KR100464926B1 - ＨＩＶ-1 ｇｐ41의 Ｎ-말단에 특이적으로 결합하는 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 gp 41의 N-말단을 포함하는 단백질에 대한 항체에 관한 것이다. 이 항체를 이용하여 HIV감염에 필수적인 기능을 수행하는 gp41의 기능을 차단하여, 궁극적으로 HIV의 감염을 예방 및 치료를 위한 백신의 제조에 유용하다.

Description

ＨＩＶ-1 ｇｐ41의 Ｎ-말단에 특이적으로 결합하는 항체{ANTIBODY BINDING TO THE N-TERMINAL OF HIV GP41}
본 발명은 HIV의 필수단백질의 기능을 차단하여 HIV의 감염 및 치료를 위한 백신의 제조에 유용한 펩타이드에 관한 것으로, 구체적으로 HIV gp41의 N-말단에 특이적으로 결합하는 펩타이드에 대한 것이다.
HIV 감염은 전세계 4 억 인구가 감염 또는 감염 잠재력을 가지고 있는 실정이다. HIV 에 대한 약물들은 주로 HIV의 주요 단백질들, 예컨대 프로테아제 및 역전사효소 등의 저해제를 개발하여 칵테일 요법으로 투여하고 있다. 그러나, 이들 약물은 HIV-1의 완전한 치료 및 예방이 불가능하며, 장기간 약물투여에 의한 부작용이 관찰되고 있으며, 또한 HIV-1의 치료약에 내성을 지닌 변이들이 출연하고 있는 것 등의 문제점을 고려할 때, 이와 같은 약물의 사용보다는 효과적인 HIV 백신을 개발이 절실히 필요한 실정이다.
HIV 백신을 개발하기 위해서, 감염된 개체로부터 일차적인 HIV 분리균 (primary HIV isolates: PIs)의 감염성을 무력화시킬 수 있는 항체를 만드는 연구가 활발하게 진행되고 있다. 일예로, HIV의 외피 단백질을 이용한 항체의 생산방법은 HIV 외피 단백질은 변이가 심하므로 적용이 어려우므로, 변이가 적으며 숙주세포로 도입 또는 HIV의 생존에 중요한 목표 단백질을 설정하여 이에 대한 항체의 개발을 시도하는 것이 바람직하다.
일반적으로 인간의 후천성 면역결핍증을 일으키는 HIV-1 (Human immundoeficiency virus type-1)는 숙주세포에서 유래된 지질 이중층과 바이러스에 의하여 암호화된 외피 당단백질로 구성되어 있는 대략 직경 100-120 ㎚의 외피 바이러스이다. 지질 이중층은 주조직적합성 항원, 액틴 및 유비퀴톤 (ubiquiton) 등을 포함하여 숙주세포로부터 온 다양한 세포막 단백질을 가지고 있다. 그들의 표면 당단백질은 수용성 당단백질 gp120와 막관통(transmembrane) 당단백질 gp41의 복합체로 구성되어 있으며, gp120은 막관통 단백질인 gp41을 통해 바이러스에 고착되어 있다. HIV-1의 외피 당 단백질 복합체 (gp120/gp41)는 바이러스의 침투에 결정적인 역할을 하는 것으로서, 감염된 세포가 감염되지 않은 주변의 세포들과 융합하도록 매개함으로써 하나의 세포가 많은 핵을 가지는 신시튬(syncytium)을 형성하도록 하여 감염을 진행시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 이와 같은 당단백질 등이 HIV백신을 제조하기 위한 좋은 항원이 될 수 있다.
gp120을 항원으로 이용하여 재조합 백신을 만들려는 시도가 행해졌는데, 많은 백신화의 전략은 gp120가 특히 감염에 있어 초기 결합과 침투 단계를 매개하는 것에 초점을 맞추어 진행되어 왔다. 1993년에는, 미국 국립보건원의 지원하에 HIV 외피 단백질의 표면 gp120 서브유닛의 두 가지 재조합 형태를 백신 후보로 정하여 대규모 효능 연구를 진행하여 무력화 항체 (neutralizing antibody)를 생성하였다. 그러나, gp120가 빠르게 변이되어 이들 항체 저해제가 변이된 gp120을 인식하지 못하는 결과가 나타났다.
그러나, HIV 결합과 융합이 일어나는 동안에 생기는 일시적인 외피-CD4-코어수용체 구조를 포착하기 위해, '융합-수용성’HIV 백신 면역원을 만들어 트랜스제닉 생쥐에 면역시킨 결과 이러한 포름알데하이드-고정화된 완전한(intact) 세포 (FC 백신) 백신이 다양한 지역에서 분리된 24개의 일차적인 HIV 분리체중 23 개의 감염성을 무력화시킬 수 있는 항체를 이끌어낼 수 있음이 밝혀졌다. 불활성화된 완전한 세포 FC 백신의 형태는 임상적인 단계의 개발에는 실현성이 없으나, 이러한 융합-의존성 면역원의 개발은 광범위하고도 효과적인 HIV 백신을 만들 수 있도록 이끌 수 있는 가능성을 제시하고 있으며, gp120 와 같이 변이가 심하지 않은 재조합 단백질을 찾아보려는 시도가 활발하게 진행되고 있다.
gp41은 표적세포와 바이러스 사이의 세포막 융합을 매개하는 역할을 한다고 알려져 있다. gp41의 삼중체(trimer)는 HIV-1의 초기 융합을 매개하므로, gp41에서 유래된 큰 펩타이드(Large peptide)가 시험관에서 HIV-1 감염을 저해하므로 잠재적인 약물 표적일 가능성이 나타났다. 이러한 펩타이드들이 gp 41의 삼중체중 하나 혹은 그 이상의 구성성분을 치환하고 막융합에 필수적인 분자간 상호작용을 저해함으로써 gp41내의 구조적인 변화를 방해한다. gp41의 세포외 도메인에 두 개의 α-헬릭스 도메인 (N-말단 및 C-말단)을 가지고 있으며(도 1b 및 도 1c)(Brian G 등의 J. Mol. Biol. 285, 1 (1999))), 이들 두 도메인간의 상호작용이 바이러스와 표적세포간의 세포막 융합에 중요하리라고 생각되며, 두 헬릭스 도메인의 인식을 저해하면 HIV의 융합 자체에 영향을 끼친다는 사실이 알려졌다. 따라서 연구자들은 gp41 단백질을 재조합 단백질로 발현하여 이에 대한 항체를 제조하고, 이 항체가 HIV 감염을 저해하는지를 확인하려는 실험을 시도하였다.
그러나, 재조합 단백질에 대한 항체는 잘 만들어지나, 일반적으로 이와 같은 항체들이 감염을 방해함을 증명하는 확실한 증거가 밝혀지지 않고 있어 HIV의 백신을 위한 증거가 불충분하다. 일반적으로 이와 같은 현상은 항체가 인식할 수 있는 부위가 감염을 방해할 수 있는 부분과 일치하지 않는 가능성이 있기 때문이다. 따라서, 연구자들은 gp41 재조합 단백질에 대한 항체의 인식 부위에 대한 지도화를 통해 좀 더 분석적으로 일을 해결하려는 경향을 보이고 있다.
여러 가지 gp41 단백질의 항체 에피토페(epitope)를 조사해 본 결과, 이들은 주로 N-말단과 C-말단 사이의 루프 부분을 인식하며, C-말단을 약하게 인식하는 것으로 알려졌다. C-말단을 약하게 인식하는 것은 C-말단에 글리코실화 자리가 있으므로, 루프구조는 항체에 의한 인식이 떨어지는 것으로 생각된다.
결국, N-말단의 아미노산 서열은 여러 가지 바이러스에서 보존되어 있으므로HIV 등을 비롯한 모든 바이러스의 융합기작에서 gp41 단백질을 사용하는 모든 바이러스에 대한 공통되는 목표 단백질이 된다. 따라서 지금까지 gp41 단백질에 대한 항체들이 주로 C-말단 또는 C-말단과 N-말단을 연결하는 루프 부분을 인식한데 반해, N-말단을 인식하는 새로운 항체를 제조하고 이러한 항체를 이용하여 바이러스의 감염 또는 융합을 억제 할 수 있는 치료제로서 HIV 백신을 제공할 필요성이 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하고자, 본 발명은 HIV의 gp 41에 대한 저해효과를 갖는 HIV gp41의 N 말단에 대한 항체를 제공하고자 한다.
또한, 본 발명의 목적은 HIV gp41의 N말단을 포함하는 재조합 단백질을 제조하고, 단클론항체를 제조하는 것을 특징으로 하는 HIV gp41의 저해효과를 갖는 단백질의 제조방법에 관한 것이다.
도 1은 HIV gp 41 단백질의 융합단백질의 구조를 나타낸다. 도 1a는 gp 41의 융합단백질의 구조도로서 융합 펩타이드(fp), 두 개의 소수성 헵타드 반복서열, 막관통 단편(tm)과 세포질 영역(cyto)으로 이루어져 있다. 도 1b 및 1c는 공지된 gp41의 세포외영역의 삼중 코일형태 헬릭스를 나타낸다.
도 2는 Trx-N (gp41의 N-말단 합성 펩타이드)에 특이적인 단클론 항체에 대한 BIAcore를 이용한 센서그램을 나타낸다. 도 2a는 GP-6B4F 항체(용액상)와 Trx-N(고정화됨)과의 상호작용을 설명하는 BIAcore 센서그램이고, 도 2b는 GP-6B4E 항체(용액상)와 Trx-N(고정화됨)과의 상호작용을 설명하는 BIAcore 센서그램이고, 도 2c는 TN-3E10E 항체(용액상)와 Trx-N(고정화됨)과의 상호작용을 설명하는 BIAcore 센서그램이고, 도 2d는 TN-8D6G 항체(용액상)와 Trx-N(고정화됨)과의 상호작용을 설명하는 BIAcore 센서그램이고, 도 2e는 GP-6B8D 항체(용액상)와 Trx-N(고정화됨)과의 상호작용을 설명하는 BIAcore 센서그램이다.
도 3은 gp41-ex (세포외 도메인)에 특이적인 단클론 항체에 대한 BIAcore를 이용한 센서그램이다. 도 3a는 GP-6B8D 항체(용액상)와 gp41-ex(고정화됨)와의 상호작용을 설명하는 BIAcore 센서그램이고, 도 3b는 TN-8D4E 항체(용액)와 gp41-ex(고정화됨)의 BIAcore 센서그램이고, 도 3c는 TN-6B11D 항체(용액)와 gp41-ex (고정화됨)의 BIAcore 센서그램이고, 도 3d는 gp41-ex(고정화됨)와 정상적인 IgG, GP-6B4F, GP-6B11D, 및 TN-8D4E와의 결합에 대한 BIAcore 센서그램이고, 도 3e는 GP-6B4F (용액)와 gp-41(고정화됨)에 대한 BIAcore 센서그램이고, 도 3f는 GP-6B6E 항체(용액)와 gp41-ex (고정화)에대한 BIAcore 센서그램이다.
도 4는 Trx-N (gp 41 N-말단) 및 gp 41-ex 에 교차 반응성을 갖고 gp 41의 억제 기능이 있는 GP-6B4F, TN-3E10E, TN-8D6G 및 TN-8D4E 의 아미노산 서열을 나타낸 것으로, 도 4a는 상기 항체의 중쇄 아미노산 서열을 나타낸 것이고, 도 4b는 상기 항체의 경쇄 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 서열 중 "."으로 나타낸 것은 항체 GP 6B4F와 동일한 서열임을 나타낸다.
본 발명은 HIV의 gp 41의 N말단과 결합하는 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 이와 같이 부분적으로 발현된 N-말단과 C-말단, gp41의 세포외 도메인의 각각에 대해 단클론 항체를 배양하여, 이를 ELISA 및 BIAcore 등으로 그 특이성을 확인하고 이들이 각각 gp41의 N-말단에 특이적인 단백질임을 확인하는 실험을 기술한 것이다.
HIV-1 표면 당단백질 중 하나인 트랜스멤브레인 단백질은 N-말단 트랜스멤브레인 도메인과 C-말단 바이러스 내 도메인으로 구성되어 있는데, N-말단은 gp 41의 중심에 coiled-coil 모티프로 구성된 삼중체를 형성하고 있으며, 이러한 삼중체 coiled-coil로 된 헬릭스 팩킹(packing)으로 되어 있어, HIV gp120와 CD4가 세포에 용이하게 결합하도록 하여, 이러한 퓨소제닉 펩타이드(fusogenic peptide)가 세포막으로 침입할 수 있도록 한다 (Caffrey 등,J.Mol.Biol.271, 819,1998) (Ryu등,Mol.Cells, 8.717-723,1998)
gp41 재조합 단백질을 제조하면, 이들은 생체내에서와 같이 곧 삼중체 또는 사중체(tetramer) 형태를 형성하며, 도 1b와 같이 N-말단은 삼중체 또는 사중체의 속으로 가려지기 때문에 항원으로서의 역할을 잘 수행하지 못하는 경향이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 N-말단 또는 C-말단을 서로 단독으로 발현된 단백질을 얻는 것이 무엇보다도 필요하며, 이는 유 등의 보고에 의하여 최근에 티오레독신(thioredoxin (Trx))에 접합된 형태로 발현되어 순수한 형태로 얻어낼 수 있었다.(Yu et al., Mol cells 1998 Dec 31; 9(6): pp.717-723)
특히 본 연구에서는 그 동안 얻기 어려웠던 N-말단 단백질을 상기 유 등의 동일 문헌에 기재된 방법에 의하여 Trx 단백질과 융합하여 대량 발현하여, 이를 면역화에 이용함으로서, 부분 단백질 특이적인 (특히 N-말단 특이적) 항체를 얻기 위하여 노력하였다. 이는 지금까지 gp41 단백질에 대한 항체들이 주로 C-말단, 또는 C-말단과 N-말단을 연결하는 루프 부분을 인식하나, N-말단을 인식하지 못하는 점을 해결하려는 시도이다. 본 발명에서는 3 개의 펩타이드, 즉 Trx-N-말단, Trx-C-말단, 또한 gp41의 세포외 도메인(gp41-ex)을 이용하여 단클론 항체를 만들고 이들항원과 만들어진 항체들에 대한 특이성을 BIAcore 실험에 의하여 증명하려고 시도하였다.
특히 본 발명에서는 N-말단 특이적으로 제조된 항체가 N-말단 특이적인 결과를 도출했을 뿐만 아니라, gp41-ex 단백질에도 잘 결합하는 것으로 조사되었다. 또한 이와 같은 N-말단 특이적 항체가 gp41에 대한 저해활성을 가짐으로써 HIV 바이러스의 감염 또는 융합의 억제제로서 유용할 것이다.
본 발명에서는 그 동안의 gp41 단백질에 대한 항체가 C-말단이나 C-말단과 N-말단을 연결하는 부분을 인식하고, 이와 같은 항체가 HIV의 융합을 저해하는데 아무런 역할을 하지 못하는 데서, 좀 더 분석적인 방법으로 융합을 저해하는 무력화항체를 만들기 위한 노력에서 시작되었다. 특히, gp41 단백질의 특성상, N-말단은 C-말단에 둘러싸여 있기 때문에, 전체에 대한 항체를 제조하게 되면, N-말단을 인식하는 항체를 만들기는 매우 어렵게 된다. 따라서, 이 문제를 해결하기 위하여 N-말단, 또는 C-말단 펩타이드를 제조하고 이에 특이적 항체를 제조하게 된 것이다.
도 2와 표 1 에는 Trx-N을 고정화 한 후에 여러 가지 항체를 흘린 결과를 보여주고 있으며, 도 3와 표 2 에 gp41-ex를 고정화하고 여러 가지 항체를 흘린 결과를 보여주고 있다. 우선 도 2에서 보여 주듯이 대조구로 사용한 리간드인 Trx 와 BSA엔 항체가 거의 결합하지 않음을 확인하였으며, 본 발명에서 얻은 단일 클론 항체들이 gp41 단백질의 N-말단 특이적 항체임을 확인할 수 있었다. 표 1에서 보여 주는 바와 같이 이와 같은 항원-항체 반응은 그 접합력이 낮은 nM에 이르는 것을확인하였다. gp41-ex에 대한 항체 역시 gp41-ex에 매우 특이적인 항체로 밝혀졌으며, 이와 같은 접합 강도도 표 2에서 보여 주듯이 역시 낮은 농도 nM에 이르고 있다.
gp41-ex 와 Trx-N에 대해 얻어진 항체중 일부가 교차 반응성을 가지고 있음을 확인하였다. 이와 같은 현상은 TN-8D4E 항체에서 잘 보여지고 있으며, 대부분의 Trx-N 특이적 항체는 gp41-ex를 인식하는 것으로 생각된다. 이와 같은 교차 반응성은 gp41-ex에 대한 항체의 일부(GP-6B4F 등)에서도 나타났지만, 이들 중에는 전혀 교차 반응성이 없는 GP-6B11D와 같은 항체도 존재함을 확인하였다. 이와 같은 결과는 본 발명에서 의도한 것처럼 N-말단 펩타이드가 gp41 전체의 중요한 epitope임을 확인할 수 있는 하나의 증거라고 할 수 있다.
HIV 뿐만 아니라, 많은 바이러스들이 gp41의 코일(coiled-coil) 형태의 인식을 통하여 융합을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 연구가 활성화되어 본 발명에서 얻어진 N-말단 특이적 항체가 HIV의 감염을 차단하는 효과를 확실하게 얻게되면, 이를 모든 바이러스에 적용할 수 있다. 특히 이와 같은 시도를 가능하게 할 수 있는 사실로는 N-말단 서열들이 각각의 바이러스에 따라 보존되어 있으며, 그 변이도 심하지 않은데 있다. 특히 본 연구에 선행으로 실시한 연구를 통하여, N-말단 단백질들을 대량으로 쉽게 발현할 수 있다는 것도 본 발명이 쉽게 그 영역을 넓힐 수 있는 잠재력을 제시해 주고 있다. 즉, N-말단 특이적 gp41 단백질에 대한 특이적 단일 클론 항체를 얻을 수 있음은 이들 항체를 HIV 감염을 차단할 수 있는 치료제로서도 쓸 수 있는 가능성을 열어주고 있다.
항체의 발현을 좀더 경제적으로 발현하고 이를 쉽게 정제하는 방법을 이용하거나, 이들 항체를 클로닝 하여 그 유전자를 유전자 요법에 의하여 체내에 발현하도록 유도할 수 있다. 또한 본 발명에서 제시한 바와 같이 gp41 단백질에 대한 부분적 단백질에서 항체를 얻을 수 있음은 이와 같은 부분 단백질을 이용한 백신의 개발을 가능하게 하는 큰 진보를 얻은 것이다.
다음의 실시예를 들어 본발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본발명의 보호범위가 그 실시예로 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
제조예 1
Trx-N, Trx-C 와 gp41-ex의 제조에 관한 것은 유등의 'development of an in vitro assay system for screening of gp41 inhibitory compounds', Mol, Cells, 8(6): pp717-723, (1998)에 기재된 방법에 의해서 제조되었다.
실시예 1
항원 단백질에 대한 단클론항체의 제조
10% 글리세롤, 15mM 트리tm-HCl (pH7.2) 완충용액에 각각 담겨있던 새 종류의 항원 Trx-N, Trx-C 와 gp41-ex를 각각 PBS pH 7.2로 완충용액을 바꾸어 면역화시키는데 사용하였다.
임신하지 않은 8주된 Balb/c 암컷 생쥐(Valb/c)의 복강에 3주 간격으로 각각 3번씩 면역화시켰다. 먼저, CFA (Complete Frund Adjuvant, Sigma)와 IFA (Incomplete Frund Adjuvand, Sigma)를 사용하여 첫번째 면역시킬 때와 두 번째 면역시킬 때 PBS에 약 20㎍/250㎕ 농도로 준비한 항원과 함께 같은 부피로 섞어 사용하였다. 이들은 생체 내에서 항원의 느린 방출을 촉진하는 동시에, 비특이적으로 면역 반응에 관여하는 거식세포와 면역관용성 세포에 풍부한 육아종의 형성을 유도하여 항체 생성세포로 항원을 전달하는데 직접적인 영향을 끼치므로 효과적인 면역반응을 유도하기 위하여 사용하였다.
두 번째 면역후 약 1 주일 뒤 생쥐의 꼬리에서 약간의 혈액을 채취하여 항체의 생성유무를 확인하였다. 세 번째 면역일로부터 3일 후에 면역시킨 생쥐를 희생시키고, 비장 세포로부터 적혈구 용혈 완충액 (155 mM NH4Cl in 0.01 M Tris-HCl pH 7.5) 2㎖을 첨가해 적혈구를 제거하였다. 이 결과물에 약 107개의 SP2/o-Ag14 골수종 세포들을 PEG 1500을 이용하여 1000rpm에서 5 분동안 원심분리하여 혼합한 후에, 약 200개의 웰에 나누어 배양하였다. 각각의 항원과 결합하는 항체를 생산하는 일차 하이브리도마 클론에 대해 ELISA를 이용하는 Halow & Lane 방법(Halow & Lane,Antibodies,(1988))을 이용하여 항원 특이적인 항체를 단일 클론으로 배양하여 얻었다. 각각의 항원에 특이적인 단일한 하이브리도마 클론만을 순수하게 분리해 내기 위해서, 상기 일차 하이브리도마 클론을 여러 가지 세포 성장 요소들이 들어있는 비장 세포 배양 배지 (Spleen Feeder Cell Culture Supernatant)를 이용하여, 세포 배양 3 웰당 평균 하나의 세포가 들어갈 비율로 충분히 희석하여 나누어 넣은 후, 단일 세포가 충분히 자랄 때까지 배양하였다.
세포가 잘 자라고 있는 웰에서 배양액을 따서 ELISA을 행하여 항원과 특이적으로 결합하는 세포만을 생산하는 단일 하이브리도마 클론을 다음과 같이 얻었다. Trx-N 항원에 대해 11개(3E4F, 3E5F, 3E10E, 3E10F, 2-3E10C, 2-8D3F, 2-8D5B, 8D3F, 8D4E, 8D6G, 8D9C), gp41-ex 항원에 대해 12개(6B4D, 6B4F, 6B6E, 6B6G, 6B8D, 2-6B4C, 2-6B4D, 2-6B6E, 2-6B9D, 2-6B10C, 2-6B11D, 2-6B11F)의 단일 클론항체를 선별하였다. Trx-C의 경우 C-말단 합성 펩타이드 자체의 소수성 잔기의 비중이 높으므로 ELISA 분석시 반응값 측정이 불안정하여 본 발명에는 포함하지 않았다.
실시예 2
단클론 항체의 정제
생쥐의 복수액으로부터 단클론 항체를 제조하였다. 미리 단클론 세포를 주사하기 2주전에 프리스탄(Sigma)을 주사한 10주령 암컷 Balb/c 생쥐의 복강에 배양된 5ⅹ106∼1ⅹ107세포를 주사하였다. 2∼3주 후에 생쥐의 복부가 항체를 함유하고 있는 복수액으로 인해 팽창되어 오면, 22-게이지 바늘이 부착된 주사기로 생쥐의 복강으로부터 복수액(8∼12mL/마리)을 2-3회에 걸쳐 뽑아냈다. 이렇게 뽑은 복수액은 37℃ 수조에서 1 시간 동안 반응시켜 혈액 및 혈액 및 혈장단백질을 응고시킨 후, 3000rpm에서 10분간 원심분리시켜 혈청만 모았다. 이 용액을 -20℃에 저장해서 충분한 양의 복수액을 모은 다음 정제하여 단클론 항체를 사용하였다. 각 단계의 정제 방법에서는 이렇게 얻은 복수액을 한번 더 원심 분리하여 기타 불순물을 가라앉히고, 적용하고자 하는 단계에 사용되는 완충액으로 1/1 (v/v)로 섞어 사용하였다.항체는 암모늄 설페이트 침전, 단백질-A 친화성 크로마토그라피, 양이온-교환 크로마토그라피, 음이온-교환 크로마토그라피 등의 방법으로 정제하였다.
A. 암모늄 설페이트 침전법
포화 암모늄 설페이트를 이용한 침전법은 효과적이면서도 간단한 정제 방법 중 하나로, 얼음에서 2 부피의 PBS(phosphate buffered saline)로 복수액을 희석한 다음, 이 상태로 30분 동안 SAS(saturated ammonium sulfate)를 천천히 넣으면서 그 최종 농도가 45% (v/v)되게 첨가하였다. 그런 후에 4℃에서 1000ⅹg로 15분간 원심분리 시켰다. 침전물을 45% SAS로 씻은 후, 재 원심분리하고 원래의 복수 액과 같은 양의 PBS (pH 7.0)를 넣어 다시 녹였다. 그 밖의 다른 불용성 물질을 제거하기 위해서 4℃에서 5000ⅹg로 15분간 원심분리 하였다. 상층액을 새 튜브로 옮긴 후, 최종 농도 40%의 SAS를 넣어 다시 재 침전시키고 4℃에서 1000ⅹg로 15분간 원심분리시켰다. 약 0.5mL (minimum volume)의 PBS를 넣어 녹인 후, 투석하였다. 다시 4℃에서 5000ⅹg로 15분간 원심 분리한 후, UV 스펙트로포토미터를 사용하여 280㎚에서 단백질의 농도를 측정하였다.
B. 단백질-A 친화성 아가로스 크로마토그래피
암모늄 설페이트 면역-침전법과 투석법으로 1차 정제된 항체를 단백질-A 아가로스 크로마토그래피(1ⅹ4㎝)를 이용하여 분리하였다. 단백질-A 아가로스에 칼럼 부피의 10배에 해당하는 고농도의 결합 완충액(글리세린 1.5 M, Nacl 3.0 M, pH 8.9)를 이용하여 0.1 mL/분으로 씻은 다음, 미리 이 완충액과 동일한 양으로 섞어둔 일차 정제된 항체를 넣어 0.7mL/분으로 천천히 결합시켰으며, 약 10 배의 칼럼부피에 해당하는 완충액을 흘려 단백질-A 아가로스에 약하게 붙어있는 다른 단백질을 제거하였다. 이후에 강하게 붙어 있는 항체를 8배 칼럼 부피에 해당하는 용출 완충액(글리세린 0.1 M, pH 2.5)를 0.6 mL/분으로 흘려서 떼어내었다. 각각의 부분 (3.0 mL/fraction)에 대해 280nm에서 흡광도를 재어 용출된 단백질의 농도를 확인하였다. 이때 낮은 pH로 인한 항체의 변질을 막기 위해 각 부분의 튜브에는 각 부분의 부피의 1/5에 해당하는 수집 완충액 (Tris HCl 1.0 M, pH 10.0)를 미리 넣어두어 중화시켰다. 이렇게 얻은 항체는 Centriprep-30 (Amicon)으로 1,500ⅹg 에서 20분, 15분, 10분 단계별로 원심분리 하여 그 단계마다 UV 스펙트로포토미터를 사용하여 280㎚ 흡광도를 재어 항체의 농도를 확인하면서 농축시켰고, Centricon-30 (amicon)으로 옮겨 5000ⅹg에서 30 분간 원심 분리하여 저장 buffer (PBS, pH 7.0 with 0.01% sodium azide)를 이용하여 농축시켰다.
C. 음이온-교환 크로마토그래피
농축시킨 항체를 양이온-교환 수지인 SP-Sepharose??(HiLoadTM16/10; Pharmacia)를 사용한 음이온-교환 크로마토그래피를 사용하여 한번 더 정제하였다. buffer A(50 mM MES, pH 5.5)와 buffer B (50 mM MES, 1.0 M, NaCl, pH 5.5)를 1.0mL/min으로 농도구배로 흘렸다. 농도 구배는 용액 B를 0%에서 50%까지 사용하였으며, 각 부분(2mL)은 UV 280 nm에서 분리 정제되어 나오는 항체의 양을 측정하였다. 대부분의 항체 단백질들은 30∼40%의 B용액에서 분리되었다. 이렇게 얻어진 항체는 centri-prep (Amicon)과 centri-con (amicon)으로 농축시키고 분석 완충액(10 mM MES, 100 mM NaCl, 0.02% NaN3pH 5.5)로 완충액를 바꾸었다. 각각의 항체의 농도는 1∼2 mg/mL이 되도록 조절하여 사용하였다.
각 단계로 정제하여 12% 변성된 SDS-PAGE로 확인한 결과, 세 단계의 분리 정제과정을 통해 단클론 항체의 중쇄와 경쇄 (각 50 Kda, 25 Kda)에 해당하는 두 개의 밴드를 확인을 통해, 깨끗하게 분리정제 되었음을 확인하였다. 정제된 항체를 이후 실험에 사용하였다.
실시예 3
ELISA를 이용한 단클론 항체의 특이성 탐색
각각의 항원에 대해 선택적으로 결합하는 항체를 얻기 위하여 사용한 ELISA 방법을 이용하였다. 각 항원을 PBS (pH 7.2)에 80 nM∼125 nM (2㎍/㎖) 되도록 희석한 후, 96-웰 ELISA 판에 2시간 이상 상온에서 반응시켜 결합시킨 다음, 비 특이적인 반응을 제거하기 위해 3% 탈지우유 DIFCO (PBST (0.05% Tween 20)중에 포함)을 이용하여 항원이 결합되지 않는 부분을 차단하고, 하이브리도마 배양액을 넣어 상온에서 반응시켰다. 호스 래디쉬 퍼옥시다제가 결합된 염소 항-마우스 gG(H+L; Jackson ImmunoResearch Lab)와 반응시키고, 1㎎/㎖의 o-페닐렌디아민 디히드로클로라이드 (OPD; Pierce) 용액을 넣어 각 웰의 항원 항체 결합정도를 490 nm에서 흡광도를 측정하여 (Hornbeck;1992) 그 반응정도를 조사하여 각각의 항원과 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 클론들을 선별하였다. 특히, 항원 Trx-N와 Trx-C는 각각의 합성 펩타이드를 Trx(thioredoxin)란 단백질 (M.W 13 KDa)에 결합시켰으므로, 이들에 대한 특이적으로 결합하는 항체의 선별시는 따로 Trx만을 항원으로 ELISA하여 N-말단 이나 C-말단에만 특이적으로 결합하는 항체만을 선별하고자 동시에 시행하였다.
실시예 4
BIAcore를 이용한 펩타이드 항원과 여러 가지 항체의 접합강도의 실험
활성화 센서칩을 제조하기 위해서, 센서칩 CM5에 0.05 M의 N-히드록시숙신이미드(NHS) 와 0.2 M의 N-에틸-N′-(이메틸아미노프로필)-카보디이미드(EDC)를 섞은 혼합물로 5㎕/분으로 15분 동안 흘려서 카르복시메틸기를 변형시켜 활성화시켰다.
gp41-ex, Trx-N 및 Trx의 고정화을 활성화 센서칩에 고정화하기 위해서는, 아민 커플링 방법을 이용하여 gp41-ex (19.4 ㎛), Trx-N (15㎛), Trx (7.7㎛) 그리고 대조구로서 BSA (15㎛)를 각각 세포에 결합시켰으며, 각 리간드의 결합 정도(RU)는 비슷한 양 (2000 RU)을 유지할 수 있도록 노력하였다. 표면에 남아있는 활성화된 에스테르기를 1M 에탄올아민 히드로클로라이드(pH 8.5)를 5㎕/min으로 약 75㎕ 흘려 비공유 결합으로 연결되어 있는 물질을 제거시켜 준다.
측정을 하고자 하는 본 실험에서 얻은 정제된 단클론 항체(analyte)를 고정화가 된 세포에 주입하기 전에, 고정화시킨 Trx-N의 합성 펩타이드들의 활성이 그대로 유지되어 있는지를 확인하기 위해 Trx에 비해 Trx-N에 상대적으로 결합정도가 강하다고 이미 밝혀진 GST-C1을 양성 대조구로 주입하여 Trx에 대해 Trx-N에 약 5 배정도 결합강도가 강함을 확인하여 고정화시킨 리간드의 고정화 정도와 활성을 확인하였다.
단일 클론 항체들을 각각 PBS pH 7.2에 일련의 희석 (각 항체당 희석농도는 도 2와 도 3에 표시하였음)하여 농도 순서로 주입하였다. 또한 상대적인 비교를 위하여 같은 양의 정상적인 항-마우스 IgG을 주입하여 리간드 결합력을 함께 비교 분석하였다. 분석대상을 리간드에 결합시킨 후에 다음의 분석대상을 결합시키기 위하여, 0.025 % SDS PBS 용액을 사용하여 이전에 결합된 분석대상을 제거하였다. 이와 같은 조건에서 다음 분석대상을 주입하기 위한 기저선이 유지되었다. 얻어진 센서그램을 도 2 및 도 3에 나타냈고, Trx-N (gp41 의 N 말단 합성 펩타이드)을 고정화하고 여러 가지 특이적인 단클론 항체에 대해 BIAcore를 이용한 산출된 결합상수 (KD) 값을 표 1에 나타냈고, gp41의 세포외 도메인을 고정화하고 여러 가지 특이적인 단클론 항체에 대한 BIAcore를 이용해 산출된 결합상수 (KD) 값을 표 2에 나타냈다.
상기 표 1 및 표 2에서 볼 수 있는 바와 같이, GP-6B4F, GP-6B6E, GP-6B8D, TN-3E10E, TN-8D6G 및 TN-8D4E 는 Trx-N (gp 41 의 N-말단)에 특이적으로 결합할 뿐 아니라 gp 41-ex 부위를 인식하는 교차 반응성을 나타냈으며, GP-6B4F, TN-3E10E, TN-8D6G 및 TN-8D4E 는 gp 41 에 대한 억제 효과를 나타내었다. 상기 GP-6B4F, TN-3E10E, TN-8D6G 및 TN-8D4E 의 아미노산 서열을 도 4 및 SEQ ID NO:1 내지 8에 나타내었고, similarity search 결과를 표 3에 나타내었다.
항 체 명 Similarity Search
GP-6B4F 1. 안티-CD30 단클론항체 Ki-3 scFv 82/118(69%)(중쇄의 경우)2. 안티-알파 (2-8) 폴리시알산 IgG 2a 항체 중쇄 Fd'부위 (mice, NZB, Peptide, 246 aa)3. p53 특이적 단일-가닥-항체 Pab 421-human 100/102(98%)(경쇄의 경우)4. 0.5b 안티-HIV 항체의 구조(경쇄의 경우)
TN-3E10E 1. p53 특이적 단일-가닥-항체 Pab 421-human 98/100(98%)(중쇄의 경우)2. 류머티스 팩터 RE 1-7=IgM 자가항체 kappa 체인 93/95(97%)(경쇄의 경우)3. 인간 사이토메갈로 바이러스 이뮤노글로불린 Vh 체인(Mus musculus)의 항-당단백질-B 108/123(87%)(중쇄의 경우)
TN-8D4E 1. HIV-1 캡시드 단백질 (p24)의 결정 구조인 Fab 13b5 복합체로 된 체인 L, 59/60 (97%)(Vk)2. 무력화 항체(neutralizing antibody)와 인플루엔자 바이러스 혈구 응집소(hemagglutinin) 복합체로 있는 체인 L, 51/59(86%)(경쇄의 경우)3. Mfe-23 항-종양성배아(carcinoembryonic) 항원 단일 가닥 Fv 항체인 체인 A, 51/59(86%)(경쇄의 경우))
TN-8D6G 1. 안티-HIV p24 항체 D2 kappa 경쇄 (Mus musculus) 67/92(72%)(경쇄의 경우)2. 안티-HIV-1 p17 ScFv (합성 구조) 66/92(71%)(경쇄의 경우)3. HIV-1의 Gp 41의 에피토프(epitope)에 대한 무력화 항체의 Fab 단편 68/92(73%)(경쇄의 경우)
본 발명은 gp 41의 N말단을 포함하는 단백질에 대한 항체에 관한 것이다. 이 항체를 이용하여 HIV감염에 필수적인 기능을 수행하는 gp41의 기능을 차단하여, 궁극적으로 HIV의 감염을 예방 및 치료를 위한 백신의 제조에 유용하다.
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Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 85 90 95 Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Ala Pro Ser Trp 100 105 <210> 3 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TN 3E10E heavy chain <400> 3 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Thr Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser Trp 20 25 30 Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Pro Ser Gly Tyr Val Asn Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TN 3E10E light chain <400> 4 Glu Asn Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 85 90 95 Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Ala Pro Ser Trp Lys Ser Asn Gly 100 105 110 <210> 5 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TN 8D4E heavy chain <400> 5 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Val Glu Val Arg Val Thr Pro Thr Arg 1 5 10 15 Thr Glu Ile Ile Ile Leu Ala Thr Arg Thr Gln Asn Val Leu Gly Glu 20 25 30 Lys Gly Arg Arg Ile Arg Glu Leu Thr Ala Val Val Gln Lys Arg Phe 35 40 45 Gly Phe Pro Glu Gly Ser Val Glu Leu Tyr Ala Glu Lys Val Ala Thr 50 55 60 Arg Gly Leu Cys Ala Ile Ala Gln Ala Glu Ser Leu Arg Tyr Lys Leu 65 70 75 80 Pro Gly Gly Leu Ala Val Arg Arg Ala Cys Tyr Gly Val Leu Arg Phe 85 90 95 Ile Met Glu Ser Gly Ala Lys Gly Pro Arg Ser Pro Ser Pro Gln 100 105 110 <210> 6 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TN 8D4E light chain <400> 6 His Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Thr Ala Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Glu Val Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Thr Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asn Tyr Pro Leu Ile Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 7 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TN 8D6G heavy chain <400> 7 Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Thr Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Asp 20 25 30 Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Trp Ile Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asp Tyr Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 103 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> TN 8D6G light chain <400> 8 Tyr Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Gly Thr Ile Ala 1 5 10 15 Gln Pro Ser Ser Ile Phe Cys Lys Ser Ser His Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu His Arg Pro Ile His Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Cys Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Trp Asp Ile Phe Tyr Thr Glu Asn 65 70 75 80 His Asn Cys Glu Ala Tyr Asp Leu Gly Cys Leu Phe Ile Asp Val Lys 85 90 95 Val Thr His Ile Phe Val Asp 100

Claims (4)

  1. HIV의 gp 41의 N말단과 특이적으로 결합함과 동시에 gp 41-ex(extracellular domain)를 인식하는 교차 반응성을 가지고, 상기 gp 41을 저해하며, 중쇄가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 구성되고 경쇄가 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열로 구성된 항체 펩타이드.
  2. HIV의 gp 41의 N말단과 특이적으로 결합함과 동시에 gp 41-ex 를 인식하는 교차 반응성을 가지고, 상기 gp 41을 저해하며, 중쇄가 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열로 구성되고 경쇄가 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열로 구성된 항체 펩타이드.
  3. HIV의 gp 41의 N말단과 특이적으로 결합함과 동시에 gp 41-ex 를 인식하는 교차 반응성을 가지고, 상기 gp 41을 저해하며, 중쇄가 SEQ ID NO: 5의 아미노산 서열로 구성되고 경쇄가 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열로 구성된 항체 펩타이드.
  4. HIV의 gp 41의 N말단과 특이적으로 결합함과 동시에 gp 41-ex을 인식하는 교차 반응성을 가지고, 상기 gp 41을 저해하며, 중쇄가 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열로 구성되고 경쇄가 SEQ ID NO: 8의 아미노산 서열로 구성된 항체 펩타이드.
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