドメインの三次元構造を求める工程と、
b)前記親の前記三次元構造を、複数のヒト受容体抗体の対応する三次元可変ドメインの規定のデータベースに重ね合わせる工程と、
c)二乗平均平方根偏差(rmsd)値が低い複数のヒト受容体抗体を選択する工程と、
d)前記受容体抗体の前記複数の可変ドメインアミノ酸配列を、前記親抗体と比較する工程と、
e)配列の同一性及び類似性の値が高い前記複数のヒト受容体抗体を選択する工程と、
f)rmsd値が低く、配列の同一性及び類似性の値が高い複数の可変ドメインの前記アミノ酸配列をコードする前記核酸断片を含むライブラリーを構築する工程と、
g)前記親の前記複数の特異性決定残基(SDR)を同定する工程と、
h)親SDRを選択された受容体構造内にグラフトしてヒト化免疫グロブリンの前記アミノ酸配列のモデルを求める工程と、
i)複数のアミノ酸残基置換に関する前記エネルギー値を計算する工程と、
j)負のエネルギー値を有する複数の残基を選択することによって、前記ヒト化免疫グロブリンの前記アミノ酸配列を最適化する工程と、
k)ヒト化免疫グロブリンの複数の可変領域セグメントのアミノ酸配列をデザインする工程と、
l)選択された複数の可変領域セグメントの前記アミノ酸配列をコードする複数の核酸断片を含むライブラリーを構築する工程と、
m)前記核酸断片を宿主生物の複数の細胞内に導入する工程と、
n)複数の組換えヒト化免疫グロブリンが生成されるように前記核酸断片を発現させる工程と、
を含む、方法。 - 標的抗原に対して少なくとも10−5Mの親和性で結合する前記生成されたヒト化免疫グロブリンを同定することをさらに含む、
請求項27に記載の方法。 - 前記生成されたヒト化免疫グロブリンを精製することをさらに含む、
請求項28に記載の方法。 - XがL又はIであるRTSKSXLYSNGITYLYと、XがL又はSであるRTSKSLXYSNGITYLYと、XがT又はSであるRTSKSLLYSNGIXYLYと、XがL又はAであるRTSKSLLYSNGITYXYと、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域軽鎖相補性決定領域1を持つ修飾型抗体1UZ8である、
抗ルイスXモノクローナル抗体。 - XがS又はTであるQMXNLASと、XがN,S,K又はQであるQMSXLASと、XがL又はRであるQMSNXASから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域軽鎖相補性決定領域2を持つ修飾型抗体1UZ8である、
抗ルイスXモノクローナル抗体。 - XがQ又はAであるAXNLEVPWのアミノ酸配列を含む可変領域軽鎖相補性決定領域3を持つ修飾型抗体1UZ8である、
抗ルイスXモノクローナル抗体。 - XがN又はSであるIXPDSSTINYTPSLKDKと、XがS又はEであるINPDXSTINYTPSLKDKと、XがT,N,K又はRであるINPDSSXINYTPSLKDKと、XがI,K又はTであるINPDSSTXNYTPSLKDKと、XがL又はVであるINPDSSTINYTPSXKDKと、XがK又はRであるINPDSSTINYTPSLKDXと、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域重鎖相補性決定領域2を持つ修飾型抗体1UZ8である、
抗ルイスXモノクローナル抗体。 - XがF又はYであるXEISSLKSと、XがI,A又はDであるFEXSSLKSとから成る群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域軽鎖相補性決定領域2を持つ修飾型抗体2FD6である、
抗ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体抗体。 - XがT又はSであるFXNFYIHと、XがN又はDであるFTXFYIHと、XがF又はLであるFTNXYIHと、XがI,M又はVであるFTNFYXHと、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域重鎖相補性決定領域1を持つ修飾型抗体2FD6である、
抗ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体抗体。 - XがI又はFであるWXFHGSDNTEYNEと、XがE又はQであるWIFHGSDNTEYNXと、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域重鎖相補性決定領域2を持つ修飾型抗体2FD6である、
抗ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体抗体。 - XがY又はAであるRWGPHWXFDと、XがF又はKであるRWGPHWYXDと、から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む可変領域重鎖相補性決定領域3を持つ修飾型抗体2FD6である、
抗ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体抗体。
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