JP2022552724A - 細胞培養のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

細胞培養システムおよび方法は、さらなる拡張性、柔軟性、ならびに自動化を伴う改良された免疫療法生成物製造を提供する。細胞培養システムは、交換可能カートリッジを用いて構成され、汎用性および拡張性を可能にする。システムは、異なるタイプの細胞の並列処理を可能にする、複数の接続された細胞培養チャンバを有するように構成される。ガス不透過性細胞培養チャンバおよび閉鎖系において細胞を発生させるための方法は、汚染ならびにユーザエラーを防止する。細胞培養培地を再循環させるための方法は、付加的効率を提供する。

Description

本願は、その内容が、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる、２０１９年１０月２１日に出願された米国仮出願第６２／９２３，９６３号、および２０１９年１０月２１日に出願された米国仮出願第６２／９２３，９６７号、および２０１９年１０月２１日に出願された米国仮出願第６２／９２３，９７３号、および２０１９年１０月２１日に出願された米国仮出願第６２／９２３，９７５号、および２０１９年１０月２１日に出願された米国仮出願第６２／９２３，９７８号、ならびに２０１９年１０月２１日に出願された米国仮出願第６２／９２３，９８２号の優先権および利益を主張する。

本開示は、概して、細胞培養のためのシステムおよび方法に関する。

癌は、世界中で死亡率および罹患率の主因であり、長年の並外れた研究努力にもかかわらず、治療法は、わかりにくいままである。腫瘍タイプの多様性は、１つの腫瘍に調整された治療が、別のものに対して効果的ではない場合があるため、癌療法における課題を提示する。個人化された治療が、追求されているが、多くの課題が、それらを開発する際に存在する。

１つの有望な分野は、患者のＴ細胞が、ある癌を標的化するように改変される、Ｔ細胞療法である。これは、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）療法、および新生抗原ベースのＴ細胞療法を含む。新生抗原ベースの療法は、腫瘍シーケンシングデータから抗原を同定し、高度に個人化された患者特異的免疫療法を設計する能力を提供する。

残念ながら、多くの課題が、Ｔ細胞療法の開発および製造において存在する。癌抗原特異的Ｔ細胞の単離、調製、および増殖のための既存のプロセスは、限定されている。自己抗原提示樹状細胞（ＤＣ）によるヒトＴ細胞の刺激に関する従来のプロトコルは、培養容器の間で細胞を移送するステップ、培地を変更するステップ、およびサイトカインならびに細胞培地を補充するステップを含む、いくつかの手動ステップを伴う。それらのプロセスは、労働集約的であり、容易に拡張可能ではない。プロトコルを実行するために要求される手動ステップの数は、法外に多い。加えて、それらのプロトコルは、使用の間に開放および閉鎖される、フラスコまたは他の容器の使用を伴い、細胞生成物の品質および安全性を損ない得る汚染のリスクを高める。そのような方法は、現在の適正製造基準（ｃＧＭＰ）に準拠せず、Ｔ細胞療法を大規模に生産するために有用ではない。細胞調製の時間、最適な表現型の維持、十分な細胞数への増殖、および細胞生成物の品質ならびに安全性等の付加的課題もまた、存在する。

本発明は、Ｔ細胞治療処理および製造の自動化が、関連付けられる複雑な生物学的プロセスならびに自己細胞処理と関連付けられるバイオプロセスおよび規制要件に起因して成功していないことを認識する。存在する数少ないシステムは、過度に複雑かつ高費用であり、したがって、前臨床アッセイのために有用ではない。本発明の発明的細胞培養システムおよび関連する方法は、細胞培養における問題のうちの多くに対する解決策を提供し、汚染およびユーザエラーを減少させ、ならびに効率、拡張性、および使いやすさを向上させるための多数の特徴を提供する。本発明のシステムおよび方法は、費用を最小限にし、単純さおよび使いやすさを向上させながら、堅牢なＴ細胞生成のための能力を提供し、開示されるシステムおよび方法を前臨床研究ならびに日常的細胞培養の両方のために有用にする一方、臨床製造に関する現在の適正製造基準に関する要件を満たすことが可能である。

ある側面では、開示されるシステムおよび方法は、抗原特異的Ｔ細胞を生成するための改良された自動化技術を提供する。手動プロセスの自動化は、ユーザエラーに関する可能性を劇的に低減させ、汚染のリスクを減少させる。例えば、本開示は、ＣＡＲ－ＴおよびＴＣＲ形質導入Ｔ細胞ならびに新生抗原標的Ｔ細胞を閉鎖系において生成するためのシステムおよび方法を提供する。これは、従来技術で一般的であるように、Ｔ型フラスコを開放および閉鎖する必要性を回避し、それによって、プロセスを簡略化し、汚染の源を回避する。別の実施例として、容易に交換可能な細胞培養チャンバを用いて構成される、細胞培養システムが、開示され、ユーザが、細胞集団をスケールアップまたはスケールダウンすることを可能にする。種々のチャンバおよび容器は、本システムが、使用全体を通して閉鎖されたままであり得るように、滅菌管溶接を介して接続可能である。本開示はまた、細胞培養のためのガス不透過性カートリッジを提供し、これは、最適な細胞接着のための固体ポリスチレン表面と、製造が容易であり、溶接された管接続を用いて動作されるときに汚染の影響を受けにくい剛性カートリッジ構造とを提供する。開示されるシステムはまた、刺激されたＴ細胞を発生させるためのプロセスにおいて樹状細胞およびＴ細胞の並列処理を可能にする。システムアーキテクチャは、Ｔ細胞培養のプロセスを合理化し、時間および物質の節約を提供する。本システムが物質を節約する別の方法は、細胞が、最小量の高価な培養培地および補足物を用いて培養され得ることを確実にするために、細胞培養培地を再循環させることによる。

開示されるシステムおよび方法は、免疫療法生成物製造におけるプロセス最適化のための多数の機会を提供するため、上記に説明される特徴に加えて、他の特徴も、当業者に明白となるであろう。

本開示の側面は、交換可能カートリッジを伴う細胞培養システムを提供する。細胞培養システムは、細胞培養培地を含有する流体リザーバを受容するように構成される、第１のエリアと、廃棄物リザーバを受容するように構成される、第２のエリアとを含む。細胞培養システムはまた、流体リザーバに流体的に接続可能である、１つまたはそれを上回るポンプと、異なる形状および／またはサイズの細胞培養チャンバを受容ならびに保定するように構成される、基板とを有する。

実施形態では、基板は、基板が、異なる形状および／またはサイズの細胞培養チャンバを受容ならびに保定するように構成されるように配列される、複数の異なる開口部を有する。基板は、複数の細胞培養チャンバを同時に受容および保定するように構成されることができる。基板の第１の部分は、第１のサイズの第１の細胞培養チャンバを受容するように構成されてもよい一方、基板の第２の部分は、第１のサイズと異なる第２の形状の第２の細胞培養チャンバを受容するように構成される。実施形態では、基板の第１の部分は、第１の形状の第１の細胞培養チャンバを受容するように構成され、基板の第２の部分は、第１の形状と異なる第２の形状の第２の細胞培養チャンバを受容するように構成される。実施形態では、基板の第１の部分は、第１のサイズのおよび形状の第１の細胞培養チャンバを受容するように構成され、基板の第２の部分は、第１のサイズおよび形状と異なる第２のサイズおよび形状の第２の細胞培養チャンバを受容するように構成される。

実施形態では、流体リザーバは、第１のエリア内に位置付けられ、廃棄物リザーバは、廃棄物エリア内に位置付けられる。流体リザーバを１つまたはそれを上回るポンプに、ならびに／もしくは１つまたはそれを上回るポンプを細胞培養チャンバに、ならびに／もしくは細胞培養チャンバを廃棄物リザーバに流体的に接続する、１つまたはそれを上回る管が、含まれることができる。各細胞培養チャンバは、別個のポンプに流体的に結合されることができる。いくつかの実施形態では、プロセッサが、１つまたはそれを上回るポンプおよび細胞培養システム内の流体の特性を測定するように動作可能である１つまたはそれを上回るセンサに動作可能に接続され、プロセッサは、測定された特性に基づいて、１つまたはそれを上回るポンプを動作させる。

関連する側面では、本開示は、細胞を培養するための方法を提供する。本方法は、細胞培養培地を含有する流体リザーバを受容するように構成される、第１のエリアと、廃棄物リザーバを受容するように構成される、第２のエリアと、流体リザーバに流体的に接続可能である、１つまたはそれを上回るポンプと、異なる形状および／またはサイズの細胞培養チャンバを受容ならびに保定するように構成される、基板とを有する、細胞培養システムを提供するステップを含む。本方法はさらに、流体リザーバを第１のエリアの中に装填し、廃棄物リザーバを第２のエリアの中に装填するステップと、第１のサイズおよび／または形状の第１の細胞培養チャンバを基板の第１の部分上に装填するステップと、第２のサイズおよび／または形状の第２の細胞培養チャンバを基板の第２の部分上に装填するステップとを伴う。本方法はさらに、流体リザーバ、１つまたはそれを上回るポンプ、第１および第２の細胞培養チャンバ、ならびに廃棄物リザーバを管類と接続するステップを伴う。本方法はさらに、第１および第２の細胞培養チャンバ内で細胞を培養するように本システムを動作させるステップを伴う。

実施形態では、基板は、基板が、異なる形状および／またはサイズの細胞培養チャンバを受容ならびに保定するように構成されるように配列される、複数の異なる開口部を有する。第１の細胞培養チャンバは、第１のサイズであり得、第２の細胞培養チャンバは、第２のサイズであり得る。第１の細胞培養チャンバは、第１の形状であり得、第２の細胞培養チャンバは、第２の形状であり得る。第１の細胞培養チャンバは、第１のサイズおよび形状の両方であり得、第２の細胞培養チャンバは、第２のサイズおよび形状の両方であり得る。

実施形態では、第１および第２の細胞培養チャンバはそれぞれ、別個のポンプに流体的に結合される。本システムはまた、１つまたはそれを上回るポンプおよび細胞培養システム内の流体の特性を測定するように動作可能な１つまたはそれを上回るセンサに動作可能に接続される、プロセッサを含むことができ、プロセッサは、測定された特性に基づいて、１つまたはそれを上回るポンプを動作させる。

実施形態では、細胞培養が第１および第２の細胞培養チャンバ内で完了した後、第１および第２の細胞培養チャンバのそれぞれの中の培養された細胞は、収集される。第１および第２の細胞培養チャンバのそれぞれの中の培養された細胞は、同一の収集容器内または異なる収集容器内に収集されることができる。

別の側面では、本開示は、閉鎖系においてＣＡＲまたはＴＣＲを伴う形質導入Ｔ細胞を生成するための方法を提供する。本方法は、第１および第２の培養チャンバを有する、細胞培養器具を提供するステップと、細胞を含有する懸濁液を第１の培養チャンバの中に流動させるステップとを伴う。本方法はさらに、適切な形質導入および増殖試薬を用いて第１の培養チャンバ内でＴ細胞を灌流し、第１の培養チャンバ内で増殖する形質導入されたＴ細胞を生成するステップを伴う。本方法はさらに、第１の培養チャンバから第２の培養チャンバの中に形質導入および増殖されたＴ細胞を流動させるステップを伴う。本方法はさらに、細胞培養培地を第２の培養チャンバの中に流動させ、形質導入および増殖されたＴ細胞をさらに増殖させるステップを伴い、本方法は、滅菌状態が本方法全体を通して維持されるように、閉鎖様式で単一の器具上で実施される。

いくつかの実施形態では、第２の培養チャンバは、第１の培養チャンバよりも大きい。一方または両方の培養チャンバは、ポリスチレンから作製されることができる。培養チャンバは、滅菌管を介して接続されることができる。第１の培養チャンバは、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する不活性ウイルスであり得る、活性化試薬ならびに／もしくは細胞形質導入試薬を有してもよい。代替として、第２の培養チャンバは、第１の細胞培養器具の一部ではない別個の細胞培養器具であってもよい。

実施形態では、細胞培養培地は、滅菌容器内に提供され、滅菌管溶接によって閉鎖系に接続される。細胞培養培地を第１の培養チャンバの中に流動させるステップは、第１の培養チャンバ内のヘッドスペースを排除するステップを伴ってもよい。細胞培養培地は、インターロイキン－２を伴うＡｉｍ Ｖを含んでもよい。

本方法はさらに、第１の培養チャンバ内のＴ細胞を活性化させるステップを伴ってもよく、これは、１つまたはそれを上回る活性化抗体もしくは可溶性活性化抗体含有試薬、および形質導入試薬を備える磁性または非磁性ビーズと接触することによって行われることができる。本方法はさらに、第２の培養チャンバから流体を排出するステップと、緩衝液を用いて形質導入および増殖されたＴ細胞を洗浄するステップと、凍結保存培地を第２の培養チャンバの中に流動させ、形質導入および増殖されたＴ細胞を再懸濁させるステップとを伴ってもよい。本方法はさらに、形質導入および増殖されたＴ細胞を閉鎖様式で採取容器の中に流動させるステップを伴ってもよい。

実施形態では、流動させるステップはそれぞれ、滅菌管を介して行われてもよい。滅菌管は、滅菌管溶接によって接続されてもよい。

別の側面では、本開示は、閉鎖系において新生抗原標的Ｔ細胞を生成するための方法を提供する。本方法は、第１および第２の培養チャンバを有する、細胞培養器具を提供するステップと、単球を含有する細胞培養培地を第１の培養チャンバの中に流動させるステップとを含む。本方法はまた、第１の培養チャンバ内で精製された単球を灌流し、第１の培養チャンバ内で樹状細胞を生成するステップと、樹状細胞を第１の培養チャンバ内で腫瘍特異的ペプチドを含み得る抗原物質と接触させ、成熟した樹状細胞を生成するステップとを伴う。本方法はさらに、成熟した樹状細胞を第１の培養チャンバから、精製されたＴ細胞を備える第２の培養チャンバの中に流動させ、成熟した樹状細胞および精製されたＴ細胞を共培養し、それによって、新生抗原標的Ｔ細胞を生成するステップを伴う。本方法は、滅菌状態が本方法全体を通して維持されるように、閉鎖様式で単一の器具上で実施される。

実施形態では、本方法はまた、次いで、精製されたＴ細胞との第２の共培養を実施するために、単球の第２のバッチを第２の培養チャンバの中に流動させるステップと、それらを樹状細胞に分化させるステップと、樹状細胞を成熟させるステップとを伴う。第１および第２の培養チャンバは、ポリスチレンから作製されることができる。第１および第２の培養チャンバは、滅菌管を介して接続されることができる。細胞培養培地は、滅菌容器内に提供されることができ、滅菌管溶接によって閉鎖系に接続されることができる。細胞培養培地を第１の培養チャンバの中に流動させるステップは、第１の培養チャンバ内のヘッドスペースを排除するステップを伴うことができる。流動させるステップはそれぞれ、滅菌管溶接によって接続され得る、滅菌管を介して行われることができる。

実施形態では、本方法はまた、第２の培養チャンバ内でＴ細胞を活性化させるステップを含む。実施形態では、本方法はまた、第２の培養チャンバから流体を排出するステップと、緩衝液を用いて新生抗原標的Ｔ細胞を洗浄するステップと、凍結保存培地を第２の培養チャンバの中に流動させ、新生抗原標的Ｔ細胞を再懸濁させるステップとを含む。本方法はまた、新生抗原標的Ｔ細胞を閉鎖様式で採取容器の中に流動させるステップを伴ってもよい。

別の側面では、本開示は、並行して樹状細胞を生成し、Ｔ細胞を刺激するための並列処理のための方法を提供する。本方法は、第１および第２の培養チャンバを伴う細胞培養器具を提供するステップと、単球を含有する細胞培養培地を第１の培養チャンバの中に流動させるステップとを含む。本方法はさらに、第１の培養チャンバ内で単球を灌流し、第１の培養チャンバ内で樹状細胞を生成するステップを含む。本方法はさらに、第２の培養チャンバ内で培養されているＴ細胞を第２の培養チャンバから樹状細胞を伴う第１の培養チャンバの中に流動させ、第１の培養チャンバ内でＴ細胞をさらに培養するステップを含む。実施形態では、滅菌状態が、本方法全体を通して維持される。

本方法はまた、培養されたＴ細胞を収集容器の中に流動させることによって、第１の培養チャンバから培養されたＴ細胞を収集するステップを含んでもよい。本方法はまた、樹状細胞を腫瘍特異的ペプチドを含み得る抗原物質と接触させることによって、第１の培養チャンバ内の樹状細胞を成熟させるステップを含んでもよい。実施形態では、本方法はまた、第２の培養チャンバ内でＴ細胞を活性化させるステップを伴い、これは、活性化試薬を使用することによって行われることができる。実施形態では、本方法はまた、緩衝液を用いて刺激されたＴ細胞を洗浄するステップと、随意に、刺激されたＴ細胞を凍結保存培地に移送するステップとを伴う。本方法はまた、新生抗原標的Ｔ細胞を閉鎖様式で採取容器の中に流動させるステップを伴ってもよい。流動させるステップはそれぞれ、随意に、滅菌管溶接によって接続される、滅菌管を介して行われることができる。

細胞培養培地は、滅菌容器内に提供されてもよく、滅菌管溶接によって閉鎖系に接続されてもよい。細胞培養培地を第１の培養チャンバの中に流動させるステップは、第１の培養チャンバ内のヘッドスペースを排除するステップを伴ってもよい。実施形態では、第１および第２の培養チャンバは、ポリスチレンから作製され、随意に、滅菌管を介して接続されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養器具からの第１および第２の細胞培養チャンバのうちの一方または両方は、交換されることができ、本方法は、繰り返されることができる。

別の側面では、本開示は、ガス不透過性細胞培養チャンバを提供し、上部、底部、および両方の側壁は、ガス不透過性材料から成る。ガス不透過性材料はまた、それに細胞が接着する材料であってもよい。ガス不透過性材料は、ポリスチレンであってもよい。

実施形態では、細胞培養チャンバは、入口を有する。細胞培養チャンバはまた、出口を有してもよい。入口および出口は、細胞培養チャンバの上に位置することができ、随意に、入口および出口は、それぞれ、管類と流体的かつシール可能に結合するように構成される。細胞培養チャンバは、一体的に形成されることができ、これは、培養器内に嵌合するようにサイズ決めおよび構成されることができる。細胞培養チャンバは、細胞培養器具の基板に結合するようにサイズ決めおよび構成されることができる。

関連する側面では、本開示は、入口と、出口とを有する、細胞培養チャンバを提供するステップであって、上部、底部、および両方の側壁は、ガス不透過性材料から作製される、ステップを伴う、細胞を培養するための方法を提供する。本方法はまた、細胞を細胞培養チャンバの中に装填するステップと、培養チャンバ内で細胞を培養するために、入口を介して細胞培養チャンバの中に細胞培養培地を流動させ、出口を介して細胞培養チャンバから外に流動させるステップであって、入口および出口を介した細胞培養チャンバを通した細胞培養培地の流動は、細胞培養チャンバを通した細胞培養培地の連続的流動を引き起こし、細胞培養チャンバ内の細胞と細胞培養培地との間でガス交換が起こることを可能にする、ステップとを伴う。

実施形態では、ガス不透過性材料はまた、ポリスチレン等のそれに細胞が接着する材料である。実施形態では、入口および出口は、細胞培養チャンバの上に位置し、随意に、管類と流体的かつシール可能に結合するように構成される。管類は、細胞培養培地が高透過性管類内にある間にガスを交換することを可能にする、高透過性管類であり得る。実施形態では、細胞培養チャンバは、一体的に形成される。細胞培養チャンバは、培養器内に嵌合するようにサイズ決めおよび構成されることができ、随意に、これは、細胞培養器具の基板に結合するようにサイズ決めおよび構成されることができる。

別の側面では、本開示は、細胞培養チャンバを通して細胞培養培地を流動させることによって、細胞培養器具上の細胞培養チャンバ内で細胞を培養するステップであって、細胞培養チャンバを通してすでに流動された細胞培養培地の一部は、細胞培養プロセスの間に細胞培養チャンバの中に戻るように再循環される、ステップを伴う、細胞を培養するための方法を提供する。

実施形態では、本方法はまた、再循環に先立って、使用済み培地の１つまたはそれを上回るパラメータを測定するステップを伴う。パラメータは、グルコース、乳酸、溶存酸素、もしくは細胞代謝物等の使用済み培地内の１つまたはそれを上回る化合物の濃度であり得る。パラメータはまた、ｐＨまたは細胞数であり得る。

実施形態では、本方法は、細胞培養チャンバに動作可能に接続されるプロセッサを使用して、再循環させるステップに先立って、使用済み培地の１つまたはそれを上回るパラメータのうちの少なくとも１つが所定の閾値を満たすかどうかを決定するステップを伴う。測定するステップは、細胞培養チャンバと動作可能に関連付けられる１つまたはそれを上回るセンサによって実施されることができる。１つまたはそれを上回るセンサは、細胞培養チャンバと流体連通する廃棄物リザーバと動作可能に関連付けられることができる。細胞培養チャンバは、１つまたはそれを上回るポンプに動作可能に接続されることができ、入口と、出口とを有してもよい。再循環させるステップは、使用済み培地の一部を廃棄物リザーバから細胞培養チャンバの中に戻るように再指向するステップを伴ってもよい。実施形態では、使用済み培地の一部は、新鮮な培地のボーラスと組み合わせられる。

関連する側面では、本開示は、細胞を含有する、細胞培養チャンバを提供するステップと、細胞培養培地を細胞培養チャンバの中に流動させるステップと、細胞培養チャンバから使用済み細胞培養培地を除去するステップと、使用済み細胞培養培地のパラメータを査定するステップと、パラメータが、所定の閾値を満たす場合、使用済み細胞培養培地を細胞培養チャンバに戻すステップとを伴う、細胞を培養するための方法を提供する。

実施形態では、本方法はまた、戻すステップに先立って、使用済み細胞培養培地を新鮮な細胞培養培地のボーラスと組み合わせるステップを伴う。査定するステップは、細胞培養チャンバに動作可能に結合されるセンサを使用して、パラメータを測定するステップを伴ってもよい。査定するステップは、プロセッサを使用して、パラメータが所定の閾値を満たすかどうかを決定するステップを伴ってもよい。パラメータは、グルコース、乳酸、もしくは細胞代謝物等の使用済み細胞培養培地内の１つまたはそれを上回る化合物の測定された濃度であってもよい。実施形態では、戻すステップは、使用済み細胞培養培地を廃棄物リザーバから細胞培養チャンバの中に再指向するステップを含む。他の実施形態では、本方法はまた、パラメータが、所定の閾値を満たさない場合、使用済み細胞培養培地を廃棄するステップと、新鮮な細胞培養培地を細胞培養チャンバの中に流動させるステップとを伴う。

別の側面では、本開示は、流体リザーバを受容するための複数の棚を含む、細胞培養システムを提供する。棚は、第２の棚の上に第１の棚を伴ってスタックされ、第１および第２の棚はそれぞれ、流体リザーバを受容するように構成されてもよい。棚はそれぞれ、第１および第２の棚のそれぞれの上に流体リザーバを保定する、保定機構を含んでもよい。

本システムはさらに、少なくとも１つのポンプと、少なくとも１つのポンプに動作可能に結合される、プロセッサと、複数の細胞培養チャンバを同時に保持するようにサイズ決めおよび構成される、基板とを含んでもよい。好ましくは、本システムはさらに、少なくとも１つのセンサを含み、プロセッサは、少なくとも１つのセンサに接続されてもよく、センサによって測定された特性に基づいて、少なくとも１つのセンサを動作させるように構成されることができる。例えば、センサは、グルコース、乳酸、もしくは細胞代謝物等の細胞培養培地内の１つまたはそれを上回る化合物の濃度を測定してもよい。プロセッサは、１つまたはそれを上回るセンサから作製された測定値に基づいて、ポンプを調整してもよい（例えば、ポンプをオンまたはオフにする）。例えば、１つのセンサが、細胞培養チャンバに取り付けられてもよい。そのセンサは、例えば、細胞培養チャンバ内の培地内のグルコースレベルを測定してもよい。グルコースレベルが、所定の閾値を下回るとき、プロセッサは、細胞培養チャンバ内の培地を交換するためにポンプをトリガしてもよい。

いくつかの実施形態では、プロセッサは、細胞タイプを培養するための命令を受信および実行するように構成される。他の事例では、プロセッサは、Ｔ細胞を形質導入するための命令を受信および実行するように構成されてもよい。

いくつかの実施形態では、基板は、異なるサイズおよび／または形状の細胞培養チャンバを受容するように構成される。本構成は、これが、本システムが、ユーザの特定の必要性に応じて、異なる品質の細胞または異なる細胞タイプを培養するようにカスタマイズされることを可能にするため、有利である。本システムはさらに、複数のポンプを含んでもよい。例えば、本システムは、本システム内に含まれる細胞培養チャンバ毎に別個のポンプを含み、各細胞培養チャンバ内の細胞が別個に培養されることを可能にし得る。

いくつかの実施形態では、本システムはさらに、第１の棚上の第１の流体リザーバから複数のポンプに、複数のポンプから複数の細胞培養チャンバに、かつ複数の細胞培養チャンバから第２の棚上の第２の流体リザーバに流体的に接続する、複数の管を含む。好ましくは、本システムは、培養器の中への挿入のために寸法決定される。

関連する側面では、本開示は、細胞の滅菌培養のための方法を提供する。本方法は、第２の棚の上に第１の棚を伴ってスタックされる、複数の棚であって、第１および第２の棚はそれぞれ、流体リザーバを受容するように構成される、複数の棚と、少なくとも１つのポンプと、少なくとも１つのポンプに動作可能に結合される、プロセッサと、

複数の細胞培養チャンバを同時に保持するようにサイズ決めおよび構成される、基板とを備える、細胞培養システムを提供するステップを含む。本方法はさらに、第１の棚上に第１の流体リザーバを装填するステップと、第２の棚上に第２の流体リザーバを装填するステップと、基板上に第１の細胞培養チャンバおよび第２の細胞培養チャンバを装填するステップと、第１および第２の流体リザーバ、少なくとも１つのポンプ、ならびに第１および第２の細胞培養チャンバを管類と接続するステップと、第１および第２の細胞培養チャンバの内側の細胞を培養するように本システムを動作させるステップとを含む。

いくつかの実施形態では、第１および第２の細胞培養チャンバは、異なるサイズまたは形状を含む。いくつかの実施形態では、本システムは、少なくとも１つのセンサを含む。いくつかの実施形態では、プロセッサは、少なくとも１つのセンサに接続され、センサによって測定された特性に基づいて、ポンプを動作させるように構成される。

図１は、多重生物反応器システムの実施例を示す。

図２は、生物学的反応器の実施形態を示す。

図３は、多重生物反応器システムを示す。

図４は、ＣＡＲ－Ｔ／ＴＣＲワークフローを示す。

図５－８は、異なるシステムを使用したＴ細胞増殖の比較を示す。 図５－８は、異なるシステムを使用したＴ細胞増殖の比較を示す。 図５－８は、異なるシステムを使用したＴ細胞増殖の比較を示す。 図５－８は、異なるシステムを使用したＴ細胞増殖の比較を示す。 図５－８は、異なるシステムを使用したＴ細胞増殖の比較を示す。 図５－８は、異なるシステムを使用したＴ細胞増殖の比較を示す。

図９－１０は、新たに培養された樹状細胞およびＰＢＭＣまたはＴ細胞を共培養するための方法ならびにその結果を示す。 図９－１０は、新たに培養された樹状細胞およびＰＢＭＣまたはＴ細胞を共培養するための方法ならびにその結果を示す。

図１１は、細胞ベースの免疫療法生成物を形成するための方法を示す。

図１２は、いくつかの実施形態による、システムアーキテクチャを示す。

詳細な説明
本発明の細胞培養システムは、免疫療法生成物製造を有意に改良し、比類のない程度の一貫性、品質、安全性、経済性、拡張性、柔軟性、および携帯性を伴う流動ベースの免疫療法生成技術を提供する。一般に、細胞は、時として、カートリッジと称される、単回使用細胞培養チャンバ内で成長され、これは、フィルタの必要性を伴わずに高増殖性を達成するために、低い流率において灌流される。本システムは、本明細書に説明されるように、免疫療法生成物を発生させるために、患者の細胞物質の処理を実行するために相互に流体的に結合されるべき１つまたはそれを上回る細胞培養チャンバを支持する。生物反応器が、ある実施形態では、閉鎖環境において提供されることを理解されたい。本例示的実施形態のスケールアップは、直列および／または並列処理を可能にするためにモジュール（例えば、生物学的反応器）を追加することによって、当業者の知識の範囲内であろう。当業者はまた、異なる、または代替配列が、生成されるべき生成物に基づいて所望され得ることを理解するであろう。

図１は、多重生物反応器システム９００の実施例を示す。システム９００は、流体リザーバ９８０と流体連通する管類９４０に接続される、入口８４５および９４５を有する、第１の細胞培養チャンバ８２０と、第２の細胞培養チャンバ９２０とを含む。細胞培養チャンバは、廃棄物リザーバ９８４と流体連通する、出口８３５および９３５を有する。ポンプ９１０ａおよび９１０ｂは、流体リザーバ９８０から細胞培養チャンバ８２０ならびに９２０への流体の圧送を促進する。ポンプは、本明細書に説明される機能を実施するために、プロセッサ９９９によって制御される。

生物学的反応器１１０の別の実施形態が、細胞培養チャンバ１２０の部分のより詳細な概略図を提供する、図２に示される。本明細書に説明される細胞培養プラットフォームが、異なる体積、形状、および物理的特性の細胞培養チャンバが使用されることを可能にするように構成されることに留意することが重要である。図２に示されるチャンバは、例示的にすぎず、他の実施形態も、当業者に明白となるであろう。図２に示されるように、細胞培養チャンバ１２０は、底面１２２と、少なくとも１つの付加的表面１２４とを含む。底面１２２は、それに細胞が接着する第１の材料から成る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの付加的表面１２４は、ガス透過性である第２の材料から成る。下記により詳細に説明されるであろう他の実施形態では、表面１２４を含む、細胞培養チャンバ１２０全体が、ガス不透過性である第１の材料から作製される。細胞培養チャンバはまた、１つまたはそれを上回る入口１２６、１３６と、１つまたはそれを上回る出口１２８、１３８とを備える。ある実施形態では、生物学的反応器はまた、少なくとも１つの灌流流体リザーバ１３２、少なくとも１つの廃棄物流体リザーバ１３４、チャンバ１２０を通して灌流流体を移動させるための少なくとも１つのポンプ１４０、ならびにリザーバ１３２、１３４に、およびそれからチャンバ１２０を通して流体を輸送するための関連付けられる入口１３６ならびに出口１３８を含む。

細胞培養チャンバ１２０に関して、第１の材料は、生体適合性であり、それに、それぞれ、樹状細胞（ＤＣ）または単球等の抗原提示細胞（ＡＰＣ）もしくはそれらの前駆体が接着するであろう任意の材料であり得る。細胞培養チャンバ１２０内で起こるＴ細胞刺激および増殖プロセスの間、成熟したＡＰＣが、発達し、好ましくは、底面１２２に接着するであろう一方、Ｔ細胞は、底面の上方の上澄部内に留まり、増殖されたＴ細胞を別個に取得することをより容易にする。

一例示的実施形態では、第１の材料は、ポリスチレンを含む。培養が行われるであろう底面のためにポリスチレンを使用する１つの利益は、ＰＢＭＣから樹状細胞を発生させるプロセスにおいて本材料が果たす有用な役割である。具体的には、ポリスチレン表面は、ＰＢＭＣの不均質な懸濁液から単球を富化させるために使用されることができる。これは、例えば、ＩＬ４およびＧＭ－ＣＳＦを含有する培地中での培養を介した単球の分化によってＤＣを発生させるために利用される、培養プロセスにおける最初のステップである。Ｔ細胞刺激の１サイクル全体を通した樹状細胞生成のための同一のポリスチレン表面の使用は、これが、そうでなければ必要であろう多数の移送ステップを排除し、それによって、ＤＣ刺激療法Ｔ細胞製造のための閉鎖系を可能にするため、バイオプロセスの観点から非常に有益である。

底面は、６および２４ウェルプレート（それぞれ、９．５ｃｍ^２ならびに３．８ｃｍ^２）等の従来のウェルプレートに匹敵する表面積を有することができる。また、表面積が、約２．０ｃｍ^２～約２００ｃｍ^２の表面積、例えば、約２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９，０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、７５．０、１００．０、１２５．０、１５０．０、１７５．０、および２００．０ｃｍ^２、ならびにその間の任意の表面積を有する等、従来のウェルプレートよりも小さい、またはさらにははるかに大きくあり得る（例えば、標準的な細胞培養皿およびフラスコに匹敵する表面積を有する）ことを理解されたい。

少なくとも１つの付加的表面１２４は、１つまたはそれを上回る側壁および上部壁等の任意の構成を備えることができる。一実施形態では、図２に示されるように、側壁は、箱形状が、底面１２２と併せて形成されるように、相互に対して９０度の角度において配列されることができる。別の実施形態では、少なくとも１つの付加的表面１２４は、チャンバ１２０またはその断面が、円筒、楕円円筒、円錐、ドーム様形状、もしくは三角形形状を形成するように、湾曲した側壁を形成する。上記の例示的構成が、非限定的であり、少なくとも１つの付加的表面が、前述の例示的構成に提供されない他の構成を有し得ることを理解されたい。

多重生物反応器システムの例示的構成が、図３に見出され、本構成を使用して実行されるプロセスに関する付加的詳細が、下記に提供されることができる。図３のパネルＢに示されるように、第２の生物反応器２１０が関与する場合では、第２の細胞培養チャンバ２２０は、第１のチャンバの出口および第２のチャンバの入口を介して第１の細胞培養チャンバ１２０と接続するように位置付けられる。接続は、好ましくは、滅菌接続である。接続は、第１の細胞培養チャンバ１２０の中への滅菌空気の注入を可能にし、増殖されたＴ細胞を含有する上澄部を第２の細胞培養チャンバ２２０の中に移送する。流体流動の技術分野で公知の代替技法が、上澄部を第１の細胞培養チャンバ１２０から第２の細胞培養チャンバ２２０に移送するために採用されてもよい。また、示されるように、各生物反応器は、その独自の流体および廃棄物収集リザーバ、ポンプ、ならびに関連付けられる管類を含む。しかしながら、リザーバおよびポンプが、生物反応器の間で共有され得ることを理解されたい。

本システムは、本明細書に説明される細胞培養の種々の方法のために要求される、培地を用いて細胞培養チャンバ内の細胞を灌流することが可能であるように構成される。灌流は、細胞ベースの免疫療法生成物の形成を支援するために、十分なガス交換および廃棄物除去とともに、細胞混合物への均一な栄養素およびサイトカイン供給を確実にする。培地およびサイトカインの一貫した局所的濃度プロファイルを維持することは、従来技術のプレートベースのプロトコルと比較して、より高い収率およびＤＣへの単球分化のプロセスを加速させる潜在的能力を確実にする。しかしながら、接着性（ＤＣ）および非接着性（Ｔ細胞）タイプの組み合わせは、機械的力に対するＤＣの高感受性とともに、特に、細胞培養チャンバを通した流体の流動に関して、抗原特異的Ｔ細胞の刺激ならびに増殖に対する課題をもたらす。したがって、培地およびサイトカインが灌流を介して提供されるそれらの実施形態では、本発明のシステムは、ＤＣ等のある抗原提示細胞の剪断感受性もまた考慮しながら、生物反応器から細胞を除去することなく、細胞に栄養素およびサイトカインを供給することが可能でなければならない。本発明のシステムおよび方法は、成長因子をリフレッシュし、ＤＣの最小の物理的刺激を維持しながら、Ｔ細胞増殖に好都合なオートクライン／パラクラインシグナルの留保を最適化することを目標とする。これを考慮するために、細胞培養チャンバを通した灌流流動の方向および率の両方が、考慮されなければならない。

ある側面では、流体流率は、抗原提示細胞の沈降率を下回って維持される。したがって、抗原提示細胞は、それらの質量のため、培養チャンバ内に留まるであろう。言い換えると、抗原提示細胞は、細胞培養チャンバの底部に向かって沈み、したがって、細胞培養チャンバ内に留まるであろう。
沈降率よりも低い流率が、以下の方程式１に従って計算されることができる。

式中、ｖ＿ｍａｘは、それを超えると細胞が上向きに持上されるであろう液体速度であり、ψは、細胞の形状係数（細胞の表面積と等しい体積の球体の表面積との比率、細胞が完全に球状ではなく、本係数が１を下回ることが予期されることに留意されたい）であり、ｄ＿ｐは、細胞のものに等しい体積の球状粒子の直径であり、μは、細胞を含有する液体の粘度であり、ｇは、重力定数であり、ｐ＿ｃｅｌｌは、細胞の密度であり、ｐ＿ｌｉｑｕｉｄは、細胞を含有する液体の密度であり、ｅは、細胞によって占有されていない着目体積の割合である。

培地の灌流を伴う下記に説明される方法において、灌流が、培養の間に連続的に実施され得る、またはこれが、例えば、各日もしくは週に１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれを上回る回数等、細胞が任意の１つの細胞培養チャンバ内で培養される時間周期にわたる具体的時点で行われ得ることを理解されたい。連続的灌流は、プロセス全体を通してほぼ一定の培養体積を維持することに役立つ。同様に、サイトカインが、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、またはそれを上回る回数等の培養の間の１つまたはそれを上回る時点で、もしくは連続的に注入されることができる。それらの実施形態では、連続的灌流は、サイトカインの一貫した局所的濃度プロファイルを維持することに役立ち、これは、静的細胞培養方法と比較して、より高い収率を確実にすることに役立つことができ、Ｔ細胞が刺激および増殖される速度を増加させる能力を有する。

灌流パラメータは、培養サイクルの間の任意の時点で変動されることができる。例示的パラメータは、限定ではないが、流率の中央値、サイトカイン濃度、および培養サイクルの持続時間を含む。これらのパラメータはそれぞれ、Ｔ刺激の効能に影響を及ぼし得る。例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４００４２号および第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／６０７０１号に説明されるように、ＤＣへの単球拡散のための培養チャンバを設計する最近の研究では、０．１ｄｙｎ／ｃｍ^２の壁剪断応力レベルに対応する培地灌流率が、従来の６または２４ウェルプレートベースのプロトコルを使用して発生されるものと表現型的に同じであるＤＣを生成することが可能であると決定されている。したがって、培養サイクルの間に上記に説明される表現型および機能的測定値のうちの１つまたはそれを上回るものを測定することによって、効能に対する１つまたはそれを上回る灌流パラメータの効果が、監視され、適切な調節を可能にすることができる。

灌流を促進するために、本システムは、１つまたはそれを上回るポンプ１４０を含む。ポンプは、細胞培養チャンバの中に灌流培地を灌流するために、細胞培養チャンバ１２０に動作可能に結合されることができる。生物反応器１１０はまた、１つまたはそれを上回る流体リザーバ１３２を含むことができる。流体リザーバ１３２は、細胞培養チャンバ１１０と流体連通し、１つまたはそれを上回るポンプ１４０に動作可能に結合されることができる。流体リザーバをポンプおよび細胞培養チャンバに接続するための１つまたはそれを上回る管もまた、提供される。ある側面では、１つまたはそれを上回るポンプは、流体リザーバから、細胞培養チャンバを通して、廃棄物収集リザーバの中に流体を圧送するために構成される。図２に示される例示的実施形態では、流体は、流体リザーバ１３２から、管類１５２を通してポンプ１４０に、かつ入口１３６を介して細胞培養チャンバ１２０の中に移動し、出口１３８を介して細胞培養チャンバ１２０から外に戻り、管類１５４を通して、廃棄物収集リザーバ１３４の中に移動する。

ある実施形態では、流体リザーバおよび／または廃棄物収集リザーバは、それぞれ、チャンバに流体的に結合される、１つまたはそれを上回るシールされたバッグもしくは容器として提供されることができる。各リザーバは、入口ポートおよび出口ポート、または出口ポートならびに１つまたはそれを上回る細胞培養チャンバの入口に流体的に結合される排出口を含有する。いくつかの実施形態では、ルアーコネクタおよびルアーコネクタの周囲に嵌合するように切断されるシリコーンガスケットが、入口または出口の一方もしくは両方を通した漏出を防止するために使用されることができる。いくつかの実施形態では、シールされたリザーバは、いずれの容器も外部環境に暴露せず、滅菌状態を維持する流体接続を作成する、滅菌管溶接デバイスを使用して細胞培養チャンバに接続されることができる。下記により詳細に議論されるであろうように、これは、本発明の方法が閉鎖系において実施されることを可能にする。

開示される細胞培養システムの小さいサイズおよび携帯性に起因して、それらは、管溶接デバイスと併せて容易に使用されることができる。本発明のシステムは、必要な滅菌接続を行うために、容易に持上され、管溶接機と近接するように運搬されることができる。細胞培養システムのサイズおよび構成はまた、それらを標準的な培養器と互換性にする。細胞培養システムは、開示されるプロセスが、その中で実行され得るように、従来の培養器の内側の単一の棚上に嵌合するようにサイズ決めおよび構成される。複数の器具が、構成に応じて、単一の培養器内に嵌合することができる。培養器内の条件は、３７℃の持続温度および９５～１００％の湿度を含む。したがって、選定される材料は、材料（流体および生物製剤を含む）が、そのような条件下で拡大する傾向があることを前提として、これらの条件に耐える完全性を有していなければならない。さらに、いくつかの状況では、培養器内の条件は、安定したままであり、温度の自動化記録が、培養器内で実施される反応におけるいずれかの異常と相関させるための温度変動の知識を有するために可能である。

故に、いかなる電力の供給も、培養器内の環境を変化させるべきではない。例えば、あるポンプは、熱を発生させる。故に、一実施形態では、ポンプは、生物学的反応器とは別個に格納されるが、依然として、反応器と流体的かつ動作可能に連通する。別の実施形態では、ポンプは、生物学的反応器に直接取り付けられ、培養器内に位置するが、熱を持たない、または熱を放散させるために熱シンクならびに／もしくはファンに動作可能に接続される。別の実施形態では、ポンプは、発生される熱の量を低減させるためにデューティサイクルで起動する。構成にかかわらず、ポンプは、生物学的反応器、順に、細胞培養チャンバに動作可能に結合される。いくつかの実施形態では、本システムはまた、細胞培養リザーバ、および随意に、流体リザーバの温度を制御するためのヒータを含む。そのような構成では、いかなる培養器も、要求されず、本システムは、電力の源のみを用いて自律的に動作することができる。本システムにヒータが欠如する場合、これは、細胞培養器の内側で動作されることができる。

オンボード使い捨て蠕動ポンプによって可能にされるオンボード試薬貯蔵および灌流を用いた内皮細胞培養のための小規模培養システムならびにポリスチレン底面を伴うチャンバを使用した単球からの樹状細胞発生のためのより大規模な培養システム等の灌流ベースの自動化細胞培養システムに関する付加的詳細が、国際特許公開第ＷＯ ２０１７／００４１６９号、第ＷＯ ２０１７／０７９６７４号、および第ＷＯ ２０１８／００５５２１号、ならびに米国特許出願番号第１６／５３９，９１６号（そのそれぞれは、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる）に見出されることができる。

本発明のシステムまたはデバイスは、モジュール式であり、直列で（すなわち、流体が１つのデバイスから別のものの中に流動する）、および／または並列で他の類似するデバイスへの流体接続が可能であり、また、相互と物理的にスタックする、もしくは培養器等の関連するデバイス内での物理的配列が可能であるように構成されてもよい。本システムのモジュール式設計は、具体的には、本システム内に含まれるべき所望のプロセスに応じて、モジュールが柔軟に出し入れされて切り替えられることを可能にする。

細胞培養チャンバを備える生物学的反応器を含む、本発明の流体デバイスは、マイクロ流体実施形態（すなわち、その中の１つまたはそれを上回るチャネルもしくはチャンバが、約１μｍ～約９９９μｍの範囲内の寸法を有する）またはマクロ流体実施形態（その中のチャネルもしくはチャンバが全て、約１ｍｍまたはそれを上回る寸法を有する）のいずれか、もしくは両方において提供されることができる。

流体デバイスはさらに、特定の設計によって要求されるように、付加的流体チャネルまたはコンパートメント、ガスケットまたはシール、混合区域、弁、ポンプ、排出口、加圧ガスのためのチャネル、電気導体、試薬、ポート、および管類を含むことができる。それらはまた、１つまたはそれを上回る制御モジュール、送信機、受信機、プロセッサ、メモリチップ、バッテリ、ディスプレイ、ボタン、制御装置、モータ、空気圧アクチュエータ、アンテナ、電気コネクタ、および同等物を含有してもよい。本デバイスは、好ましくは、哺乳類細胞に対して非毒性であり、アルコールおよび／または熱もしくはガンマ線照射またはエチレンオキシドガスへの暴露等の他の手段の使用による滅菌と適合する材料のみを含有する。

機器の材料は、各プロセスに特有の異なる温度および圧力定格下で適切な化学的適合性を伴って選定される。加えて、シリンジ、蠕動、圧力、および回転ポンプ等の本デバイスにおいて実装されるポンプの選択肢は、異なる機能に関する流動および圧力要件に応じて、流率においてｎＬ～ｍＬに及び、圧力において１０～１０，０００ｐｓｉに及ぶ。

本発明のシステムはまた、入口チャネルと流体連通する、モジュールの種々の種々の入口において、サンプルを本デバイスに導入するための１つまたはそれを上回るサンプル溶液リザーバもしくはウェルまたは他の装置を含むことができる。本発明の流体デバイス上に１つまたはそれを上回るサンプルを装填するために使用されるリザーバおよびウェルは、限定ではないが、シリンジ、カートリッジ、バイアル、エッペンドルフ管、ならびに細胞培養材料（例えば、９６ウェルプレート）を含む。

有用である場合、本デバイスの表面は、プラズマへの暴露によって等、より親水性にされることができる、もしくは１つまたはそれを上回るゲル、化学官能基化コーティング、タンパク質、抗体、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、サイトカイン、もしくは細胞を用いてコーティングされることができる。本発明の流体デバイスは、好ましくは、動作条件下で流体漏出がなく、数日から数週間の周期にわたる滅菌動作が可能である。本発明の流体デバイスはまた、新しい物質または汚染物質を本システムに導入することなく、試験のために流体が本システムから除去されることを可能にする、サンプリング機構を含む。

ある側面では、細胞培養システムの少なくとも一部は、使い捨てコンポーネントを備え、そのうちのいくつかまたは全ては、非使い捨てフレーム内に格納されることができる。他の側面では、本システムの全てのコンポーネントは、使い捨てである。さらに、いくつかの実施形態では、細胞培養システムは、患者物質を追跡およびドキュメント化するためのサンプル追跡コンポーネントを含む。

製造プロセスの間の少なくとも１つのステップ、時として、複数または全てのステップは、種々のインラインプロセス分析ツール（ＰＡＴ）もしくは小型化マイクロ全分析システム（マイクロＴＡＳ）を使用して、生成物特性（例えば、純度および多形相）に関して監視される。

上記に説明されるように、本発明の細胞培養システムは、本システム内の流体および実体の方向ならびに流動を制御することが可能である。本発明のシステムは、例えば、弁およびポンプを利用する、圧力駆動流動制御を使用し、細胞、試薬等の流動を、１つまたはそれを上回る方向において、ならびに／もしくは流体デバイスの１つまたはそれを上回るチャネルの中に操作することができる。しかしながら、電気浸透性流動制御、電気泳動、および誘電泳動（Ｆｕｌｗｙｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １５６， ９１０ （１９７４）； Ｌｉ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ６９， １５６４ （１９９７）； Ｆｉｅｄｌｅｒ， ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７０， １９０９－１９１５ （１９９８）； 米国特許第５，６５６，１５５号）等の他の方法もまた、単独で、またはポンプおよび弁と組み合わせて使用されてもよい。

本発明のシステムはまた、本システムを通した流体の移動を制御し、本システム内の温度等の種々のパラメータを監視および制御し、加えて、細胞ベースの免疫療法生成物の存在、生成物の数量（直接もしくは間接的に）、変換率等を検出するための１つまたはそれを上回る制御システムを含む、もしくはそれに動作可能に結合されることができる。本システムはまた、フィードバック制御を可能にする、高度なリアルタイムプロセス監視および制御プロセス、ならびに本システムを使用して取得された反応および精製結果を前提として統合ならびにスケールアップを可能にするプロセス等の多数のクラスのソフトウェアを装備してもよい。

ある実施形態では、本システムは、チャネル寸法、流動幾何学形状、および本デバイスの異なるモジュールの間の相互接続の観点から交換可能である、マイクロ、ミリ、またはマクロ流体モジュールおよび管類の組み合わせを含む。各モジュールおよび管類は、具体的機能のために設計されてもよい。一実施形態では、本システム内のモジュールは全て、細胞培養およびＴ細胞刺激のために設計される。他の実施形態では、本システム内のモジュールは、免疫療法生成物の連続的製造のために全て統合される、組織処理、樹状細胞発生、細胞培養、濃縮、および／または精製等の異なる機能のために設計される。流動用途のために好適である均質および不均質なプロセスの両方が、考慮される。これらのプロセスは、流動プロセスの間に本システムを容易に詰まらせないように、出発材料および温度、圧力、ならびに流率等の動作条件に関して設計および最適化される。
（ガス不透過性細胞培養チャンバ）

いくつかの実施形態では、開示されるシステムの細胞培養チャンバは、ガス不透過性材料から作製される。ガス不透過性材料は、生体適合性であり、それに樹状細胞が接着するであろう材料である。一例示的実施形態では、ガス不透過性材料は、ポリスチレンから成り、これは、上記に説明されるように、ＰＢＭＣの不均質な懸濁液から単球を富化させるために有用である。ガス不透過性材料から作製される細胞培養チャンバ全体は、それに細胞が接着し得るより大きい表面積をもたらし、本システムの滅菌状態を向上させる。

ガス不透過性細胞培養チャンバは、チャンバ１２０の付加的表面１２４および全ての他の表面が、底面１２２と同一の材料から作製されることを除いて、図２に示されるチャンバ１２０と実質的に同一であり得、上記に説明される任意の体積、形状、サイズ、および物理的特性を有することができる。いくつかの実施形態では、チャンバ１２０の上部、底部、および全ての側壁は、ガス不透過性である。ガス不透過性細胞培養チャンバの底面は、６および２４ウェルプレート（それぞれ、９．５ｃｍ^２ならびに３．８ｃｍ^２）等の従来のウェルプレートに匹敵する表面積を有することができる。また、表面積が、約２．０ｃｍ^２～約２００ｃｍ^２の表面積、例えば、約２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９，０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０、１６．０、１７．０、１８．０、１９．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、７５．０、１００．０、１２５．０、１５０．０、１７５．０、および２００．０ｃｍ^２、ならびにその間の任意の表面積を有する等、従来のウェルプレートよりも小さい、またはさらにははるかに大きくあり得る（例えば、標準的な細胞培養皿およびフラスコに匹敵する表面積を有する）ことを理解されたい。

チャンバが、ガスに対して透過性ではないとき、ある修正が、上記に説明されるシステムに行われる必要がある。例えば、ガスが、細胞培養チャンバの表面のうちの１つを通して流動しない、そのような実施形態では、細胞と培地との間のガス交換は、別の方法で促進されなければならない。細胞培養チャンバは、１つまたはそれを上回る入口１２６および１３６と、１つまたはそれを上回る出口１２８および１３８とを備える。入口および出口開口部は、個別の開口部とシールされる、管類に流体的に結合されることができる。入口および出口は、それによって、チャンバを通して灌流流体を移動させるための対応するポンプを伴う灌流流体リザーバならびに廃棄物流体リザーバに接続可能である。入口および出口は、チャンバの任意の表面において位置することができる。いくつかの実施形態では、それらは、チャンバの上部において位置する。管類は、好ましくは、高透過性管類である。ガス交換をもたらすために、培地は、高透過性管類を通して、チャンバの中への進入に先立って、およびチャンバから離れた後、ガスを交換することができる。ガスは、したがって、１つまたはそれを上回る入口を通してチャンバの中に効果的にもたらされ、１つまたはそれを上回る出口を通して除去される。入口またはそれに接続される管は、細胞培養チャンバに進入する液体または空気を濾過するために、０．２ミクロンフィルタ等のフィルタを含むことができる。

ガス流動は、灌流率によって影響を受け、そのパラメータは、上記に説明されるように制御されることができる。高透過性管類を介してガスを交換することによって、本システムは、チャンバがガス透過性であることを要求することなく、要求されるレベルのガス交換を達成する能力を維持する。細胞培養の方法は、灌流およびガス流動のための入口１２６および１３６ならびに出口１２８および１３８を伴う、完全にガス不透過性のチャンバ内で実施されることができる。方法実施形態では、ガス不透過性細胞培養チャンバは、チャンバの中に細胞を装填し、入口および出口を介してチャンバの内外に細胞培養培地を流動させることによってそれらを灌流することによって、細胞を培養するために使用されることができる。灌流流動は、栄養素ならびにガス交換を細胞培養に提供する。チャンバを通した流動は、層状であるため、いくつかの方法は、細胞採取のため等、付加的振盪を要求し得る。しかしながら、開示されるシステムのサイズおよび構成を前提として、システム全体が、必要に応じて、オービタルシェーカ上に設置されることができる。

ガス不透過性実施形態の別の利点は、それらがより少ない異なる部分および材料を有するため、それらが製造することがより容易であることである。それらは、必要に応じて、大きいまたは小さいものとして作製されることができる。ガス不透過性チャンバは、一体的に形成されることができる、またはこれは、複数の部分から形成されることができる。例えば、これは、従来的製造プロセスまたは３Ｄ印刷等の付加製造プロセスによって、材料の単一の断片から形成されることができる。実施形態では、それぞれ、ガス不透過性材料から作製される、複数の部材が、機械的締結、接着剤および溶剤接合、ならびに超音波溶接等の溶接等の当技術分野で公知の方法を使用して、ともに継合される。
（細胞培養チャンバの交換可能性）

本発明の細胞培養システムは、種々のサイズおよび形状の細胞培養チャンバと接続することが可能であるように構成される。細胞培養システムは、流体リザーバと、廃棄物リザーバと、リザーバへの、およびそれからの流体流動を制御するための１つまたはそれを上回るポンプとを含むことができる。細胞培養システムはまた、異なる形状およびサイズの１つまたはそれを上回る細胞培養チャンバを受容するように構成されるエリアを有する。１つまたはそれを上回る管が、流体リザーバ、細胞培養チャンバ、および廃棄物リザーバを流体的に接続する。ポンプは、管を通して流体を移動させるように構成される。

異なる細胞培養チャンバサイズが、異なる目的のために、または相互と組み合わせて使用されることができる。サイズは、所望の細胞産出量または必要とされる試薬の異なる割合に基づいて選択されることができる。例えば、小さいカートリッジサイズが、研究、前臨床使用、またはプロセス開発のために有用であり得る。大きいカートリッジは、同一のアーキテクチャを伴うより高容量のバージョンである。

１つまたはそれを上回る細胞培養チャンバの高さは、変動することができる。例えば、限定ではないが、細胞培養チャンバ高の例示的範囲は、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０、３５．０、４０．０、４５．０、５０．０、５５．０、６０．０、６５．０、７０．０、７５．０、８０．０、８５．０、９０．０、９５．０、１００．０ｍｍ、またはそれを上回るもの、もしくはその間の任意の高さ等の０．５ｍｍ～１００ｍｍのいずれかの高さを含む。ある実施形態では、チャンバの高さは、約０．８ｍＬ～６ｍＬの体積容量を伴う、２～６ｍｍ等、典型的には、６および２４ウェルプレートにおいて実施される培養における液体高に匹敵し得る。他の実施形態では、細胞培養チャンバは、約５０ｃｍ^２の培養面を伴う、１０ｍｍ～５０ｍｍ等のより大きいサイズであろう。いくつかの実施形態では、細胞培養チャンバは、約１ｍＬ～約１００ｍＬの体積容量を有し、約５、１０、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９０ｍＬ、もしくはその間のいずれかであってもよい。他の実施形態では、細胞培養チャンバは、約１００ｍＬ～約１，０００ｍＬ、例えば、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、または１，０００ｍＬの体積容量を有する。特定の実施形態では、細胞培養チャンバは、２１０ｍＬの容量を有する。

本発明に伴うカートリッジの交換可能性は、同一のシステムを使用した細胞成長手順の間のスケールアップを可能にする。これは、細胞を成長させ続けるために、異なる細胞培養システムに切り替える必要性を回避する。例えば、約２０億個の細胞のバッチサイズを製造するために、本システムは、約２５ｍＬの容量を伴う小さいカートリッジから開始し、次いで、約２１０ｍＬの容量を伴う大きいカートリッジにスケールアップすることができる。本交換可能性は、プロセスのより多くの部分が、活性化から充填および仕上げを通して同一のシステムで行われ得ることを意味する。特定のプロトコルの必要性に応じて、本システムは、例えば、２つの大きい（約２１０ｍＬ）細胞培養チャンバ、２つの小さい（約２５ｍＬ）細胞培養チャンバ、またはそれぞれのうちの１つとともに動作可能である。各入口および出口は、任意のサイズのチャンバに接続されることができるため、本システムは、必要に応じて、スケールアップまたはスケールダウンすることが可能である。

再度図１を参照すると、システム９００は、１つまたはそれを上回る細胞培養チャンバ８２０および９２０を支持するように構成される、プラットフォーム９５０を含む。形状またはサイズにかかわらず、細胞培養チャンバは、管９４０を介して接続されることができる。このように、異なる形状およびサイズの細胞培養チャンバが、本システムと互換性がある。細胞培養チャンバは、横並びに位置付けられる、またはスタックされる等、プラットフォーム上に異なる構成において配列されることができる。実施形態では、管９４０は、チャンバと一体的に形成される。管およびチャンバ本体は、上記に議論される同一の製造方法を使用して、ともに継合されることができる。一実施形態では、細胞培養チャンバは、１つまたはそれを上回る入口もしくは出口の形成を可能にするために、側壁および／または上部壁における材料の少なくとも一部が切り抜かれて製造される。例示的配列では、管が、容器とのシールを形成するために、開口部の中に別個に挿入されることができる。前述の構成が、実施例にすぎず、チャンバおよび１つまたはそれを上回る管を継合するための他の構成もまた、本発明の想定される実施形態であることを理解されたい。

交換可能性は、部分的に、本システムの種々の容器およびチャンバを結合するために滅菌管接続を使用することによって促進される。滅菌管は、好ましくは、滅菌管溶接機を使用して接続される。概して、滅菌管溶接機は、２つの管を受容し、それらを定位置に固着させ、次いで、高温ブレードを用いてそれらを切断し得、第１の管および第２の管が整合されるようにそれらを再整合し、ブレードが後退されるとき、２つの切断端をともに融解させるデバイスである。本発明との併用のための滅菌管溶接機は、Ｔｅｒｕｍｏ ＢＣＴ， Ｉｎｃ． （Ｌａｋｅｗｏｏｄ， ＣＯ）からのＳＣＤ(R) ＩＩＢ、Ｖａｎｔｅ ＢｉｏＰｈａｒｍ （Ｔｕｃｓｏｎ， ＡＺ）からのＶａｎｔｅ(R) ３６９０、およびＧｅｎｅｓｉｓ ＢＰＳ^TM （Ｒａｍｓｅｙ， ＮＪ）からのＴＣＤ(R)を含む、任意の商業的に入手可能な滅菌管溶接機であり得る。

下記により詳細に説明されるであろうように、ある実施形態では、本システムは、機能的に閉鎖される。閉鎖系は、移送の全てが滅菌管溶接を使用して行われることによって維持される。例えば、細胞が、滅菌バッグ内に貯蔵され得、これは、次いで、滅菌細胞培養チャンバに接続される。細胞は、滅菌状態を維持しながら、細胞培養チャンバの中に流動されることができる。管接続性は、細胞播種、洗浄、および採取が、全て滅菌条件下で同一のデバイス上で行われることを可能にする。滅菌管溶接機を使用することによって、１つのバッグが、別のものを接続する前に接続解除される必要性はない。

上記の説明は、システムコンポーネントおよび種々の可能性として考えられる構成に焦点を当てる。以下の説明は、本発明のシステムを使用して実行され得る、あるプロセスに焦点を当てる。
（閉鎖系におけるＣＡＲ－ＴおよびＴＣＲプロセス）

上記に説明される細胞培養システムは、ＣＡＲ－ＴおよびＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を生成する方法のために有用である。ＣＡＲ－Ｔ／ＴＣＲワークフローの可視化が、図４に示される。開示されるシステムは、遺伝子修飾、細胞増殖、細胞洗浄および濃縮、ならびに細胞製剤化を含む、閉鎖系におけるワークフローのステップのうちのいくつかを実施するために使用されることができる。ＣＡＲ－ＴおよびＴＣＲ形質導入Ｔ細胞を生成する産業において使用される従来技術の方法は、閉鎖系において実施されない。一般的に使用されるポリスチレンのＴ型フラスコは、移送を実施するために開放および閉鎖される必要性があり、したがって、潜在的汚染を受ける。本発明は、固体ポリスチレンから作製された閉鎖された交換可能なカートリッジを使用し、これは、Ｔ型フラスコのために設計されたプロトコルが、開示される滅菌システム上で行われるように容易に再フォーマットされることを可能にする。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、Ｔ細胞を伴う培養チャンバの中に細胞培養培地を流動させ、Ｔ細胞を灌流し、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する不活性ウイルス等の形質導入試薬を用いてそれらを形質導入することを伴う。灌流流体は、細胞を増殖させるための活性化試薬を含んでもよい。いくつかの実施形態では、形質導入および／または活性化試薬は、細胞と事前混合され、他の実施形態では、それらは、別個の滅菌バッグまたは容器からのものである。バッグは、上記に説明されるような滅菌溶接手段を通して接続されることができ、試薬は、重力によって、またはポンプによってバッグの中に流動されることができる。いくつかの実施形態では、細胞培養チャンバは、ヘッドスペースを殆どまたは全く伴わずに完全に充填される。

細胞は、最大約３日にわたって成長され、その間、それらは、ＣＡＲ、ＴＣＲを帯びることを可能にされ、灌流培地によって持続される。細胞は、チャンバ内で沈殿物を形成し、灌流率は、細胞がカートリッジから外に流動しないように防止するために十分に低く維持される。形質導入された細胞は、培養チャンバ内で増殖され、次いで、さらなる増殖のために、滅菌管を介して接続されるより大きい培養チャンバに移送されることができる。本発明の方法を使用すると、小さいカートリッジ（２５ｍＬ体積）内の７日間の増殖は、約５億～１０億個のＴ細胞をもたらすことができ、大きいカートリッジ（２１０ｍＬ体積）は、約１０～３０億個のＴ細胞をもたらすことができる。

灌流バッグとの接続は、取り外され、採取バッグが、取り付けられる。細胞は、次いで、採取バッグの中に排出される。実施形態では、緩衝液バッグが、同一の方法によって接続され、それらが採取バッグの中に除去される前に、細胞の１回またはそれを上回る洗浄を実施するために使用されることができる。細胞がその中にある液体の体積は、１つの液体を排出し、別のものを添加し、新しい体積の液体中で細胞を再懸濁させることによって増加または減少されることができる。いくつかの実施形態では、本システムは、蓄積された乳酸を除去するために排出されることができる。細胞培養が増殖するにつれて、乳酸が、蓄積され、灌流のみを通してでは十分に速く除去されない場合がある。解決策は、細胞を除去することなく合計体積を（おそらく９０～９５％だけ）低減させるように培地を排出し、次いで、新鮮な培地を用いて灌流することである。いくつかの実施形態では、培地は、異なる細胞培養培地または凍結保存培地と交換されることができる。

細胞培養チャンバは、方法全体が、移送するときに容器のうちのいずれかを開放することによって培地を空気に暴露する必要性を伴わずに、閉鎖環境において実施されるように、閉鎖系において接続される。言及されているように、本方法の接続および接続解除は全て、滅菌管溶接機を用いて行われることができる。

従来技術と異なり、開示される活性化、形質導入、および増殖の方法は、閉鎖された滅菌システムにおいて実施される。上記に説明される交換可能性を用いて、ユーザは、全て閉鎖環境において、最大１００～２００億個の増殖された細胞のバッチにスケールアップすることができる。いくつかの実施形態では、本方法は、より大きい生物反応器システム上での製造のためのバッチを調製するために使用されてもよい。従来のＣＡＲ－Ｔ製造では、１００億個またはそれを上回る細胞のバッチが、必要とされる。本開示されるシステムおよび方法は、１０億個またはそれを上回る細胞をＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ （Ｃｈｉｃａｇｏ， ＩＬ）から入手可能なＸＵＲＩ^TM等のより大きい増殖システムに移送することに先立って、活性化、形質導入、および初期増殖の上流ステップを実施することができる。本能力は、システムを非磁性活性化試薬と大いに適合させる。

図５－６は、Ｆｌａｓｋｗｏｒｋｓ， ＬＬＣ （Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）からのＢＡＴＯＮ^TMとして公知の本開示されるシステムおよびＷｉｌｓｏｎＷｏｌｆ （Ｓｔ． Ｐａｕｌ， ＭＮ）からの別の商業的に入手可能なＴ細胞増殖プラットフォームであるＧ－ＲＥＸ(R)を用いて行われたＴ細胞増殖の間の比較の実施例を示す。図５は、２５ｍＬカートリッジにおいて実行された、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ （Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）からのＤＹＮＡＢＥＡＤＳ(R)を用いて刺激されたＰＢＭＣを伴う９日間にわたるＢＡＴＯＮ^TMを使用した倍増増殖のグラフを示す。ＢＡＴＯＮ^TMを用いて達成された堅牢な倍増増殖は、Ｇ－ＲＥＸ(R)のものに匹敵する。

図６は、両方のシステムを使用した０日目および７日目の細胞の数を示す。ＢＡＴＯＮ^TMでは、約１０億個の細胞が、本開示に従って、２１０ｍＬカートリッジにおいて７日間で４，０００万個のＴ細胞から取得された。表現型は、主として、セントラルメモリである。図７にさらに示されるように、表現型プロファイルは、ＢＡＴＯＮ^TMとＧ－ＲＥＸ(R)との間で匹敵する。図はまた、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ． （Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）から入手可能なＴ７５フラスコを比較する。示されるように、ＢＡＴＯＮ^TMおよびＧ－ＲＥＸ(R)は両方とも、９日目に同等のＣＤ４／ＣＤ８比を発生させた。

図８に示されるように、ＢＡＴＯＮ^TMを用いて生成されたＴ細胞の細胞傷害性は、Ｇ－ＲＥＸ(R)のものに匹敵する。エフェクタ細胞は、９日にわたって増殖され、標的細胞は、ジャーカットＴ細胞であった。細胞は、エフェクタ対標的の１０：１比において混合され、２４時間にわたって５％ＣＯ_０において３７℃においてインキュベートされた。培地は、ＲＰＭＩ １６４０（ＡＴＣＣ）＋１５％ＦＢＳであった。全ての３つの群からの５日目および７日目の細胞は、細胞傷害性において匹敵した。
（閉鎖系上での新生抗原プロセス）

開示されるシステムはまた、新生抗原標的Ｔ細胞を生成するためのワークフローにおいて有用である。本クラスの療法論は、腫瘍特異的ペプチドのライブラリを用いて刺激される抗原提示細胞および自己Ｔ細胞の共培養を伴う。新生抗原提示細胞の製造は、ＣＡＲ－Ｔよりも複雑である。ＣＡＲ／ＴＣＲと異なり、本方法は、１つのみではなく、標的のライブラリを追求することができる。これは、従来技術のシステムから利用可能ではない、本開示されるシステムによって提供されるある能力を要求する。

本システムは、患者の単球から新鮮な樹状細胞を発生させる。本システムはまた、樹状細胞を患者のＰＢＭＣまたはＴ細胞と共培養し、刺激されたＴ細胞を送達するように構成される。本システムは、異なる抗原の間の競合効果を回避するために、新たに発生された樹状細胞との複数のサイクルの共培養を実施することができる。本プロセスを促進するための樹状細胞およびＴ細胞の並列処理が、下記により詳細に説明されるであろう。新生抗原療法のための典型的な投与量は、約２億個のＴ細胞であり、これは、小さい（約２５ｍＬ）カートリッジまたは大きい（約２１０ｍＬ）カートリッジのいずれかにおいて開示されるシステムによって取り扱われることができる。

従来技術の方法と異なり、本発明のシステムは、閉鎖環境において上記の全てを促進する。本方法は、本システムの相互接続された細胞培養チャンバを利用する。精製された単球が、細胞培養チャンバのうちの一方に導入され、精製されたＴ細胞が、他方に導入される。単球は、細胞培養培地を用いて灌流され、樹状細胞を生成し、これは、次いで、腫瘍特異的ペプチドを含む抗原物質と接触される。これは、腫瘍特異的ペプチドを提示する成熟した樹状細胞を生成する。Ｔ細胞は、成熟した樹状細胞を含有するチャンバの中に移送され、それらをＴ細胞と共培養する。共培養は、新生抗原標的Ｔ細胞を生成する。共培養を介した１サイクルの刺激後、Ｔ細胞は、除去され、随意に、新たに発生された成熟した樹状細胞を含有する第２のチャンバの中に流動され、第２の共培養を実施することができる。樹状細胞の第２のバッチは、第１のチャンバ内で発生された樹状細胞から非同期的に生成されることができる。

実施形態では、成熟した樹状細胞が、第１のチャンバ内で発生され、次いで、Ｔ細胞が、第１のチャンバに添加され、共培養される。第１のチャンバからのＴ細胞は、次いで、第２のチャンバに移動され、そこで、それらは、ペプチドの同一または異なるセットのいずれかを用いて刺激される新たに発生された樹状細胞と共培養される。増殖されたＴ細胞は、次いで、第１のチャンバに戻るように移動されることができ、そこで、ペプチドの同一または異なるセットのいずれかを用いて刺激される新鮮な成熟した樹状細胞のまた別のバッチが、待ち受けている。

Ｔ細胞は、所望に応じて、２つの接続されたチャンバの間で任意の回数だけ往復して移送されることができる。これは、いくつかの異なるペプチドを用いてＤＣを刺激するために特に有用であり得る。例えば、それを用いてＤＣが刺激される必要がある２０ほどのペプチドのライブラリを有する場合、一度に全てのペプチドを用いてＤＣを刺激しようと試みることは、ペプチドの間の競合効果のため、不十分な刺激をもたらすであろう。いくつかのペプチドは、その他を上回る効果および／または親和性を有する。段階的に刺激を実施する、例えば、第１の共培養において５つのペプチドを用いてＤＣのバッチを刺激し、次いで、第２の共培養において５つの異なるペプチドを用いてＤＣの次のバッチを刺激し、以下同様である。他の実施形態では、複数の刺激サイクルが、ペプチドの単一の小さい群を用いて行われることができる。非限定的実施形態では、Ｔ細胞は、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１５回、２０回、また２５回移送されることができる。各共培養は、同一または異なるペプチドを用いて刺激されるＤＣを伴うことができる。

方法全体が、本開示の閉鎖系内で実施され、それによって、本方法全体を通して滅菌状態を維持する。他の開示される方法のように、培養チャンバ接続は、管溶接機を用いて接続される滅菌管を用いて達成されることができる。これは、滅菌容器内に提供される細胞培養培地のその滅菌状態を維持する。種々の実施形態では、Ｔ細胞は、同一の器具上のチャンバの間で移送される、または別個の器具上のチャンバの間で移送されることができる。

共培養が完了した後、流体が、チャンバから排出され、新生抗原標的Ｔ細胞は、緩衝液を用いて洗浄され、凍結保存液中で再懸濁される、および／または同様に閉鎖様式で接続される採取バッグ内で採取されることができる。

図９は、本発明の閉鎖系上で新たに培養された樹状細胞およびＰＢＭＣまたはＴ細胞を共培養するための方法の概略フローチャートを示す。滅菌溶接接続を使用して、開示される細胞培養システムは、自動化された播種、培養、および細胞採取を提供する。ワークフローに示されるように、単球が、０日目に播種され、０～６日目にわたって樹状細胞に分化する。６日目において、同種のＰＢＭＣまたはＴ細胞が、添加される。樹状細胞は、ＰＢＭＣからのＴ細胞増殖を可能にする。増殖されたＴ細胞は、１３日目に採取される。

開示される方法を用いて生成される増殖されたＴ細胞は、堅牢な細胞傷害能を示す。ワークフローを使用して実施された実施例の結果が、図１０に示される。ＣＤ８＋Ｔ細胞とジャーカット細胞との標的比率は、１：１であり、実験は、１００～３００万個の採取された細胞を使用して実施された。ジャーカット細胞は、アッセイに先立ってＰＫＨ６７を用いて染色された。細胞は、１日にわたってインキュベートされ、全ての細胞は、アッセイ後にＣＤ３およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖを用いて染色された。結果として生じる死滅したジャーカット細胞が、図１０に示される。
（樹状細胞およびＴ細胞の並列処理）

細胞ベースの免疫療法生成物を形成するためのプロセスは、２つのタイプの細胞を共培養することを要求する。本開示されるシステムでは、これらの細胞は、抗原特異的Ｔ細胞のより効率的な発生のために、並行して発生されることができる。簡潔に言うと、樹状細胞が、単球から生成され、抗原物質との接触によって成熟され、Ｔ細胞が、活性化され、次いで、ＤＣと共培養される。従来技術の方法では、本方法は、いくつかの手動ステップを要求するであろう。しかしながら、本システムは、閉鎖系において並行して２つの細胞バッチを生成することができる。本明細書に開示されるシステムを使用して、樹状細胞が、１つのチャンバ内で生成され、並行して、Ｔ細胞が、別の接続されたチャンバ内で刺激される。単球が、第１のチャンバ内で灌流され、ＤＣを生成し、これは、それらを成熟させるために抗原物質と接触される。別の接続されたチャンバからの活性化されたＴ細胞が、ＤＣに接触し、Ｔ細胞をさらに培養するために、第１のチャンバの中に流動される。他の方法におけるように、チャンバは、本方法が、実質的に閉鎖系において実施されるように、滅菌管を介して接続される。Ｔ細胞は、依然として閉鎖系構成にありながら、それらを収集容器の中に流動させることによって収集される、および／または凍結保存培地に移送されることができる。

細胞ベースの免疫療法生成物を形成するためのプロセスの一般的概観を示す、図１１が、参照される。本発明のある実施形態による、細胞療法生成物を生成する際のステップは、細胞培養チャンバを含有する生物学的反応器内で刺激された抗原提示細胞（例えば、ＤＣ）をＴ細胞含有細胞と共培養するステップを含む。増殖された療法Ｔ細胞生成物を含有する上澄部が、培養の間に発生される。ある側面では、患者において療法反応を誘発するために十分な量の抗原特異的Ｔ細胞を生成するために、Ｔ細胞は、１つまたはそれを上回る付加的細胞培養チャンバ内で付加的培養を受けなければならない。本付加的培養をもたらすために、上澄部が発生された培養チャンバから、抗原提示細胞の新鮮な供給物を含有する後続細胞培養チャンバへの上澄部の移送が、行われなければならない。細胞培養チャンバの間の上澄部の移送は、第１の細胞生成物を含む上澄部を、流体コネクタを通して、新しい細胞培養チャンバの中に移送する、第１の細胞培養チャンバの中へのガス流動の導入を伴ってもよい。さらに、培養ステップのそれぞれの間、例えば、培地およびサイトカインを含有する灌流流体が、チャンバに灌流されることができる。ある側面では、灌流流体は、細胞が培養の間にチャンバ内に留まることを確実にするように、垂直流路に沿ってチャンバを通して流動する。１つまたはそれを上回る後続細胞培養チャンバが、本システムに接続され、各チャンバは、抗原ペプチドパルス化自己抗原提示細胞の新しいバッチを含有することができる。

抗原特異的Ｔ細胞を刺激および増殖させるために、プロセスは、細胞培養チャンバ内でのＴ細胞含有細胞と同一の個人から取得された抗原提示細胞（ＡＰＣ）との共培養から始まる。特定の実施形態では、Ｔ細胞含有細胞は、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）を含み、ＡＰＣは、ＤＣを含む。Ｔ細胞含有細胞およびＡＰＣは、例えば、限定ではないが、約１０００：１、９００：１、８００：１、７００：１、６００：１、５００：１、４００：１、３００：１、２００：１、１００：１、７５：１、５０：１、２５：１、２０：１、１５：１、１０：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１５、１：２０、１：５０、１：７５、１：１００、１：２００、１：３００、１：４００、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１０００、またはその間の任意の比率等、約１０００：１～１：１０００の比率（Ｔ細胞含有細胞：ＡＰＣ）において細胞培養チャンバに提供されることができる。一側面では、１０：１の比率が、好ましい。

ＡＰＣとＴ細胞含有細胞との相互作用からのＴ細胞の刺激および増殖を開始するために、ＡＰＣは、刺激される必要がある。これは、１つまたはそれを上回る刺激分子の使用を通して行われることができる。ある実施形態では、刺激分子は、非腫瘍特異的である。他の実施形態では、刺激分子は、腫瘍特異的である。例えば、刺激分子は、異なる抗原ペプチド等の個人の腫瘍の１つまたはそれを上回る特性から選定されることができる。いくつかの実施形態では、刺激分子は、好ましくは、培養サイクルの開始時にのみ添加される。刺激分子は、約数分、１時間、数時間、またはそれよりも長い周期にわたってのみ添加されることができる。一好ましい実施形態では、刺激分子は、約１時間の時間周期にわたって添加される。

ＡＰＣおよびＴ細胞の共培養は、培養培地中で行われる。例示的培養培地は、限定ではないが、ＲＰＭＩ培地およびＣｅｌｌｇｅｎｉｘ(R)培地を含む。当技術分野で公知の任意の他の好適な培養培地が、本発明の実施形態に従って使用されることができる。ＩＬ－４およびＧＭ－ＣＳＦ等のサイトカインもまた、培養培地に添加されることができる。

通常、１回のみの共培養を行うことは、十分ではない。開示されるシステムは、Ｔ細胞が懸濁液中に引き出されることを可能にする。ここでは、Ｔ細胞は、新鮮な樹状細胞を用いて再刺激されることができ、複数の共培養が、閉鎖系において行われることができる。本発明の並列処理方法では、カートリッジは、連鎖的に接続されることができ、細胞が、１つのカートリッジから別のものに押動されることができる。成熟した接着されたＤＣを含有する１つの反応器が、ＰＢＭＣを装填され、培地およびサイトカインの灌流を用いて刺激サイクルを受けるであろう。並列処理では、増殖されたＴ細胞は、抗原ペプチドを用いてパルス化されることによって、第１の細胞培養チャンバ内で生成されている新鮮なＤＣに連続的に暴露されることができる。刺激プロセスは、療法用量のＴ細胞に関して十分に多数の細胞を発生させるために必要な長さにわたって継続することができる。

滅菌接続を介して複数のチャンバをともに接続することは、図３に関して上記に議論されるような複数のチャンバの構成を伴うことができる。接続は、第１の細胞培養チャンバの中への滅菌空気の注入を可能にし、増殖されたＴ細胞を含有する上澄部を第２の細胞培養チャンバの中に移送する。ある実施形態では、１つまたはそれを上回る生物学的反応器は、生物学的反応器の細胞培養チャンバ内で行われるプロセスに先立って、それと並行して、もしくはそれに続けて、種々の他のプロセスをもたらすためのモジュールを含有するシステムにおいて提供されることができる。

１つのカートリッジが、滅菌溶接およびシールを介して採取バックの中に、または新しいカートリッジの中に移送されることができる。いくつかの実施形態では、樹状細胞が、発生され、次いで、採取および凍結保存され、要求に応じて使用されることができる。一方、本システムは、新鮮な樹状細胞発生のために第２のカートリッジを独立して起動することができる。

ある側面では、算出モデル化アプローチが、Ｔ細胞と抗原提示細胞との相互作用を最適化するために使用される。本発明による算出モデルは、灌流の影響および刺激のために要求される最適な時間を考慮し、粒子相互作用ベースのアプローチならびに運動パラメータベースのアプローチの両方を組み込む。例示的粒子相互作用ベースのアプローチおよび運動パラメータベースのアプローチは、当技術分野で公知であり、そのうちのいくつかは、本明細書に説明される。例えば、粒子相互作用ベースのアプローチに関して、ＤａｙおよびＬｙｔｈｅは、以下の式を使用して、Ｔ細胞がリンパ節の表面上のＡＰＣを見出すために要求される時間を説明しており、式中、Ｄは、Ｔ細胞の拡散率であり、ｂは、半径Ｒの球状リンパ節内の中心に位置するＡＰＣの半径である。Ｄａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ； ２０１１を参照されたい。

運動パラメータベースのアプローチに関して、Ｖａｌｉｔｕｔｔｉは、図９に示されるように、Ｔ細胞と抗原提示細胞との間の相互作用のモデルを開発した。Ｖａｌｉｔｕｔｔｉ ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２０１０を参照されたい。しかしながら、そのような相互作用は、培養チャンバまたは生物反応器の文脈内でモデル化されていない。

粒子相互作用ベースのアプローチならびに運動パラメータベースのアプローチの両方を本発明の算出モデルに組み込むことによって、２つの細胞タイプが細胞培養チャンバ内で相互に接触する確率を最大限にするための灌流流体（例えば、サイトカイン注入培地）の最適な灌流率の自動化決定および監視が、達成されることができる。

例えば、ある実施形態では、細胞培養チャンバと、中央処理ユニットによって実行可能な命令を含有するメモリを備える中央処理ユニットとを含む、細胞培養システムが、提供される。ある側面では、命令は、本システムに、第１の入力として、細胞培養チャンバのサイズを備えるデータを受信させ、第２の入力として、細胞培養チャンバの中に導入されるであろう１つまたはそれを上回る流体中の第１の細胞タイプの第１の濃度および第２の細胞タイプの第２の濃度を備えるデータを受信させ、第１ならびに第２の入力に基づいて、第１の細胞タイプおよび第２の細胞タイプが細胞培養チャンバ内で相互に接触する確率を最大限にする、細胞培養チャンバの中に導入されるであろう灌流流体の灌流率を計算させる。細胞培養システム内で本発明の方法を実装するためのコンピュータシステムに関する付加的詳細が、下記に提供される。

いくつかの側面では、本システムはまた、１つまたはそれを上回る灌流流体リザーバに動作可能に結合され、中央処理ユニットに動作可能に結合される、１つまたはそれを上回るポンプを含み、したがって、中央処理ユニットはまた、１つまたはそれを上回るポンプを制御することによって灌流流体の灌流率を制御する。
（培地の再循環）

細胞培養培地および補足物（サイトカイン等）は、高価であり、使用済み培地は、多くの場合、その中に残留栄養素を有し、これは、廃棄される。これを認識して、開示されるシステムは、部分的に使用された培地の一部を再捕捉し、これを再循環させる方法を提供する。本発明のある方法では、細胞が、開示される細胞培養チャンバのうちの１つの中で培養され、細胞培養培地が、細胞培養チャンバを通して流動される。概して、流体は、入口の中に流動し、出口から外に流動する。細胞培養チャンバを通して、出口から外にすでに流動している細胞培養培地の一部は、細胞培養プロセスの間に細胞培養チャンバの中に戻るように再循環される。

細胞培養チャンバに戻されるべきである使用済み培地の量および／または部分を決定するために、本発明は、再循環に先立って、使用済み培地の栄養素含有量もしくはｐＨ等の１つまたはそれを上回るパラメータを測定する。測定される栄養素は、グルコース、乳酸、溶存酸素、または細胞代謝物であり得る。着目パラメータは、測定され、プロセッサが、パラメータが、これが再循環され得ることを示す所定の閾値を満たすかどうかを決定する。該当する場合、培地は、細胞培養チャンバの中に戻るように送出される。

使用済み培地は、そのままで再循環されることができる、またはこれは、新鮮な培地のボーラスと組み合わせられることができる。一方、使用済み培地が、所定の閾値を満たさない場合、これは、廃棄される。いくつかの実施形態では、弁が、使用済み培地を、廃棄物リザーバに指向するか、または細胞培養チャンバの中に戻るように指向するかのいずれかを行うように動作する。

種々の実施形態では、再循環は、任意の頻度で実施されることができる。例えば、１つまたはそれを上回るセンサは、１秒毎、１分毎、１０分毎、１時間毎等の一定の間隔で使用済み培地をチェックすることができる。他の実施形態では、１つまたはそれを上回るセンサは、これが廃棄物ラインを通して進む際に培地を測定することによって、連続的に動作することができる。いくつかの実施形態では、再循環は、これが再使用され得るかどうか、またはこれが消耗済みであるかどうかを決定するために廃棄物培地を監視する、外部フィルタもしくはセンサからのフィードバックを通して制御される。いくつかの実施形態では、インラインセンサが、廃棄物培地を監視し、これが再循環され得るかどうかを決定するために、本システム内に埋設される。

再循環は、培地が再循環を伴わずにそのまま灌流されていたプロセスに対して、プロセスによって消費されるであろう培地の量を低減させながら、細胞培養チャンバの外部とその中に含有される細胞との間のガス交換を可能にする目標を達成する。

再循環の率は、要求されるガス交換および栄養素供給に基づいて変調されることができる。例えば、Ｔ細胞が少数からはるかに多い数に増殖される細胞培養プロセスでは、培養の初期段階は、１００％の再循環を伴う低流率灌流において実行されることができる。これは、閉鎖灌流ループ内の栄養素が、少数の細胞のために適正であり、流率が、十分なガス交換（酸素吸入、ＣＯ_２排出）を確実にするために十分であるように設定されるためである。次いで、細胞が増殖し始める際、それらの栄養素およびガス交換の必要性が、高まる。成長は、監視され、灌流流率の増加（ガス交換を増加させるため）および再循環の範囲の変更（培地の一部のみを再循環させ、漸進的に増加する割合において新しい培地を添加する）と関連付けられる決定の基礎を形成することができる。原則として、これは、動的かつ自動的に行われ得る。

実施形態では、細胞培養チャンバは、細胞培養チャンバに動作可能に結合される、１つまたはそれを上回るセンサを含む。本システムは、異なるパラメータを監視し、制御システムと統合するために、種々のセンサ構成を用いて構成されることができる。センサは、ｐＨ、溶存酸素、総バイオマス、細胞直径、グルコース濃度、乳酸濃度、および細胞代謝物濃度等の細胞培養チャンバ内の１つまたはそれを上回るパラメータを測定することが可能であり得る。本システムは、灌流流出流体をサンプリングし、データを伝送する、グルコースおよび乳酸のための既製品の単回使用センサを用いてカスタマイズされることができる。いくつかの実施形態では、カートリッジは、光学的に透明であり、光学密度またはラマン等の感知モダリティとインターフェースをとられることができる。いくつかの実施形態では、センサは、廃棄物ラインまたは廃棄物リザーバに動作可能に結合されてもよく、その中に流動する流体の１つまたはそれを上回るパラメータを測定するように構成される。ある側面では、１つまたはそれを上回るセンサは、パラメータの自動的監視および調節が、可能であるように、命令を実行するための中央処理ユニットを有するコンピュータシステムに動作可能に結合される。本システムは、流体が、あるパラメータを満たす場合、入口を介してチャンバの中に戻るように流体を自動的に再指向するように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、器具類は、コンピュータ、ネットワーク、およびプロセス管理のためのグラフィカルユーザインターフェース、ならびにプロセスプラント機械類とインターフェースをとるための他の周辺デバイスを使用して、制御システムアーキテクチャとインターフェースをとる。廃棄物管は、例えば、流体が十分なレベルの栄養素を有するかどうかに応じて、流体を１つの場所または別の場所に指向し得る弁を有してもよい。細胞培養チャンバを使用して本発明の方法を実装するためのコンピュータシステムに関する付加的詳細が、下記に提供される。
（システムアーキテクチャ）

上記に説明されるような本システムを通した流体の移動の制御ならびに種々のパラメータの監視および制御等の本明細書に説明される本開示の側面は、プロセッサ、例えば、中央処理ユニットを含む、コンピュータまたはプログラマブル論理コントローラ（ＰＬＣ）等の任意のタイプのコンピューティングデバイス、もしくは各デバイスが本プロセスまたは方法の少なくとも一部を実施する、コンピューティングデバイスの任意の組み合わせを使用して実施されることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に説明されるシステムおよび方法は、ハンドヘルドデバイス、例えば、スマートタブレット、スマートフォン、または本システムのために生産された特殊デバイスを用いて実施されてもよい。

本開示の方法は、ソフトウェア、ハードウェア、ファームウェア、ハードワイヤリング、またはこれらのうちのいずれかの組み合わせを使用して実施されることができる。機能を実装する特徴はまた、機能の一部が、異なる物理的場所において実装されるように分散されることを含む、種々の位置に物理的に位置することができる（例えば、無線または有線接続を伴う、例えば、１つの部屋における撮像デバイスおよび別の部屋における、もしくは別個の建物におけるホストワークステーション）。

コンピュータプログラムの実行のために好適なプロセッサは、実施例として、汎用および専用マイクロプロセッサの両方、ならびに任意の種類のデジタルコンピュータのいずれか１つまたはそれを上回るプロセッサを含む。概して、プロセッサは、読取専用メモリまたはランダムアクセスメモリもしくは両方から命令およびデータを受信するであろう。コンピュータの要素は、命令を実行するためのプロセッサならびに命令およびデータを記憶するための１つまたはそれを上回るメモリデバイスである。概して、コンピュータはまた、データを記憶するための１つまたはそれを上回る非一過性大容量記憶デバイス、例えば、磁気、光磁気ディスク、もしくは光学ディスクを含む、またはそれからデータを受信する、もしくはそれにデータを転送するように動作的に結合される、または両方であろう。コンピュータプログラム命令およびデータを具現化するために好適な情報キャリアは、実施例として、半導体メモリデバイス（例えば、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）、およびフラッシュメモリデバイス）、磁気ディスク（例えば、内部ハードディスクまたはリムーバブルディスク）、光磁気ディスク、ならびに光学ディスク（例えば、ＣＤおよびＤＶＤディスク）を含む、全ての形態の不揮発性メモリを含む。プロセッサおよびメモリは、専用論理回路によって補完される、またはその中に組み込まれることができる。

ユーザとの相互作用を提供するために、本明細書に説明される主題は、Ｉ／Ｏデバイス、例えば、情報をユーザに表示するためのＣＲＴ、ＬＣＤ、ＬＥＤ、または投影デバイスと、それによってユーザが入力をコンピュータに提供し得る、キーボードおよびポインティングデバイス（例えば、マウスもしくはトラックボール）等の入力または出力デバイスとを有する、コンピュータ上に実装されることができる。他の種類のデバイスも、同様にユーザとの相互作用を提供するために使用されることができる。例えば、ユーザに提供されるフィードバックは、任意の形態の感覚フィードバック（例えば、視覚フィードバック、聴覚フィードバック、または触覚フィードバック）であり得、ユーザからの入力は、音響、発話、もしくは触覚入力を含む、任意の形態において受信されることができる。

本明細書に説明される主題は、バックエンドコンポーネント（例えば、データサーバ）、ミドルウェアコンポーネント（例えば、アプリケーションサーバ）、またはフロントエンドコンポーネント（例えば、グラフィカルユーザインターフェースを有するクライアントコンピュータもしくはそれを通してユーザが本明細書に説明される主題の実装と相互作用し得るウェブブラウザ）、またはそのようなバックエンド、ミドルウェア、およびフロントエンドコンポーネントの任意の組み合わせを含む、コンピューティングシステムにおいて実装されることができる。本システムのコンポーネントは、任意の形態または媒体のデジタルデータ通信によるネットワーク、例えば、通信ネットワークを通して相互接続されることができる。通信ネットワークの実施例は、セルネットワーク（例えば、３Ｇまたは４Ｇ）、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、および広域ネットワーク（ＷＡＮ）、例えば、インターネットを含む。

本明細書に説明される主題は、データ処理装置（例えば、プログラマブルプロセッサ、コンピュータ、または複数のコンピュータ）による実行のための、もしくはその動作を制御するための情報キャリア内（例えば、非一過性コンピュータ可読媒体内）で有形に具現化される１つまたはそれを上回るコンピュータプログラム等の１つまたはそれを上回るコンピュータプログラム製品として実装されることができる。コンピュータプログラム（プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション、アプリ、マクロ、またはコードとしても公知である）は、コンパイル型もしくはインタープリタ型言語（例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｐｅｒｌ）を含む、任意の形態のプログラミング言語において書き込まれることができ、これは、スタンドアロンプログラムとして、またはコンピューティング環境における使用のために好適なモジュール、コンポーネント、サブルーチン、もしくは他のユニットとしてを含む、任意の形態において展開されることができる。本発明のシステムおよび方法は、限定ではないが、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｐｅｒｌ、Ｊａｖａ（登録商標）、ＡｃｔｉｖｅＸ、ＨＴＭＬ５、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、またはＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）を含む、当技術分野で公知の任意の好適なプログラミング言語において書き込まれる命令を含むことができる。

コンピュータプログラムは、必ずしもファイルに対応するわけではない。プログラムは、他のプログラムまたはデータを保持するファイルまたはファイルの一部の中に、当該プログラムの専用である単一のファイル内に、もしくは複数の連携ファイル（例えば、１つまたはそれを上回るモジュール、サブプログラム、もしくはコードの一部を記憶するファイル）内に記憶されることができる。コンピュータプログラムは、１つの地点における１つのコンピュータまたは複数のコンピュータ上で実行される、もしくは複数の地点を横断して分散され、通信ネットワークによって相互接続されるように展開されることができる。

ファイルは、例えば、ハードドライブ、ＳＳＤ、ＣＤ、または他の有形非一過性媒体上に記憶される、デジタルファイルであり得る。ファイルは、ネットワークを経由して１つのデバイスから別のものに（例えば、サーバから、クライアントに、例えば、ネットワークインターフェースカード、モデム、無線カード、または類似物を通して送信されるパケットとして）送信されることができる。

本発明の実施形態に従ってファイルを書き込むステップは、有形非一過性コンピュータ可読媒体を、例えば、粒子（例えば、読取／書込ヘッドによる磁化のパターンへの正味電荷または双極モーメントを伴う）を追加、除去、もしくは再配列することによって変換するステップを伴い、パターンは、次いで、ユーザによって所望され、ユーザに有用な客観的な物理的現象についての情報の新しいコロケーションを表す。いくつかの実施形態では、書込は、有形非一過性コンピュータ可読媒体における物質の物理的変換（例えば、光学読取／書込デバイスが、次いで、情報の新しい有用なコロケーションを読み取り得るように、ある光学性質を伴い、例えば、ＣＤ－ＲＯＭを焼くこと）を伴う。いくつかの実施形態では、ファイルを書き込むステップは、ＮＡＮＤフラッシュメモリデバイス等の物理的フラッシュメモリ装置を変換し、フローティングゲートトランジスタから作製されたメモリセルのアレイにおける物理的要素を変換することによって情報を記憶するステップを含む。ファイルを書き込む方法は、当技術分野で周知であり、例えば、手動で、またはプログラムによって、もしくはソフトウェアからの保存コマンドまたはプログラミング言語からの書込コマンドによって自動的に行使されることができる。

好適なコンピューティングデバイスは、典型的には、大容量メモリ、少なくとも１つのグラフィカルユーザインターフェース、少なくとも１つのディスプレイデバイスを含み、典型的には、デバイスの間の通信を含む。大容量メモリは、あるタイプのコンピュータ可読媒体、すなわち、コンピュータ記憶媒体を例証する。コンピュータ記憶媒体は、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュール、または他のデータ等の情報の記憶のための任意の方法もしくは技術において実装される揮発性、不揮発性、リムーバブル、および非リムーバブル媒体を含んでもよい。コンピュータ記憶媒体の実施例は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリ、または他のメモリ技術、ＣＤ－ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、または他の光学記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置、または他の磁気記憶デバイス、無線周波数識別タグまたはチップ、もしくは所望の情報を記憶するために使用され得、コンピューティングデバイスによってアクセスされ得る任意の他の媒体を含む。

当業者は、本発明の方法の実施のために必要である、または最適であると認識するであろうため、本発明の実施形態において採用されるコンピュータシステムもしくは機械は、バスを介して相互と通信する、１つまたはそれを上回るプロセッサ（例えば、中央処理ユニット（ＣＰＵ）、グラフィックス処理ユニット（ＧＰＵ）、もしくは両方）、主要メモリ、および静的メモリを含んでもよい。

図１２に示される例示的実施形態では、システム６００は、コンピュータ６４９（例えば、ラップトップ、デスクトップ、またはタブレット）を含むことができる。コンピュータ６４９は、ネットワーク６０９を横断して通信するように構成されてもよい。コンピュータ６４９は、１つまたはそれを上回るプロセッサ６５９およびメモリ６６３、ならびに入力／出力機構６５４を含む。本発明の方法が、クライアント／サーバアーキテクチャを採用する場合、本発明の方法の動作は、データ、命令等を取得する、またはインターフェースモジュール６２５を介して結果を提供する、もしくは結果をファイル６１７として提供することが可能である、プロセッサ６２１およびメモリ６２９のうちの１つまたはそれを上回るものを含む、サーバ６１３を使用して実施されてもよい。サーバ６１３は、コンピュータ６４９または端末６６７を通してネットワーク６０９を経由して従事してもよい、もしくはサーバ６１３は、１つまたはそれを上回るプロセッサ６７５およびメモリ６７９、ならびに入力／出力機構６７１を含む、端末６６７に直接接続されてもよい。

本発明の例示的実施形態によるシステム６００または機械はさらに、Ｉ／Ｏ６４９、６３７、または６７１のうちのいずれかのために、ビデオディスプレイユニット（例えば、液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）もしくはブラウン管（ＣＲＴ））を含んでもよい。いくつかの実施形態によるコンピュータシステムまたは機械はまた、英数字入力デバイス（例えば、キーボード）、カーソル制御デバイス（例えば、マウス）、ディスクドライブユニット、信号発生デバイス（例えば、スピーカ）、タッチスクリーン、加速度計、マイクロホン、セルラー無線周波数アンテナ、および、例えば、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）、Ｗｉ－Ｆｉカード、もしくはセルラーモデムであり得る、ネットワークインターフェースデバイスを含むことができる。

本発明の例示的実施形態によるメモリ６６３、６７９、または６２９は、機械可読媒体を含むことができ、その上に、本明細書に説明される方法論もしくは機能のうちのいずれか１つまたはそれを上回るものを具現化する、命令（例えば、ソフトウェア）の１つまたはそれを上回るセットが、記憶される。ソフトウェアはまた、完全に、または少なくとも部分的に、コンピュータシステムによるその実行の間、主要メモリ内ならびに／もしくはプロセッサ内に常駐してもよく、主要メモリおよびプロセッサもまた、機械可読媒体を成す。ソフトウェアはさらに、ネットワークインターフェースデバイスを介してネットワークを経由して伝送または受信されてもよい。
（参照による組み込み）

特許、特許出願、特許公開、雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツ等の他の文書の参照および引用が、本開示全体を通して行われた。全てのそのような文書は、あらゆる目的のために、参照することによってその全体として本明細書に組み込まれる。
（均等物）

本発明は、ある実施形態と併せて説明されたが、当業者は、前述の明細書を熟読した後、本明細書に記載される組成物および方法の種々の変更、その均等物の代用、ならびに他の改変をもたらすことが可能であろう。

Claims (120)

1. 細胞培養システムであって、
   細胞培養培地を備える流体リザーバを受容するように構成される第１のエリアと、
   廃棄物リザーバを受容するように構成される第２のエリアと、
   前記流体リザーバに流体的に接続可能である１つまたはそれを上回るポンプと、
   異なる形状および／またはサイズの細胞培養チャンバを受容および保定するように構成される基板と
   を備える、細胞培養システム。
2. 前記基板は、前記基板が、異なる形状および／またはサイズの細胞培養チャンバを受容および保定するように構成されるように配列される複数の異なる開口部を前記基板内に備える、請求項１に記載の細胞培養システム。
3. 前記基板は、複数の細胞培養チャンバを同時に受容および保定するように構成される、請求項１に記載の細胞培養システム。
4. 前記第１のエリア内に位置付けられる前記流体リザーバと、前記廃棄物エリア内に位置付けられる前記廃棄物リザーバとをさらに備える、請求項１に記載の細胞培養システム。
5. 流体リザーバから前記１つまたはそれを上回るポンプに、前記１つまたはそれを上回るポンプから前記細胞培養チャンバに、および前記細胞培養チャンバから前記廃棄物リザーバに流体的に接続する１つまたはそれを上回る管をさらに備える、請求項４に記載の細胞培養システム。
6. 前記基板の第１の部分は、第１のサイズの第１の細胞培養チャンバを受容するように構成され、前記基板の第２の部分は、前記第１のサイズと異なる第２の形状の第２の細胞培養チャンバを受容するように構成される、請求項１に記載の細胞培養システム。
7. 前記基板の第１の部分は、第１の形状の第１の細胞培養チャンバを受容するように構成され、前記基板の第２の部分は、前記第１の形状と異なる第２の形状の第２の細胞培養チャンバを受容するように構成される、請求項１に記載の細胞培養システム。
8. 前記基板の第１の部分は、第１のサイズおよび形状の第１の細胞培養チャンバを受容するように構成され、前記基板の第２の部分は、前記第１のサイズおよび形状と異なる第２のサイズおよび形状の第２の細胞培養チャンバを受容するように構成される、請求項１に記載の細胞培養システム。
9. 各細胞培養チャンバは、別個のポンプに流体的に結合される、請求項１に記載の細胞培養システム。
10. 前記１つまたはそれを上回るポンプおよび前記細胞培養システム内の流体の特性を測定するように動作可能な１つまたはそれを上回るセンサに動作可能に接続されるプロセッサをさらに備え、前記プロセッサは、前記測定された特性に基づいて、前記１つまたはそれを上回るポンプを動作させる、請求項１に記載の細胞培養システム。
11. 細胞を培養するための方法であって、前記方法は、
    細胞培養システムを提供するステップであって、前記細胞培養システムは、細胞培養培地を備える流体リザーバを受容するように構成される第１のエリアと、廃棄物リザーバを受容するように構成される第２のエリアと、前記流体リザーバに流体的に接続可能である１つまたはそれを上回るポンプと、異なる形状および／またはサイズの細胞培養チャンバを受容および保定するように構成される基板とを備える、ステップと、
    前記流体リザーバを前記第１のエリアの中に装填し、前記廃棄物リザーバを前記第２のエリアの中に装填するステップと、
    第１のサイズおよび／または形状の第１の細胞培養チャンバを前記基板の第１の部分上に装填するステップと、
    第２のサイズおよび／または形状の第２の細胞培養チャンバを前記基板の第２の部分上に装填するステップと、
    前記流体リザーバ、前記１つまたはそれを上回るポンプ、前記第１および第２の細胞培養チャンバ、および前記廃棄物リザーバを管類と接続するステップと、
    前記第１および第２の細胞培養チャンバ内で細胞を培養するように前記システムを動作させるステップと
    を含む、方法。
12. 前記基板は、前記基板が、異なる形状および／またはサイズの細胞培養チャンバを受容および保定するように構成されるように配列される複数の異なる開口部を前記基板内に備える、請求項１１に記載の方法。
13. 前記第１の細胞培養チャンバは、第１のサイズであり、前記第２の細胞培養チャンバは、第２のサイズである、請求項１１に記載の方法。
14. 前記第１の細胞培養チャンバは、第１の形状であり、前記第２の細胞培養チャンバは、第２の形状である、請求項１１に記載の方法。
15. 前記第１の細胞培養チャンバは、第１のサイズおよび形状であり、前記第２の細胞培養チャンバは、第２のサイズおよび形状である、請求項１１に記載の方法。
16. 前記第１および第２の細胞培養チャンバはそれぞれ、別個のポンプに流体的に結合される、請求項１１に記載の方法。
17. 前記細胞培養システムはさらに、前記１つまたはそれを上回るポンプおよび前記細胞培養システム内の流体の特性を測定するように動作可能な１つまたはそれを上回るセンサに動作可能に接続されるプロセッサを備え、前記プロセッサは、前記測定された特性に基づいて、前記１つまたはそれを上回るポンプを動作させる、請求項１１に記載の方法。
18. 細胞培養が前記第１および第２の細胞培養チャンバ内で完了した後、前記第１および第２の細胞培養チャンバのそれぞれの中の前記培養された細胞は、収集される、請求項１１に記載の方法。
19. 前記第１および第２の細胞培養チャンバのそれぞれの中の前記培養された細胞は、同一の収集容器内に収集される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記第１および第２の細胞培養チャンバのそれぞれの中の前記培養された細胞は、異なる収集容器内に収集される、請求項１８に記載の方法。
21. 形質導入Ｔ細胞を生成するための方法であって、前記方法は、
    第１および第２の培養チャンバを備える細胞培養器具を提供するステップと、
    Ｔ細胞を含む懸濁液を前記第１の培養チャンバの中に流動させるステップと、
    前記第１の培養チャンバ内で前記Ｔ細胞を灌流し、前記第１の培養チャンバ内で増殖する形質導入されたＴ細胞を生成するステップと、
    前記第１の培養チャンバから前記第２の培養チャンバの中に前記形質導入および増殖されたＴ細胞を流動させるステップと、
    細胞培養培地を前記第２の培養チャンバの中に流動させ、前記形質導入および増殖されたＴ細胞をさらに増殖させるステップであって、前記方法は、滅菌状態が前記方法全体を通して維持されるように、閉鎖様式で単一の器具上で実施される、ステップと
    を含む、方法。
22. 前記第２の培養チャンバは、前記第１の培養チャンバよりも大きい、請求項２１に記載の方法。
23. 前記第１および第２の培養チャンバは、ポリスチレンから作製される、請求項２１に記載の方法。
24. 前記第１および第２の培養チャンバは、滅菌管を介して接続される、請求項２１に記載の方法。
25. 前記第１の培養チャンバはさらに、活性化試薬および／または細胞形質導入試薬を備える、請求項２１に記載の方法。
26. 前記細胞形質導入試薬は、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する不活性ウイルスを含む、請求項２５に記載の方法。
27. 前記細胞培養培地は、滅菌容器内に提供され、滅菌管溶接によって前記閉鎖系に接続される、請求項２１に記載の方法。
28. 前記細胞培養培地を前記第１の培養チャンバの中に流動させるステップは、前記第１の培養チャンバ内のヘッドスペースを排除するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
29. 前記第１の培養チャンバ内の前記Ｔ細胞を活性化させるステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
30. 活性化させるステップは、抗体を含む試薬と接触するステップを含む、請求項２９に記載の方法。
31. 前記抗体は、ビーズに付着される、請求項３０に記載の方法。
32. 前記第２の培養チャンバから流体を排出するステップと、
    緩衝液を用いて前記形質導入および増殖されたＴ細胞を洗浄するステップと、
    凍結保存培地を前記第２の培養チャンバの中に流動させ、前記形質導入および増殖されたＴ細胞を再懸濁させるステップと
    をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
33. 前記形質導入および増殖されたＴ細胞を閉鎖様式で採取容器の中に流動させるステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
34. 前記流動させるステップはそれぞれ、滅菌管を介して行われる、請求項２１に記載の方法。
35. 前記滅菌管は、滅菌管溶接によって接続される、請求項３４に記載の方法。
36. 前記細胞培養培地は、インターロイキン－２を伴うＡｉｍ Ｖを含む、請求項２１に記載の方法。
37. 新生抗原形質導入Ｔ細胞を生成するための方法であって、前記方法は、
    第１および第２の培養チャンバを備える細胞培養器具を提供するステップと、
    単球を含有する細胞培養培地を前記第１の培養チャンバの中に流動させるステップと、
    前記第１の培養チャンバ内で前記精製された単球を灌流し、前記第１の培養チャンバ内で樹状細胞を生成するステップと、
    前記樹状細胞を前記第１の培養チャンバ内で抗原物質と接触させ、成熟した樹状細胞を生成するステップと、
    Ｔ細胞を含む細胞懸濁液を前記第１の培養チャンバの中に流動させ、前記成熟した樹状細胞および前記Ｔ細胞を共培養し、それによって、増殖された新生抗原標的Ｔ細胞を生成するステップと
    を含み、
    前記方法は、滅菌状態が前記方法全体を通して維持されるように、閉鎖様式で単一の器具上で実施される、方法。
38. 前記第２の培養チャンバ内で成熟した樹状細胞の第２のバッチを発生させるステップと、
    前記増殖されたＴ細胞を前記第１の培養チャンバから前記第２の培養チャンバの中に導入し、前記増殖されたＴ細胞を前記成熟した樹状細胞の第２のバッチとともに共培養するステップと
    をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記成熟した樹状細胞の第２のバッチは、前記第１の培養チャンバからの前記成熟した樹状細胞と異なるペプチドのセットを用いて刺激されている、請求項３８に記載の方法。
40. 前記成熟した樹状細胞の第２のバッチと共培養された前記増殖されたＴ細胞を、前記第１の培養チャンバに戻るように移送するステップをさらに含み、前記第１の培養チャンバは、成熟した樹状細胞の第３のバッチを備える、請求項３８に記載の方法。
41. 前記抗原物質は、腫瘍特異的ペプチドを含む、請求項３７に記載の方法。
42. 前記第１および第２の培養チャンバは、ポリスチレンから作製される、請求項３７に記載の方法。
43. 前記第１および第２の培養チャンバは、滅菌管を介して接続される、請求項３７に記載の方法。
44. 前記細胞培養培地は、滅菌容器内に提供され、滅菌管溶接によって前記閉鎖系に接続される、請求項３７に記載の方法。
45. 前記細胞培養培地を前記第１の培養チャンバの中に流動させるステップは、前記第１の培養チャンバ内のヘッドスペースを排除するステップを含む、請求項３７に記載の方法。
46. 前記第１の培養チャンバから流体を排出するステップと、
    緩衝液を用いて前記新生抗原形質導入Ｔ細胞を洗浄するステップと、
    凍結保存培地を前記第１の培養チャンバの中に流動させ、前記新生抗原形質導入Ｔ細胞を再懸濁させるステップと
    をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
47. 前記新生抗原形質導入Ｔ細胞を閉鎖様式で採取容器の中に流動させるステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
48. 前記流動させるステップはそれぞれ、滅菌管を介して行われる、請求項３７に記載の方法。
49. 前記滅菌管は、滅菌管溶接によって接続される、請求項４８に記載の方法。
50. 並行して樹状細胞を生成し、Ｔ細胞を刺激するための方法であって、前記方法は、
    第１および第２の培養チャンバを備える細胞培養器具を提供するステップと、
    単球を含む細胞培養培地を前記第１の培養チャンバの中に流動させるステップと、
    前記第１の培養チャンバ内で前記単球を灌流し、前記第１の培養チャンバ内で樹状細胞を生成するステップと、
    Ｔ細胞を含む細胞懸濁液を前記第１の培養チャンバの中に流動させ、前記樹状細胞および前記Ｔ細胞を共培養し、それによって、活性化された増殖されたＴ細胞を生成するステップと、
    前記活性化された増殖されたＴ細胞を前記第１の培養チャンバから、単球の第２の別個のバッチから発生された樹状細胞を備える前記第２の培養チャンバの中に流動させ、前記Ｔ細胞をさらに培養するステップと
    を含む、方法。
51. 滅菌状態が、前記方法全体を通して維持される、請求項５０に記載の方法。
52. 前記方法はさらに、前記培養されたＴ細胞を収集容器の中に流動させることによって、前記第１の培養チャンバから前記培養されたＴ細胞を収集するステップを含む、請求項５０に記載の方法。
53. 前記樹状細胞を抗原物質と接触させることによって、前記第１の培養チャンバ内の前記樹状細胞を成熟させるステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
54. 前記抗原物質は、腫瘍特異的ペプチドを含む、請求項５３に記載の方法。
55. 前記第１および第２の培養チャンバは、ポリスチレンから作製される、請求項５０に記載の方法。
56. 前記第１および第２の培養チャンバは、滅菌管を介して接続される、請求項５０に記載の方法。
57. 前記細胞培養培地は、滅菌容器内に提供され、滅菌管溶接によって前記閉鎖系に接続される、請求項５０に記載の方法。
58. 前記細胞培養培地を前記第１の培養チャンバの中に流動させるステップは、前記第１の培養チャンバ内のヘッドスペースを排除するステップを含む、請求項５０に記載の方法。
59. 前記第２の培養チャンバ内で前記Ｔ細胞を活性化させるステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
60. 活性化させるステップは、抗体を含む試薬と接触するステップを含む、請求項５９に記載の方法。
61. 緩衝液を用いて前記刺激されたＴ細胞を洗浄するステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
62. 前記刺激されたＴ細胞を凍結保存培地に移送するステップをさらに含む、請求項６１に記載の方法。
63. 前記新生抗原形質導入Ｔ細胞を閉鎖様式で採取容器の中に流動させるステップをさらに含む、請求項５０に記載の方法。
64. 前記流動させるステップはそれぞれ、滅菌管を介して行われる、請求項５０に記載の方法。
65. 前記滅菌管は、滅菌管溶接によって接続される、請求項６４に記載の方法。
66. 前記細胞培養器具からの前記第１および第２の細胞培養チャンバのうちの一方または両方は、交換され、前記方法は、繰り返される、請求項５０に記載の方法。
67. 上部、底部、および両方の側壁は、ガス不透過性材料から成る、細胞培養チャンバ。
68. 前記ガス不透過性材料はまた、それに細胞が接着する材料である、請求項６７に記載の細胞培養チャンバ。
69. 前記ガス不透過性材料は、ポリスチレンを含む、請求項６８に記載の細胞培養チャンバ。
70. 前記細胞培養チャンバはさらに、入口を備える、請求項６７に記載の細胞培養チャンバ。
71. 前記細胞培養チャンバはさらに、出口を備える、請求項７０に記載の細胞培養チャンバ。
72. 前記入口および前記出口は、前記細胞培養チャンバの上に位置する、請求項７１に記載の細胞培養チャンバ。
73. 前記入口および前記出口は、それぞれ、管類と流体的かつシール可能に結合するように構成される、請求項７２に記載の細胞培養チャンバ。
74. 前記細胞培養チャンバは、一体的に形成される、請求項６７に記載の細胞培養チャンバ。
75. 前記細胞培養チャンバは、培養器内に嵌合するようにサイズ決めおよび構成される、請求項６７に記載の細胞培養チャンバ。
76. 前記細胞培養チャンバは、細胞培養器具の基板に結合するようにサイズ決めおよび構成される、請求項６７に記載の細胞培養チャンバ。
77. 細胞を培養するための方法であって、前記方法は、
    入口と、出口とを備える細胞培養チャンバを提供するステップであって、上部、底部、および両方の側壁は、ガス不透過性材料から成る、ステップと、
    細胞を前記細胞培養チャンバの中に装填するステップと、
    前記培養チャンバ内で前記細胞を培養するために、前記入口を介して前記細胞培養チャンバの中に細胞培養培地を流動させ、前記出口を介して前記細胞培養チャンバから外に流動させるステップであって、前記入口および前記出口を介した前記細胞培養チャンバを通した前記細胞培養培地の流動は、前記細胞培養チャンバを通した細胞培養培地の連続的流動を引き起こし、前記細胞培養チャンバ内の前記細胞と前記細胞培養培地との間でガス交換が起こることを可能にする、ステップと
    を含む、方法。
78. 前記ガス不透過性材料はまた、それに細胞が接着する材料である、請求項７７に記載の方法。
79. 前記ガス不透過性材料は、ポリスチレンを含む、請求項７８に記載の方法。
80. 前記入口および前記出口は、前記細胞培養チャンバの上に位置する、請求項７７に記載の方法。
81. 前記入口および前記出口は、管類と流体的かつシール可能に結合される、請求項８０に記載の方法。
82. 前記細胞培養チャンバは、一体的に形成される、請求項７７に記載の方法。
83. 前記細胞培養チャンバは、培養器内に嵌合するようにサイズ決めおよび構成される、請求項７７に記載の方法。
84. 前記細胞培養チャンバは、細胞培養器具の基板に結合するようにサイズ決めおよび構成される、請求項７７に記載の方法。
85. 前記管類は、高透過性管類である、請求項８１に記載の方法。
86. 前記細胞培養培地は、前記高透過性管類内にある間にガスを交換する、請求項８５に記載の方法。
87. 細胞を培養するための方法であって、前記方法は、
    細胞培養チャンバを通して細胞培養培地を流動させることによって、細胞培養器具上の前記細胞培養チャンバ内で細胞を培養するステップであって、前記細胞培養チャンバを通してすでに流動された前記細胞培養培地の一部は、前記細胞培養プロセスの間に前記細胞培養チャンバの中に戻るように再循環される、ステップ
    を含む、方法。
88. 前記再循環に先立って、前記使用済み培地の１つまたはそれを上回るパラメータを測定するステップをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
89. 前記１つまたはそれを上回るパラメータのうちの少なくとも１つは、前記使用済み培地内の１つまたはそれを上回る化合物の濃度を備える、請求項８８に記載の方法。
90. 前記１つまたはそれを上回る化合物は、グルコース、乳酸、溶存酸素、または細胞代謝物を備える、請求項８９に記載の方法。
91. 前記パラメータは、ｐＨを備える、請求項８８に記載の方法。
92. 前記細胞培養チャンバに動作可能に接続されるプロセッサを使用して、前記再循環させるステップに先立って、前記使用済み培地の１つまたはそれを上回るパラメータのうちの少なくとも１つが所定の閾値を満たすかどうかを決定するステップをさらに含む、請求項８８に記載の方法。
93. 前記測定するステップは、前記細胞培養チャンバと動作可能に関連付けられる１つまたはそれを上回るセンサによって実施される、請求項８８に記載の方法。
94. 前記１つまたはそれを上回るセンサは、前記細胞培養チャンバと流体連通する廃棄物リザーバと動作可能に関連付けられる、請求項９３に記載の方法。
95. 前記再循環させるステップは、前記使用済み培地の一部を前記廃棄物リザーバから前記細胞培養チャンバの中に戻るように再指向するステップを含む、請求項９４に記載の方法。
96. 前記使用済み培地の一部を新鮮な培地のボーラスと組み合わせるステップをさらに含む、請求項８７に記載の方法。
97. 前記細胞培養チャンバは、１つまたはそれを上回るポンプに動作可能に接続される、請求項８７に記載の方法。
98. 前記細胞培養チャンバは、入口と、出口とを備える、請求項８７に記載の方法。
99. 細胞を培養するための方法であって、前記方法は、
    細胞を備える細胞培養チャンバを提供するステップと、
    細胞培養培地を前記細胞培養チャンバの中に流動させるステップと、
    前記細胞培養チャンバから使用済み細胞培養培地を除去するステップと、
    前記使用済み細胞培養培地のパラメータを査定するステップと、
    前記パラメータが、所定の閾値を満たす場合、前記使用済み細胞培養培地を前記細胞培養チャンバに戻すステップと
    を含む、方法。
100. 前記戻すステップに先立って、前記使用済み細胞培養培地を新鮮な細胞培養培地のボーラスと組み合わせるステップをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
101. 前記査定するステップは、前記細胞培養チャンバに動作可能に結合されるセンサを使用して、前記パラメータを測定するステップを含む、請求項９９に記載の方法。
102. 前記査定するステップは、プロセッサを使用して、前記パラメータが前記所定の閾値を満たすかどうかを決定するステップを含む、請求項９９に記載の方法。
103. 前記パラメータは、前記使用済み細胞培養培地内の１つまたはそれを上回る化合物の測定された濃度を備える、請求項１０２に記載の方法。
104. 前記１つまたはそれを上回る化合物は、グルコース、乳酸、または細胞代謝物を備える、請求項１０３に記載の方法。
105. 前記戻すステップは、前記使用済み細胞培養培地を廃棄物リザーバから前記細胞培養チャンバの中に再指向するステップを含む、請求項９９に記載の方法。
106. 前記パラメータが、前記所定の閾値を満たさない場合、前記使用済み細胞培養培地を廃棄するステップと、
     新鮮な細胞培養培地を前記細胞培養チャンバの中に流動させるステップと、
     をさらに含む、請求項９９に記載の方法。
107. 細胞培養システムであって、前記システムは、
     第２の棚の上に第１の棚を伴ってスタックされる複数の棚であって、前記第１および第２の棚はそれぞれ、流体リザーバを受容するように構成される、複数の棚と、
     少なくとも１つのポンプと、
     前記少なくとも１つのポンプに動作可能に結合されるプロセッサと、
     複数の細胞培養チャンバを同時に保持するようにサイズ決めおよび構成される基板と
     を備える、システム。
108. 前記システムは、少なくとも１つのセンサを備える、請求項１０７に記載のシステム。
109. 前記プロセッサは、少なくとも１つのセンサに接続可能であり、前記センサによって測定された特性に基づいて、前記少なくとも１つのポンプを動作させるように構成される、請求項１０８に記載のシステム。
110. 前記基板は、異なるサイズおよび／または形状の細胞培養チャンバを受容するように構成される、請求項１０７に記載のシステム。
111. 前記少なくとも１つのポンプは、複数のポンプである、請求項１０７に記載のシステム。
112. 前記第１の棚上の第１の流体リザーバから前記複数のポンプに、前記複数のポンプから複数の細胞培養チャンバに、および前記複数の細胞培養チャンバから前記第２の棚上の第２の流体リザーバに流体的に接続する複数の管をさらに備える、請求項１１１に記載のシステム。
113. 前記第１および第２の棚はそれぞれ、前記第１および第２の棚のそれぞれの上に前記流体リザーバを保定する保定機構を備える、請求項１０７に記載のシステム。
114. 前記システムは、培養器の中への挿入のために寸法決定される、請求項１０７に記載のシステム。
115. 前記プロセッサは、細胞タイプを培養するための命令を受信および実行するように構成される、請求項１０７に記載のシステム。
116. 前記プロセッサは、Ｔ細胞を形質導入するための命令を受信および実行するように構成される、請求項１０７に記載のシステム。
117. 細胞培養方法であって、前記方法は、
     細胞培養システムを提供するステップであって、前記細胞培養システムは、第２の棚の上に第１の棚を伴ってスタックされる複数の棚であって、前記第１および第２の棚はそれぞれ、流体リザーバを受容するように構成される、複数の棚と、少なくとも１つのポンプと、前記少なくとも１つのポンプに動作可能に結合されるプロセッサと、複数の細胞培養チャンバを同時に保持するようにサイズ決めおよび構成される基板とを備える、ステップと、
     前記第１の棚上に第１の流体リザーバを装填するステップと、
     前記第２の棚上に第２の流体リザーバを装填するステップと、
     前記基板上に第１の細胞培養チャンバおよび第２の細胞培養チャンバを装填するステップと、
     前記第１および第２の流体リザーバ、前記少なくとも１つのポンプ、および前記第１および第２の細胞培養チャンバを管類と接続するステップと、
     前記第１および第２の細胞培養チャンバの内側の細胞を培養するように前記システムを動作させるステップと
     を含む、方法。
118. 前記第１および第２の細胞培養チャンバは、異なるサイズまたは形状を備える、請求項１１７に記載の方法。
119. 前記システムは、少なくとも１つのセンサを備える、請求項１１７に記載の方法。
120. 前記プロセッサは、少なくとも１つのセンサに接続され、前記センサによって測定された特性に基づいて、前記ポンプを動作させるように構成される、請求項１１９に記載の方法。

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