JP6249816B2 - 細胞培養装置、細胞培養システム、及び細胞培養方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞培養装置、細胞培養システム、及び細胞培養方法に関する。
細胞培養装置として、ポンプ（送液手段）で培養液を送液して循環させつつ、細胞を培養する細胞培養装置が知られている。また、気体チャンバー（エアダンパー）を設けて、ポンプ（送液手段）の脈動を吸収する細胞培養装置がある（例えば、特許文献１）。
ところで、培養液を送液しながら細胞の培養を行う細胞培装置では、長時間に亘って培養液を送液する必要がある。このため、シリンジポンプ等の一定容量のポンプを用いて送液を行う場合、大容量のシリンジポンプが必要となる。このような大容量のシリンジポンプは大型となるため、顕微鏡のステージに載らず、定期的に細胞の培養状態を観察するのが困難となっている。また、装置が大型になれば可搬性が悪くなるため、培養液の送液には小型のチュービングポンプ等が適している。
ここで、チュービングポンプは、その構造上、脈動が避けられず、培養液の流量を一定にできない問題がある。また、本発明者は、実験を重ねた結果、脈動を抑制して培養液の流量を一定の範囲内で維持すれば、細胞の死滅を回避できることを確認した。
ここで、特許文献１のように、気体チャンバーを設けた場合であっても、ポンプ（送液手段）の脈動を十分に吸収できず、培養液の圧力が変動して流量のばらつきを抑制できないことがある。すなわち、温度変化によって気体チャンバーの体積が変動すれば、エアダンパーとしての弾性率が変動するため、一定の脈動抑制機能を維持するのが困難となる。また、温度が上昇すれば気体チャンバー内の空気が膨張し、培養液中に気泡が混入する虞がある。そして、上記の問題を回避するために気体チャンバーの容量を大容量とすれば、装置が大型になってしまう。このため、ポンプの脈動を抑制できる小型の細胞培養装置が望まれている。
一方、細部の培養に用いられる培養液は、ｐＨ調整や細胞毒性等の理由により、一般的に炭酸系のバッファ成分を含んでいる。このため、温度変化等で培養液中に炭酸ガス等の気泡が発生しやすくなり、この気泡が細胞の死滅の原因となるので、気泡の発生を抑制する必要がある。本発明者は、以上の検討を行い、ポンプの脈動を抑制すると共に、気泡の発生を低減できる細胞培養装置が必要であることを見出し、本発明に至った。
本発明は、上記事実を考慮し、培養液の圧力の変動を抑制し、且つ細胞培養部へ気泡が流入するのを抑制できる細胞培養装置、細胞培養システム、及び細胞培養方法を提供することを課題とする。
本発明の第１態様に係る細胞培養装置は、細胞を培養する細胞培養部と、培養液を貯蔵する貯蔵部と、前記細胞培養部と前記貯蔵部とを接続する流路と、前記流路に設けられ、前記貯蔵部から前記細胞培養部へ前記培養液を送液する送液手段と、前記流路に設けられ、前記細胞培養部へ送液される前記培養液にかかる圧力の変動を抑制する圧力均一化手段と、前記細胞培養部の流出口側の前記流路に設けられ、前記培養液へ所定の圧力を加える加圧手段と、を有する。
上記の発明によれば、培養液が送液手段により流路を通じて貯蔵部から細胞培養部へ送液される。ここで、流路には圧力均一化手段が設けられており、細胞培養部へ送液される培養液にかかる圧力が変動するのを抑制する。これにより、培養液の脈動が抑えられ、流量のばらつきを抑制できる。
また、細胞培養部の流出口側の流路には、加圧手段が設けられている。そして、加圧手段が培養液へ所定の圧力を加えることで、培養液中の気体が気泡となるのを抑制し、気泡が原因とされる細胞の死滅を回避できる。このため、例えば、培養液の温度が変化しても気泡の発生を抑制できる。また、培養液へ圧力を加えることで、培養液中の気泡を溶解させることができる。さらに、培養液へ圧力を加えれば、圧力均一化手段だけを配置した場合と比べて、より脈動を低減できる。
また、送液手段が送液する培養液の流量を変化させた場合であっても、圧力均一化手段及び加圧手段によって脈動が抑制されているので、急激に培養液の流量が変動することなく、培養液の流量を微調整できる。これにより、細胞の培養に適した流量で培養液を送液できる。以上のように、圧力均一化手段を備え、さらに細胞培養部の流出口側の流路に加圧手段を配置すれば、実用的な細胞培養装置を得ることができる。
本発明の第２態様に係る細胞培養装置は、第１態様に係る発明おいて、前記圧力均一化手段は、前記培養液が充填される流体室と、前記流体室に形成され、前記流路と接続される流入口及び流出口と、前記流体室の内壁の一部を構成すると共に、前記流体室の圧力の変動に応じて撓む可撓性膜と、を有する。
上記の発明によれば、脈動に合わせて可撓性膜が撓むことで、流体室の容積が増減して流体室の圧力の変動を低減できる。また、気体チャンバーを用いて圧力変動を抑制する場合、温度変化に応じて気体チャンバーの容積が変動してしまい、培養液の流量が安定しない。本発明の圧力均一化手段では、可撓性膜を用いることで、温度が変化しても流体室の容積が増減せず、培養液の流量を安定させることができる。
本発明の第３態様に係る細胞培養装置は、第２態様に係る発明において、前記流入口及び前記流出口は、前記流体室の対向する端部に形成され、前記流体室は、前記端部から中央部に向かって徐々に広幅に形成されている。
上記の発明によれば、流体室に培養液を充填する際に、気泡を巻き込むのを抑制し、気泡が原因とされる細胞の死滅を回避できる。
本発明の第４態様に係る細胞培養装置は、第３態様に係る細胞培養装置において、前記流体室は、平面視で、角が丸められたひし形状である。
上記の発明によれば、ひし形状の角部に気泡が入り込んで残留するのを抑制できる。
本発明の第５態様に係る細胞培養装置は、第１態様〜第４態様に係る細胞培養装置において、前記加圧手段は、前記流路に接続され、前記流路より断面積が小さい加圧部と、前記加圧部の壁面の一部を構成し、前記加圧部へ流入した前記培養液の圧力により弾性変形する弾性膜と、を有する。
上記の発明によれば、加圧部に培養液を流入させるだけで培養液圧力を加えることができる。このとき、培養液が所定以上の圧力になれば、気泡が培養液中に溶解し、細胞の死滅を回避できる。また、例えば、狭幅の管体を接続して加圧する場合、管体に細胞が詰まって流路の圧力が変動する虞がある。これに対して、加圧部の壁面の一部を弾性膜とすれば、弾性膜が弾性変形して流路の幅を広げることができるので、細胞が詰まるのを抑制できる。
本発明の第６態様に係る細胞培養装置は、第１態様〜第５態様に係る発明において、前記細胞培養部の流入口側の前記流路には、気泡を除去する気泡除去手段が設けられている。
上記の発明によれば、細胞培養部へ流入する前に培養液中の気泡を気泡除去手段で除去できるので、細胞培養部に気泡が流入して細胞が死滅するのを回避できる。
本発明の第７態様に係る細胞培養装置は、第１態様〜第６態様に係る発明において、前記圧力均一化手段を複数備えている。
上記の発明によれば、圧力均一化手段を１つしか備えていない場合と比べて、培養液の圧力の変動を抑制できる。また、培養液の流量をより細かく設定できる。
本発明の第８態様に係る細胞培養システムは、請求項１〜７の何れか１項に記載の細胞培養装置と、前記細胞培養装置を格納する恒温器と、を有する。
上記の発明によれば、細胞培養装置全体を恒温器に格納することで、細胞の培養に適した温度で細胞を培養できる。また、環境温度の変化による気泡の発生を抑制できる。なお、細胞培養システムには、細胞培養部に生着した細胞を観察するための顕微鏡等の観察手段を含んでもよい。
本発明の第９態様に係る細胞培養方法は、請求項１〜７の何れか１項に記載の細胞培養装置を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、前記細部培養部、前記貯蔵部、及び前記圧力均一化手段の少なくとも１つに細胞を添加する工程と、前記加圧手段で前記流路中の前記培養液を加圧しつつ、前記送液手段で前記流路中の前記培養液を循環させる工程と、を有する。
上記の発明によれば、細胞添加工程で細部培養部、貯蔵部、及び圧力均一化手段の少なくとも１つに細部を添加する。添加する細胞は特に限定しないが、例えば多能性細胞である。細部を添加することにより、細胞から分泌された分泌物が培養液に流されて細胞培養部へ流入し、細胞の培養を促進できる。また、循環工程で培養液を循環させることで、分泌物を含む培養液を繰り返し細胞培養部へ送液できる。
本発明は、上記の構成としたので、培養液の圧力の変動を抑制し、且つ細胞培養部へ気泡が流入するのを抑制できる細胞培養装置、細胞培養システム、及び細胞培養方法を提供できる。
（第１実施形態）
図を参照しながら、本発明の第１実施形態に係る細胞培養装置１０を備えた細胞培養システム１００について説明する。本実施形態に係る細胞培養システム１００は、主に多能性細胞を培養するものであるが、これに限らず、他の細胞を培養する装置として用いてもよい。なお、ここでいう多能性細胞とは、複数の種類の細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。例えば、多能性細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）、及び体性幹細胞を含むがこれらに限定されない。また、多能性細胞は、種々の生物に由来するものであってよい。好ましくは、ヒトを含む哺乳類動物由来の多能性細胞であり、より好ましくは、マウス由来の多能性細胞や霊長類由来の多能性細胞である。特に好ましくは、ヒト由来の多能性細胞である。
図を参照しながら、本発明の第１実施形態に係る細胞培養装置１０を備えた細胞培養システム１００について説明する。本実施形態に係る細胞培養システム１００は、主に多能性細胞を培養するものであるが、これに限らず、他の細胞を培養する装置として用いてもよい。なお、ここでいう多能性細胞とは、複数の種類の細胞に分化する能力を有する細胞を意味する。例えば、多能性細胞は、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）、及び体性幹細胞を含むがこれらに限定されない。また、多能性細胞は、種々の生物に由来するものであってよい。好ましくは、ヒトを含む哺乳類動物由来の多能性細胞であり、より好ましくは、マウス由来の多能性細胞や霊長類由来の多能性細胞である。特に好ましくは、ヒト由来の多能性細胞である。
多能性細胞の中でも、特に胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、近い将来に再生医療への利用が見込まれている。ここで、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）とは、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。また、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）とは、特定の初期化因子を、ＤＮＡ又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる幹細胞である。特に、ＥＳ細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である。
図１に示すように、本実施形態に係る細胞培養システム１００は、恒温器としてのインキュベーター１０２と、インキュベーター１０２に格納された細胞培養装置１０とを備えている。インキュベーター１０２は、細胞培養装置１０が格納できる大きさであればよく、内部温度を所定の温度に維持している。なお、本実施形態では、人の体温に近い温度で細胞の培養を行えるよう、インキュベーター１０２内を３７度に維持しているが、これに限らず、細胞の培養に適した温度に維持すればよい。またインキュベーター１０２としては、ＣＯ２インキュベーター１０２を用いるのが好ましい。
細胞培養装置１０は、主として、細胞培養部１２、リザーバ（貯蔵部）１４、循環ポンプ（送液手段）１６、圧力均一化機構（圧力均一化手段）１８、エアトラップ（気泡除去手段）２０、加圧機構（加圧手段）２２を備えている。そして、各部にはチューブ２４Ａ〜２４Ｆが接続されて循環流路２６を構成している。なお、本実施形態では、細胞培養部１２に形成された６つのチャネルのうち、２つのチャネルを用いて培養を行っている。このため、循環ポンプ１６、圧力均一化機構１８、エアトラップ２０、及び加圧機構２２が２つずつ設けられているが、これに限らず、使用するチャネルの数に応じて、さらに多くの循環流路２６を設けてもよい。また、１つの循環ポンプ１６に複数のチューブ２４を接続してもよい。
以下、本実施形態に係る細胞培養装置１０を構成する各部について説明する。リザーバ１４は、図１の下側に設けられており、リザーバ１４の中には、培養液が貯蔵される。また、本実施形態では、１つのリザーバ１４に対して２つの循環ポンプ１６が接続されているが、これに限らず、それぞれの循環ポンプ１６に対して独立してリザーバ１４を設けても良い。
ここで、リザーバ１４に貯蔵する培養液は、培養する細胞に応じて適切な培養液を選択することができる。例えば、ＥＳ細胞を培養するための培養液としては、０．１ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、２ｍＭのＬ−グルタミン酸、２０％のＫＳＲ、及び４ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを補充したＤＭＥＭ／Ｆ−１２培養液が使用される。また、ｉＰＳ細胞誘導のための培養液としては、１０〜１５％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はＤＭＥ培養液が用いられる。また、市販の培養液（マウスＥＳ細胞培養用培養液、霊長類ＥＳ細胞培養用培養液、無血清培地などが含まれる。
リザーバ１４には、チューブ２４Ａを介して送液手段としての循環ポンプ１６が接続されている。循環ポンプ１６としては、様々な送液ポンプを利用することができるが、低流量で小型のポンプが好ましい。本実施形態では、一例として、ペリスタルティック方式のチュービングポンプを用いているが、これに限らず、他のポンプを用いてもよい。また、本実施形態では、平均流量が０．７５μｌ／ｍｉｎ以下の流量で培養液を送液している。
循環ポンプ１６は、リザーバ１４からチューブ２４Ａを通じて培養液を吸い上げ、チューブ２４Ｂへ送液する。これにより、チューブ２４Ｂが接続された圧力均一化機構１８内の培養液が押し出され、チューブ２４Ｃを通じてエアトラップ２０へ送液される。これと同様にして、培養液は、チューブ２４Ｄを通じて細胞培養部１２へ送液され、さらにチューブ２４Ｅを通じてリザーバ１４へ送液される。このようにして、培養液は層流として細胞培養装置１０を循環する。なお、ここでいう層流とは、流体の流線が壁面と平行であることを意味し、乱流ではない流れ場を意味する。好ましくは、層流は、壁に近づくほど流速は小さくなり、一定以上壁面から離れることで流速が均一となる流れ場である。
循環ポンプ１６には、チューブ２４Ｂを介して圧力均一化手段としての圧力均一化機構１８が接続されている。圧力均一化機構１８は、図２（Ａ）に示すように、主として、上ブロック４０、下ブロック４２、及び可撓性膜４４を備えており、可撓性膜４４を上ブロック４０と下ブロック４２で挟んで形成されている。上ブロック４０及び下ブロック４２は、樹脂製のブロックであり、上ブロック４０には、上ブロック４０の下面を凹ませて流体室４６が形成されている。
流体室４６は、培養液が充填される空間であり、流体室４６の長手方向の一端部には、上ブロック４０の上面へ貫通して流入口４０Ａが形成されており、この流入口４０Ａにチューブ２４Ｂが接続されている。また、流体室４６の長手方向の他端部には、上ブロック４０の上面へ貫通して流出口４０Ｂが形成されており、チューブ２４Ｃが接続されている。
ここで、流体室４６は、図２（Ｂ）に示すように、平面視で、角が丸められたひし形状に形成されている。これにより、流入口４０Ａから流出口４０Ｂへ培養液を流して充填する際に、流体室４６中に空気（気泡）が残留するのを抑制できる。また、本実施形態では、ひし形状の鋭角となる位置に流入口４０Ａ及び流出口４０Ｂを形成することで、流体室４６の幅が流入口４０Ａから流体室４６の中央部へ向かって徐々に広くなるようにして、培養液を充填する際に気泡を巻き込みにくくしている。鋭角の角度θは、好ましくは９０度〜５度、より好ましくは６０度〜８度、特に好ましくは３０度〜１０度である。なお、流体室４６の隅は、必ずしも丸める必要がなく、また、ひし形状でなくてもよい。
図２（Ａ）に示すように、上ブロック４０の下面には、可撓性膜４４が接着されており、流体室４６の内壁の一部を構成している。可撓性膜４４の材質としては、流体室４６の容積を十分に変化できる程度に撓むものであれば特に限定せず、例えば、可撓性樹脂や、ゴム等の弾性体でもよく、可撓性を有する金属でもよい。なお、培養液と反応しない材質で形成することは勿論である。
ここで、循環ポンプ１６の脈動などにより、流体室４６の圧力が高くなった場合、図３に示すように、可撓性膜４４が下方に撓んで流体室４６の容積を大きくする。これにより、流体室４６の圧力を降下させて循環流路２６の圧力の変動を抑制できる。また、逆に、流体室４６の圧力が低くなった場合、可撓性膜４４が上方に撓んで流体室４６の容積を小さくする。これにより、流体室４６の圧力を上昇させて循環流路２６の圧力の変動を抑制できる。以上のようにして、流体室４６の圧力の変動に応じて可撓性膜４４が撓むことで、圧力を均一にできる。
なお、本実施形態では、上ブロック４０の上面に流入口４０Ａ及び流出口４０Ｂを形成し、培養液を流体室４６に対して垂直方向から流入したが、これに限らず、上ブロック４０の両側面に流入口４０Ａ及び流出口４０Ｂを形成し、水平方向から流体室４６へ培養液を流入させてもよい。
図１に示すように、圧力均一化機構１８には、チューブ２４Ｃを介して気泡除去手段としてのエアトラップ２０が接続されている。エアトラップ２０は、図４に示すように、トラップ本体４８を備えており、トラップ本体４８の上面には、チューブ２４Ｃ及びチューブ２４Ｄが接続されている。また、トラップ本体４８の内部には、チューブ２４Ｃとチューブ２４Ｄとを結ぶ流路４８Ａが形成されている。
ここで、流路４８Ａの中央部には、流路４８Ａの幅を広げてトラップ部４８Ｂが形成されている。トラップ部４８Ｂの大きさは、培養液の流量や気泡の発生度合に応じて適切な寸法に形成されている。これにより、流路４８Ａを流れている培養液中に気泡Ｏが発生した場合、トラップ部４８Ｂを通過する間に上方へ浮き上がり、壁面に遮られて気泡Ｏがトラップされる。トラップされた気泡Ｏは、トラップ本体４８に形成されたベント用の配管（不図示）を開くことで排気してもよいが、加圧機構２２による加圧により除去してもよい。
図１に示すように、エアトラップ２０には、チューブ２４Ｄを介して細胞培養部１２が接続されている。細胞培養部１２は、細胞の培養が行われる平面視で略矩形状の部材であり、図５に示すように、樹脂プレート３０、ポリメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）層３２、及びガラス板３４を備えており、これらを上から順番に重ねて形成されている。また、ガラス板３４の下方に下クランプ３８を配置した状態で、樹脂プレート３０の上方から上クランプ３６を当てて、上クランプ３６と下クランプ３８とで、樹脂プレート３０、ＰＤＭＳ層３２、及びガラス板３４を挟み込んでいる。この状態で、上クランプ３６の形成されたボルト孔３６Ａと下クランプ３８に形成されたボルト孔３８Ａにボルト４１を挿通して互いを締結し、細胞培養部１２が形成されている。
ここで、ＰＤＭＳ層３２には、チャネルとなるスリット状の溝３２Ａが独立して６つ形成されている。本実施形態では、一例として、溝３２Ａの幅を０．５ｍｍ、長さを２０ｍｍ、深さを０．５ｍｍで形成しているが、これに限らず、他の寸法で形成してもよい。また、それぞれの溝３２Ａには、流入口３２Ｂ及び流出口３２Ｃが形成されている。なお、本実施形態では、ＰＤＭＳ層３２に溝３２Ａを形成したが、他の材質の部材を用いてもよい。例えば、プラスチック、シリコン樹脂、ポリメチルメタクリレート、ポリウレタン、ポリスチレン、又はガラスを用いてもよい。
図６に示すように、流入口３２Ｂにはチューブ２４Ｄが接続されており、チューブ２４Ｄから細胞培養部１２へ培養液が送液されると、培養液は、細胞培養部１２の下部に形成された培養室１２Ｂの一端部へ到達する。ここで、培養室１２Ｂには、細胞が生着されており、層流として流れる培養液により培養されている。培養室１２Ｂを通過した培養液は、培養室１２Ｂの他端部から上方へ移動し、流出口３２Ｃに接続されたチューブ２４Ｅから流出される。
図１に示すように、細胞培養部１２には、チューブ２４Ｅを介して加圧手段としての加圧機構２２が接続されている。加圧機構２２は、循環流路２６を流れる培養液を所定の圧力に加圧する機構であり、図７に示すように、加圧機構２２は主として、上ブロック５０、ダイアフラムベース５４、弾性膜としてのダイアフラム５６、及び下ブロック５２とを備えている。
上ブロック５０及び下ブロック５２は、樹脂製のブロックであり、上ブロック５０には、２つの貫通孔５０Ａ、５０Ｂが設けられチューブ２４Ｅ、２４Ｆがそれぞれの貫通孔５０Ａ、５０Ｂに挿通されている。また、チューブ２４Ｅ、２４Ｆの内側には内筒５８、６０が挿入されており、内筒５８、６０と貫通孔５０Ａ、５０Ｂの孔壁とでチューブ２４Ｅ、２４Ｆを挟み込んでいる。
下ブロック５２は、上ブロック５０と間隔を開けて上ブロック５０の下方に設けられており、下ブロック５２の中央部には、貫通孔５２Ａが形成されている。これにより、後述するダイアフラム５６が下方へ弾性変形した際に、下ブロック５２と接触しないようにしている。なお、下ブロック５２の上面を凹ませて凹部を形成してもよい。
上ブロック５０と下ブロック５２の間には、ダイアフラムベース５４が設けられている。ダイアフラムベース５４は、板状の樹脂部材であり、上ブロック５０の貫通孔５０Ａ、５０Ｂと対応する位置に、ダイアフラムベース５４を貫通して流路５４Ａが形成されている。また、ダイアフラムベース５４の中央部は、周端部より高さが低くなっている。
ダイアフラムベース５４の下面には、ダイアフラム５６が取り付けられている。ダイアフラム５６は、弾性変形可能な膜状の部材であり、本実施形態では、ダイアフラムベース５４と同じ大きさで形成されているが、これに限らず、流路５４Ａを覆う大きさであれば、ダイアフラムベース５４と異なる大きさでもよい。さらに、ダイアフラム５６は、ダイアフラムベース５４の周端部に接着されており、ダイアフラム５６とダイアフラムベース５４の中央部との間には、循環流路２６より狭幅の狭幅部５４Ｂが形成されている。
ここで、チューブ２４Ｅから加圧機構２２へ培養液が送液されると、培養液は、ダイアフラムベース５４の流路５４Ａから狭幅部５４Ｂへ流れる。このとき、狭幅部５４Ｂで培養液が加圧され、図８に示すように、ダイアフラム５６を下方へ弾性変形させて狭幅部５４Ｂを押し広げる。弾性変形されたダイアフラム５６には復元力が作用し、流路５４Ａを縮める方向に力が付与され、培養液が所定の圧力に加圧される。なお、本実施形態では、一例として、１０ｋＰａで加圧できるようにダイアフラム５６の厚み等を調整しているが、これに限らず、１０ｋＰａ以上の圧力で加圧してもよい。
図１に示すように、加圧機構２２は、チューブ２４Ｆを介してリザーバ１４へ接続されている。そして、リザーバ１４へ送液された培養液は、リザーバ１４で貯蔵された後、循環ポンプ１６に吸い上げられ、循環ポンプ１６を停止するまでの間、循環流路２６を循環する。
なお、本実施形態では、細胞培養部１２にのみ細胞を生着しているが、これに限らず、リザーバ１４や加圧機構２２に細胞を添加してもよい。この場合、循環ポンプ１６で循環される培養液中に細胞から分泌された分泌物が混じって、細胞培養部１２の細胞の培養を促進できることがある。
次に、本実施形態に係る細胞培養装置１０の作用について説明する。本実施形態に係る細胞培養装置１０は、圧力均一化機構１８を備えているので、循環ポンプ１６の脈動による培養液の圧力の変動を抑制できる。これにより、細胞培養部１２を流れる培養液の圧力が変動して細胞にダメージを与えることがない。
また、細胞培養部１２の流出口３２Ｃ側の循環流路２６には、加圧機構２２が設けられているので、細胞培養部１２へ送液される培養液が加圧され、培養液中に気泡が発生するのを抑制できる。さらに、所定以上の圧力を付与することで、循環流路２６中に巻き込まれた気泡を培養液中に溶解できる。このようにして、細胞培養部１２へ気泡が流入するのを抑制することにより、気泡が原因とされる細胞の死滅を回避できる。
また、加圧機構２２は、弾性変形可能なダイアフラム５６を用いて形成されているので、流路５４Ａを狭くした場合であっても、培養液中の細胞が詰まることがなく、安定して培養液を循環できる。
さらに、本実施形態に係る細胞培養装置１０では、圧力均一化機構１８と加圧機構２２とを設けたことで相乗効果を得ることができる。すなわち、圧力均一化機構１８だけでは十分に圧力の変動を抑制できない場合であっても、加圧機構２２が培養液を加圧することで、圧力の変動を抑制し、また、培養液中の気泡の発生を抑制できる。
また、本実施形態に係る細胞培養装置１０に必要な培養液の流量は、０．７５μｌ／ｍｉｎ以下の低流量であるため、装置全体の大きさを小型にすることができる。これにより、例えば、装置全体をインキュベーター１０２から取り出して顕微鏡へ運び、細胞培養部１２の培養室１２Ｂを観察できる。
また、低流量で培養液を送液する場合、循環ポンプ１６の流量の設定を変更しただけでは、脈動の影響が大きいので、細かい流量の調整を行うことができない。これに対して、加圧機構２２を設けることで、流量の変動が抑制され、流量の微調整が可能となる。流量の微調整が可能になれば、培養条件の再現性を得ることができる。
（試験例）
ここで、本実施形態に係る細胞培養装置１０の効果を確かめるため、以下の試験を行った。
試験１：本実施形態に係る細胞培養装置１０を用いて、細胞培養部１２へ送液される培養液の流量を微小流量計で計測し、図１０に示した。また、細胞培養装置１０から圧力均一化機構１８及び加圧機構２２を取り外した比較例の細胞培養装置を用いて、細胞培養部１２へ送液される培養液の流量を微量流量計で計測し、図９に示した。
試験２：本実施形態に係る細胞培養装置１０を用いて、細胞培養部１２へ送液される培養液の流量を０．３μｌ／ｍｉｎ、０．５μｌ／ｍｉｎ、０．７５μｌ／ｍｉｎに設定し、それぞれの場合において、培養開始後１日目と３日目の培養室１２Ｂに生着しているｉＰＳ細胞の個数を顕微鏡で数えて表１に記載した。また、上述した比較例の細胞培養装置を用いて同様の試験を実施した。なお、比較例の細胞培養装置における培養液の平均流量は０．５μｌ／ｍｉｎとした。また、何れも培養はＣＯ２インキュベーター内で行い、培養液は、１．０×１０５細胞／ｍｌのものを用いた。
ここで、本実施形態に係る細胞培養装置１０の効果を確かめるため、以下の試験を行った。
試験１：本実施形態に係る細胞培養装置１０を用いて、細胞培養部１２へ送液される培養液の流量を微小流量計で計測し、図１０に示した。また、細胞培養装置１０から圧力均一化機構１８及び加圧機構２２を取り外した比較例の細胞培養装置を用いて、細胞培養部１２へ送液される培養液の流量を微量流量計で計測し、図９に示した。
試験２：本実施形態に係る細胞培養装置１０を用いて、細胞培養部１２へ送液される培養液の流量を０．３μｌ／ｍｉｎ、０．５μｌ／ｍｉｎ、０．７５μｌ／ｍｉｎに設定し、それぞれの場合において、培養開始後１日目と３日目の培養室１２Ｂに生着しているｉＰＳ細胞の個数を顕微鏡で数えて表１に記載した。また、上述した比較例の細胞培養装置を用いて同様の試験を実施した。なお、比較例の細胞培養装置における培養液の平均流量は０．５μｌ／ｍｉｎとした。また、何れも培養はＣＯ２インキュベーター内で行い、培養液は、１．０×１０５細胞／ｍｌのものを用いた。
試験結果を見ると、図９に示すように、比較例の細胞培養装置では、循環ポンプ１６の脈動がそのまま流量に反映されており、−０．２μｌ／ｍｉｎ〜１．３μｌ／ｍｉｎの範囲で周期的に流量が変動している。このように、流量の変動が大きい場合、細胞にダメージを与えることがある。表１に示すように、圧力均一化機構１８及び加圧機構２２が設けられていない比較例の細胞培養装置では、３日目に細胞が全て死滅した。
これに対して、圧力均一化機構１８及び加圧機構２２を接続した本実施形態に係る細胞培養装置１０では、図１０に示すように脈動が抑えられており、培養液の流量が０．５μｌ／ｍｉｎで落ち着いているのが確認でき、安定した環境で細胞を培養できるのが分かる。
表１に示すように、本実施形態に係る細胞培養装置１０では、少なくとも３日目までに全ての細胞が死滅することがなかった。また、本実施形態に係る細胞培養装置１０では、設定したいずれの流量に関しても、流量（実測値）の変動幅が小さく、設定値の２０％以下である。すなわち、本実施形態に係る細胞培養装置１０は、流量制御に関して高い分解能を有すると言え、設定流量を変化させるにあたり、設定値を細かく制御できる。例えば、細胞培養に適した流量を見出したい場合に、本実施形態に係る細胞培養装置１０によれば、流量を細かく設定でき、最適値の決定精度を高めることができる。表１に示す例で言えば、０．３μｌ／ｍｉｎ、０．５μｌ／ｍｉｎおよび０．７５μｌ／ｍｉｎ設定流量において、互いの実測値が重複することがないので、各設定量における効果を精度よく比較検討できる。なお、本例では、培養液の流量が０．５μｍ／ｍｉｎの場合に、高い細胞生存率を実現できることが分かる。ここで、個数比が１００％を超えているのは、細胞が分裂したためである。例えば、また、細胞を培養する場合においては、細胞培養のための設定流量に関し、より細かな調整が可能であり、最適層流条件での培養が可能となる。
本発明によれば、流量（実測値）の変動幅を、設定値の０〜５０％の範囲に抑えることができ、例えば、本実施形態に係る細胞培養装置１０によれば、流量（実測値）の変動幅を、設定値の３〜３０％に抑えることが可能である。
（第２実施形態）
次に、本発明の第２実施形態に係る細胞培養装置７０について説明する。なお、第１実施形態と同様の構成については、同じ符号を付し、説明を省略する。
次に、本発明の第２実施形態に係る細胞培養装置７０について説明する。なお、第１実施形態と同様の構成については、同じ符号を付し、説明を省略する。
図１１に示すように、本実施形態に係る細胞培養装置７０は、第１実施形態と同様に、インキュベーター１０２に格納され、３７度に維持されている。また、細胞培養装置７０は、細胞培養部１２、リザーバ１４、循環ポンプ１６、圧力均一化機構１８、エアトラップ２０、及び加圧機構２２を備えている。さらに、エアトラップ２０と培養室１２Ｂとの間には、第２圧力均一化機構７２が配置されている。第２圧力均一化機構７２は、チューブ２４Ｇで細胞培養部１２と接続されている。
第２圧力均一化機構７２は、第１圧力均一化機構１８と同様の構造を有しており、圧力の変動を抑制できるように構成されている。なお、本実施形態では、一例として、第２圧力均一化機構７２をエアトラップ２０と細胞培養部１２との間に設けているが、これに限らず、他の部分に接続してもよく、例えば、圧力均一化機構１８とエアトラップ２０との間に設けてもよい。
本実施形態に係る細胞培養装置７０によれば、培養液は、圧力均一化機構１８、及び第２圧力均一化機構７２を流れるので、圧力均一化機構１８のみが設けられた第１実施形態と比べて、より脈動を抑制できる。
以上、本発明の第１実施形態及び第２実施形態について説明したが、本発明はこうした実施形態に限定されるものでなく、実施形態を組み合わせて用いてもよいし、本発明の要旨を逸脱しない範囲において、種々なる態様で実施し得ることは勿論である。例えば、図１２に示すように、エアトラップを含まない細胞培養装置８０でもよい。
また、図１３に示すように、流路を循環させずにリザーバ１４から一方方向へ培養液を送液する細胞培養装置９０でもよい。この場合、リザーバ１４から細胞培養部１２へ送液された培養液は、加圧機構２２を経て廃液槽９２へ廃液される。
１０、７０ 細胞培養装置
１２ 細胞培養部
１４ リザーバ（貯蔵部）
１６ 循環ポンプ（送液手段）
１８ 圧力均一化機構（圧力均一化手段）
２０ エアトラップ（気泡除去手段）
２２ 加圧機構（加圧手段）
２４Ａ〜２４Ｇ チューブ（循環流路）
２６ 循環流路
４６ 流体室
４０Ａ 流入口
４０Ｂ 流出口
４４ 可撓性膜
５４Ｂ 狭幅部
５６ ダイアフラム（弾性膜）
７２ 第２圧力均一化機構（圧力均一化手段）
１００ 細胞培養システム
１０２ インキュベーター（恒温器）
１２ 細胞培養部
１４ リザーバ（貯蔵部）
１６ 循環ポンプ（送液手段）
１８ 圧力均一化機構（圧力均一化手段）
２０ エアトラップ（気泡除去手段）
２２ 加圧機構（加圧手段）
２４Ａ〜２４Ｇ チューブ（循環流路）
２６ 循環流路
４６ 流体室
４０Ａ 流入口
４０Ｂ 流出口
４４ 可撓性膜
５４Ｂ 狭幅部
５６ ダイアフラム（弾性膜）
７２ 第２圧力均一化機構（圧力均一化手段）
１００ 細胞培養システム
１０２ インキュベーター（恒温器）
Claims (7)
- 細胞を培養する細胞培養部と、
培養液を貯蔵する貯蔵部と、
前記細胞培養部と前記貯蔵部とを接続する流路と、
前記流路に設けられ、前記貯蔵部から前記細胞培養部へ前記培養液を送液する送液手段と、
前記流路に設けられ、前記細胞培養部へ送液される前記培養液にかかる圧力の変動を抑制する圧力均一化機構と、
前記細胞培養部の流出口側の前記流路に設けられ、前記培養液へ所定の圧力を加える加圧機構と、
を有し、
前記圧力均一化機構は、
前記培養液が充填される流体室と、
前記流体室に形成され、前記流路と接続される流入口及び流出口と、
前記流体室の内壁の一部を構成すると共に、前記流体室の圧力の変動に応じて撓む可撓性膜と、を有し、
前記加圧機構は、
前記流路に接続され、前記流路より断面積が小さい加圧部と、
前記加圧部の壁面の一部を構成し、前記加圧部へ流入した前記培養液の圧力により弾性変形する弾性膜と、
を有する細胞培養装置。 - 前記圧力均一化機構が有する前記流入口及び前記流出口は、前記流体室の対向する端部に形成され、
前記流体室は、前記端部から中央部に向かって徐々に広幅に形成されている請求項１に記載の細胞培養装置。 - 前記流体室は、平面視で、角が丸められたひし形状である請求項２に記載の細胞培養装置。
- 前記細胞培養部の流入口側の前記流路には、気泡を除去する気泡除去手段が設けられて
いる請求項１〜３の何れか１項に記載の細胞培養装置。 - 前記圧力均一化機構を複数備えた請求項１〜４の何れか１項に記載の細胞培養装置。
- 請求項１〜５の何れか１項に記載の細胞培養装置と、
前記細胞培養装置を格納する恒温器と、
を有する細胞培養システム。 - 請求項１〜５の何れか１項に記載の細胞培養装置を用いて細胞を培養する細胞培養方法であって、
前記細胞培養部、前記貯蔵部、及び前記圧力均一化機構の少なくとも１つに細胞を添加する工程と、
前記加圧機構で前記流路中の前記培養液を加圧しつつ、前記送液手段で前記流路中の前記培養液を循環させる工程と、
を有する細胞培養方法。
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