TW202124703A - 用於細胞培養之系統及方法 - Google Patents

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沙希 Ｋ 默西
安德魯 寇茲比爾
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美商富雷斯渥克斯有限責任公司
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Abstract

本發明係關於細胞培養系統及方法，其提供改良之免疫治療產品製造，且可擴展性、靈活性及自動化性更大。細胞培養系統係經組態成具有可互換之藥筒，從而允許多功能性及可擴展性。系統係經組態成具有多個經連接之細胞培養腔室，其允許並行處理不同類型之細胞。不透氣細胞培養腔室及用於在封閉系統中產生細胞之方法防止污染及使用者錯誤。用於再循環細胞培養介質之方法提供額外效率。

Description

用於細胞培養之系統及方法
本揭示內容大體上係關於用於細胞培養之系統及方法。
癌症係全球死亡率及發病率之主要原因，且儘管經過多年不懈研究努力，但治療仍然難以捉摸。腫瘤類型之多樣性在癌症療法中呈現挑戰，因為針對一種腫瘤定製之治療可能對另一種腫瘤無效。已尋求個人化治療，但在其開發中存在許多挑戰。
一個有前景的領域係T細胞療法，其中改變患者的T細胞以靶向某些癌症。此包括嵌合抗原受體T細胞(CAR-T)療法、T細胞受體(TCR)療法及基於新抗原之T細胞療法。基於新抗原之療法可自腫瘤定序資料鑑定抗原以設計高度個人化患者特異性免疫療法。
不幸地，在T細胞療法之開發及製造中存在許多挑戰。用於癌症抗原特異性T細胞之分離、製備及擴增之現有製程受到限制。藉由自體抗原呈現樹突狀細胞(DC)刺激人類T細胞之習知方案涉及幾個人工步驟，包括在培養容器之間轉移細胞，更換培養基，及補給細胞介素及細胞介質。彼等製程係勞動密集型且不容易擴展。實行該方案所需的人工步驟數量過高。另外，彼等方案涉及使用燒瓶或其他容器，其在使用期間開開關關，從而增加污染風險，此會損及細胞產品之品質及安全性。此類方法不符合現行藥品優良製造規範(current good manufacturing practices) (cGMP)且不適用於大規模生產T細胞療法。亦存在其他挑戰，諸如細胞製備時間、維持最佳表型、擴增至足夠的細胞數、及細胞產物之品質及安全性。
本發明認識到，由於相關的複雜生物製程以及與自體細胞處理相關之生物製程及調節要求，因此自動化T細胞療法處理及製造係不成功的。確實存在的少數系統過度地複雜且成本高昂，及因此不適用於臨床前分析。本發明之發明性細胞培養系統及相關方法為細胞培養中之許多問題提供解決辦法且提供減少污染及使用者錯誤之眾多特徵，以及增加效率、可擴展性及易用性。本發明之系統及方法提供用於穩健T細胞生產之能力，同時使成本最小化且增加簡潔性及易用性，使得所揭示的系統及方法可用於臨床前研究及常規細胞培養，同時能夠滿足臨床生產之現行藥品優良製造規範之要求。
在某些態樣中，所揭示的系統及方法提供用於產生抗原特異性T細胞之改良之自動化技術。人工製程之自動化顯著減少使用者錯誤之機會且降低污染之風險。例如，本揭示內容提供用於在封閉系統中產生CAR-T及TCR轉導之T細胞以及靶向新抗原之T細胞之系統及方法。此避免如先前技術中常見的打開及關閉T型燒瓶之需求，由此簡化製程且避免污染來源。作為另一個實例，揭示細胞培養系統，其經組態有可容易互換之細胞培養腔室，從而允許使用者按比例增加或按比例縮小細胞群體。各種腔室及容器可經由無菌管焊接連接，以致系統可在整個使用過程中保持封閉。本揭示內容亦提供用於細胞培養之不透氣藥筒，其提供固體聚苯乙烯表面以實現最佳細胞黏附及剛性藥筒構造，該藥筒構造易於製造且在利用焊接管連接進行操作時不易受到污染。所揭示的系統亦允許在用於產生經刺激之T細胞之製程中並行處理樹突狀細胞及T細胞。該系統架構簡化T細胞培養製程，節省時間及材料。該系統節省材料之另一種方式係藉由再循環細胞培養介質，以確保可用最少量之昂貴培養介質及補充劑來培養細胞。
除了以上所述的特徵之外，熟習此項技術者當明瞭其他特徵，因為所揭示的系統及方法對於免疫治療性產品製造中之製程最佳化提供許多機會。
本揭示內容之態樣提供具有可互換藥筒之細胞培養系統。細胞培養系統包括經組態成接收含有細胞培養介質之流體儲槽之第一區域及經組態成接收廢液儲槽之第二區域。細胞培養系統亦具有可流體地連接至流體儲槽之一或多個泵及經配置為接收及保持不同形狀及/或尺寸之細胞培養腔室之基板。
在實施例中，基板具有複數個不同開口，該等開口經配置成使得基板經組態成接收及保持不同形狀及/或尺寸之細胞培養腔室。基板可經配置為同時接收及保持多個細胞培養腔室。基板之第一部分可經組態成接收第一尺寸之第一細胞培養腔室而基板之第二部分經組態成接收不同於第一尺寸之第二尺寸之第二細胞培養腔室。在實施例中，基板之第一部分經組態成接收第一形狀之第一細胞培養腔室及基板之第二部分經組態成接收不同於第一形狀之第二形狀之第二細胞培養腔室。在實施例中，基板之第一部分經組態成接收第一尺寸及形狀之第一細胞培養腔室及基板之第二部分經組態成接收不同於第一尺寸及形狀之第二尺寸及形狀之第二細胞培養腔室。
在實施例中，流體儲槽位於第一區域中及廢液儲槽位於廢液區域中。可包括一或多個管，其將流體儲槽流體地連接至一或多個泵，及/或將一或多個泵流體地連接至細胞培養腔室，及/或將細胞培養腔室流體地連接至廢液儲槽。各細胞培養腔室可流體地耦接至個別泵。在一些實施例中，處理器可操作地連接至一或多個泵且一或多個感測器可操作以測量細胞培養系統中之流體之特性，其中該處理器基於所測量的特性來操作一或多個泵。
在一個相關態樣中，本揭示內容提供一種用於培養細胞之方法。該方法包括提供一細胞培養系統，其具有經組態成接收含有細胞培養介質之流體儲槽之第一區域及經組態成接收廢液儲槽之第二區域、可流體地連接至流體儲槽之一或多個泵、及經組態成接收及保持不同形狀及/或尺寸之細胞培養腔室之基板。該方法進一步涉及將流體儲槽裝載於第一區域中且將廢液儲槽裝載於第二區域中，將第一尺寸及/或形狀之第一細胞培養腔室裝載於基板之第一部分上，及將第二尺寸及/或形狀之第二細胞培養腔室裝載於基板之第二部分上。該方法進一步涉及用管件連接流體儲槽、一或多個泵、第一及第二細胞培養腔室及廢液儲槽。該方法進一步涉及操作系統以在第一及第二細胞培養腔室中培養細胞。
在實施例中，基板具有複數個不同開口，該等開口經配置成使得基板經組態成接收及保持不同形狀及/或尺寸之細胞培養腔室。第一細胞培養腔室可係第一尺寸及第二細胞培養腔室可係第二尺寸。第一細胞培養腔室可係第一形狀及第二細胞培養腔室可係第二形狀。第一細胞培養腔室可係第一尺寸及形狀，及第二細胞培養腔室可係第二尺寸及形狀。
在實施例中，第一細胞培養腔室及第二細胞培養腔室中之各者係流體耦接至個別泵。該系統亦可包括可操作地連接至一或多個泵之處理器及一或多個可操作以測量細胞培養系統中之流體之特性之感測器，其中該處理器基於所測量的特性來操作一或多個泵。
在實施例中，在第一細胞培養腔室及第二細胞培養腔室中完成細胞培養後，收集第一細胞培養腔室及第二細胞培養腔室各者中之經培養之細胞。第一細胞培養腔室及第二細胞培養腔室各者中之經培養之細胞可收集在相同收集容器中或不同收集容器中。
在另一個態樣中，本揭示內容提供一種用於在封閉系統中產生具有CAR或TCR之經轉導之T細胞之方法。該方法涉及提供具有第一培養腔室及第二培養腔室之細胞培養儀器及使含有細胞之懸浮液流動進入第一培養腔室中。該方法進一步涉及利用適宜轉導及擴增試劑灌注第一培養腔室中之T細胞以產生在第一培養腔室中擴增之經轉導之T細胞。該方法進一步涉及使經轉導且經擴增之T細胞自第一培養腔室流動進入第二培養腔室中。該方法進一步涉及使細胞培養介質流動進入第二培養腔室中以進一步擴增經轉導且經擴增之T細胞，其中該方法係以封閉方式在單個儀器上進行使得在整個方法中保持無菌。
在一些實施例中，第二培養腔室大於第一培養腔室。一個或兩個培養腔室可由聚苯乙烯製成。培養腔室可經由無菌管連接。第一培養腔室可具有活化試劑及/或細胞轉導試劑，其可為表現CAR或TCR之非活性病毒。或者，第二培養腔室可為不係第一細胞培養儀器之一部分之個別細胞培養儀器。
在實施例中，將細胞培養介質提供在無菌容器中且藉由無菌管焊接連接至封閉系統。使細胞培養介質流動進入第一培養腔室中可涉及消除第一培養腔室中之頂隙。細胞培養介質可包括具有介白素-2之Aim V。
該方法可進一步涉及活化第一培養腔室中之T細胞，此可藉由與包含一或多種活化抗體或含可溶性活化抗體之試劑及轉導試劑之磁珠或非磁珠接觸來完成。該方法可進一步涉及自第二培養腔室排出流體，用緩衝液洗滌經轉導且經擴增之T細胞，及使冷凍保存介質流動進入第二培養腔室中以再懸浮經轉導且經擴增之T細胞。該方法可進一步涉及使經轉導且經擴增之T細胞以封閉方式流動進入收穫容器中。
在實施例中，流動步驟中之各者可經由無菌管來完成。無菌管可藉由無菌管焊接連接。
在另一態樣中，本揭示內容提供一種用於在封閉系統中產生靶向新抗原之T細胞之方法。該方法包括提供具有第一培養腔室及第二培養腔室之細胞培養儀器及使含有單核細胞之細胞培養介質流動進入第一培養腔室中。該方法亦涉及灌注第一培養腔室中之經純化之單核細胞以在第一培養腔室中產生樹突狀細胞及使樹突狀細胞在第一培養腔室中與可包括腫瘤特異性肽之抗原材料接觸以產生成熟樹突狀細胞。該方法進一步涉及使成熟樹突狀細胞自第一培養腔室流動進入包含經純化之T細胞之第二培養腔室中以共培養成熟樹突狀細胞及經純化之T細胞，以由此產生靶向新抗原之T細胞。該方法以封閉方式在單個儀器上進行使得在整個方法中維持無菌。
在實施例中，該方法亦涉及使第二批單核細胞流動進入第二培養腔室，使其分化為樹突狀細胞並使樹突狀細胞成熟，以便隨後與經純化之T細胞進行第二次共培養。該等第一及第二培養腔室可由聚苯乙烯製成。該等第一及第二培養腔室可經由無菌管連接。細胞培養介質可提供於無菌容器中且可藉由無菌管焊接連接至封閉系統。使細胞培養介質流動進入第一培養腔室中之步驟可涉及消除第一培養腔室中之頂隙。流動步驟中之各者均可經由無菌管完成，該等無菌管可藉由無菌管焊接連接。
在實施例中，該方法亦包括活化第二培養腔室中之T細胞。在實施例中，該方法亦包括自第二培養腔室排出流體，用緩衝液洗滌靶向新抗原之T細胞，及使冷凍保存介質流動進入第二培養腔室中以再懸浮靶向新抗原之T細胞。該方法亦可涉及以封閉方式使靶向新抗原之T細胞流動進入收穫容器中。
在另一個態樣中，本揭示內容提供一種用於並行加工來以並行方式產生樹突狀細胞及刺激T細胞之方法。該方法包括提供具有第一培養腔室及第二培養腔室之細胞培養儀器及使含有單核細胞之細胞培養介質流動進入第一培養腔室中。該方法進一步包括灌注第一培養腔室中之單核細胞以在第一培養腔室中產生樹突狀細胞。該方法進一步包括使已在第二培養腔室中培養之T細胞與樹突狀細胞一起自第二培養腔室流動進入第一培養腔室中以在第一培養腔室中進一步培養T細胞。在實施例中，在整個方法中維持無菌。
該方法亦可包括藉由使經培養之T細胞流動進入收集容器中而自第一培養腔室收集經培養之T細胞。該方法亦可包括藉由使樹突狀細胞與抗原材料接觸而使第一培養腔室中之樹突狀細胞成熟，該抗原材料可包括腫瘤特異性肽。在實施例中，該方法亦涉及活化第二培養腔室中之T細胞，此可藉由使用活化試劑來完成。在實施例中，該方法亦涉及用緩衝液洗滌經刺激之T細胞，且視需要將經刺激之T細胞轉移至冷凍保存介質。該方法亦可涉及以封閉方式使靶向新抗原之T細胞流動進入收穫容器中。流動步驟中之各者均可經由無菌管完成，該等無菌管係視需要藉由無菌管焊接連接。
細胞培養介質可提供於無菌容器中且可藉由無菌管焊接連接至封閉系統。使細胞培養介質流入第一培養腔室中可涉及消除第一培養腔室中之頂隙。在實施例中，該等第一及第二培養腔室係由聚苯乙烯製成，且視需要可經由無菌管連接。在一些實施例中，可更換來自細胞培養儀器之第一及第二細胞培養腔室中之一者或兩者且可重複該方法。
在另一個態樣中，本揭示內容提供一種不透氣細胞培養腔室，其中頂部、底部及兩個側壁包含不透氣材料。不透氣材料也可以是細胞粘附的材料。不透氣材料可為聚苯乙烯。
在實施例中，細胞培養腔室具有入口。細胞培養腔室亦可具有出口。入口及出口可位於細胞培養腔室之頂部上，且視需要，入口及出口各經組態成可與管件流體地且密封地耦合。細胞培養腔室可一體地形成，且其可經定尺寸及經組態以裝於培養箱中。細胞培養腔室可經定尺寸及經組態以耦合至細胞培養儀器之基板。
在一個相關態樣中，本揭示內容提供一種用於培養細胞之方法，該方法涉及提供具有入口及出口之細胞培養腔室，其中頂部、底部及兩個側壁係由不透氣材料製成。該方法亦涉及將細胞裝載於細胞培養腔室中且使細胞培養介質經由入口流動進入細胞培養腔室中以在培養腔室中培養細胞並經由出口流出細胞培養腔室，其中該細胞培養介質經由入口及出口流動穿過細胞培養腔室導致細胞培養介質連續流動穿過細胞培養腔室且允許在細胞培養腔室中之細胞與細胞培養介質之間發生氣體交換。
在實施例中，不透氣材料亦為細胞黏附之材料，諸如聚苯乙烯。在實施例中，入口及出口位於細胞培養腔室之頂部上且係視需要經組態成與管件流體地且可密封地耦合。管件可為高滲透性管件，其允許細胞培養介質在存於高滲透性管件中時交換氣體。在實施例中，細胞培養腔室係一體形成。細胞培養腔室可經定尺寸及經組態以裝於培養箱內且視需要其可經定尺寸及經組態以耦合至細胞培養儀器之基板。
在另一個態樣中，本揭示內容提供一種用於培養細胞之方法，該方法涉及藉由使細胞培養介質流動穿過細胞培養腔室來在細胞培養儀器上之細胞培養腔室中培養細胞，其中已經流動穿過細胞培養腔室的細胞培養介質之一部分在細胞培養製程期間經再循環回至細胞培養腔室中。
在實施例中，該方法亦涉及在再循環之前測量所使用的介質之一或多個參數。該等參數可為所使用的介質中之一或多種化合物(諸如葡萄糖、乳酸鹽、溶解氧或細胞代謝產物)之濃度。該參數亦可為pH或細胞數。
在實施例中，該方法涉及使用可操作地連接至細胞培養腔室之處理器確定在再循環步驟之前所使用的介質之一或多個參數中之至少一者是否滿足預定閾值。測量步驟可藉由與細胞培養腔室可操作地相關聯之一或多個感測器進行。該一或多個感測器可與和細胞培養腔室流體連通的廢液儲槽可操作地相關聯。細胞培養腔室可係可操作地連接至一或多個泵，且可具有入口及出口。再循環步驟可涉及將所使用的介質之一部分自廢液儲槽再導引回至細胞培養腔室中。在實施例中，將所使用的介質之一部分與一推注量的新製介質組合。
在一個相關態樣中，本揭示內容提供一種用於培養細胞之方法，該方法涉及提供含有細胞之細胞培養腔室，使細胞培養介質流動進入細胞培養腔室中，自細胞培養腔室移除所使用的細胞培養介質，評估所使用的細胞培養介質之參數，及若參數滿足預定閾值則將所使用的細胞培養介質返送於細胞培養腔室。
在實施例中，該方法亦涉及在返送步驟之前將所使用的細胞培養介質與推注量的新製細胞培養介質組合。評估步驟可涉及使用可操作地耦合至細胞培養腔室之感測器來測量參數。評估步驟可涉及使用處理器確定參數是否滿足預定閾值。參數可為所使用的細胞培養介質中之一或多種化合物(諸如葡萄糖、乳酸鹽或細胞代謝產物)之測量濃度。在實施例中，返送步驟包括將所使用的細胞培養介質自廢液儲槽再導引進入細胞培養腔室中。在其他實施例中，該方法亦涉及若參數不滿足預定閾值則丟棄所使用的細胞培養介質，且使新製細胞培養介質流動進入細胞培養腔室中。
在另一個態樣中，本揭示內容提供一種細胞培養系統，其包括用於接收流體儲槽之複數個擱板。該等擱板可以第一擱板在第二擱板之頂部上堆疊，該第一及第二擱板中之各者經組態以接收流體儲槽。該等擱板中之各者可包括將流體儲槽保持於第一及第二擱板中之各者上之保持機構。
該系統可進一步包括至少一個泵、可操作地耦合至該至少一個泵之處理器；及經定尺寸及經組態成同時容納複數個細胞培養腔室之基板。較佳地，該系統進一步包括至少一個感測器，及該處理器可經連接至至少一個感測器且可經組態成基於由感測器測量的特性來操作至少一個泵。例如，感測器可測量細胞培養介質中之一或多種化合物(諸如葡萄糖、乳酸鹽或細胞代謝產物)之濃度。處理器可基於由一或多個感測器進行的測量來調節泵(例如打開或關閉泵)。例如，一個感測器可附接至細胞培養腔室。該感測器可測量例如細胞培養腔室內的介質內的葡萄糖濃度。當葡萄糖濃度下降低於預定閾值時，處理器可觸發泵以替換細胞培養腔室中之介質。
在一些實施例中，處理器經組態成接收且執行用於培養細胞類型之指令。在其他情況下，處理器可經組態成接收且執行用於轉導T細胞之指令。
在一些實施例中，基板係經組態成接收不同尺寸及/或形狀之細胞培養腔室。該組態係有利的，因為其允許根據使用者的特定需求客製化系統以培養不同數量之細胞或不同細胞類型。該系統可進一步包括複數個泵。例如，該系統可包括用於包括在系統內之各細胞培養腔室從而允許各細胞培養腔室內的細胞被分別培養之個別泵。
在一些實施例中，該系統進一步包括複數個管，其自第一擱板上的第一流體儲槽流體地連接至複數個泵，自複數個泵流體地連接至複數個細胞培養腔室，及自複數個細胞培養腔室流體地連接至第二擱板上的第二流體儲槽。較佳地，該系統係經尺寸調整以插入培養箱中。
在一個相關態樣中，本揭示內容提供一種用於細胞之無菌培養之方法。該方法包括提供細胞培養系統，其包含以第一擱板在第二擱板之頂部上堆疊之複數個擱板，該等第一及第二擱板中之各者經組態成接收流體儲槽；至少一個泵；可操作地連接至該至少一個泵之處理器；及經定尺寸及經組態成同時容納複數個細胞培養腔室之基板。該方法進一步包括將第一流體儲槽裝載於第一擱板上，將第二流體儲槽裝載於第二擱板上，將第一細胞培養腔室及第二細胞培養腔室裝載於基板上，利用管件連接第一及第二流體儲槽、至少一個泵及第一及第二細胞培養腔室；及操作該系統以在第一及第二細胞培養腔室內部培養細胞。
在一些實施例中，該等第一及第二細胞培養腔室包括不同尺寸或形狀。在一些實施例中，該系統包括至少一個感測器。在一些實施例中，該處理器係連接至至少一個感測器且係經組態成基於藉由感測器測量的特性來操作泵。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2019年10月21日申請之美國臨時申請案第62/923,963號、及2019年10月21日申請之美國臨時申請案第62/923,967號、及2019年10月21日申請之美國臨時申請案第62/923,973號、及2019年10月21日申請之美國臨時申請案第62/923,975號、及2019年10月21日申請之美國臨時申請案第62/923,978號、及2019年10月21日申請之美國臨時申請案第62/923,982號之優先權及權利，該等案之全部內容係以引用之方式併入本文中。
本發明之細胞培養系統顯著改良免疫治療產品之製造，為基於流之免疫治療生產技術提供無與倫比程度之一致性、品質、安全性、經濟性、可擴展性、靈活性及可攜性。一般而言，細胞生長於一次性使用式細胞培養腔室(有時稱為藥筒)中，該等細胞培養腔室以低流速灌注，無需過濾器即可達成高擴增。該系統支撐一或多個細胞培養腔室以彼此流體耦合來實施患者細胞材料之處理以產生如本文所述的免疫治療產品。應明瞭，在某些實施例中，生物反應器係提供於封閉環境中。藉由添加模組(例如生物反應器)以允許串列及/或並行處理，該實例實施例之按比例擴增將係在熟練技術者之知識範圍內。熟練技術者亦將明瞭，基於意欲生產的產品，可能需要不同或替代配置。
圖1顯示多生物反應器系統900之一個實例。系統900包括第一細胞培養腔室820及第二細胞培養腔室920，其具有連接至與流體儲槽980流體連通之管件940之入口845及945。細胞培養腔室具有與廢液儲槽984流體連通之出口835及935。泵910a及910b有助於將流體自流體儲槽980泵送至細胞培養腔室820及920。該等泵藉由處理器999控制以便進行本文所述的功能。
生物反應器110之另一個實施例顯示於圖2中，其提供細胞培養腔室120之零件之更詳細的示意圖。重要的是應注意，本文所述的細胞培養平臺經組態成允許使用不同體積、形狀及物理特性之細胞培養腔室。顯示於圖2中之腔室僅係示例性，及熟練技術者當明瞭其他實施例。如圖2中所顯示，細胞培養腔室120包括底表面122及至少一個另外表面124。底表面122包含細胞黏附的第一材料。在一些實施例中，該至少一個另外表面124包含透氣之第二材料。在將在以下更詳細描述的其他實施例中，整個細胞培養腔室120(包括表面124)係由不透氣之第一材料製成。細胞培養腔室亦包含一或多個入口126、136及一或多個出口128、138。在某些實施例中，生物反應器亦包括至少一個灌注流體儲槽132、至少一個廢液流體儲槽134、用於使灌注流體移動穿過腔室120之至少一個泵140、以及用於將流體輸送至儲槽132、134及自儲槽132、134輸送且穿過腔室120之相關聯之入口136及出口138。
關於細胞培養腔室120，第一材料可為生物相容性且抗原呈現細胞(APC)或其前驅物(諸如樹突狀細胞(DC)或單核細胞)各自將黏附之任何材料。在發生於細胞培養腔室120中之T細胞刺激及擴增製程期間，成熟APC將發育且較佳黏附於底表面122上，而T細胞保留在底表面上方的上清液中，使得其更容易個別地獲得經擴增之T細胞。
在一個實例實施例中，第一材料包含聚苯乙烯。將聚苯乙烯用於將進行培養的底表面之一個益處係該材料在自PBMC產生樹突狀細胞之製程中所扮演的有用角色。具體而言，聚苯乙烯表面可用於自PBMC之異質懸浮液富集單核細胞。此係培養製程中用於藉由經由在含有例如IL4及GM-CSF之介質中培養來分化單核細胞產生DC之第一步驟。從生物製程觀點來看，在一個T細胞刺激週期中全程使用相同聚苯乙烯表面來產生樹突狀細胞具有極大價值，因為其消除原本必需的大量轉移步驟，由此達成封閉系統之DC刺激之治療性T細胞製造。
底表面可具有與習知孔板(諸如6孔板及24孔板)相當之表面積(分別為9.5 cm2 及3.8 cm2 )。亦應明瞭，表面積可比習知孔板小或甚至大得多(例如具有與標準細胞培養皿及燒瓶相當之表面積)，諸如具有在約2.0 cm2 與約200 cm2 之間之表面積，例如約2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、100.0、125.0、150.0、175.0及200.0 cm2 ，及在其間之任何表面積。
該至少一個另外表面124可包含任何組態，諸如一或多個側壁及頂壁。在一個實施例中，如圖2中所顯示，側壁可相對於彼此成90度角配置，使得與底表面122結合形成盒形狀。在另一個實施例中，該至少一個另外表面124形成彎曲側壁，使得腔室120或其橫截面形成圓柱體、橢圓柱體、圓錐、圓頂樣形狀或三角形。應明瞭，以上實例組態係非限制性及該至少一個另外表面可具有未提供於上述實例組態中之其他組態。
多生物反應器系統之一個實例組態可見於圖3，其具有關於使用以下提供的該組態實施的製程之另外詳細內容。如圖3小圖B中所顯示，在涉及第二生物反應器210之情況下，第二細胞培養腔室220經定位成經由第一腔室之出口及第二腔室之入口與第一細胞培養120腔室連接。連接較佳係無菌連接。該連接允許將無菌空氣注入至第一細胞培養腔室120中以將含有經擴增之T細胞之上清液轉移至第二細胞培養腔室220中。可採用流體流動技術中已知的替代技術將上清液自第一細胞培養腔室120轉移至第二細胞培養腔室220。亦如所示，各生物反應器包括其自身流體及廢液收集儲槽、泵及相關聯管件。然而，應明瞭，儲槽及泵可在生物反應器之間共用。
該系統經組態成能夠用介質灌注細胞培養腔室中之細胞，此係本文所述的各種細胞培養方法所必需的。灌注確保對細胞混合物均勻地供應營養素及細胞介素以及充分地氣體交換及廢液移除以幫助形成基於細胞之免疫治療產品。與先前技術的基於板之方案相比，維持介質及細胞介素之一致局部濃度分佈確保更高產率及加速單核細胞分化為DC之製程之潛在能力。然而，黏附(DC)及非黏附(T細胞)類型之組合以及DC對機械力之高敏感性對抗原特異性T細胞之刺激及擴增呈現挑戰，特別是關於流體流動穿過細胞培養腔室。因此，在其中經由灌注提供介質及細胞介素之彼等實施例中，本發明之系統必須能夠對細胞供應營養素及細胞介素而不自生物反應器移除細胞同時亦考慮到某些抗原呈現細胞(諸如DC)之剪切敏感性。本發明之系統及方法旨在最佳化有利於T細胞增殖之自分泌/旁分泌信號之保留同時更新生長因子且維持對DC之最小物理刺激。為了說明此點，必須同時考慮穿過細胞培養腔室之方向及灌注流速率。
在某些態樣中，流體流速維持低於抗原呈現細胞之沉降速率。因此，抗原呈現細胞由於其質量而將保留在培養腔室內。換言之，抗原呈現細胞將朝著細胞培養腔室之底部沉沒且因此保留在細胞培養腔室中。
可根據公式1計算得低於沉降速率之流速： v_max = 〖(ψd_p)〗^2/150μ g(p_細胞-p_液體)e^3/(1-e) 其中v_max為超過其時細胞將被向上提起之液體速度，ψ為細胞之形狀因子(細胞之表面積與等體積球體之表面積之比；注意細胞不是完全球形及預期該因子為小於1)，d_p為體積等於細胞體積之球形顆粒之直徑，μ為含有細胞之液體之黏度，g為重力常數，p_細胞為細胞之密度，p_液體為含有細胞之液體之密度，及e為未被細胞佔用的相關體積之分率。
在以下所述的涉及灌注介質之方法中，應明瞭，灌注可在培養期間連續進行或其可於細胞在任何一個細胞培養腔室中培養的時間段內的特定時間點發生，諸如例如每天或每週1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。連續灌注有助於在整個製程中維持接近恆定之培養體積。同樣地，可在培養期間的一或多個點注入細胞介素，諸如例如1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次或連續地注入。在該等實施例中，連續灌注有助於維持細胞介素之一致局部濃度分佈，此可幫助確保更高產率且與靜態細胞培養方法相比具有增加刺激及擴增T細胞之速度之能力。
灌注參數可在培養週期期間的任何時間改變。實例參數包括(但不限於)中位流速、細胞介素濃度及培養週期之持續時間。此等參數中之各者可於T-刺激之功效上具有影響。例如，在設計用於將單核細胞擴散至DC之培養腔室之最新著作中，如國際專利申請案第PCT/US2016/040042號及第PCT/US2016/60701號中所述，已確定對應於0.1 dyn/cm2之壁剪切應力程度之中等灌注速率能夠產生與彼等使用習知基於6-或24孔板方案所產生者表型上相同之DC。因此，藉由在培養週期期間測量以上所述的表型及功能性量度中之一者或多者，可監測一或多個灌注參數對功效之影響，從而允許進行適宜調整。
為促進灌注，該系統包括一或多個泵140。該等泵可係可操作地耦合至細胞培養腔室120以將灌注介質灌注於細胞培養腔室中。生物反應器110亦可包括一或多個流體儲槽132。流體儲槽132與細胞培養腔室110流體連通且可係可操作地耦合至一或多個泵140。亦提供用於將流體儲槽連接至泵及細胞培養腔室之一或多個管。在某些態樣中，該一或多個泵經組態成用於將來自流體儲槽之流體泵送穿過細胞培養腔室，且進入廢液收集儲槽中。在顯示於圖2中之實例實施例中，流體自流體儲槽132穿過管件152移動至泵140且經由入口136進入細胞培養腔室120中，經由出口138穿過管件154自細胞培養腔室120出來，且進入廢液收集儲槽134中。
在某些實施例中，流體儲槽及/或廢液收集儲槽可各自以流體耦合至腔室之一或多個密封袋或容器提供。各儲槽含有入口埠及出口埠、或出口埠及流體耦合至一或多個細胞培養腔室之入口之通風口。在一些實施例中，Luer連接器及經切割以配合在Luer連接器周圍之聚矽氧墊圈可用於防止穿過入口或出口中之任一者或兩者洩漏。在一些實施例中，可使用無菌管焊接裝置將經密封之儲槽連接至細胞培養腔室，該無菌管焊接裝置建立流體連接而不將任一容器暴露於外部環境且保持無菌。如將於以下更詳細地論述，此允許在封閉系統中進行本發明之方法。
由於所揭示的細胞培養系統之小尺寸及可攜性，其可容易地與管焊接裝置結合使用。為進行必要的無菌連接，本發明之系統可容易地提起且攜帶於管焊接機附近。細胞培養系統之尺寸及組態亦使其與標準培養箱相容。細胞培養系統經定尺寸及經組態以裝於習知培養箱內的單個擱板上，以致可在其中進行所揭示的製程。根據組態，可將多個儀器裝於單個培養箱中。培養箱內的條件包括37℃之持續溫度及95至100％濕度。因此，考慮到材料(包括流體及生物製劑)在此種條件下傾向於擴增，因此所選擇的材料必須具有承受此等條件之完整性。此外，在一些情況下，培養箱內的條件保持穩定，且溫度之自動化記錄可使得溫度波動之知識與在培養箱內進行的反應中之任何異常相關聯。
因此，任何電源供應均不應改變培養箱內的環境。例如，某些泵會產生熱量。因此，在一個實施例中，泵係與生物反應器分開容納，但仍與反應器流體連通且可操作地連通。在另一個實施例中，泵直接附接至生物反應器且位於培養箱內，但沒有熱量或係可操作地連接至散熱器及/或風扇以耗散熱量。在另一個實施例中，泵基於工作循環運行以減少所產生的熱量。不論組態為何，泵係可操作地耦合至生物反應器，及進而耦合至細胞培養腔室。在一些實施例中，該系統亦包括用於控制細胞培養儲槽及視需要流體儲槽之溫度之加熱器。在此種組態中，不需要培養箱，且該系統可僅利用電源來自主地操作。若系統缺乏加熱器，則其可在細胞培養培養箱內操作。
關於基於灌注之自動化細胞培養系統(諸如用於利用板上(on-board)試劑儲存及藉由板上丟棄式蠕動泵實現的灌注進行內皮細胞培養之小型培養系統及用於使用具有聚苯乙烯底表面之腔室自單核細胞產生樹突狀細胞之較大型培養系統)之另外詳細內容可見於國際專利公開案WO 2017/004169；WO 2017/079674；及WO 2018/005521；以及美國專利申請案序號16/539,916；該等案各者之全文係以引用之方式併入本文中。
本發明之系統或裝置為模組化且能夠以串聯方式(亦即流體自一個裝置流動進入另一裝置中)及/或以並行方式流體連接至其他類似裝置，且亦可經如此組態成彼此物理堆疊或能夠物理配置於相關裝置(諸如培養箱)中。該系統之模組化設計特別允許根據欲包括在系統中之所需製程靈活地切入及切出模組。
本發明之流體裝置(包括包含細胞培養腔室之生物反應器)可以微流體實施例(亦即其中，其中的一或多個通道或腔室具有在約1 µm至約999 µm之範圍內之尺寸)或大流體實施例(其中，其中的所有通道或腔室具有約1 mm或更大之尺寸)或二者提供。
流體裝置可進一步包括如特定設計所需的另外流體通道或區室、墊圈或密封件、混合區、閥、泵、通風口、加壓氣體之通道、電導體、試劑、埠及管件。其亦可含有一或多個控制模組、傳輸器、接收器、處理器、記憶體晶片、電池、顯示器、按鈕、控件、馬達、氣動致動器、天線、電連接器及類似者。該等裝置較佳僅含有對哺乳動物細胞無毒之材料及與藉由使用醇及/或熱量或其他手段之滅菌(諸如暴露於伽馬輻射或環氧乙烷氣體)相容之材料。
設備之材料係經選擇成在特定於各製程之不同溫度及壓力等級下具有適宜化學相容性。另外，根據對於不同功能之流量及壓力要求，在裝置中實施的泵(諸如注射器、蠕動泵、壓力泵及旋轉泵)之選擇在nL至mL流速及10至10,000 psi壓力之範圍內。
本發明之系統亦可包括一或多個樣品溶液儲槽或孔或用於在模組之各種入口(其與入口通道流體連通)處將樣品引入裝置之其他設備。用於將一或多個樣品裝載於本發明之流體裝置上的儲槽及孔包括(但不限於)注射器、藥筒、小瓶、Eppendorf管及細胞培養材料(例如96孔板)。
在有用之情況下，可使裝置之表面更親水，諸如藉由暴露於電漿，或可塗覆一或多種凝膠、化學官能化塗層、蛋白質、抗體、蛋白多糖、糖胺多糖、細胞介素或細胞。本發明之流體裝置較佳在操作條件下沒有流體洩漏且能夠在幾天至幾週之時間內進行無菌操作。本發明之流體裝置亦包括採樣機構，其允許將流體自系統移除以進行測試而不會將新的材料或污染物引入至系統。
在某些態樣中，細胞培養系統之至少一部分包含丟棄式組件，其中之一些或全部可容納在非丟棄式框架內。在其他態樣中，該系統之所有組件均係丟棄式。此外，在一些實施例中，細胞培養系統包括用於追蹤及記錄患者材料之樣品追蹤組件。
使用各種在線製程分析工具(PAT)或小型化微全分析系統(micro-TAS)監測製造製程期間的至少一個步驟及有時複數個或所有步驟之產品特性(例如純度及多晶型形式)。
如以上所述，本發明之細胞培養系統能夠控制系統內之流體及實體之方向及流動。本發明之系統可使用壓力驅動流量控制，例如利用閥及泵，以操縱細胞、試劑等沿一或多個方向流動及/或流動進入流體裝置之一或多個通道。然而，亦可單獨或與泵及閥組合使用其他方法，諸如電滲流量控制、電泳及介電泳(Fulwyer，Science 156，910 (1974)；Li與Harrison，Analytical Chemistry 69，1564 (1997)；Fiedler等人 Analytical Chemistry 70，1909-1915 (1998)；美國專利第5,656,155號)。
本發明之系統亦可包括或可操作地耦合至一或多個控制系統，該等控制系統用於控制穿過系統之流體移動；監測及控制系統內的各種參數，諸如溫度；以及偵測基於細胞之免疫治療產品之存在、產品量(直接地或間接地)、轉化速率等。該系統亦可配備有允許進行回饋控制的多種類型之軟體(諸如先進即時製程監測及控制製程)，以及允許根據使用系統獲得的反應及純化結果整合及按比例放大之製程。
在某些實施例中，系統包括微流體、毫流體或大流體模組及管件之組合，其在就通道尺寸、流動幾何形狀及裝置之不同模組之間的相互連接方面係可互換。各模組及管件可針對於特定功能進行設計。在一個實施例中，系統內的所有模組均經設計以進行細胞培養及T細胞刺激。在其他實施例中，系統之模組係針對於不同功能進行設計，諸如組織處理、樹突狀細胞生成、細胞培養、濃縮及/或純化，其全部經整合以用於連續製造免疫治療產品。均質及異質製程均被認為適於流動應用。此等製程係針對起始材料及操作條件(諸如溫度、壓力及流速)進行設計及最佳化以便在流動製程期間不易堵塞系統。 不透氣細胞培養腔室
在一些實施例中，所揭示系統之細胞培養腔室係由不透氣材料製成。不透氣材料係生物相容性且係樹突狀細胞將黏附之材料。在一個實例實施例中，不透氣材料包含聚苯乙烯，其如以上所述可用於自PBMC之異質懸浮液富集單核細胞。由不透氣材料製成的整個細胞培養腔室提供細胞可黏附的較大表面積且增加系統之無菌性。
不透氣細胞培養腔室可與顯示於2中之腔室120實質上相同，且除了另外表面124及腔室120之所有其他表面係由與底表面122相同的材料製成之外，其可具有以上所述的任何體積、形狀、尺寸及物理特性。在一些實施例中，腔室120之頂部、底部及所有側壁係不透氣。不透氣細胞培養腔室之底表面可具有與習知孔板(諸如6孔板及24孔板)相當之表面積(分別為9.5 cm2 及3.8 cm2 )。亦應明瞭，表面積可比習知孔板小或甚至大得多(例如具有與標準細胞培養皿及燒瓶相當之表面積)，諸如具有在約2.0 cm2 與約200 cm2 之間之表面積，例如約2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、100.0、125.0、150.0、175.0及200.0 cm2 ，及介於其間之任何表面積。
當腔室不可滲透氣體時，需要對以上所述的系統進行某些修改。例如，在氣體不流動穿過細胞培養腔室之表面中之一者之此類實施例中，必須以另一種方式促進細胞與介質之間之氣體交換。細胞培養腔室包含一或多個入口126及136及一或多個出口128及138。入口及出口開口可流體耦合至管件，該管件係經相應開口密封。入口及出口由此可利用相應泵連接至灌注流體儲槽及廢液流體儲槽以用於使灌注流體移動穿過腔室。入口及出口可位於腔室之任何表面中。在一些實施例中，其係位於腔室之頂部。管件較佳為高滲透性管件，為了實現氣體交換，介質可在進入腔室中之前及在穿過高滲透性管件離開腔室之後交換氣體。因此，氣體穿過一或多個入口被有效地帶入腔室中且穿過一或多個出口移除。入口或與其連接之管可包括用於過濾進入細胞培養腔室之液體或空氣之過濾器，諸如0.2微米過濾器。
氣流受灌注速率之影響，其參數可如以上所述進行控制。經由通過高滲透性管件交換氣體，該系統維持達成所需程度之氣體交換之能力而不需要腔室具有氣體滲透性。細胞培養方法可在完全不透氣腔室中進行，其中入口126及136及出口128及138用於灌注及氣體流動。在方法實施例中，不透氣細胞培養腔室可藉由將細胞裝載於腔室中且藉由使細胞培養介質經由入口及出口流入及流出腔室灌注細胞而用來培養細胞。灌注流提供營養以及細胞培養之氣體交換。因為穿過腔室之流係層流，故一些方法可能需要進行另外搖動，諸如以進行細胞收穫。然而，考慮到所揭示系統之尺寸及組態，可根據需要將整個系統置於軌道振盪器上。
不透氣實施例之另一個優點係其易於製造，因為其具有較少不同零件及材料。其可根據需要製成大或小。不透氣腔室可一體地形成或其可由多個零件形成。例如，其可藉由傳統製造製程或積層製造製程(諸如3D印刷)由單件材料製成。在實施例中，使用此項技術中已知的方法(諸如機械扣接、黏著劑及溶劑結合及焊接(諸如超音波焊接))將各由不透氣材料製成的複數個部件結合在一起。 細胞培養腔室之可互換性
本發明之細胞培養系統係經組態成能夠與各種尺寸及形狀之細胞培養腔室連接。細胞培養系統可包括流體儲槽、廢液儲槽及用於控制流體流動至儲槽及自儲槽流動之一或多個泵。細胞培養系統亦具有經組態成接收一或多個不同形狀及尺寸之細胞培養腔室之區域。一或多個管將流體儲槽、細胞培養腔室及廢液儲槽流體連接。泵經組態成使流體移動穿過管。
不同細胞培養腔室尺寸可用於不同目的，或彼此組合使用。可基於所需的細胞輸出或所需試劑之不同比例來選擇尺寸。例如，小藥筒尺寸對於研究、臨床前用途或製程開發可能有用。大藥筒係具有相同架構之更高容量形式。
一或多個細胞培養腔室之高度可變化。例如(但不限於)細胞培養腔室高度之一個實例範圍包括0.5 mm至100 mm之任何高度，諸如0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0、85.0、90.0、95.0、100.0 mm或更大或其間的任何高度。在某些實施例中，腔室之高度可與通常在6-及24孔板中進行的培養物中之液體高度相當，諸如在2 mm與6 mm之間，且體積容量為約0.8 mL至6 mL。在其他實施例中，細胞培養腔室將具有更大尺寸，諸如在10 mm與50 mm之間，且培養表面為約50 cm2 。在一些實施例中，細胞培養腔室具有在約1 mL與約100 mL之間之體積容量，且可為約5、10、20、25、30、40、50、60、70、80或90 mL或其間的任何值。在其他實施例中，細胞培養腔室具有在約100 mL與約1,000 mL之間之體積容量，例如100、200、300、400、500、600、700、800、900或1,000 mL。在一個特定實施例中，細胞培養腔室具有210 mL之容量。
本發明之藥筒之可互換性允許在使用相同系統之細胞生長程序期間按比例放大。此避免為了繼續生長細胞而切換至不同細胞培養系統之需要。例如，為製造約20億個細胞之批量，該系統可始於容量為約25 mL之小藥筒，且然後按比例放大至容量為約210 mL之大藥筒。該可互換性意指自活化至填充及精加工，可在相同系統上完成製程之更多個部分。取決於特定方案之需要，該系統可利用例如兩個大(約210 mL)細胞培養腔室、兩個小(約25 mL)細胞培養腔室或各一個操作。由於各入口及出口可連接至任何尺寸腔室，故該系統能夠根據需要按比例放大或縮小。
再次參考圖1，系統900包括經組態成支撐一或多個細胞培養腔室820及920之平臺950。不論形狀或尺寸為何，細胞培養腔室可經由管940連接。依此方式，不同形狀及尺寸之細胞培養腔室可與系統相容。細胞培養腔室可以不同組態配置在平臺上，諸如並排放置或堆疊放置。在實施例中，管940係與腔室一體形成。可使用以上所論述的相同製造方法將管及腔室本體接合在一起。在一個實施例中，細胞培養腔室係經製造成具有側壁及/或頂壁中之材料之至少一部分經切出以允許形成一或多個入口或出口。在一個實例配置中，可將管個別地插入開口中以與容器形成密封。應明瞭，前述組態僅係實例及用於接合腔室及一或多個管之其他組態亦係本發明之經考慮之實施例。
藉由使用無菌管連接於耦合系統之各種容器及腔室部分地促進可互換性。無菌管較佳係使用無菌管焊接機連接。一般而言，無菌管焊接機係一種裝置，其可接收兩個管，將其固定到位，且然後用熱刀片將其切割，將其再對準以使第一個管及第二個管對準，及在刀片縮回時將兩個切割端融化在一起。適於本發明使用之無菌管焊接機可為任何市售無菌管焊接機，包括來自Terumo BCT, Inc. (Lakewood，CO)之SCD® IIB；來自Vante BioPharm (Tucson，AZ)之Vante® 3690；及來自Genesis BPS™ (Ramsey，NJ)之TCD®。
如以下將更詳細地描述，在某些實施例中，系統係功能上封閉。封閉系統係藉由使用無菌管焊接完成所有的轉移來維持。例如，可將細胞儲存在無菌袋中，然後將其連接至無菌細胞培養腔室。細胞可在維持無菌的同時流動進入細胞培養腔室中。管連接性允許在無菌條件下在相同裝置上完成所有細胞接種、洗滌及收穫。藉由使用無菌管焊接機，一個袋不必在連接另一個袋之前斷開連接。
以上描述集中於系統組件及各種可能之組態。以下描述集中於可使用本發明之系統進行之某些製程。 封閉系統中之 CAR-T 及 TCR 製程
以上所述的細胞培養系統可用於產生CAR-T及TCR轉導之T細胞之方法。CAR-T/TCR工作流程之可視化顯示於圖4中。所揭示的系統可用於在封閉系統中進行工作流程之幾個步驟，包括基因修飾、細胞擴增、細胞洗滌及濃縮、及細胞調配。工業上使用的產生CAR-T及TCR轉導之T細胞之先前已知的方法不在封閉系統中進行。常用的聚苯乙烯T燒瓶必須打開及關閉以進行轉移，且因此會受到潛在污染。本發明使用由固體聚苯乙烯製成的封閉且可互換之藥筒，其允許針對於T燒瓶設計的方案容易地再格式化以在所揭示的無菌系統上完成。
在一些實施例中，本發明之方法涉及使細胞培養介質流動進入具有T細胞之培養腔室中，且利用轉導試劑(諸如例如表現CAR或TCR之非活性病毒)灌注T細胞以將其轉導。灌注流體可包括活化試劑以使細胞擴增。在一些實施例中，將轉導及/或活化試劑與細胞預混合，且在其他實施例中，其係來自個別的無菌袋或容器。袋可透過如以上所述的無菌焊接手段連接，且試劑可藉由重力或藉由泵流動進入袋中。在一些實施例中，細胞培養腔室經完全填充而具有極少或沒有頂隙。
使細胞生長至多約3天，在該時間期間，其可接受CAR、TCR，且藉由灌注介質持續。細胞在腔室中形成沉積物且灌流速率維持足夠低以防止細胞自藥筒流出。經轉導之細胞在培養腔室中擴增且然後可轉移至更大的培養腔室，該培養腔室係經由無菌管連接以進行進一步擴增。使用本發明之方法，在小藥筒(25-mL體積)中之7-天擴增可產生約5億至十億個T細胞，及大藥筒(210-mL體積)可產生約十億至三十億個T細胞。
脫離與灌注袋之連接且附接收穫袋。然後將細胞排乾於收穫袋中。在實施例中，緩衝袋可藉由相同方法連接且用於在將細胞移除至收穫袋中之前對其進行一或多次洗滌。藉由排乾一種液體，添加另一種液體，且將細胞再懸浮於新體積之液體中，可增加或減少細胞所處的液體之體積。在一些實施例中，可將系統排乾以移除積累的乳酸。隨著細胞培養物擴增，乳酸會積累且單獨透過灌注可能無法足夠快地移除。解決辦法係在不移除細胞下排乾介質以減少總體積(可能減少90至95％)，且然後灌注新製介質。在一些實施例中，該介質可用不同細胞培養介質或冷凍保存介質代替。
細胞培養腔室在封閉系統中連接使得整個方法在封閉環境中進行而無需在轉移時藉由打開任何容器將介質暴露於空氣。如已提及，該方法之所有連接及斷開連接均可利用無菌管焊接機完成。
不同於先前技術，所揭示的活化、轉導及擴增之方法係在封閉無菌系統中進行。利用以上所述的可互換性，使用者可按比例放大至多達100至200億個經擴增細胞之批量，全部在封閉環境中。在一些實施例中，該等方法可用於製備用於在更大生物反應器系統上製造的批量。在習知CAR-T製造中，需要100億或更多個細胞之批量。當前揭示的系統及方法可在將十億個或更多個細胞轉移至更大擴增系統(諸如可自GE Healthcare (Chicago，IL)獲得之XURI™)之前進行活化、轉導及初始擴增之上游步驟。該能力使得系統與非磁性活化試劑高度相容。
圖5至6顯示利用目前揭示的系統(稱為BATON™，來自Flaskworks，LLC (Boston，MA))及另一市售T細胞擴增平臺G-REX® (來自WilsonWolf (St. Paul，MN))實施的T細胞擴增之間的比較之一個實例。圖5顯示利用經來自Thermo Fisher (Waltham，MA)的在25 mL藥筒中運行之DYNABEADS®刺激之PBMC歷時9天使用BATON™進行倍數擴增的圖。利用BATON™實現的穩健倍數擴增與G-REX®之倍數擴增相當。
圖6顯示使用兩個系統，在第0天及第7天之細胞數。根據本揭示內容，利用BATON™，在210 mL藥筒中在七天內自4千萬個T細胞獲得約十億個細胞。該表型主要為中央記憶體。如圖7中進一步顯示，表型圖譜(phenotypic profiles)在BATON™與G-REX®之間係相當。該圖亦比較可自Corning Inc. (Corning，NY)獲得之T75燒瓶。如所示，BATON™ 及 G-REX®二者均產生相等的第9天CD4/CD8比。
如圖8中所顯示，利用BATON™產生的T細胞之細胞毒性與G-REX®相當。使效應細胞擴增9天，及靶細胞為Jurkat T細胞。將細胞以10:1效應物與靶標比混合且在37℃於5% CO0 下培養24小時。介質為RPMI 1640 (ATCC) + 15% FBS。來自所有三個組之第5天及第7天細胞在細胞毒性方面係相當。 在封閉系統上之新抗原製程
所揭示的系統亦有用於產生靶向新抗原之T細胞之工作流程。該類療法涉及經腫瘤特異性肽及自體T細胞文庫刺激之抗原呈現細胞之共培養。新抗原呈現細胞之製造比CAR-T更複雜。不同於CAR/TCR，本發明方法可追求標靶文庫而不僅僅是一個文庫。其需要由當前揭示的系統提供的某些能力，該等能力係無法自先前技術系統獲得。
本發明系統自患者單核細胞產生新製樹突狀細胞。該系統亦經組態成將樹突狀細胞與患者PBMC或T細胞共培養且傳遞經刺激之T細胞。該系統可與新鮮生成之樹突狀細胞進行多個共培養循環以避免不同抗原之間的競爭效應。以下將更詳細地描述樹突狀細胞及T細胞之並行處理以促進該製程。新抗原療法之典型劑量大小為約2億個T細胞，其可藉由所揭示的系統在小(約25 mL)或大(約210 mL)藥筒中處理。
不同於先前技術方法，本發明之系統在封閉環境中促進上述全部。該方法利用本發明系統之互連細胞培養腔室。將經純化之單核細胞引入細胞培養腔室中之一者，且將經純化之T細胞引入另一細胞培養腔室。單核細胞經灌注細胞培養介質以產生樹突狀細胞，然後使其與包含腫瘤特異性肽之抗原材料接觸。此產生呈現腫瘤特異性肽之成熟樹突狀細胞。將T細胞轉移至含有成熟樹突狀細胞之腔室中以將其與T細胞共培養。共培養產生靶向新抗原之T細胞。在經由共培養刺激之一個循環之後，可移除T細胞且視需要使其流動進入含有新鮮產生之成熟樹突狀細胞之第二腔室中以進行第二次共培養。第二批樹突狀細胞可與產生於第一腔室中之樹突狀細胞非同步地產生。
在實施例中，成熟樹突狀細胞產生於第一腔室中且然後將T細胞加入第一腔室中並共培養。然後將來自第一腔室之T細胞移至第二腔室，在該腔室中，將其與新鮮產生之樹突狀細胞共培養，該等樹突狀細胞係經相同或不同組之肽刺激。然後可將經擴增之T細胞移回至第一腔室，在該腔室中，等待經相同或不同組之肽刺激之又另一批新鮮成熟樹突狀細胞。
T細胞可根據需要任意次數地轉移回且在兩個相連腔室之間轉移。此對於用幾種不同肽刺激DC可能特別有用。例如，若一者具有20個左右肽(需要用其來刺激DC)之文庫，則由於肽之間之競爭效應，立刻嘗試用所有肽刺激DC將導致刺激不足。一些肽比其他肽具有更大效應及/或親和力。分階段進行刺激，例如，在第一次共培養中用五種肽刺激一批DC，且然後在第二次共培養中用五種不同肽刺激下一批DC，依此類推。在其他實施例中，可用單個、小組之肽完成多個刺激循環。在非限制性實施例中，可將T細胞轉移2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次、15次、20次或25次。各共培養可涉及經相同或不同肽刺激之DC。
整個方法係在本揭示內容之封閉系統內進行，由此在整個方法中維持無菌。如同其他所揭示方法，培養腔室連接可利用藉由管焊接機連接之無菌管來達成。此維持提供於無菌容器中之細胞培養介質之無菌性。在各種實施例中，T細胞可在相同儀器上之腔室之間轉移或在個別儀器上之腔室之間轉移。
在完成共培養後，自腔室排乾流體，且可用緩衝液洗滌靶向新抗原之T細胞且將其再懸浮於冷凍保存劑中及/或收穫於收穫袋中，該收穫袋亦以封閉方式連接。
圖9顯示用於在本發明之封閉系統上共培養經新鮮培養之樹突狀細胞及PBMC或T細胞之方法之示意性流程圖。使用無菌焊接式連接，所揭示的細胞培養系統提供自動化接種、培養及細胞收穫。如工作流程中所顯示，在第0天接種單核細胞，且經第0-6天分化為樹突狀細胞。在第6天，加入同種異體PBMC或T細胞。樹突狀細胞使得T細胞能夠自PBMC擴增。在第13天收穫經擴增之T細胞。
利用所揭示的方法產生的經擴增之T細胞顯示穩健細胞毒性能力。使用工作流程進行的實例之結果顯示於圖10中。CD 8+ T細胞與Jurkat細胞之目標比為1:1，且使用1至3百萬個所收穫的細胞進行實驗。在分析之前，將Jurkat細胞用PKH67染色。將細胞培養1天，且將所有細胞在分析後用CD3及膜聯蛋白(Annexin)V染色。所得的死Jurkat細胞顯示於圖10中。 並行處理樹突狀細胞及 T 細胞
用於形成基於細胞之免疫治療產品之製程需要共培養兩種類型之細胞。利用當前揭示的系統，可以並行方式產生此等細胞以更有效地產生抗原特異性T細胞。簡言之，樹突狀細胞係自單核細胞產生且藉由與抗原材料接觸而成熟，及活化T細胞且然後與DC共培養。在先前技術方法中，該方法將需要幾個人工步驟。然而，當前系統可在封閉系統中以並行方式產生兩個細胞批次。使用本文所揭示的系統，在一個腔室中產生樹突狀細胞，且以並行方式，在另一個連接腔室中刺激T細胞。在第一腔室中灌注單核細胞以產生DC，將DC與抗原材料接觸以使其成熟。來自另一連接腔室之經活化之T細胞流動進入第一腔室中以接觸DC且進一步培養T細胞。如同在其他方法中，該等腔室係經由無菌管連接，使得該方法係在實質封閉系統中進行。T細胞可藉由使其流動進入收集容器中及/或轉移至冷凍保存介質來收集，同時仍在封閉系統組態中。
參考圖11，其顯示用於形成基於細胞之免疫治療產品之製程之一般概述。根據本發明之某些實施例產生細胞治療產物中之步驟包括在含有細胞培養腔室之生物反應器中將經刺激之抗原呈現細胞(例如DC)與含有T細胞之細胞共培養。在培養期間產生含有經擴增之治療性T細胞產物之上清液。在某些態樣中，為了產生足以在患者中引起治療反應之一定量之抗原特異性T細胞，必須在一或多個另外細胞培養腔室中對T細胞進行另外培養。為了實現該另外培養，必須發生將上清液自其中產生上清液之培養腔室轉移至隨後的含有抗原呈現細胞之新鮮供應之細胞培養腔室。上清液在細胞培養腔室之間之轉移可涉及將氣流引入第一細胞培養腔室中，該氣流將包含第一細胞產物之上清液穿過流體連接器轉移且進入新細胞培養腔室中。此外，在培養步驟各者期間，可將含有例如介質及細胞介素之灌注流體灌注至腔室。在某些態樣中，灌注流體沿垂直流動路徑流動穿過腔室以便確保在培養期間細胞保留在腔室內。可將一或多個隨後細胞培養腔室連接至系統，其中各腔室含有新一批抗原肽脈衝之自體抗原呈現細胞。
為了刺激及擴增抗原特異性T細胞，該製程始於將含有T細胞之細胞與自相同個體獲得之抗原呈現細胞(APC)在細胞培養腔室中進行共培養。在一個特定實施例中，含有T細胞之細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及APC包括DC。可將含有T細胞之細胞及APC以約1000:1至1:1000，諸如例如(但不限於)1000:1、900:1、800:1、700:1、600:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、75:1、50:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:50、1:75、1:100、1:200、1:300、1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900、1:1000或其間之任何比率之比率(含有T細胞之細胞:APC)提供至細胞培養腔室。在一個態樣中，較佳為10:1之比率。
為了自APC與含有T細胞之細胞之相互作用引發T細胞之刺激及擴增，需要對APC進行刺激。此可透過使用一或多種刺激分子來完成。在某些實施例中，刺激分子為非腫瘤特異性。在其他實施例中，刺激分子為腫瘤特異性。例如，刺激分子可選自個體腫瘤之一或多個特徵，諸如不同抗原肽。在一些實施例中，較佳僅在培養週期的開始加入刺激分子。刺激分子可歷時僅約幾分鐘、一小時、幾小時或更長時間之時段添加。在一個較佳實施例中，歷時約一小時時段加入刺激分子。
APC及T細胞之共培養在培養介質中進行。實例培養介質包括(但不限於)RPMI介質及Cellgenix®介質。根據本發明之實施例可使用此項技術中已知的任何其他適宜培養介質。亦可將細胞介素(諸如IL-4及GM-CSF)加入培養介質。
僅進行一次共培養通常不夠。所揭示的系統允許將T細胞從懸浮液中取出。在此，T細胞可用新製樹突狀細胞再刺激且可在密閉系統中進行多次共培養。利用本發明之並行處理方法，可將藥筒以鏈方式連接且可將細胞從一個藥筒推到另一藥筒。一個含有成熟、黏附DC之反應器將經裝載PBMC且在灌注介質及細胞介素下進行刺激循環。利用並行處理，可藉由用抗原肽脈衝使經擴增之T細胞連續暴露於產生於第一細胞培養腔室中之新製DC。刺激製程可繼續所需時間以便產生足夠大數目之細胞而得到治療劑量之T細胞。
經由無菌連接將多個腔室連接在一起可涉及如以上關於圖3所論述的多個腔室之組態。該連接允許將無菌空氣注入第一細胞培養腔室中以將含有經擴增之T細胞之上清液轉移至第二細胞培養腔室中。在某些實施例中，可將一或多個生物反應器提供於包含用於在發生於生物反應器之細胞培養腔室內之製程之前、同時或之後實現各種其他製程之模組之系統中。
可經由無菌焊接及密封將一個藥筒轉移至收穫袋中或新藥筒中。在一些實施例中，可產生樹突狀細胞且然後收穫並冷凍保存，且按需使用。同時，系統可獨立地運行第二藥筒以生成新製樹突狀細胞。
在某些態樣中，計算模型化方法用於最佳化T細胞與抗原呈現細胞之相互作用。根據本發明之計算模型考慮灌注之影響及刺激所需的最佳時間，且併入基於粒子相互作用之方法以及基於動力學參數之方法。實例的基於粒子相互作用之方法及基於動力學參數之方法係此項技術中已知的，其中一些描述於本文中。例如，關於基於粒子相互作用之方法，Day及Lythe使用以下表現式描述T細胞在淋巴結表面上找到APC所需的時間，其中D為T細胞之擴散率，及b為位於半徑R之球形淋巴結中心的APC之半徑。參見Day等人，Mathematical Models and Immune Cell Biology；2011
Figure 02_image001
關於基於動力學參數之方法，Valitutti已開發T細胞與抗原呈現細胞間相互作用之模型，如圖9中所顯示。Valitutti等人，FEBS Lett. 2010。然而，此種相互作用尚未在培養腔室或生物反應器之情境中進行模型化。
藉由將基於粒子相互作用之方法以及基於動力學參數之方法兩者併入本發明之計算模型中，可達成自動化確定及監測灌注流體(例如注入細胞介素之介質)之最佳灌注速率以使兩種細胞類型在細胞培養腔室中彼此接觸之概率最大化。
例如，在某些實施例中，提供一種細胞培養系統，其包括細胞培養腔室及中央處理單元，該中央處理單元包含含有可藉由中央處理單元執行之指令之記憶體。在某些態樣中，指令引起系統接收包含細胞培養腔室之尺寸作為第一輸入資料，接收包含在將引入細胞培養腔室中之一或多種流體中之第一細胞類型之第一濃度及第二細胞類型之第二濃度作為第二輸入資料，及基於第一及第二輸入計算將引入細胞培養腔室中之使第一細胞類型及第二細胞類型在細胞培養腔室內彼此接觸之概率最大化之灌注流體之灌注速率。以下提供關於用於在細胞培養系統內實行本發明之方法之電腦系統之另外詳細內容。
在一些態樣中，該系統亦包括可操作地耦合至一或多個灌注流體儲槽且可操作地耦合至中央處理單元之一或多個泵，使得中央處理單元亦藉由控制一或多個泵來控制灌注流體之灌注速率。 再循環介質
細胞培養介質及補充劑(諸如細胞介素)係昂貴的，及用過的介質經常會在其中具有殘餘營養素，該等營養素會被丟棄。注意到此點，所揭示的系統提供再捕獲一些經部分使用的介質且將其再循環之方式。在本發明之某些方法中，在所揭示的細胞培養腔室中之一者中培養細胞，其中使細胞培養介質流動穿過細胞培養腔室。一般而言，流體流動進入入口且從出口流出。使已經流動穿過細胞培養腔室且流出出口之細胞培養介質之一部分在細胞培養製程期間再循環回至細胞培養腔室中。
為了確定應將用過介質之多少及/或哪個部分返送至細胞培養腔室，本發明在再循環之前測量一或多個參數，諸如用過介質之營養素含量或pH。所測量的營養素可為葡萄糖、乳酸鹽、溶解氧或細胞代謝產物。測量相關參數及處理器確定參數是否滿足預定閾值，該預定閾值指示其可經再循環。如果是這樣，則將介質送回至細胞培養腔室中。
用過的介質可單獨再循環或其可與推注量的新製介質組合。另一方面，若用過的介質不滿足預定閾值，則將其丟棄。在一些實施例中，閥操作以將用過的介質導引至廢液儲槽或導引回至細胞培養腔室中。
在各種實施例中，可以任何頻率進行再循環。例如，一或多個感測器可以規則時間間隔(諸如每秒、每分鐘、每10分鐘、每小時等)檢查用過的介質。在其他實施例中，一或多個感測器可在介質穿過廢液管線時藉由測量該介質來連續地操作。在一些實施例中，透過來自外部過濾器或感測器之回饋來控制再循環，該等外部過濾器或感測器監視廢液介質以確定其是否可再利用或其是否被廢棄。在一些實施例中，在線感測器經嵌入系統中以監視廢液介質且確定其是否可經再循環。
再循環達成實現細胞培養腔室之外部與內含細胞之間的氣體交換同時相對於其中介質直接灌注穿過而未再循環之製程減少製程將消耗的介質量之目標。
再循環速率可基於所需的氣體交換及營養素供應進行調節。例如，在其中T細胞自小數目擴增至遠遠較多數目的細胞培養製程中，培養之初始階段可在低流速灌注下以100%再循環進行。此係因為封閉灌注迴路中之營養素足以供應小數目之細胞且流速經設定成足以確保足夠的氣體交換(氧氣進入，CO2出來)。然後，隨著細胞開始擴增，其對營養素及氣體交換之需求增長。監測生長且可形成與增加灌注流速(以增加氣體交換)及改變再循環之程度(僅再循環一部分的介質且以逐漸增加的分率添加新介質)相關聯之決策基礎。原則上，此可動態且自動地完成。
在實施例中，細胞培養腔室包括可操作地耦合至細胞培養腔室之一或多個感測器。該系統可經組態成具有各種感測器組態以監測不同參數且與控制系統整合。感測器可係能夠測量細胞培養腔室內的一或多個參數，諸如pH、溶解氧、總生物質、細胞直徑、葡萄糖濃度、乳酸鹽濃度及細胞代謝產物濃度。系統可使用現成的一次性使用的葡萄糖和乳酸鹽感測器進行定製，以對灌注流出液進行採樣並傳輸數據。在一些實施例中，藥筒係光學透明且可與感測模態(諸如光學密度或拉曼(Raman))對接。在一些實施例中，感測器可係可操作地耦合至廢液管線或廢液儲槽，且經組態成測量在其中流動的流體之一或多個參數。在某些態樣中，該一或多個感測器係可操作地耦合至具有用於執行指令之中央處理單元之電腦系統，使得可自動監測及調整參數。該系統可經組態成若流體滿足一特定參數，則將流體經由入口自動地再導引回至腔室中。在一些實施例中，使用用於製程管理之電腦、網路及圖形使用者界面及其他周邊裝置將儀器與控制系統架構對接以與製程設備機械對接。廢液管可具有閥，其可例如根據流體是否具有足夠營養素濃度而將流體導引至一個位置或另一個位置。以下提供關於用於使用細胞培養腔室實行本發明之方法之電腦系統之另外詳細內容。 系統架構
可使用任何類型之計算裝置(諸如電腦或可程式化邏輯控制器(PLC))來進行本文所述的本揭示內容之態樣，諸如如以上所述控制流體之移動穿過系統及監測及控制各種參數，其包括處理器，例如中央處理單元，或計算裝置之任何組合，其中各裝置執行製程或方法之至少一部分。在一些實施例中，本文所述的系統及方法可利用手持式裝置進行，例如智慧型平板電腦、智慧型手機或針對於該系統生產的專用裝置。
可使用軟體、硬體、韌體、硬接線或此等中之任何者之組合來進行本揭示內容之方法。實行功能之特徵亦可物理上位於各種位置，包括經分佈使得功能之部分在不同物理位置實行(例如成像設備在一個房間中及主機工作站在另一房間中或在獨立建築物中，例如利用無線或有線連接)。
舉例而言，適於執行電腦程式之處理器包括一般及專用微處理器及任何種類之數位電腦之任何一或多個處理器。一般而言，處理器將自唯讀記憶體或隨機存取記憶體或二者接收指令及數據。電腦之元件係用於執行指令之處理器及用於儲存指令及資料之一或多個記憶體裝置。一般而言，電腦亦將包括一或多個用於儲存資料之非暫態大量儲存裝置(例如磁碟、磁光碟或光碟)，或係可操作地耦合成自一或多個用於儲存資料之非暫態大量儲存裝置(例如磁碟、磁光碟或光碟)接收資料或向其轉移資料或兩種情況。適於體現電腦程式指令及資料之資訊載體包括非揮發性記憶體之所有形式，包括(舉例而言)半導體記憶體裝置(例如EPROM、EEPROM、固態驅動器(SSD)及快閃記憶體裝置)；磁碟(例如內部硬碟或可移磁碟)；磁光碟；及光碟(例如CD及DVD磁碟)。處理器及記憶體可由專用邏輯電路補充或併入專用邏輯電路中。
為提供與使用者之交互作用，本文所述的標的可在具有I/O裝置(例如CRT、LCD、LED或用於對使用者展現資訊之投影裝置)及輸入或輸出裝置(諸如鍵盤及指向裝置(例如滑鼠或軌跡球))之電腦上實施，藉由該輸入或輸出裝置使用者可向電腦提供輸入。其他種類之裝置亦可用於提供與使用者之互動。例如，提供至使用者之回饋可係任何形式之感覺回饋(例如視覺回饋、聽覺回饋或觸覺回饋)，及來自使用者之輸入可以任何形式(包括聽覺、語言或觸覺輸入)進行接收。
本文所述的標的可在計算系統(包括後端組件(例如資料伺服器)、中間軟體組件(例如應用伺服器)或前端組件(例如具有圖形使用者介面或網頁瀏覽器(使用者可透過其與本文所述的標的之實施互動)之客戶端電腦)、或此類後端、中間軟體及前端組件之任何組合)中實施。該系統之組件可藉由數位資料通訊之任何形式或媒體透過網路(例如通訊網路)互連。通訊網路之實例包括蜂巢網路(例如3G或4G)、區域網路(LAN)及廣域網路(WAN)，例如網際網路(Internet)。
本文所述的標的可經實施為一或多種電腦程式產品，諸如一或多種有形地體現在資訊載體中(例如體現在非暫態電腦可讀取媒體中)之電腦程式，其用於藉由資料處理設備(例如可程式化之處理器、電腦或多電腦)之操作執行或控制該操作。電腦程式(亦稱為程式、軟體、軟體應用、app (應用程式)、巨集(macro)或代碼(code))可以任何形式之程式語言(包括編譯或解譯語言(例如C、C++、Perl))寫入，且其可以任何形式部署，包括作為獨立程式或作為模組、組件、子程式(subroutine)或適用於計算環境中之其他單元。本發明之系統及方法可包括以此項技術中已知的任何適宜程式語言(包括(但不限於)C、C++、Perl、Java、ActiveX、HTML5、Visual Basic或JavaScript)寫入的指令。
電腦程式不一定與檔案對應。程式可儲存在檔案或保存其他程式或資料之檔案之一部分中，儲存在所述程式專用的單個檔案中，或儲存在多個協調檔案(例如儲存一或多個模組、子程式或代碼之部分之檔案)中。電腦程式可經部署成在一個站點處的一個電腦或多個電腦上執行或分佈在多個站點上且藉由通訊網路互連。
檔案可為數位檔案，例如，儲存在硬驅動器、SSD、CD或其他有形、非暫態媒體中。檔案可在網路上自一個裝置發送至另一裝置(例如，作為自伺服器發送至客戶端之程式包(packets)，例如透過網路介面卡、數據機(modem)、無線卡或類似者)。
根據本發明之實施例寫入檔案涉及例如藉由添加、移除或重排粒子(例如以淨電荷或偶極矩轉換成藉由讀取/寫入頭磁化之模式)轉換有形、非暫態、電腦可讀取媒體，然後該等模式代表關於使用者期望且對於使用者有用之客觀物理現象之資訊之新連語。在一些實施例中，寫入涉及有形、非暫態電腦可讀取媒體中之材料之物理轉換(例如，具有某些光學特性使得光學讀取/寫入裝置可隨後讀取新且有用之資訊連語，例如刻錄CD-ROM)。在一些實施例中，寫入檔案包括轉換物理快閃記憶體設備，諸如NAND快閃記憶體裝置，及藉由轉換由浮動閘極電晶體(floating-gate transistors)製成的記憶體單元陣列中之物理元件儲存資訊。寫入檔案之方法係此項技術中熟知的且例如可藉由程式或藉由來自軟體之保存命令(save command)或來自程式語言之寫入命令手動或自動調用。
適宜計算裝置通常包括大量記憶體、至少一個圖形使用者介面、至少一個顯示裝置，且通常包括裝置之間的通訊。大量記憶體說明一種類型之電腦可讀取媒體，亦即電腦儲存媒體。電腦儲存媒體可包括以用於儲存資訊(諸如電腦可讀取指令、資料結構、程式模組或其他資料)之任何方法或技術實施的揮發性、非揮發性、可移除及不可移除之媒體。電腦儲存媒體之實例包括RAM、ROM、EEPROM、快閃記憶體或其他記憶體技術、CD-ROM、數位通用磁碟(DVD)或其他光學儲存、磁卡式、磁帶、磁碟儲存或其他磁儲存裝置、射頻識別標籤或晶片、或可用於儲存所需資訊及可藉由計算裝置存取之任何其他媒體。
如熟習此項技術者將認識到對於進行本發明之方法而言係必需或最適宜，用於本發明之實施例中之電腦系統或機器可包括一或多個處理器(例如中央處理單元(CPU)、圖形處理單元(GPU)或二者)、主記憶體及靜態記憶體，其經由匯流排彼此通訊。
在顯示於圖12中之一個實例實施例中，系統600可包括電腦649 (例如膝上型電腦、桌上型電腦或平板電腦)。電腦649可經組態成在網路609上通訊。電腦649包括一或多個處理器659及記憶體663以及輸入/輸出機構654。在本發明之方法採用客戶端/伺服器架構之情況下，可使用伺服器613進行本發明之方法之操作，該伺服器包括處理器621及記憶體629中之一者或多者，能夠獲得資料、指令等或經由介面模組625提供結果或提供結果作為檔案617。伺服器613可透過電腦649或終端667在網路609上來連接，或伺服器613可直接連接至終端667，包括一或多個處理器675及記憶體679、以及輸入/輸出機構671。
對於I/O 649、637或671中之任何者，根據本發明之實例實施例之系統600或機器可進一步包括視頻顯示單元(例如液晶顯示器(LCD)或陰極射線管(CRT))。根據一些實施例之電腦系統或機器亦可包括文數輸入裝置(例如鍵盤)、游標控制裝置(例如滑鼠)、磁碟驅動單元、信號生成裝置(例如揚聲器)、觸控螢幕、加速計、麥克風、蜂巢射頻天線及網路介面裝置，其可為例如網路介面卡(NIC)、Wi-Fi卡或蜂巢數據機。
根據本發明之實例實施例之記憶體663、679或629可包括機器可讀取媒體，在該機器可讀取媒體上儲存體現本文所述的方法或功能中之任何一者或多者之一組或多組指令(例如軟體)。軟體在其藉由電腦系統之執行期間亦可全部或至少部分地駐留在主記憶體內及/或處理器內，該主記憶體及處理器亦構成機器可讀取媒體。軟體可經由網路介面裝置在網路上進一步發送或接收。 以引用之方式併入
在本揭示內容中，已提及及引用其他文件，諸如專利、專利申請案、專利公開案、期刊、書籍、論文、網站內容。出於所有目的，所有此類文件均以全文引用之方式併入本文中。 等效物
儘管已結合某些實施例描述本發明，但一般技術者在閱讀前述說明書之後將能夠實現對本文闡述的組合物及方法之各種改變、等效物之替換及其他變動。
110:生物反應器 120:細胞培養腔室 122:底表面 124:表面 126:入口 128:出口 132:儲槽 134:儲槽 136:入口 138:出口 140:泵 152:管件 154:管件 210:第二生物反應器 220:第二細胞培養腔室 600:系統 609:網路 613:伺服器 617:資料檔案 621:處理器 625:介面模組 629:記憶體 649:電腦 654:輸入/輸出機構 659:處理器 663:記憶體 667:終端 671:輸入/輸出機構 675:處理器 679:記憶體 820:第一細胞培養腔室 835:出口 845:入口 900:多生物反應器系統 910a:泵 910b:泵 920:第二細胞培養腔室 935:出口 940:管件 945:入口 950:平臺 980:流體儲槽 984:廢液儲槽 999:處理器
圖1顯示多生物反應器系統之一個實例。
圖2顯示生物反應器之一個實施例。
圖3顯示多生物反應器系統。
圖4顯示CAR-T/TCR工作流程。
圖5至8顯示使用不同系統之T細胞擴增之比較。
圖9至10顯示一種用於共培養新鮮培養之樹突狀細胞及PBMC或T細胞之方法及其結果。
圖11顯示一種用於形成基於細胞之免疫治療產品之方法。
圖12顯示根據一些實施例之系統架構。
820:第一細胞培養腔室
835:出口
845:入口
900:多生物反應器系統
910a:泵
910b:泵
920:第二細胞培養腔室
935:出口
940:管件
945:入口
950:平臺
980:流體儲槽
984:廢液儲槽
999:處理器

Claims (120)

  1. 一種細胞培養系統，其包含： 經組態成接收包含細胞培養介質之流體儲槽之第一區域； 經組態成接收廢液儲槽之第二區域； 一或多個可流體連接至該流體儲槽之泵；及 經組態成接收及保持不同形狀及/或尺寸之細胞培養腔室之基板。
  2. 如請求項1之細胞培養系統，其中該基板包含在該基板中的複數個不同開口，其係經配置使得該基板經組態成接收及保持不同形狀及/或尺寸之細胞培養腔室。
  3. 如請求項1之細胞培養系統，其中該基板係經組態成同時接收及保持多個細胞培養腔室。
  4. 如請求項1之細胞培養系統，其進一步包含定位於第一區域中之流體儲槽及定位在廢液區域中之廢液儲槽。
  5. 如請求項4之細胞培養系統，其進一步包含自流體儲槽流體連接至該一或多個泵、自該一或多個泵流體連接至該等細胞培養腔室及自該等細胞培養腔室流體連接至該廢液儲槽之一或多個管。
  6. 如請求項1之細胞培養系統，其中該基板之第一部分係經組態成接收第一尺寸之第一細胞培養腔室及該基板之第二部分係經組態成接收不同於第一尺寸之第二尺寸之第二細胞培養腔室。
  7. 如請求項1之細胞培養系統，其中該基板之第一部分係經組態為接收第一形狀之第一細胞培養腔室及該基板之第二部分係經組態為接收不同於第一形狀之第二形狀之第二細胞培養腔室。
  8. 如請求項1之細胞培養系統，其中該基板之第一部分係經組態為接收第一尺寸及形狀之第一細胞培養腔室及該基板之第二部分係經組態為接收不同於第一尺寸及形狀之第二尺寸及形狀之第二細胞培養腔室。
  9. 如請求項1之細胞培養系統，其中各細胞培養腔室係流體耦合至個別泵。
  10. 如請求項1之細胞培養系統，其進一步包含可操作地連接至該一或多個泵之處理器及一或多個可操作以測量該細胞培養系統中之流體之特性之感測器，其中該處理器基於所測量的特性來操作該一或多個泵。
  11. 一種用於培養細胞之方法，該方法包括： 提供細胞培養系統，其包含經組態成接收包含細胞培養介質之流體儲槽之第一區域、經組態成接收廢液儲槽之第二區域、可流體連接至該流體儲槽之一或多個泵、及經組態為接收及保持不同形狀及/或尺寸之細胞培養腔室之基板； 將該流體儲槽裝載於第一區域中及將該廢液儲槽裝載於第二區域中； 將第一尺寸及/或形狀之第一細胞培養腔室裝載於該基板之第一部分上； 將第二尺寸及/或形狀之第二細胞培養腔室裝載於該基板之第二部分上； 用管件連接該流體儲槽、該一或多個泵、該等第一及第二細胞培養腔室及該廢液儲槽；及 操作該系統以在該等第一及第二細胞培養腔室中培養細胞。
  12. 如請求項11之方法，其中該基板包含在該基板中之複數個不同開口，其係經配置使得該基板經組態成接收及保持不同形狀及/或尺寸之細胞培養腔室。
  13. 如請求項11之方法，其中該第一細胞培養腔室具有第一尺寸及該第二細胞培養腔室具有第二尺寸。
  14. 如請求項11之方法，其中該第一細胞培養腔室具有第一形狀及該第二細胞培養腔室具有第二形狀。
  15. 如請求項11之方法，其中該第一細胞培養腔室具有第一尺寸及形狀及該第二細胞培養腔室具有第二尺寸及形狀。
  16. 如請求項11之方法，其中該等第一及第二細胞培養腔室中之各者係流體耦合至個別泵。
  17. 如請求項11之方法，其中該細胞培養系統進一步包含可操作地連接至該一或多個泵之處理器及一或多個可操作以測量該細胞培養系統中之流體之特性之感測器，其中該處理器基於所測量的特性來操作該一或多個泵。
  18. 如請求項11之方法，其中在該等第一細胞培養腔室及第二細胞培養腔室中完成細胞培養後，收集在該等第一細胞培養腔室及第二細胞培養腔室各者中之經培養之細胞。
  19. 如請求項18之方法，其中在該等第一及第二細胞培養腔室各者中之經培養之細胞係收集在相同收集容器中。
  20. 如請求項18之方法，其中在該等第一及第二細胞培養腔室各者中之經培養之細胞係收集在不同收集容器中。
  21. 一種用於產生經轉導之T細胞之方法，該方法包含： 提供包含第一及第二培養腔室之細胞培養儀器； 使包含T細胞之懸浮液流動進入該第一培養腔室中； 灌注在該第一培養腔室中之T細胞以產生在該第一培養腔室中擴增之經轉導之T細胞； 使經轉導且經擴增之T細胞自該第一培養腔室流動進入該第二培養腔室中；及 使細胞培養介質流動進入該第二培養腔室中以進一步擴增該等經轉導且經擴增之T細胞，其中該方法係以封閉方式在單個儀器上進行使得在整個方法中保持無菌。
  22. 如請求項21之方法，其中該第二培養腔室係大於該第一培養腔室。
  23. 如請求項21之方法，其中該等第一及第二培養腔室係由聚苯乙烯製成。
  24. 如請求項21之方法，其中該等第一及第二培養腔室係經由無菌管連接。
  25. 如請求項21之方法，其中該第一培養腔室進一步包含活化試劑及/或細胞轉導試劑。
  26. 如請求項25之方法，其中該細胞轉導試劑包含表現CAR或TCR之非活性病毒。
  27. 如請求項21之方法，其中該細胞培養介質係提供在無菌容器中且係藉由無菌管焊接連接至該封閉系統。
  28. 如請求項21之方法，其中使該細胞培養介質流動進入該第一培養腔室中包含消除該第一培養腔室中之頂隙。
  29. 如請求項21之方法，其進一步包含活化該第一培養腔室中之T細胞。
  30. 如請求項29之方法，其中活化包含與包含抗體之試劑接觸。
  31. 如請求項30之方法，其中該抗體係附著於珠子。
  32. 如請求項21之方法，其進一步包含： 自該第二培養腔室排乾流體； 用緩衝液洗滌該等經轉導且經擴增之T細胞；及 使冷凍保存介質流動進入該第二培養腔室中以再懸浮該等經轉導且經擴增之T細胞。
  33. 如請求項21之方法，其進一步包含以封閉方式使該等經轉導且經擴增之T細胞流動進入收穫容器中。
  34. 如請求項21之方法，其中各個流動步驟係經由無菌管完成。
  35. 如請求項34之方法，其中該等無菌管係藉由無菌管焊接連接。
  36. 如請求項21之方法，其中該細胞培養介質包含具有介白素-2之Aim V。
  37. 一種用於產生新抗原轉導T細胞之方法，該方法包含： 提供包含第一及第二培養腔室之細胞培養儀器； 使含有單核細胞之細胞培養介質流動進入該第一培養腔室中； 灌注該第一培養腔室中之經純化之單核細胞以在該第一培養腔室中產生樹突狀細胞； 使該等樹突狀細胞與抗原材料在該第一培養腔室中接觸以產生成熟樹突狀細胞； 使包含T細胞之細胞懸浮液流動進入該第一培養腔室中以共培養該等成熟樹突狀細胞及T細胞，以由此產生經擴增之靶向新抗原之T細胞； 其中該方法係以封閉方式在單個儀器上進行使得在整個方法中保持無菌。
  38. 如請求項37之方法，其進一步包含： 在該第二培養腔室中產生第二批成熟樹突狀細胞；及 將該等經擴增之T細胞自該第一培養腔室引入該第二培養腔室中以與該第二批成熟樹突狀細胞共培養該等經擴增之T細胞。
  39. 如請求項38之方法，其中該第二批成熟樹突狀細胞已經與來自該第一培養腔室之成熟樹突狀細胞不同之肽組刺激。
  40. 如請求項38之方法，其進一步包含： 將已與該第二批成熟樹突狀細胞共培養之該等經擴增之T細胞轉移回至該第一培養腔室，其中該第一培養腔室包含第三批成熟樹突狀細胞。
  41. 如請求項37之方法，其中該抗原材料包含腫瘤特異性肽。
  42. 如請求項37之方法，其中該等第一及第二培養腔室係由聚苯乙烯製成。
  43. 如請求項37之方法，其中該等第一及第二培養腔室係經由無菌管連接。
  44. 如請求項37之方法，其中該細胞培養介質係提供在無菌容器中且藉由無菌管焊接連接至該封閉系統。
  45. 如請求項37之方法，其中使該細胞培養介質流動進入該第一培養腔室中包含消除該第一培養腔室中之頂隙。
  46. 如請求項37之方法，其進一步包含： 自該第一培養腔室排乾流體； 利用緩衝液洗滌該等新抗原轉導T細胞；及 使冷凍保存介質流動進入該第一培養腔室中以再懸浮該等新抗原轉導T細胞。
  47. 如請求項37之方法，其進一步包含以封閉方式使該等新抗原轉導T細胞流動進入收穫容器中。
  48. 如請求項37之方法，其中各個流動步驟係經由無菌管完成。
  49. 如請求項48之方法，其中該等無菌管係藉由無菌管焊接連接。
  50. 一種用於以並行方式產生樹突狀細胞及刺激T細胞之方法，該方法包含： 提供包含第一及第二培養腔室之細胞培養儀器； 使包含單核細胞之細胞培養介質流動進入該第一培養腔室中； 灌注該第一培養腔室中之單核細胞以在該第一培養腔室中產生樹突狀細胞； 使包含T細胞之細胞懸浮液流動進入該第一培養腔室中以共培養該等樹突狀細胞及T細胞，以由此產生經活化之經擴增T細胞；及 使該等經活化之經擴增T細胞自該第一培養腔室流動進入包含自第二個別批單核細胞產生的樹突狀細胞之該第二培養腔室中以進一步培養該等T細胞。
  51. 如請求項50之方法，其中在整個方法中保持無菌。
  52. 如請求項50之方法，其中該方法進一步包含藉由使該等經培養之T細胞流動進入收集容器中而自該第一培養腔室收集該等經培養之T細胞。
  53. 如請求項50之方法，其進一步包含藉由使該等樹突狀細胞與抗原材料接觸來使該第一培養腔室中之樹突狀細胞成熟。
  54. 如請求項53之方法，其中該抗原材料包含腫瘤特異性肽。
  55. 如請求項50之方法，其中該等第一及第二培養腔室係由聚苯乙烯製成。
  56. 如請求項50之方法，其中該等第一及第二培養腔室係經由無菌管連接。
  57. 如請求項50之方法，其中該細胞培養介質係提供在無菌容器中且藉由無菌管焊接連接至該封閉系統。
  58. 如請求項50之方法，其中使該細胞培養介質流動進入該第一培養腔室中包含消除該第一培養腔室中之頂隙。
  59. 如請求項50之方法，其進一步包含活化該第二培養腔室中之T細胞。
  60. 如請求項59之方法，其中活化包含與包含抗體之試劑接觸。
  61. 如請求項50之方法，其進一步包含利用緩衝液洗滌該等經刺激之T細胞。
  62. 如請求項61之方法，其進一步包含將該等經刺激之T細胞轉移至冷凍保存介質。
  63. 如請求項50之方法，其進一步包含以封閉方式使該等新抗原轉導T細胞流動進入收穫容器中。
  64. 如請求項50之方法，其中各個流動步驟係經由無菌管完成。
  65. 如請求項64之方法，其中該等無菌管係藉由無菌管焊接連接。
  66. 如請求項50之方法，其中替換來自該細胞培養儀器之該等第一及第二細胞培養腔室中之任一者或二者且重複該方法。
  67. 一種細胞培養腔室，其中頂部、底部及兩個側壁包含不透氣材料。
  68. 如請求項67之細胞培養腔室，其中該不透氣材料亦為細胞所黏附之材料。
  69. 如請求項68之細胞培養腔室，其中該不透氣材料包含聚苯乙烯。
  70. 如請求項67之細胞培養腔室，其中該細胞培養腔室進一步包含入口。
  71. 如請求項70之細胞培養腔室，其中該細胞培養腔室進一步包含出口。
  72. 如請求項71之細胞培養腔室，其中該入口及該出口係位於該細胞培養腔室之頂部。
  73. 如請求項72之細胞培養腔室，其中該入口及該出口各自經組態成與管件流體地且可密封地耦合。
  74. 如請求項67之細胞培養腔室，其中該細胞培養腔室係一體形成。
  75. 如請求項67之細胞培養腔室，其中該細胞培養腔室係經定尺寸且經組態以裝於培養箱內。
  76. 如請求項67之細胞培養腔室，其中該細胞培養腔室係經定尺寸且經組態以耦合至細胞培養儀器之基板。
  77. 一種用於培養細胞之方法，該方法包括： 提供包含入口及出口之細胞培養腔室，其中頂部、底部及兩個側壁包含不透氣材料； 將細胞裝載於該細胞培養腔室中；及 使細胞培養介質經由該入口流動進入該細胞培養腔室中以在該培養腔室中培養細胞並經由該出口流出該細胞培養腔室，其中該細胞培養介質經由該入口及該出口流動穿過該細胞培養腔室導致細胞培養介質連續流動穿過該細胞培養腔室且允許在該細胞培養腔室中之細胞與該細胞培養介質之間發生氣體交換。
  78. 如請求項77之方法，其中該不透氣材料亦為細胞所黏附之材料。
  79. 如請求項78之方法，其中該不透氣材料包含聚苯乙烯。
  80. 如請求項77之方法，其中該入口及該出口係位於該細胞培養腔室之頂部。
  81. 如請求項80之方法，其中該入口及該出口係與管件流體地且可密封地耦合。
  82. 如請求項77之方法，其中該細胞培養腔室係一體形成。
  83. 如請求項77之方法，其中該細胞培養腔室係經定尺寸且經組態以裝於培養箱內。
  84. 如請求項77之方法，其中該細胞培養腔室係經定尺寸且經組態以耦合至細胞培養儀器之基板。
  85. 如請求項81之方法，其中該管件為高滲透性管件。
  86. 如請求項85之方法，其中該細胞培養介質當處於高滲透性管件中時交換氣體。
  87. 一種用於培養細胞之方法，該方法包括： 藉由使細胞培養介質流動穿過細胞培養儀器上之細胞培養腔室而在該細胞培養腔室中培養細胞，其中在細胞培養製程期間使已經流動穿過該細胞培養腔室的該細胞培養介質之一部分再循環回至該細胞培養腔室中。
  88. 如請求項87之方法，其進一步包含在再循環之前測量經使用的介質之一或多個參數。
  89. 如請求項88之方法，其中該一或多個參數中之至少一者包含經使用的介質中一或多種化合物之濃度。
  90. 如請求項89之方法，其中該一或多種化合物包含葡萄糖、乳酸鹽、溶解氧或細胞代謝產物。
  91. 如請求項88之方法，其中該參數包含pH。
  92. 如請求項88之方法，其進一步包含使用可操作地連接至該細胞培養腔室之處理器確定在再循環步驟之前經使用的介質之一或多個參數中之至少一者是否滿足預定閾值。
  93. 如請求項88之方法，其中該測量步驟係藉由一或多個與該細胞培養腔室可操作地相關聯之感測器進行。
  94. 如請求項93之方法，其中該一或多個感測器係與和該細胞培養腔室流體連通之廢液儲槽可操作地相關聯。
  95. 如請求項94之方法，其中該再循環步驟包含將經使用介質之該部分自該廢液儲槽再導引回至該細胞培養腔室中。
  96. 如請求項87之方法，其進一步包含將經使用介質之該部分與一推注量之新製介質組合。
  97. 如請求項87之方法，其中該細胞培養腔室係可操作地連接至一或多個泵。
  98. 如請求項87之方法，其中該細胞培養腔室包含入口及出口。
  99. 一種用於培養細胞之方法，該方法包括： 提供包含細胞之細胞培養腔室； 使細胞培養介質流動進入該細胞培養腔室中； 自該細胞培養腔室移出經使用的細胞培養介質； 評估該經使用的細胞培養介質之參數；及 若該參數滿足預定閾值，則將該經使用的細胞培養介質返送至該細胞培養腔室。
  100. 如請求項99之方法，其進一步包含在該返送步驟之前將該經使用的細胞培養介質與一推注量的新製細胞培養介質組合。
  101. 如請求項99之方法，其中該評估步驟包含使用可操作地耦合至該細胞培養腔室之感測器來測量參數。
  102. 如請求項99之方法，其中該評估步驟包含使用處理器來確定該參數是否滿足預定閾值。
  103. 如請求項102之方法，其中該參數包含該經使用的細胞培養介質中一或多種化合物之測量濃度。
  104. 如請求項103之方法，其中該一或多種化合物包含葡萄糖、乳酸鹽或細胞代謝產物。
  105. 如請求項99之方法，其中該返送步驟包含將該經使用的細胞培養介質自廢液儲槽再導引至該細胞培養腔室中。
  106. 如請求項99之方法，其進一步包含： 若該參數不滿足預定閾值，則丟棄該經使用的細胞培養介質；及 使新製細胞培養介質流動進入該細胞培養腔室中。
  107. 一種細胞培養系統，該系統包含： 以第一擱板在第二擱板之頂部上堆疊之複數個擱板，該等第一及第二擱板中之各者經組態成接收流體儲槽； 至少一個泵； 可操作地耦合至該至少一個泵之處理器；及 經定尺寸及經組態成同時容納複數個細胞培養腔室之基板。
  108. 如請求項107之系統，其中該系統包含至少一個感測器。
  109. 如請求項108之系統，其中該處理器係可連接至至少一個感測器且係經組態成基於藉由該感測器測量的特性來操作該至少一個泵。
  110. 如請求項107之系統，其中該基板係經組態成接收不同尺寸及/或形狀之細胞培養腔室。
  111. 如請求項107之系統，其中該至少一個泵為複數個泵。
  112. 如請求項111之系統，其進一步包含複數個管，其自該第一擱板上的第一流體儲槽流體地連接至該等複數個泵，自該等複數個泵流體地連接至複數個細胞培養腔室，及自該等複數個細胞培養腔室流體地連接至該第二擱板上的第二流體儲槽。
  113. 如請求項107之系統，其中該等第一及第二擱板中之各者包含將該流體儲槽保持在該等第一及第二擱板中之各者上之保持機構。
  114. 如請求項107之系統，其中該系統係經尺寸調整以插入至培養箱中。
  115. 如請求項107之系統，其中該處理器係經組態成接收且執行用於培養一細胞類型之指令。
  116. 如請求項107之系統，其中該處理器係經組態成接收且執行用於轉導T細胞之指令。
  117. 一種細胞培養方法，該方法包含： 提供細胞培養系統，該細胞培養系統包含以第一擱板在第二擱板之頂部上堆疊之複數個擱板，該等第一及第二擱板中之各者經組態成接收流體儲槽；至少一個泵；可操作地耦合至該至少一個泵之處理器；及經定尺寸及經組態成同時容納複數個細胞培養腔室之基板； 將第一流體儲槽裝載於該第一擱板上； 將第二流體儲槽裝載於該第二擱板上； 將第一細胞培養腔室及第二細胞培養腔室裝載於該基板上； 利用管件連接該等第一及第二流體儲槽、該至少一個泵及該等第一及第二細胞培養腔室；及 操作該系統以在該等第一及第二細胞培養腔室內部培養細胞。
  118. 如請求項117之方法，其中該等第一及第二細胞培養腔室包含不同尺寸或形狀。
  119. 如請求項117之方法，其中該系統包含至少一個感測器。
  120. 如請求項119之方法，其中該處理器係連接至至少一個感測器且係經組態成基於藉由該感測器測量的特性來操作該泵。
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