KR20220086625A - 세포 배양을 위한 시스템 및 방법 - Google Patents

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KR20220086625A
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culture chamber
cells
chamber
cell
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샤시 케이. 무르티
앤드류 코즈비알
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플라스크웍스, 엘엘씨
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Abstract

세포 배양 시스템 및 방법은 더욱 양호한 규모 확대성, 유연성 및 자동화로 개선된 면역요법 생성물 제조를 제공한다. 세포 배양 시스템은 교환가능한 카트리지로 구성되어, 다용성 및 규모 확대성을 가능하게 한다. 시스템은 다중 연결된 세포 배양 챔버를 갖도록 구성되고, 이는 상이한 유형의 세포를 병행하여 가공하는 것을 가능하게 한다. 기체 불투과성 세포 배양 챔버 및 폐쇄된 시스템에서 세포를 생성하는 방법은 오염 및 사용자 오류를 방지한다. 세포 배양 배지를 재순환시키는 방법은 추가의 효율을 제공한다.

Description

세포 배양을 위한 시스템 및 방법
관련 출원의 상호 참고
본 출원은 미국 가출원 번호 62/923,963 (2019년 10월 21일 출원), 및 미국 가출원 번호 62/923,967 (2019년 10월 21일 출원), 및 미국 가출원 번호 62/923,973 (2019년 10월 21일 출원), 및 미국 가출원 번호 62/923,975 (2019년 10월 21일 출원), 및 미국 가출원 번호 62/923,978 (2019년 10월 21일 출원), 및 미국 가출원 번호 62/923,982 (2019년 10월 21일 출원)를 우선권으로 주장하며, 이들의 내용은 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술분야
본 개시내용은 일반적으로 세포 배양을 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
암은 전세계적으로 사망률 및 이환율의 주요 원인이며, 수년간의 특별한 연구 노력에도 불구하고, 치료법을 찾기 힘들었다. 한 종양에 대해 맞춤화된 치료가 또 다른 종양에 대해서는 효과적이지 않을 수 있기 때문에, 종양 유형의 다양성은 암 요법에서 어려움을 제시한다. 개별 맞춤형 치료가 모색되었지만, 이들을 개발하는데 여러 어려움이 존재한다.
한 가지 유망한 분야는 환자의 T 세포를 특정한 암을 표적화하도록 변경시키는 것인 T 세포 요법이었다. 이에는 키메라 항원 수용체 T 세포 (CAR-T) 요법, T 세포 수용체 (TCR) 요법, 및 신생항원-기반 T 세포 요법이 포함된다. 신생항원-기반 요법은 고도로 개별 맞춤화된 환자-특이적인 면역요법을 설계하기 위해 종양 시퀀싱 데이터로부터 항원을 확인하는 능력을 제공한다.
불행하게도, T 세포 요법의 개발 및 제조에 많은 어려움이 존재한다. 암 항원-특이적인 T-세포의 단리, 제조 및 확장을 위한 기존 공정은 제한적이다. 자가 항원-제시 수지상 세포 (DC)에 의한 인간 T 세포의 자극을 위한 통상적인 프로토콜은 배양 용기 사이에서 세포를 옮기고, 배지를 교체하고, 시토카인 및 세포 배지를 보충하는 것을 비롯한 몇몇 수동 단계를 수반한다. 이들 공정은 노동-집약적이며, 쉽게 규모 확대될 수 없다. 프로토콜을 수행하기 위해 필요한 수동 단계의 수는 엄청나게 많다. 추가로, 이들 프로토콜은 사용 중에 개방 및 폐쇄되는 플라스크 또는 다른 컨테이너의 사용을 수반하고, 이는 세포 생성물의 품질 및 안전성을 손상시킬 수 있는 오염의 위험을 추가한다. 이러한 방법은 현재의 우수 제조 관리 기준 (cGMP)을 준수하지 않으며, 대규모로 T 세포 요법을 생성하는데 유용하지 않다. 세포 제조 시간, 최적 표현형의 유지, 충분한 세포 수로의 확장, 및 세포 생성물의 품질 및 안전성과 같은 추가의 어려움 또한 존재한다.
본 발명은 자가 세포 가공과 연관된 복잡한 생물학적 과정 뿐만 아니라, 그와 연관된 생물공정 및 조절 요건으로 인해 자동화 T 세포 요법 가공 및 제조가 성공적이지 않았음을 인식한다. 존재하는 몇몇 시스템은 지나치게 복잡하고 비용이 많이 들며, 따라서 전임상 검정에 유용하지 않다. 본 발명의 세포 배양 시스템 및 본 발명의 관련 방법은 세포 배양에서의 여러 문제점에 대한 해결책을 제공하고, 오염 및 사용자 오류를 감소시킬 뿐만 아니라, 효율, 규모 확대성 및 사용 용이성을 증가시키는 수많은 특징을 제공한다. 본 발명의 시스템 및 방법은 비용을 최소화하고, 간편성 및 사용 용이성을 증가시키면서, 확고한 T 세포 생성 능력을 제공하며, 이는 개시된 시스템 및 방법이 임상 제조에 대한 현재의 우수 제조 실무에 대한 요건을 충족시키면서, 전임상 연구 및 일상적인 세포 배양 둘 다에 유용하게 만든다.
특정한 측면에서, 개시된 시스템 및 방법은 항원-특이적인 T 세포를 생성하기 위해 개선되고 자동화된 기술을 제공한다. 수동 공정의 자동화는 사용자 오류에 대한 기회를 극적으로 감소시키고, 오염 위험을 감소시킨다. 예를 들어, 본 개시내용은 폐쇄된 시스템에서 CAR-T 및 TCR 형질도입된 T 세포 뿐만 아니라, 신생항원-표적화 T 세포를 생성하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 이는 선행 기술에서 일반적인 것과 같이 T 플라스크의 개방 및 폐쇄에 대한 필요를 피하게 하여, 공정을 간편화시키고, 오염원을 피하게 한다. 또 다른 예로, 사용자가 세포 집단의 규모를 확대시키거나 또는 축소시킬 수 있도록 용이하게 교환가능한 세포 배양 챔버로 구성된 세포 배양 시스템이 개시된다. 다양한 챔버 및 용기는 멸균 튜브 용접을 통해 연결될 수 있으며, 따라서 시스템은 사용하는 내내 폐쇄된 채 유지될 수 있다. 본 개시내용은 또한 세포 배양을 위한 기체 불투과성 카트리지를 제공하며, 이는 최적의 세포 부착 및 강성 카트리지 구축을 위한 고체 폴리스티렌 표면을 제공하여, 용접된 튜브 연결에 의해 작동될 때 제조가 용이하고 오염에 덜 민감하게 된다. 개시된 시스템은 또한 자극된 T 세포를 생성하는 공정에서 수지상 세포 및 T 세포를 병행하여 가공할 수 있게 한다. 시스템 아키텍쳐는 T 세포 배양 공정을 간소화시켜, 시간 및 물질의 절약을 제공한다. 시스템이 물질을 절약하는 또 다른 방식은 세포 배양 배지를 재순환시키는 것이며, 이는 세포가 고가의 배양 배지 및 보충물을 최소량으로 사용하여 배양될 수 있도록 보장한다.
상기 기재된 특징 외에도, 개시된 시스템 및 방법은 면역요법 생성물 제조에서 공정 최적화를 위한 수많은 기회를 제공하기 때문에, 다른 특징은 관련 기술분야의 가술자에게 자명할 것이다.
본 개시내용의 측면은 교환가능한 카트리지를 갖는 세포 배양 시스템을 제공한다. 세포 배양 시스템은 세포 배양 배지를 함유하는 유체 저장소를 수용하도록 구성된 제1 영역 및 폐기물 저장소를 수용하도록 구성된 제2 영역을 포함한다. 세포 배양 시스템은 또한 유체 저장소에 유체적으로 연결가능한 1개 이상의 펌프 및 상이한 형상 및/또는 크기의 세포 배양 챔버를 수용하고 보유하도록 구성된 기재를 갖는다.
실시양태에서, 기재는 기재가 상이한 형상 및/또는 크기의 세포 배양 챔버를 수용하고 보유하도록 구성되게 배열된 복수개의 상이한 개구부를 갖는다. 기재는 다중 세포 배양 챔버를 동시에 수용하고 보유하도록 구성될 수 있다. 기재의 제1 부분은 제1 크기의 제1 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성될 수 있는 반면에, 기재의 제2 부분은 제1 크기와 상이한 제2 형상의 제2 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성된다. 실시양태에서, 기재의 제1 부분은 제1 형상의 제1 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성되고, 기재의 제2 부분은 제1 형상과 상이한 제2 형상의 제2 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성된다. 실시양태에서, 기재의 제1 부분은 제1 크기 및 형상의 제1 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성되고, 기재의 제2 부분은 제1 크기 및 형상과 상이한 제2 크기 및 형상의 제2 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성된다.
실시양태에서, 유체 저장소는 제1 영역에 위치하고, 폐기물 저장소는 폐기물 영역에 위치한다. 유체 저장소를 1개 이상의 펌프에, 및/또는 1개 이상의 펌프를 세포 배양 챔버에, 및/또는 세포 배양 챔버를 폐기물 저장소에 유체적으로 연결시키는 1개 이상의 튜브가 포함될 수 있다. 각각의 세포 배양 챔버는 별도의 펌프에 유체적으로 커플링될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로세서는 1개 이상의 펌프에 작동가능하게 연결되고, 1개 이상의 센서는 세포 배양 시스템에서 유체의 특징을 측정하도록 작동가능하고, 프로세서는 측정된 특징을 기반으로 하여 1개 이상의 펌프를 작동시킨다.
관련 측면에서, 본 개시내용은 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포 배양 배지를 함유하는 유체 저장소를 수용하도록 구성된 제1 영역 및 폐기물 저장소를 수용하도록 구성된 제2 영역, 유체 저장소에 유체적으로 연결가능한 1개 이상의 펌프, 및 상이한 형상 및/또는 크기의 세포 배양 챔버를 수용하고 보유하도록 구성된 기재를 갖는 세포 배양 시스템을 제공하는 것을 포함한다. 상기 방법은 유체 저장소를 제1 영역에 및 폐기물 저장소를 제2 영역에 로딩하고, 제1 크기 및/또는 형상의 제1 세포 배양 챔버를 기재의 제1 부분 상에 로딩하고, 제2 크기 및/또는 형상의 제2 세포 배양 챔버를 기재의 제2 부분 상에 로딩하는 것을 추가로 수반한다. 상기 방법은 유체 저장소, 1개 이상의 펌프, 제1 및 제2 세포 배양 챔버, 및 폐기물 저장소를 튜브로 연결하는 것을 추가로 수반한다. 상기 방법은 제1 및 제2 세포 배양 챔버에서 세포를 배양하도록 시스템을 작동시키는 것을 추가로 수반한다.
실시양태에서, 기재는 기재가 상이한 형상 및/또는 크기의 세포 배양 챔버를 수용하고 보유하도록 구성되게 배열된 복수개의 상이한 개구부를 갖는다. 제1 세포 배양 챔버는 제1 크기를 가질 수 있고, 제2 세포 배양 챔버는 제2 크기를 가질 수 있다. 제1 세포 배양 챔버는 제1 형상을 가질 수 있고, 제2 세포 배양 챔버는 제2 형상을 가질 수 있다. 제1 세포 배양 챔버는 제1 크기 및 형상 둘 다를 가질 수 있고, 제2 세포 배양 챔버는 제2 크기 및 형상 둘 다를 가질 수 있다.
실시양태에서, 제1 및 제2 세포 배양 챔버 각각은 별도의 펌프에 유체적으로 커플링된다. 시스템은 또한 1개 이상의 펌프에 작동가능하게 연결된 프로세서, 및 세포 배양 시스템에서 유체의 특징을 측정하도록 작동가능한 1개 이상의 센서를 포함하고, 프로세서는 측정된 특징을 기반으로 하여 1개 이상의 펌프를 작동시킨다.
실시양태에서, 세포 배양이 제1 및 제2 세포 배양 챔버에서 완료된 후, 제1 및 제2 세포 배양 챔버 각각에서 배양된 세포를 수집한다. 제1 및 제2 세포 배양 챔버 각각에서 배양된 세포는 동일한 수집 용기에서 또는 상이한 수집 용기에서 수집될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 폐쇄된 시스템에서 CAR 또는 TCR에 의해 형질도입된 T 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 제1 및 제2 배양 챔버를 갖는 세포 배양 장비를 제공하고, 세포를 함유하는 현탁액을 제1 배양 챔버로 유동시키는 것을 수반한다. 상기 방법은 제1 배양 챔버에서 T 세포를 적절한 형질도입 및 확장 시약으로 관류시켜, 제1 배양 챔버에서 확장하는 형질도입된 T 세포를 생성하는 것을 추가로 수반한다. 상기 방법은 형질도입되고 확장된 T 세포를 제1 배양 챔버로부터 제2 배양 챔버로 유동시키는 것을 추가로 수반한다. 상기 방법은 세포 배양 배지를 제2 배양 챔버로 유동시켜, 형질도입되고 확장된 T 세포를 추가로 확장시키는 것을 추가로 수반하고, 상기 방법은 방법 전반에 걸쳐 멸균성이 유지되도록 폐쇄된 방식으로 단일 장비에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 제2 배양 챔버는 제1 배양 챔버보다 크다. 배양 챔버 중 하나 또는 둘 다는 폴리스티렌으로 제조될 수 있다. 배양 챔버는 멸균 튜브를 통해 연결될 수 있다. 제1 배양 챔버는 활성화 시약 및/또는 세포 형질도입 시약을 가질 수 있고, 이는 CAR 또는 TCR을 발현하는 불활성 바이러스일 수 있다. 대안적으로, 제2 배양 챔버는 제1 세포 배양 장비의 일부가 아닌 별도의 세포 배양 장비일 수 있다.
실시양태에서, 세포 배양 배지는 멸균 용기에 제공되고, 멸균 튜브 용접에 의해 폐쇄된 시스템에 연결된다. 세포 배양 배지를 제1 배양 챔버로 유동시키는 것은 제1 배양 챔버에서 헤드스페이스를 제거하는 것을 수반할 수 있다. 세포 배양 배지는 인터류킨-2와 함께 Aim V를 포함할 수 있다.
상기 방법은 제1 배양 챔버에서 T 세포를 활성화시키는 것을 추가로 수반할 수 있고, 이는 1개 이상의 활성화 항체 또는 가용성 활성화 항체-함유 시약, 및 형질도입 시약을 포함하는 자성 또는 비-자성 비드와 접촉시킴으로써 수행될 수 있다. 상기 방법은 제2 배양 챔버로부터 유체를 배수시키고, 형질도입되고 확장된 T 세포를 완충제로 세척하고, 냉동보존 배지를 제2 배양 챔버로 유동시켜, 형질도입되고 확장된 T 세포를 재현탁시키는 것을 추가로 수반할 수 있다. 상기 방법은 형질도입되고 확장된 T-세포를 폐쇄된 방식으로 수확 용기로 유동시키는 것을 추가로 수반할 수 있다.
실시양태에서, 각각의 유동 단계는 멸균 튜브를 통해 수행될 수 있다. 멸균 튜브는 멸균 튜브 용접에 의해 연결될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 폐쇄된 시스템에서 신생항원-표적화 T 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 제1 및 제2 배양 챔버를 갖는 세포 배양 장비를 제공하고, 단핵구를 함유하는 세포 배양 배지를 제1 배양 챔버로 유동시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 제1 배양 챔버에서 정제된 단핵구를 관류시켜, 제1 배양 챔버에서 수지상 세포를 생성하고, 제1 배양 챔버에서 수지상 세포를 종양-특이적인 펩티드를 포함할 수 있는 항원 물질과 접촉시켜, 성숙한 수지상 세포를 생성하는 것을 수반한다. 상기 방법은 성숙한 수지상 세포를 제1 배양 챔버로부터 정제된 T 세포를 포함하는 제2 배양 챔버로 유동시켜, 성숙한 수지상 세포 및 정제된 T 세포를 공동-배양하고, 이에 의해 신생항원-표적화 T 세포를 생성하는 것을 추가로 수반한다. 상기 방법은 방법 전반에 걸쳐 멸균성이 유지되도록 폐쇄된 방식으로 단일 장비에서 수행된다.
실시양태에서, 상기 방법은 또한 단핵구의 제2 배치를 제2 배양 챔버로 유동시키고, 이들을 수지상 세포로 분화시키고, 수지상 세포를 성숙시켜, 정제된 T 세포와 함께 제2 공동-배양을 수행하는 것을 수반한다. 제1 및 제2 배양 챔버는 폴리스티렌으로 제조될 수 있다. 제1 및 제2 배양 챔버는 멸균 튜브를 통해 연결될 수 있다. 세포 배양 배지는 멸균 용기에 제공될 수 있고, 멸균 튜브 용접에 의해 폐쇄된 시스템에 연결될 수 있다. 세포 배양 배지를 제1 배양 챔버로 유동시키는 단계는 제1 배양 챔버에서 헤드스페이스를 제거하는 것을 수반할 수 있다. 각각의 유동 단계는 멸균 튜브 용접에 의해 연결될 수 있는 멸균 튜브를 통해 수행될 수 있다.
실시양태에서, 상기 방법은 또한 제2 배양 챔버에서 T 세포를 활성화시키는 것을 포함한다. 실시양태에서, 상기 방법은 또한 제2 배양 챔버로부터 유체를 배수시키고, 신생항원-표적화 T 세포를 완충제로 세척하고, 냉동보존 배지를 제2 배양 챔버로 유동시켜, 신생항원-표적화 T 세포를 재현탁시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 또한 신생항원-표적화 T 세포를 폐쇄된 방식으로 수확 용기로 유동시키는 것을 수반할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 수지상 세포를 생성하고 이와 병행하여 T 세포를 자극하기 위해 병행하여 가공하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 제1 및 제2 배양 챔버를 갖는 세포 배양 장비를 제공하고, 단핵구를 함유하는 세포 배양 배지를 제1 배양 챔버로 유동시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 제1 배양 챔버에서 단핵구를 관류시켜, 제1 배양 챔버에서 수지상 세포를 생성하는 것을 추가로 포함한다. 상기 방법은 제2 배양 챔버에서 배양된 T 세포를 제2 배양 챔버로부터 수지상 세포를 갖는 제1 배양 챔버로 유동시켜, 제1 배양 챔버에서 T 세포를 추가로 배양하는 것을 추가로 포함한다. 실시양태에서, 멸균성은 방법 전반에 걸쳐 유지된다.
상기 방법은 또한 배양된 T 세포를 수집 용기로 유동시킴으로써 배양된 T 세포를 제1 배양 챔버로부터 수집하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 또한 수지상 세포를 종양-특이적인 펩티드를 포함할 수 있는 항원 물질과 접촉시킴으로써 제1 배양 챔버에서 수지상 세포를 성숙시키는 것을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 상기 방법은 또한 제2 배양 챔버에서 T 세포를 활성화시키는 것을 수반하며, 이는 활성화 시약을 이용하여 수행될 수 있다. 실시양태에서, 상기 방법은 또한 자극된 T 세포를 완충제로 세척하고, 임의적으로 자극된 T 세포를 냉동보존 배지로 옮기는 것을 수반한다. 상기 방법은 또한 신생항원-표적화 T 세포를 폐쇄된 방식으로 수확 용기로 유동시키는 것을 수반할 수 있다. 각각의 유동 단계는 임의적으로 멸균 튜브 용접에 의해 연결되는 멸균 튜브를 통해 수행될 수 있다.
세포 배양 배지는 멸균 용기에 제공될 수 있고, 멸균 튜브 용접에 의해 폐쇄된 시스템에 연결될 수 있다. 세포 배양 배지를 제1 배양 챔버로 유동시키는 것은 제1 배양 챔버에서 헤드스페이스를 제거하는 것을 수반할 수 있다. 실시양태에서, 제1 및 제2 배양 챔버는 폴리스티렌으로 제조되고, 임의적으로 멸균 튜브를 통해 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 장비로부터의 제1 및 제2 세포 배양 챔버 중 하나 또는 둘 다 교체될 수 있고, 상기 방법이 반복될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 기체 불투과성 세포 배양 챔버를 제공하며, 상부, 하부 및 둘 다의 측벽은 기체 불투과성 물질로 구성된다. 기체 불투과성 물질은 또한 세포가 부착하는 물질일 수 있다. 기체 불투과성 물질은 폴리스티렌일 수 있다.
실시양태에서, 세포 배양 챔버는 주입구를 갖는다. 세포 배양 챔버는 또한 배출구를 가질 수 있다. 주입구 및 배출구는 세포 배양 챔버의 상부에 위치할 수 있고, 임의적으로 주입구 및 배출구 각각은 유체적으로 및 밀봉가능하게 튜브로 커플링되도록 구성된다. 세포 배양 챔버는 일체형으로 형성될 수 있고, 이는 인큐베이터 내에 맞도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성될 수 있다. 세포 배양 챔버는 세포 배양 장비의 기재에 커플링하도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성될 수 있다.
관련 측면에서, 본 개시내용은 주입구 및 배출구를 갖는 세포 배양 챔버를 제공하는 것을 수반하는, 세포를 배양하는 방법을 제공하며, 상부, 하부 및 둘 다의 측벽은 기체 불투과성 물질로 제조된다. 상기 방법은 또한 세포를 세포 배양 챔버에 로딩하고, 세포 배양 배지를 주입구를 통해 세포 배양 챔버로 유동시켜, 배양 챔버에서 세포를 배양하고, 배출구를 통해 세포 배양 챔버로부터 유동시키는 것을 수반하며, 주입구 및 배출구를 통하는 세포 배양 챔버를 통한 세포 배양 배지의 유동은 세포 배양 챔버를 통한 세포 배양 배지의 연속적인 유동을 유발하고, 세포 배양 챔버의 세포와 세포 배양 배지 사이에서 기체 교환이 발생하도록 한다.
실시양태에서, 기체 불투과성 물질은 또한 세포가 부착하는 물질, 예컨대 폴리스티렌이다. 실시양태에서, 주입구 및 배출구는 세포 배양 챔버의 상부에 위치하고, 임의적으로 유체적으로 및 밀봉가능하게 튜브로 커플링되도록 구성된다. 튜브는 세포 배양 배지가 고투과성 튜브 내에 있는 동안에 기체를 교환하도록 하는 고투과성 튜브일 수 있다. 실시양태에서, 세포 배양 챔버는 일체형으로 형성된다. 세포 배양 챔버는 인큐베이터 내에 맞도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성될 수 있고, 임의적으로 이는 세포 배양 장비의 기재에 커플링하도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 세포 배양 배지를 세포 배양 챔버를 통해 유동시킴으로써 세포 배양 장비 상의 세포 배양 챔버에서 세포를 배양하는 것을 수반하는, 세포를 배양하는 방법을 제공하며, 세포 배양 챔버를 통해 이미 유동한 세포 배양 배지의 일부분은 세포 배양 공정 동안에 세포 배양 챔버로 다시 재순환된다.
실시양태에서, 상기 방법은 또한 사용된 배지의 하나 이상의 파라미터를 재순환 전에 측정하는 것을 수반한다. 파라미터는 사용된 배지 내의 1종 이상의 화합물의 농도, 예컨대 글루코스, 락테이트, 용존 산소, 또는 세포 대사물일 수 있다. 파라미터는 또한 pH 또는 세포 수일 수 있다.
실시양태에서, 상기 방법은 세포 배양 챔버에 작동가능하게 연결된 프로세서를 이용하여, 사용된 배지의 하나 이상의 파라미터 중 적어도 하나가 재순환 단계 전에 예정된 역치를 충족하는지 여부를 결정하는 것을 수반한다. 측정 단계는 세포 배양 챔버와 작동가능하게 연관된 1개 이상의 센서에 의해 수행될 수 있다. 1개 이상의 센서는 세포 배양 챔버와 유체 소통하는 폐기물 저장소와 작동가능하게 연관될 수 있다. 세포 배양 챔버는 1개 이상의 펌프에 작동가능하게 연결될 수 있고, 주입구 및 배출구를 가질 수 있다. 재순환 단계는 사용된 배지의 일부를 폐기물 저장소로부터 세포 배양 챔버로 다시 재지정하는 것을 수반할 수 있다. 실시양태에서, 사용된 배지의 일부는 신선한 배지의 볼루스와 조합된다.
관련 측면에서, 본 개시내용은 세포를 함유하는 세포 배양 챔버를 제공하고, 세포 배양 배지를 세포 배양 챔버로 유동시키고, 사용된 세포 배양 배지를 세포 배양 챔버로부터 제거하고, 사용된 세포 배양 배지의 파라미터를 평가하고, 파라미터가 예정된 역치를 충족하는 경우, 사용된 세포 배양 배지를 세포 배양 챔버로 반환시키는 것을 수반하는, 세포를 배양하는 방법을 제공한다.
실시양태에서, 상기 방법은 또한 반환 단계 전에 사용된 세포 배양 배지를 신선한 세포 배양 배지의 볼루스와 조합하는 것을 수반한다. 평가 단계는 세포 배양 챔버에 작동가능하게 커플링된 센서를 이용하여 파라미터를 측정하는 것을 수반할 수 있다. 평가 단계는 프로세서를 이용하여, 파라미터가 예정된 역치를 충족하는지 여부를 결정하는 것을 수반할 수 있다. 파라미터는 사용된 세포 배양 배지 내의 1종 이상의 화합물, 예컨대 글루코스, 락테이트, 또는 세포 대사물의 측정된 농도일 수 있다. 실시양태에서, 반환 단계는 사용된 세포 배양 배지를 폐기물 저장소로부터 세포 배양 챔버로 재지정하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 또한 파라미터가 예정된 역치를 충족하지 않는 경우, 사용된 세포 배양 배지를 폐기하고, 신선한 세포 배양 배지를 세포 배양 챔버로 유동시키는 것을 수반한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 유체 저장소를 수용하기 위한 복수개의 선반을 포함하는 세포 배양 시스템을 제공한다. 선반은 제2 선반의 상부에 제1 선반이 적층될 수 있으며, 각각의 제1 및 제2 선반은 유체 저장소를 수용하도록 구성된다. 각각의 선반은 각각의 제1 및 제2 선반 상에 유체 저장소를 보유하는 보유 메카니즘을 포함할 수 있다.
시스템은 적어도 1개의 펌프, 적어도 1개의 펌프에 작동가능하게 커플링된 프로세서; 및 복수개의 세포 배양 챔버를 동시에 유지하도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성된 기재를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 시스템은 적어도 1개의 센서를 추가로 포함하고, 프로세서는 적어도 1개의 센서에 연결될 수 있고, 센서에 의해 측정된 특징을 기반으로 하여 적어도 1개의 펌프를 작동시키도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 센서는 세포 배양 배지 내의 1종 이상의 화합물, 예컨대 글루코스, 락테이트, 또는 세포 대사물의 농도를 측정할 수 있다. 프로세서는 1개 이상의 센서로부터 이루어진 측정치를 기반으로 하여 펌프를 조절할 수 있다 (예를 들어, 펌프 켜기 또는 끄기). 예를 들어, 1개의 센서는 세포 배양 챔버에 부착될 수 있다. 해당 센서는 예를 들어 세포 배양 챔버 내의 배지 내부에서 글루코스 수준을 측정할 수 있다. 글루코스 수준이 예정된 역치 아래로 떨어질 때, 프로세서는 세포 배양 챔버에서 배지를 교체하도록 펌프를 촉발시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로세서는 세포 유형을 배양하기 위한 명령을 수신하고 실행하도록 구성된다. 다른 예에서, 프로세서는 T 세포를 형질도입하기 위한 명령을 수신하고 실행하도록 구성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 기재는 상이한 크기 및/또는 형상의 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성된다. 이 구성은 배양 사용자의 특정한 요구에 따라 상이한 양의 세포 또는 상이한 세포 유형을 배양하도록 시스템을 맞춤화시킬 수 있기 때문에 유리하다. 시스템은 복수개의 펌프를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 시스템은 각각의 세포 배양 챔버 내의 세포가 별도로 배양되도록 시스템 내에 포함된 각각의 세포 배양 챔버를 위한 별도의 펌프를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 시스템은 제1 선반 상의 제1 유체 저장소로부터 복수개의 펌프로, 복수개의 펌프로부터 복수개의 세포 배양 챔버로, 및 복수개의 세포 배양 챔버로부터 제2 선반 상의 제2 유체 저장소로 유체적으로 연결하는 복수개의 튜브를 추가로 포함한다. 바람직하게는, 시스템은 인큐베이터에 삽입하기 위한 치수를 갖는다.
관련 측면에서, 본 개시내용은 세포를 멸균 배양하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 제2 선반의 상부에 제1 선반이 적층되고, 각각의 제1 및 제2 선반이 유체 저장소를 수용하도록 구성된 복수개의 선반; 적어도 1개의 펌프; 적어도 1개의 펌프에 작동가능하게 커플링된 프로세서; 및 복수개의 세포 배양 챔버를 동시에 유지하도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성된 기재를 포함하는 세포 배양 시스템을 제공하는 것을 포함한다. 상기 방법은 제1 유체 저장소를 제1 선반 상에 로딩하고, 제2 유체 저장소를 제2 선반 상에 로딩하고, 제1 세포 배양 챔버 및 제2 세포 배양 챔버를 기재 상에 로딩하고, 유체 및 제2 유체 저장소, 적어도 1개의 펌프, 및 제1 및 제2 세포 배양 챔버를 튜브로 연결하고; 제1 및 제2 세포 배양 챔버의 내부에서 세포를 배양하기 위해 시스템을 작동시키는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 세포 배양 챔버는 상이한 크기 또는 형상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 시스템은 적어도 1개의 센서를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로세서는 적어도 1개의 센서에 연결되고, 센서에 의해 측정된 특징을 기반으로 하여 펌프를 작동시키도록 구성된다.
도 1은 다중-생물반응기 시스템의 예를 도시한다.
도 2는 생물학적 반응기의 실시양태를 도시한다.
도 3은 다중-생물반응기 시스템을 도시한다.
도 4는 CAR-T/TCR 워크플로우를 도시한다.
도 5-8은 상이한 시스템을 사용하는 T 세포 확장의 비교를 도시한다.
도 9-10은 신선하게 배양된 수지상 세포 및 PBMC 또는 T 세포를 공동-배양하는 방법, 및 그의 결과를 도시한다.
도 11은 세포-기반 면역요법 생성물을 형성하는 방법을 도시한다.
도 12는 일부 실시양태에 따른 시스템 아키텍쳐를 도시한다.
본 발명의 세포 배양 시스템은 면역요법 생성물 제조를 유의하게 개선시켜, 비할 데 없는 정도의 점조도, 품질, 안전성, 경제성, 규모 확대성, 유연성 및 휴대성을 갖는 유동-기반 면역요법 생성 기술을 제공한다. 일반적으로, 세포는 여과기에 대한 필요없이 높은 확장을 달성하도록 낮은 유속으로 관류되는, 때때로 카트리지로 지칭되는 일회용 세포 배양 챔버에서 성장한다. 시스템은 본원에 기재된 바와 같이 환자의 세포 물질의 가공을 수행하여 면역요법 생성물을 생성하기 위해 또 다른 것에 유체적으로 커플링되는 1개 이상의 세포 배양 챔버를 지원한다. 특정한 실시양태에서 생물반응기가 폐쇄된 환경에서 제공된다는 것을 이해해야 한다. 일련의 및/또는 병행 가공을 가능하게 하는 모듈 (예를 들어, 생물학적 반응기)을 추가함으로써 이러한 예시적인 실시양태의 규모 확대는 숙련된 기술자의 지식 내에 있을 것이다. 숙련된 기술자는 또한 생성되는 생성물을 기반으로 하여 상이한 또는 대안적인 배열이 바람직할 수 있음을 이해할 것이다.
도 1은 다중-생물반응기 시스템 (900)의 예를 도시한다. 시스템 (900)은 유체 저장소 (980)와 유체 소통하는 튜브 (940)와 연결된 주입구 (845 및 945)를 갖는 제1 세포 배양 챔버 (820) 및 제2 세포 배양 챔버 (920)를 포함한다. 세포 배양 챔버는 폐기물 저장소 (984)와 유체 소통하는 배출구 (835 및 935)를 갖는다. 펌프 (910a 및 910b)는 유체 저장소 (980)로부터 세포 배양 챔버 (820 및 920)로 유체의 펌핑을 촉진시킨다. 펌프는 본원에 기재된 기능을 수행하도록 프로세서 (999)에 의해 제어된다.
생물학적 반응기 (110)의 또 다른 실시양태는 도 2에 도시되며, 이는 세포 배양 챔버 (120)의 부분에 대한 더욱 상세한 개략도를 제공한다. 본원에 기재된 세포 배양 플랫폼이 상이한 부피, 형상 및 물리적 특징을 갖는 세포 배양 챔버가 사용될 수 있도록 구성된다는 점을 주목하는 것이 중요하다. 도 2에 도시된 챔버는 단지 예시적인 것이며, 다른 실시양태가 숙련된 기술자에게 자명할 것이다. 도 2에 도시된 바와 같이, 세포 배양 챔버 (120)는 하부 표면 (122) 및 적어도 1개의 추가의 표면 (124)을 포함한다. 하부 표면 (122)은 세포가 부착하는 제1 물질로 구성된다. 일부 실시양태에서, 적어도 1개의 추가의 표면 (124)은 기체 투과성인 제2 물질로 이루어진다. 하기에 더욱 상세하게 기재될 다른 실시양태에서, 표면 (124)을 비롯한 전체 세포 배양 챔버 (120)는 기체 불투과성인 제1 물질로 제조된다. 세포 배양 챔버는 또한 1개 이상의 주입구 (126, 136) 및 1개 이상의 배출구 (128, 138)를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 생물학적 반응기는 또한 적어도 1개의 관류 유체 저장소 (132), 적어도 1개의 폐기물 유체 저장소 (134), 챔버 (120)를 통해 관류 유체를 이동시키기 위한 적어도 1개의 펌프 (140), 뿐만 아니라 저장소 (132, 134)로 및 그로부터 챔버 (120)를 통해 유체를 수송하기 위한 연관된 주입구 (136) 및 배출구 (138)를 포함한다.
세포 배양 챔버 (120)와 관련하여, 제1 물질은 생체적합성인 임의의 물질일 수 있고, 여기에 항원-제시 세포 (APC) 또는 그들의 전구체, 예컨대 수지상 세포 (DC) 또는 단핵구가 각각 부착할 것이다. 세포 배양 챔버 (120)에서 발생하는 T-세포 자극 및 확장 공정 동안에, 성숙한 APC가 발달하고, 바람직하게는 하부 표면 (122)에 부착할 것이지만, T 세포는 하부 표면 위에 상청액으로 남아 있어서, 확장된 T 세포를 별도로 수득하는 것을 더 용이하게 만든다.
한 예시적인 실시양태에서, 제1 물질은 폴리스티렌을 포함한다. 배양이 일어날 하부 표면을 위해 폴리스티렌을 사용하는 것의 한 이점은, 이 물질이 PBMC로부터 수지상 세포를 생성하는 공정에서 유용한 역할을 한다는 것이다. 구체적으로, 폴리스티렌 표면을 사용하여, PBMC의 이종성 현탁액으로부터 단핵구를 농축시킬 수 있다. 이는 예를 들어 IL4 및 GM-CSF를 함유하는 배지에서 배양을 통해 단핵구의 분화에 의해 DC를 생성하기 위해 이용되는 배양 공정의 제1 단계이다. T 세포 자극의 한 주기에 걸쳐 내내 수지상 세포 생성을 위해 동일한 폴리스티렌 표면의 사용은 그렇지 않으면 필요하게 될 많은 수의 전달 단계를 제거하여 DC-자극된 치료적 T 세포 제조를 위한 폐쇄된 시스템을 가능하게 하기 때문에, 이는 생물공정 관점에서 굉장한 가치가 있다.
하부 표면은 통상적인 웰 플레이트, 예컨대 6- 및 24-웰 플레이트 (각각 9.5 cm2 및 3.8 cm2)와 비슷한 표면적을 가질 수 있다. 또한, 표면적은 통상적인 웰 플레이트 (예를 들어, 표준 세포 배양 접시 및 플라스크와 비슷한 표면적을 가짐)보다 더 작거나 또는 훨씬 더 클 수 있고, 예컨대 약 2.0 cm2 내지 약 200 cm2, 예를 들어 약 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9,0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 75.0, 100.0, 125.0, 150.0, 175.0 및 200.0 cm2의 표면적, 및 그 사이의 임의의 표면적을 가질 수 있음을 이해해야 한다.
적어도 1개의 추가의 표면 (124)은 1개 이상의 측벽 및 상부 벽과 같은 임의의 구성을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 도 2에 도시된 바와 같이, 측벽은 서로에 대해 90도 각도로 배열될 수 있으며, 따라서 하부 표면 (122)과 함께 박스 형상을 형성한다. 또 다른 실시양태에서, 적어도 1개의 추가의 표면 (124)은 굽은 측벽을 형성하며, 따라서 챔버 (120) 또는 그의 횡단면은 원기둥형, 타원 기둥형, 원뿔형, 돔-유사 형상, 또는 삼각형 형상을 형성한다. 상기 예시적인 구성은 비제한적이며, 적어도 1개의 추가의 표면이 상기 언급된 예시적인 구성에 제공되지 않은 다른 구성을 가질 수 있음을 이해해야 한다.
다중-생물반응기 시스템의 예시적인 구성은 도 3에서 확인할 수 있으며, 이러한 구성을 이용하여 수행되는 공정에 관한 추가의 상세한 내용은 하기에 제공된다. 도 3, 패널 B에 도시된 바와 같이, 제2 생물반응기 (210)가 수반되는 경우에는, 제2 세포 배양 챔버 (220)는 제1 챔버의 배출구 및 제2 챔버의 주입구를 통해 제1 세포 배양 챔버 (120)에 연결되도록 위치한다. 연결은 바람직하게는 멸균 연결이다. 연결은 확장된 T 세포를 함유하는 상청액을 제2 세포 배양 챔버 (220)로 옮기기 위해 제1 세포 배양 챔버 (120)로 멸균 공기의 주입을 가능한다. 상청액을 제1 세포 배양 챔버 (120)로부터 제2 세포 배양 챔버 (220)로 옮기기 위해 관련 기술분야에 공지된 대안적인 유체 유동 기술을 이용할 수 있다. 또한 도시된 바와 같이, 각각의 생물반응기는 그 자체의 유체 및 폐기물 수집 저장소, 펌프, 및 연관된 튜브를 포함한다. 그러나, 저장소 및 펌프가 생물반응기 사이에서 공유될 수 있음을 이해해야 한다.
시스템은 세포 배양 챔버의 세포를 본원에 기재된 다양한 세포 배양 방법을 위해 필요한 배지로 관류시킬 수 있도록 구성된다. 관류는 세포-기반 면역요법 생성물의 형성을 보조하기 위해 충분한 기체 교환 및 폐기물 제거와 함께 세포 혼합물에 균일한 영양소 및 시토카인 공급을 보장한다. 배지 및 시토카인의 일관된 국소 농도 프로파일의 유지는 선행 기술의 플레이트-기반 프로토콜과 비교하여 더 양호한 수율, 및 DC로의 단핵구 분화 과정을 가속시키는 잠재적인 능력을 보장한다. 그러나, 기계적 힘에 대한 DC의 높은 민감성과 함께 부착성 (DC) 및 비-부착성 (T 세포) 유형의 조합은 특히 세포 배양 챔버를 통한 유체의 유동과 관련하여 항원-특이적인 T 세포의 자극 및 확장에 대한 도전을 제기한다. 따라서, 배지 및 시토카인이 관류를 통해 제공되는 것인 이들 실시양태에서, 본 발명의 시스템은 생물반응기로부터 세포를 제거하지 않고 특정한 항원-제시 세포, 예컨대 DC의 전단 민감성을 또한 고려하여 영양소 및 시토카인을 세포에 공급할 수 있어야 한다. 본 발명의 시스템 및 방법은 성장 인자를 재생시키고 DC의 최소 물리적 자극을 유지하면서 T 세포 증식을 선호하는 오토크린/파라크린 신호의 보유를 최적화하는 것을 목적으로 한다. 이를 고려하기 위해서는, 세포 배양 챔버를 통한 관류 유동의 방향 및 속도 둘 다를 고려해야 한다.
특정한 측면에서, 유체 유동 속도는 항원-제시 세포의 침강 속도보다 낮게 유지된다. 따라서, 항원-제시 세포는 그들의 질량 때문에 배양 챔버 내에 남아 있을 것이다. 달리 말하면, 항원-제시 세포는 세포 배양 챔버의 하부를 향해 가라 앉을 것이고, 따라서 세포 배양 챔버에 남아 있을 것이다.
침강 속도보다 낮은 유동 속도는 방정식 1에 따라 계산될 수 있다:
v_max= [(ψd_p)]^2/150μ g(p_세포-p_액체)e^3/(1-e)
상기 식에서, v_max는 세포가 위쪽으로 들어 올려지는 액체 속도이고, ψ는 세포의 형상 인자이고 (동일한 부피의 구체의 표면적에 대한 세포의 표면적의 비; 세포가 완벽하게 구체가 아님을 주목하고, 이 인자는 1 미만일 것으로 예상됨), d_p는 세포와 동일한 부피를 갖는 구체 입자의 직경이고, μ는 세포를 함유하는 액체의 속도이고, g는 중력 상수이고, p_세포는 세포의 밀도이고, p_액체는 세포를 함유하는 액체의 밀도이고, e는 세포에 의해 점유되지 않는 관심 부피의 분율이다.
배지의 관류를 수반하는 하기 기재된 방법에서, 관류가 배양하는 동안에 연속적으로 수행될 수 있거나, 또는 임의의 하나의 세포 배양 챔버에서 세포가 배양되는 기간에 걸쳐 특정한 시점에서, 예를 들어 매일 또는 매주 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과로 발생할 수 있음을 이해해야 한다. 연속적인 관류는 공정을 통해 거의 일정한 배양 부피를 유지하는데 도움이 된다. 마찬가지로, 시토카인은 배양하는 동안 1회 이상의 시점에서, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 그 초과로, 또는 연속적으로 주입될 수 있다. 이들 실시양태에서, 연속적인 관류는 시토카인의 일관된 국소 농도 프로파일을 유지하는데 도움이 되고, 이는 보다 양호한 수율을 보장하는데 도움이 될 수 있으며, 정적 세포 배양 방법과 비교하여 T 세포가 자극되고 확장되는 속도를 증가시키는 능력을 갖는다.
관류 파라미터는 배양 주기 동안에 임의의 시점에서 변경될 수 있다. 예시적인 파라미터에는 중간 유동 속도, 시토카인 농도, 및 배양 주기 기간이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 이들 각각의 파라미터는 T-자극의 효능에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 번호 PCT/US2016/040042 및 PCT/US2016/60701에 기재된 바와 같이 DC로 단핵구-확산을 위한 배양 챔버를 설계하는 최근의 작업에서, 0.1 dyn/cm2의 벽 전단 응력 수준에 상응하는 배지 관류 속도가 통상적인 6- 또는 24-웰 플레이트-기반 프로토콜을 이용하여 생성되는 것들과 표현형이 동일한 DC를 생성할 수 있는 것으로 결정되었다. 따라서, 배양 주기 동안에 상기 기재된 표현형 및 기능 측정 중 1개 이상을 측정함으로써, 효능에 대한 1개 이상의 관류 파라미터의 효과를 모니터링할 수 있고, 이는 적절한 조정을 가능하게 한다.
관류를 용이하게 하기 위해, 시스템은 1개 이상의 펌프 (140)를 포함한다. 펌프는 세포 배양 챔버로 관류 배지를 관류시키기 위해 세포 배양 챔버 (120)에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 생물반응기 (110)는 또한 1개 이상의 유체 저장소 (132)를 포함할 수 있다. 유체 저장소 (132)는 세포 배양 챔버 (110)와 유체 소통하고, 1개 이상의 펌프 (140)에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 유체 저장소를 펌프 및 세포 배양 챔버에 연결하기 위한 1개 이상의 튜브가 또한 제공된다. 특정한 측면에서, 1개 이상의 펌프는 유체 저장소로부터 세포 배양 챔버를 통해 폐기물 수집 저장소로 유체를 펌핑하도록 구성된다. 도 2에 도시된 예시적인 실시양태에서, 유체는 유체 저장소 (132)로부터 튜브 (152)를 통해 펌프 (140)로 및 주입구 (136)를 통해 세포 배양 챔버 (120)로, 배출구 (138)를 통해 다시 세포 배양 챔버 (120)로부터, 튜브 (154)를 통해 폐기물 수집 저장소 (134)로 이동한다.
특정한 실시양태에서, 유체 저장소 및/또는 폐기물 수집 저장소는 각각 챔버에 유체적으로 커플링된 1개 이상의 밀봉된 백 또는 컨테이너로서 제공될 수 있다. 각각의 저장소는 주입구 포트 및 배출구 포트, 또는 배출구 포트 및 1개 이상의 세포 배양 챔버의 주입구에 유체적으로 커플링된 통풍구를 함유한다. 일부 실시양태에서, 루어 커넥터, 및 루어 커넥터 주위에 맞도록 절단된 실리콘 개스킷을 이용하여, 주입구 또는 배출구 중 하나 또는 둘 다를 통한 누출을 방지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 밀봉된 저장소는 용기를 외부 환경에 노출시키지 않고 멸균성을 유지하면서 유체 연결을 생성하는 멸균 튜브 용접 기기를 사용하여 세포 배양 챔버에 연결될 수 있다. 하기에 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 이는 본 발명의 방법이 폐쇄된 시스템에서 수행될 수 있도록 한다.
개시된 세포 배양 시스템의 소형 크기 및 휴대성으로 인해, 이들은 튜브 용접 기기와 함께 용이하게 사용될 수 있다. 본 발명의 시스템은 필요한 멸균 연결을 만들기 위해 용이하게 들어 올려지고 튜브 용접기에 근접하게 운반될 수 있다. 세포 배양 시스템의 크기 및 구성은 또한 이들이 표준 인큐베이터와 상용성이게 만든다. 세포 배양 시스템은 통상적인 인큐베이터 내부의 단일 선반에 맞도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성되어, 개시된 공정이 그 안에서 수행될 수 있다. 다중 장비는 구성에 따라 단일 인큐베이터에 맞을 수 있다. 인큐베이터 내부 조건에는 37℃의 지속적인 온도 및 95-100% 습도가 포함된다. 따라서, 물질 (유체 및 생물학적 제제 포함)이 이러한 조건하에 확장하는 경향이 있음을 감안하여, 선택된 물질은 이들 조건을 견디기 위해 온전성을 가져야 한다. 추가로, 일부 상황에서, 인큐베이터 내부 조건은 안정하게 유지되고, 온도의 자동 기록을 통해, 인큐베이터에서 수행되는 반응에서 임의의 이상과 상관관계가 있는 온도 변동에 대한 지식을 가질 수 있다.
따라서, 임의의 전력 공급은 인큐베이터 내의 환경을 변화시키지 않아야 한다. 예를 들어, 특정한 펌프는 열을 생성한다. 따라서, 한 실시양태에서, 펌프는 생물학적 반응기와는 별도로 하우징되지만, 여전히 반응기와 유체 소통 및 작동가능한 소통을 한다. 또 다른 실시양태에서, 펌프는 생물학적 반응기에 직접적으로 부착되고, 인큐베이터 내에 위치하지만, 열이 없거나 또는 열을 발산시키기 위해 방열판 및/또는 팬에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 실시양태에서, 펌프는 생성된 열의 양을 감소시키기 위한 의무 주기로 작동된다. 구성과 무관하게, 펌프는 생물학적 반응기에, 그리고 세포 배양 챔버에 작동가능하게 커플링된다. 일부 실시양태에서 시스템은 또한 세포 배양 저장소 및 임의적으로 유체 저장소의 온도를 제어하기 위한 가열기를 포함한다. 이러한 구성에서는, 인큐베이터가 필요 없으며, 시스템은 전기 전력 공급원만 가지며 자동으로 작동할 수 있다. 시스템에 가열기가 없는 경우, 이는 세포 배양 인큐베이터의 내부에서 작동될 수 있다.
관류-기반 자동화 세포 배양 시스템, 예컨대 온보드 일회용 연동 펌프에 의해 가능한 온보드 시약 보관 및 관류를 이용하여 내피 세포 배양을 위한 소규모 배양 시스템, 및 폴리스티렌 하부 표면을 갖는 챔버를 사용하여 단핵구로부터 수지상 세포 생성을 위한 더욱 대규모 배양 시스템에 관한 추가의 상세한 내용은 국제 특허 공개 WO 2017/004169; WO 2017/079674; 및 WO 2018/005521; 뿐만 아니라 미국 특허 출원 일련 번호 16/539,916에서 확인할 수 있으며; 이들 각각은 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 시스템 또는 기기는 모듈식이고, 다른 유사한 기기에 일련으로 (즉, 한 기기로부터 또 다른 기기로 유체가 유동함) 및/또는 병렬로 유체 연결될 수 있으며, 또한 인큐베이터와 같은 관련 기기 내에서 서로 물리적으로 적층되거나 또는 물리적으로 배열될 수 있도록 구성될 수 있다. 시스템의 모듈식 설계는 구체적으로 시스템 내에 포함된 원하는 공정에 따라 모듈이 유연하게 전환될 수 있게 한다.
세포 배양 챔버를 포함하는 생물학적 반응기를 비롯한 본 발명의 유체 기기는 마이크로유체 실시양태 (즉, 그 안의 1개 이상의 채널 또는 챔버가 약 1 μm 내지 약 999 μm 범위의 치수를 가짐) 또는 마크로유체 실시양태 (그 안의 채널 또는 챔버 모두가 약 1 mm 이상의 치수를 가짐), 또는 이들 둘 다로 제공될 수 있다.
유체 기기는 특정한 설계에 의해 요구되는 추가의 유체 채널 또는 구획, 개스킷 또는 밀봉, 혼합 대역, 밸브, 펌프, 통풍구, 가압 기체용 채널, 전기 전도체, 시약, 포트 및 튜브를 추가로 포함할 수 있다. 이들은 또한 1개 이상의 제어 모듈, 송신기, 수신기, 프로세서, 메모리 칩, 배터리, 디스플레이, 버튼, 제어기, 모터, 공압 작동기, 안테나, 전기 커넥터 등을 함유할 수 있다. 기기는 바람직하게는 포유동물 세포에 대해 무독성이며, 알콜 및/또는 열 또는 다른 수단을 이용하는, 예컨대 감마 방사선 또는 에틸렌 옥시드 기체에 노출시키는 멸균화에 상용성인 물질만을 함유한다.
장비의 물질은 각각의 공정에 대한 상이한 온도 및 압력 등급하에 적절한 화학적 상용성을 갖도록 선택된다. 추가로, 시린지, 연동식, 압력식 및 회전식 펌프와 같은 기기에서 실행되는 펌프의 선택은 상이한 기능에 대한 유동 및 압력 요건에 따라 nL 내지 mL 범위의 유동 속도 및 10 내지 10,000 psi 범위의 압력이다.
본 발명의 시스템은 또한 모듈의 다양한 주입구에서 샘플을 기기에 도입시키기 위해 1개 이상의 샘플 용액 저장소 또는 웰 또는 다른 장치를 포함할 수 있으며, 이는 주입구 채널과 유체 소통한다. 1개 이상의 샘플을 본 발명의 유체 기기 상에 로딩하기 위한 저장소 및 웰에는 시린지, 카트리지, 바이알, 에펜도르프 튜브 및 세포 배양 물질 (예를 들어, 96 웰 플레이트)이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
유용한 경우, 기기의 표면은 예컨대 플라즈마에 노출시켜 더욱 친수성으로 만들 수 있거나, 또는 하나 이상의 겔, 화학적 기능화 코팅, 단백질, 항체, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸, 시토카인, 또는 세포로 코팅될 수 있다. 본 발명의 유체 기기는 바람직하게는 수일 내지 수주의 기간에 걸쳐 작동 조건하에 유체 누출이 없고, 멸균 작동이 가능하다. 본 발명의 유체 기기는 또한 시스템에 새로운 물질 또는 오염물을 도입시키지 않고 시험을 위해 시스템으로부터 유체를 제거할 수 있게 하는 샘플링 메카니즘을 포함한다.
특정한 측면에서, 세포 배양 시스템의 적어도 일부는 일회용 성분을 포함하며, 이 중 일부 또는 전부는 비-일회용 프레임 내에 하우징 될 수 있다. 다른 측면에서, 시스템의 모든 성분은 일회용이다. 추가로, 일부 실시양태에서, 세포 배양 시스템은 환자 물질의 추적 및 문서화를 위해 샘플 추적 성분을 포함한다.
제조 공정 동안에 적어도 1개의 단계, 및 때때로 복수개의 또는 모든 단계는 다양한 인라인 공정 분석 도구 (PAT) 또는 소형화된 미세-총계 분석 시스템 (micro-TAS)을 이용하여 생성물 특징 (예를 들어, 순도 및 다형체 형태)에 대해 모니터링된다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 세포 배양 시스템은 시스템 내에서 유체 및 실체의 방향 및 유동을 제어할 수 있다. 본 발명의 시스템은 압력 구동 유동 제어기를 사용하여, 예를 들어 밸브 및 펌프를 사용하여, 세포, 시약 등의 유동을 1가지 이상의 방향으로 및/또는 유체 기기의 1개 이상의 채널로 조작할 수 있다. 그러나, 다른 방법, 예컨대 전기-삼튜 유동 제어, 전기영동 및 유전영동 또한 단독으로 또는 펌프 및 밸브와 조합되어 이용될 수 있다 (Fulwyer, Science 156, 910 (1974); Li and Harrison, Analytical Chemistry 69, 1564 (1997); Fiedler, et al. Analytical Chemistry 70, 1909-1915 (1998); 미국 특허 번호 5,656,155).
본 발명의 시스템은 또한 시스템을 통한 유체의 이동을 제어하고; 시스템 내의 다양한 파라미터, 예컨대 온도를 모니터링하고 제어하고; 뿐만 아니라 세포-기반 면역요법 생성물의 존재, 생성물의 양 (직접적으로 또는 간접적으로), 전환율 등을 검출하기 위해 1개 이상의 제어 시스템을 포함하거나 또는 그에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 시스템에는 또한 수많은 부류의 소프트웨어, 예컨대 피드백 제어를 가능하게 하는 고급 실시간 공정 모니터링 및 제어 공정, 뿐만 아니라 시스템을 이용하여 수득한 반응 및 정제 결과에 따라 통합 및 규모 확대를 가능하게 하는 공정이 구비될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 시스템은 채널 치수, 유동 기하학, 및 기기의 상이한 모듈간의 상호 연결의 측면에서 교환가능한 마이크로-, 밀리- 또는 마크로-유체 모듈 및 튜브의 조합물을 포함한다. 각각의 모듈 및 튜브는 구체적인 기능을 위해 설계될 수 있다. 한 실시양태에서, 시스템 내의 모든 모듈은 세포 배양 및 T-세포 자극을 위해 설계된다. 다른 실시양태에서, 시스템과 함께 모듈은 상이한 기능, 예컨대 조직 가공, 수지상 세포 생성, 세포 배양, 농도, 및/또는 정제를 위해 설계되며, 이들 모두는 면역요법 생성물의 연속적인 제조를 위해 통합된다. 유동 적용에 적합한 동종성 및 이종성 공정 둘 다 고려된다. 이들 공정은 유동 공정 동안에 시스템이 쉽게 막히지 않도록 출발 물질 및 작동 조건, 예컨대 온도, 압력 및 유동 속도와 관련하여 설계되고 최적화된다.
기체 불투과성 세포 배양 챔버
일부 실시양태에서, 개시된 시스템의 세포 배양 챔버는 기체 불투과성 물질로 제조된다. 기체 불투과성 물질은 생체적합성이고, 수지상 세포가 부착하는 물질이다. 한 예시적인 실시양태에서, 기체 불투과성 물질은 폴리스티렌을 포함하며, 이는 상기 기재된 바와 같이 PBMC의 이종성 현탁액으로부터 단핵구를 농축시키는데 유용하다. 기체 불투과성 물질로 제조된 전체 세포 배양 챔버는 세포가 부착할 수 있는 더 큰 표면적을 제공하고, 시스템의 멸균성을 증가시킨다.
추가의 표면 (124) 및 챔버 (120)의 다른 모든 표면이 하부 표면 (122)과 동일한 물질로 제조되는 것을 제외하고는, 기체 불투과성 세포 배양 챔버는 도 2에 도시된 챔버 (120)와 실질적으로 동일할 수 있고, 상기 기재된 임의의 부피, 형상, 크기, 및 물리적 특징을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 챔버 (120)의 상부, 하부, 및 모든 측벽은 기체 불투과성이다. 기체 불투과성 세포 배양 챔버의 하부 표면은 통상적인 웰 플레이트, 예컨대 6- 및 24-웰 플레이트 (각각 9.5 cm2 및 3.8 cm2)와 비슷한 표면적을 가질 수 있다. 또한, 표면적은 통상적인 웰 플레이트 (예를 들어, 표준 세포 배양 접시 및 플라스크와 비슷한 표면적을 가짐)보다 더 작거나 또는 훨씬 더 클 수 있고, 예컨대 약 2.0 cm2 내지 약 200 cm2, 예를 들어 약 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9,0, 10.0, 11.0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 16.0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 75.0, 100.0, 125.0, 150.0, 175.0, 및 200.0 cm2의 표면적, 및 그 사이의 임의의 표면적을 가질 수 있음을 이해해야 한다.
챔버가 기체에 대해 투과성이 아닌 경우에는, 상기 기재된 시스템에 대해 특정한 변형을 만들 필요가 있다. 예를 들어, 기체가 세포 배양 챔버의 표면 중 하나를 통해 흐르지 않는 이러한 실시양태에서, 세포와 배지 사이의 기체 교환은 또 다른 방식으로 촉진되어야 한다. 세포 배양 챔버는 1개 이상의 주입구 (126 및 136) 및 1개 이상의 배출구 (128 및 138)를 포함한다. 주입구 및 배출구 개구부는 각각의 개구부로 밀봉된 튜브에 유체적으로 커플링될 수 있다. 이에 의해 주입구 및 배출구는 챔버를 통해 관류 유체를 이동시키기 위한 상응하는 펌프를 갖는 관류 유체 저장소 및 폐기물 유체 저장소에 연결가능하다. 주입구 및 배출구는 챔버의 임의의 표면에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들은 챔버의 상부에 위치한다. 튜브는 바람직하게는 고투과성 튜브이며, 기체 교환을 수행하기 위해, 배지는 고투과성 튜브를 통해 챔버에 들어가기 전에 및 챔버로부터 나온 후에 기체 교환할 수 있다. 따라서, 기체는 1개 이상의 주입구를 통해 챔버에 효과적으로 유입되고, 1개 이상의 배출구를 통해 제거된다. 주입구 또는 그에 연결된 튜브는 세포 배양 챔버에 들어가는 액체 또는 공기를 여과하기 위한 여과기, 예컨대 0.2 마이크로미터 여과기를 포함할 수 있다.
기체 유동은 관류 속도에 의해 영향을 받으며, 이는 상기 기재된 바와 같이 제어될 수 있는 파라미터이다. 고투과성 튜브를 통해 기체를 교환함으로써, 시스템은 챔버가 기체 투과성일 필요없이 필요한 수준의 기체 교환을 달성하는 능력을 유지한다. 세포 배양 방법은 관류 및 기체 유동을 위해 주입구 (126 및 136) 및 배출구 (128 및 138)를 갖는 완전히 기체 불투과성인 챔버에서 수행될 수 있다. 방법 실시양태에서, 기체 불투과성 세포 배양 챔버를 이용하여, 세포를 챔버에 로딩하고, 주입구 및 배출구를 통해 챔버 안팎으로 세포 배양 배지를 유동시켜 세포를 관류시킴으로써 세포를 배양할 수 있다. 관류 유동은 세포 배양물에 영양소 뿐만 아니라 기체 교환을 제공한다. 챔버를 통한 유동이 층류이기 때문에, 일부 방법은 예컨대 세포 수확을 위해 추가의 진탕을 필요로 할 수 있다. 그러나, 개시된 시스템의 크기 및 구성을 고려할 때, 전체 시스템은 필요에 따라 궤도 진탕기 상에 배치될 수 있다.
기체 불투과성 실시양태의 또 다른 이점은 상이한 부품 및 물질이 적기 때문에, 이들을 제조하기가 더 용이하다는 것이다. 이들은 필요에 따라 크거나 작게 만들 수 있다. 기체 불투과성 챔버는 일체형으로 형성될 수 있거나 또는 다중 부품으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 이는 전통적인 제조 공정 또는 적층 제조 공정, 예컨대 3D 인쇄에 의해 물질의 단일 부분으로 형성될 수 있다. 실시양태에서, 각각 기체 불투과성 물질로 제조된 복수개의 부재가 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 기계적 고정, 접착제 및 용매 결합, 및 용접, 예컨대 초음파 용접을 이용하여 함께 결합된다.
세포 배양 챔버의 교환가능성
본 발명의 세포 배양 시스템은 다양한 크기 및 형상의 세포 배양 챔버와 연결될 수 있도록 구성된다. 세포 배양 시스템은 유체 저장소, 폐기물 저장소, 및 저장소로/로부터 유체 유동을 제어하기 위한 1개 이상의 펌프를 포함할 수 있다. 세포 배양 시스템은 또한 상이한 형상 및 크기의 1개 이상의 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성된 영역을 갖는다. 1개 이상의 튜브는 유체 저장소, 세포 배양 챔버, 및 폐기물 저장소와 유체적으로 연결된다. 펌프는 튜브를 통해 유체를 이동시키도록 구성된다.
상이한 세포 배양 챔버 크기가 상이한 목적을 위해 또는 서로 조합되어 사용될 수 있다. 크기는 원하는 세포 산출량, 또는 필요한 시약의 상이한 비율을 기반으로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 소형 카트리지 크기는 연구, 전임상 용도, 또는 공정 개발에 유용할 수 있다. 대형 카트리지는 동일한 아키텍쳐를 갖는 고용량 버전이다.
1개 이상의 세포 배양 챔버의 높이는 다양할 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 세포 배양 챔버 높이의 예시적인 범위에는 0.5 mm 내지 100 mm, 예컨대 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 15.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0, 45.0, 50.0, 55.0, 60.0, 65.0, 70.0, 75.0, 80.0, 85.0, 90.0, 95.0, 100.0 mm, 또는 그 초과의 높이, 또는 그 사이의 임의의 높이가 포함된다. 특정한 실시양태에서, 챔버의 높이는 약 0.8 mL 내지 6 mL의 부피 용량에서 전형적으로 6- 및 24-웰 플레이트에서 수행되는 배양물의 액체 높이, 예컨대 2 내지 6 mm와 비슷할 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포 배양 챔버는 약 50 cm2의 배양 표면에서 더 큰 크기, 예컨대 10 mm 내지 50 mm일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 챔버는 약 1 mL 내지 약 100 mL의 부피 용량을 갖고, 대략 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 mL, 또는 그 사이 어디든일 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포 배양 챔버는 약 100 mL 내지 약 1,000 mL, 예를 들어 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1,000 mL의 부피 용량을 갖는다. 특별한 실시양태에서, 세포 배양 챔버는 210 mL의 용량을 갖는다.
본 발명에 의한 카트리지의 교환가능성은 동일한 시스템을 사용하는 세포 성장 절차 동안에 규모 확대를 가능하게 한다. 이는 세포를 계속해서 성장시키기 위해 상이한 세포 배양 시스템으로 전환할 필요를 없애 준다. 예를 들어, 약 20억 개 세포의 배치 크기를 제조하기 위해서는, 시스템을 약 25 mL 용량의 소형 카트리지에서 시작한 다음, 약 210 mL 용량의 대형 카트리지로 규모 확대시킬 수 있다. 이 교환가능성은 활성화에서부터 충전을 통해 마무리까지 공정의 더 많은 부분이 동일한 시스템에서 수행될 수 있음을 의미한다. 특정한 프로토콜의 필요에 따라, 시스템은 예를 들어 2개의 대형 (대략 210 mL) 세포 배양 챔버, 2개의 소형 (대략 25 mL) 세포 배양 챔버, 또는 이들 중 하나에서 작동가능하다. 각각의 주입구 및 배출구가 임의의 크기 챔버에 연결될 수 있기 때문에, 시스템은 필요에 따라 규모 확대 또는 규모 축소될 수 있다.
다시 도 1을 참고하면, 시스템 (900)은 1개 이상의 세포 배양 챔버 (820 및 920)를 지원하도록 구성된 플랫폼 (950)을 포함한다. 형상 또는 크기와는 무관하게, 세포 배양 챔버는 튜브 (940)를 통해 연결될 수 있다. 이러한 방식으로, 상이한 형상 및 크기의 세포 배양 챔버가 시스템과 상용성이다. 세포 배양 챔버는 플랫폼 상에서 상이한 구성으로 배열될 수 있고, 예컨대 나란히 배치되거나 또는 적층될 수 있다. 실시양태에서, 튜브 (940)는 챔버와 일체형으로 형성된다. 튜브 및 챔버 바디는 상기 논의된 동일한 제조 방법을 이용하여 함께 결합될 수 있다. 한 실시양태에서, 세포 배양 챔버는 1개 이상의 주입구 또는 배출구의 형성을 가능하게 하도록 절단된 측벽 및/또는 상부 벽에서 물질의 적어도 일부로 제조된다. 예시적인 배열에서, 튜브는 개구부에 별도로 삽입되어 용기에 밀봉을 형성할 수 있다. 상기 언급된 구성이 단지 예시적이고, 챔버 및 1개 이상의 튜브를 결합시키기 위해 다른 구성 또한 본 발명의 실시양태에서 고려된다는 것을 이해해야 한다.
교환가능성은 시스템의 다양한 용기 및 챔버를 커플링시키기 위해 멸균 튜브 연결을 이용함으로써 부분적으로 촉진된다. 멸균 튜브는 바람직하게는 멸균 튜브 용접기를 사용하여 연결된다. 일반적으로, 멸균 튜브 용접기는 2개의 튜브를 수용하고, 제자리에서 그들을 고정시킨 다음, 고온 블레이드로 절단할 수 있는 기기이며, 제1 튜브 및 제2 튜브가 정렬되도록 그들을 재정렬하고, 블레이드가 오므려졌을 때 두 절단 말단을 함께 용융시킨다. 본 발명에서 사용하기 위한 멸균 튜브 용접기는 테루모 비씨티, 인크.(Terumo BCT, Inc., 콜로라도주 레이크우드)로부터의 SCD® IIB; 반테 바이오팜(Vante BioPharm, 아리조나주 투손)으로부터의 반테(Vante)® 3690; 및 제네시스 비피에스(Genesis BPS™, 뉴저지주 램지)로부터의 TCD®를 비롯한 임의의 상업적으로 입수가능한 멸균 튜브 용접기일 수 있다.
하기에서 더욱 상세하게 기재되는 바와 같이, 특정한 실시양태에서, 시스템은 기능적으로 폐쇄된다. 폐쇄된 시스템은 모든 수송이 멸균 튜브 용접을 이용하여 수행됨으로써 유지된다. 예를 들어, 세포는 멸균 백에 보관될 수 있고, 이어서 이는 멸균 세포 배양 챔버에 연결된다. 멸균성을 유지하면서 세포를 세포 배양 챔버로 유동시킬 수 있다. 튜브 연결성은 세포 시딩, 세척 및 수확이 멸균 조건하에 동일한 기기에서 모두 수행될 수 있게 한다. 멸균 튜브 용접기를 사용함으로써, 1개의 백을 또 다른 백에 연결하기 전에 분리할 필요가 없다.
상기 설명은 시스템 성분 및 다양한 가능한 구성에 중점을 둔다. 하기 설명은 본 발명의 시스템을 이용하여 수행될 수 있는 특정한 공정에 중점을 둔다.
폐쇄된 시스템에서 CAR-T 및 TCR 공정
상기 기재된 세포 배양 시스템은 CAR-T 및 TCR 형질도입된 T 세포를 생성하는 방법에서 유용하다. CAR-T/TCR 워크플로우의 시각화가 도 4에 도시된다. 개시된 시스템을 이용하여, 유전자 변형, 세포 확장, 세포 세척 및 농축, 및 세포 제형화를 비롯하여, 폐쇄된 시스템에서 워크플로우의 몇몇 단계를 수행할 수 있다. CAR-T 및 TCR 형질도입된 T 세포를 생성하기 위해 산업에서 이용되는 이전의 공지된 방법은 폐쇄된 시스템에서 수행되지 않는다. 일반적으로 사용되는 폴리스티렌 T 플라스크는 수송을 수행하기 위해 개방 및 폐쇄되어야 하고, 따라서 잠재적인 오염이 발생한다. 본 발명은 고체 폴리스티렌으로 제조된 폐쇄되고 교환가능한 카트리지를 사용하며, 이는 T 플라스크에 대해 설계된 프로토콜이 개시된 멸균 시스템에서 수행되도록 용이하게 재포맷될 수 있게 한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 T 세포를 갖는 배양 챔버로 세포 배양 배지를 유동시키고, T 세포를 관류시켜, 이들을 형질도입 시약, 예를 들어 CAR 또는 TCR을 발현하는 불활성 바이러스로 형질도입시키는 것을 수반한다. 관류 유체는 세포를 확장시키기 위해 활성화 시약을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 형질도입 및/또는 활성화 시약을 세포와 미리 혼합하고, 다른 실시양태에서, 이들은 별도의 멸균 백 또는 용기로부터의 것이다. 백은 상기 기재된 바와 같이 멸균 용접 수단을 통해 연결될 수 있고, 시약은 중력에 의해 또는 펌프에 의해 백으로 유동될 수 있다. 일부 실시양태에서, 헤드스페이스가 거의 없거나 전혀 없도록 세포 배양 챔버를 완전히 채운다.
세포를 약 3 일 이하 동안 성장시키고, 그 동안에 이들이 CAR, TCR 상에 있도록 하고, 관류 배지에 의해 지속시킨다. 세포는 챔버에서 침전물을 형성하고, 관류 속도는 세포가 카트리지로부터 유동되어 나오지 않도록 충분히 낮게 유지된다. 형질도입된 세포는 배양 챔버에서 확장된 다음, 추가의 확장을 위해 멸균 튜브를 통해 연결되는 더 대형의 배양 챔버로 옮겨질 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 소형 카트리지 (25-mL 부피)에서 7 일 확장은 약 5억 내지 10억 개의 T 세포를 수득할 수 있고, 대형 카트리지 (210-mL 부피)는 약 10억 내지 30억 개의 T 세포를 수득할 수 있다.
관류 백과의 연결을 분리시키고, 수확 백에 부착시킨다. 이어서, 세포를 수확 백을 배수시킨다. 실시양태에서, 완충제 백은 동일한 방법에 의해 연결될 수 있고, 세포를 수확 백으로부터 제거하기 전에 세포를 1회 이상 세척하기 위해 사용될 수 있다. 한 액체를 배수시키고, 또 다른 액체를 첨가하고, 새로운 부피의 액체에 세포를 재현탁시킴으로써 세포가 있는 액체의 부피를 증가시키거나 또는 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스템을 배수시켜, 축적된 락트산을 제거할 수 있다. 세포 배양물이 확장됨에 따라, 락트산이 축적되고, 관류만으로는 충분히 빠르게 제거되지 않을 수 있다. 해결책은 세포를 제거하지 않고 배지를 배수시켜 총 부피를 감소시킨 다음 (아마도 90-95%만큼), 신선한 배지로 관류시키는 것이다. 일부 실시양태에서, 배지를 상이한 세포 배양 배지 또는 냉동보존 배지로 교체할 수 있다.
옮길 때 임의의 용기를 개방하여 배지를 공기에 노출시킬 필요없이 전체 방법이 폐쇄된 환경에서 수행되도록 세포 배양 챔버는 폐쇄된 시스템으로 연결된다. 언급된 바와 같이, 상기 방법의 모든 연결 및 분리는 멸균 튜브 용접기에 의해 수행될 수 있다.
선행 기술과 달리, 개시된 활성화, 형질도입 및 확장 방법은 폐쇄된 멸균 시스템에서 수행된다. 상기 기재된 교환가능성에 의해, 모두 폐쇄된 환경에서 사용자는 배치의 규모를 100억 내지 200억 개의 확장된 세포로 확대시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 방법을 이용하여 더 대형의 생물반응기 시스템에서 제조하기 위한 배치를 제조할 수 있다. 통상적인 CAR-T 제조에서, 100억 개 이상의 세포의 배치가 필요하다. 현재 개시된 시스템 및 방법은 10억 개 이상의 세포를 더 대형의 확장 시스템, 예컨대 지이 헬쓰케어(GE Healthcare, 일리노이주 시카고)로부터 입수가능한 수리(XURI)™로 옮기기 전에 활성화, 형질도입 및 초기 확장의 상류 단계를 수행할 수 있다. 이러한 능력은 시스템이 비-자성 활성화 시약과 매우 상용성이게 만든다.
도 5-6은 플라스크웍스, 엘엘씨(Flaskworks, LLC, 메사추세츠주 보스턴)로부터의 바톤(BATON)™으로 공지된 현재 개시된 시스템, 및 윌슨울프(WilsonWolf, 미네소타주 세인트 폴)로부터 또 다른 상업적으로 입수가능한 T 세포 확장 플랫폼 지-렉스(G-REX)®에 의해 수행되는 T 세포 확장 사이의 비교의 예를 도시한다. 도 5는 25 mL 카트리지에서 작동하는 써모 피셔(Thermo Fisher, 메사추세츠주 월텀)로부터의 디나비즈(DYNABEADS)®에 의해 자극된 PBMC와 함께 9 일에 걸쳐 바톤™을 이용한 확장 배수의 그래프를 도시한다. 바톤™에 의해 달성된 확고한 확장 배수는 지-렉스®와 비슷하다.
도 6은 두 시스템을 이용하여 0 일째 및 7 일째에 세포의 수를 도시한다. 바톤™의 경우, 본 개시내용에 따라 210 mL 카트리지에서 7 일 내에 4천만 개의 T 세포로부터 대략 10억 개의 세포가 수득되었다. 표현형은 주로 중추 기억이다. 도 7에 추가로 도시된 바와 같이, 표현형 프로파일은 바톤™ 및 지-렉스® 사이에서 비슷하다. 도면은 또한 코닝 인크.(Corning Inc., 뉴욕주 코닝)로부터 입수가능한 T75 플라스크를 비교한다. 도시된 바와 같이, 바톤™ 및 지-렉스® 둘 다 9 일째에 동등한 CD4/CD8 비를 생성하였다.
도 8에 도시된 바와 같이, 바톤™에 의해 생성된 T 세포의 세포독성은 지-렉스®와 비슷하다. 이펙터 세포를 9 일 동안 확장시켰고, 표적 세포는 Jurkat T 세포였다. 세포를 이펙터-대-표적의 10:1 비로 혼합하고, 37℃에서 5% CO0에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 배지는 RPMI 1640 (ATCC) + 15% FBS였다. 3 가지 모든 그룹으로부터 5 일째 및 7 일째 세포는 세포독성이 비슷하였다.
폐쇄된 시스템에서 신생항원 공정
개시된 시스템은 또한 신생항원-표적화 T 세포를 생성하기 위한 워크플로우에서 유용하다. 이러한 부류의 치료제는 종양-특이적인 펩티드 및 자가 T 세포의 라이브러리로 자극된 항원-제시 세포의 공동-배양을 수반한다. 신생항원 제시 세포의 제조는 CAR-T에 비해 더 복잡하다. CAR/TCR과는 달리, 본 발명의 방법은 단지 1개가 아니라 표적의 라이브러리를 추구할 수 있다. 이는 선행 기술 시스템으로부터 입수 불가능한 현재 개시된 시스템에 의해 제공되는 특정한 능력을 필요로 한다.
본 발명의 시스템은 환자 단핵구로부터 신선한 수지상 세포를 생성한다. 시스템은 또한 수지상 세포를 환자 PBMC 또는 T 세포와 공동-배양하고, 자극된 T 세포를 전달하도록 구성된다. 시스템은 신선하게 생성된 수지상 세포와 공동-배양의 다중 주기를 수행하여, 상이한 항원 사이의 경쟁 효과를 피할 수 있다. 이 공정을 촉진시키기 위한 수지상 세포 및 T 세포의 병행 가공은 하기에 더욱 상세하게 기재될 것이다. 신생항원 요법에 대한 전형적인 용량 크기는 약 2억 개의 T 세포이고, 이는 소형 (대략 25 mL) 또는 대형 (대략 210 mL) 카트리지에서 개시된 시스템에 의해 취급될 수 있다.
선행 기술 방법과는 달리, 본 발명의 시스템은 폐쇄된 환경에서 상기 모든 것을 촉진시킨다. 상기 방법은 본 발명의 시스템의 상호연결된 세포 배양 챔버를 사용한다. 정제된 단핵구를 세포 배양 챔버 중 하나에 도입시키고, 정제된 T 세포를 다른 챔버에 도입시킨다. 단핵구를 세포 배양 배지로 관류시켜, 수지상 세포를 생성한 다음, 종양-특이적인 펩티드를 포함하는 항원 물질과 접촉시킨다. 이는 종양-특이적인 펩티드를 제시하는 성숙한 수지상 세포를 생성한다. T 세포는 성숙한 수지상 세포를 함유하는 챔버로 옮겨서, 이들을 T 세포와 공동-배양한다. 공동-배양은 신생항원-표적화 T 세포를 생성한다. 공동-배양을 통한 자극의 1 주기 후에, T 세포를 제거하고, 임의적으로 신선하게 생성된 성숙한 수지상 세포를 함유하는 제2 챔버로 유동시켜, 제2 공동-배양을 수행할 수 있다. 수지상 세포의 제2 배치는 제1 챔버에서 생성된 수지상 세포로부터 비동시적으로 생성될 수 있다.
실시양태에서, 성숙한 수지상 세포는 제1 챔버에서 생성된 다음, T 세포를 제1 챔버에 첨가하고, 공동-배양한다. 이어서, 제1 챔버로부터의 T 세포를 제2 챔버로 이동시키고, 여기서 이들은 동일한 또는 상이한 세트의 펩티드에 의해 자극되는 신선하게 생성된 수지상 세포와 공동-배양된다. 이어서, 확장된 T 세포를 제1 챔버로 다시 이동시킬 수 있고, 여기서 동일한 또는 상이한 세트의 펩티드에 의해 자극된 신선한 성숙한 수지상 세포의 또 다른 배치가 기다린다.
T 세포를 임의의 필요한 횟수만큼 2개의 연결된 챔버 사이에서 다시 옮길 수 있다. 이는 몇몇 상이한 펩티드로 DC를 자극하는데 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 하나가 DC를 자극하는데 필요한 20개 정도의 펩티드의 라이브러리를 갖는 경우, DC를 모든 펩티드로 한번에 자극하기 위한 시도는 펩티드 사이의 경쟁 효과 때문에 불충분하 자극을 일으킨다. 일부 펩티드는 다른 것에 비해 양호한 효과 및/또는 친화도를 갖는다. 예를 들어 제1 공동-배양에서 DC의 배치를 5개의 펩티드로 자극한 다음, 제2 공동-배양에서 DC의 다음 배치를 5개의 상이한 펩티드로 자극하는 등의 단계로 자극을 수행한다. 다른 실시양태에서, 다중 자극 주기는 단일의 작은 그룹의 펩티드에 의해 수행될 수 있다. 비제한적인 실시양태에서, T 세포를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 또는 25회 옮길 수 있다. 각각의 공동-배양은 동일한 또는 상이한 펩티드로 자극된 DC를 수반할 수 있다.
전체 방법은 본 개시내용의 폐쇄된 시스템 내에서 수행되며, 이에 의해 방법 전반에 걸쳐 멸균성을 유지한다. 다른 개시된 방법과는 달리, 배양 챔버 연결은 튜브 용접기에 연결된 멸균 튜브에 의해 달성될 수 있다. 이는 멸균 용기에 제공된 세포 배양 배지의 멸균성을 유지시킨다. 다양한 실시양태에서, T 세포는 동일한 장비 상의 챔버 사이에서 옮겨지거나 또는 별도의 장비 상의 챔버 사이에서 옮겨질 수 있다.
공동-배양이 완료된 후, 유체를 챔버로부터 배수시키고, 신생항원-표적화 T 세포를 완충제로 세척하고, 냉동보존제에 재현탁되고/거나, 수확 백에서 수확될 수 있고, 이 또한 폐쇄된 방식으로 연결된다.
도 9는 폐쇄된 본 발명의 시스템 상에서 신선하게 배양된 수지상 세포 및 PBMC 또는 T 세포를 공동-배양하는 방법의 개략적인 흐름도를 도시한다. 멸균 용접된 연결을 이용하여, 개시된 세포 배양 시스템은 자동화 시딩, 배양 및 세포 수확을 제공한다. 워크플로우에 도시된 바와 같이, 단핵구를 0 일째에 시딩하고, 0-6 일째에 걸쳐 수지상 세포로 분화시킨다. 6 일째에, 동종이계 PBMC 또는 T 세포를 첨가한다. 수지상 세포는 PBMC로부터 T 세포 확장을 가능하게 한다. 확장된 T 세포를 13 일째에 수확한다.
개시된 방법으로 생성된 확장된 T 세포는 확고한 세포독성 능력을 나타낸다. 워크플로우를 이용하여 수행한 예의 결과는 도 10에 도시된다. CD 8+ T 세포 대 Jurkat 세포의 표적 비는 1:1이었고, 실험은 1백만 내지 3백만 개의 수확된 세포를 이용하여 수행되었다. 검정하기 전에 Jurkat 세포를 PKH67로 염색하였다. 세포를 1 일 동안 인큐베이션하고, 모든 세포를 검정 후에 CD3 및 아넥신(Annexin) V로 염색하였다. 생성된 죽은 Jurkat 세포는 도 10에 도시된다.
수지상 세포 및 T 세포의 병행 가공
세포-기반 면역요법 생성물을 형성하는 공정은 2 가지 유형의 세포를 공동-배양하는 것을 필요로 한다. 현재 개시된 시스템에 의해, 항원-특이적인 T 세포의 더욱 효율적인 생성을 위해 이들 세포는 병행하여 생성될 수 있다. 간략히, 수지상 세포를 단핵구로부터 생성하고, 항원 물질과 접촉시켜 성숙시키고, T 세포를 활성화시킨 다음, DC와 공동-배양한다. 선행 기술 방법에서는, 이 방법이 몇몇 수동 단계를 필요로 한다. 그러나, 현재의 시스템은 폐쇄된 시스템에서 2개의 세포 배치를 병행하여 생성할 수 있다. 본원에 기재된 시스템을 이용하여, 수지상 세포는 한 챔버에서 생성되고, 이와 병행하여 T 세포는 또 다른 연결된 챔버에서 자극된다. 단핵구는 제1 챔버에서 관류되어 DC를 생성하고, 이를 항원 물질과 접촉시켜 성숙시킨다. 또 다른 연결된 챔버로부터 활성화된 T 세포를 제1 챔버로 유동시켜, DC와 접촉시키고, T 세포를 추가로 배양한다. 다른 방법과 달리, 챔버를 멸균 튜브를 통해 연결시켜, 상기 방법은 실질적으로 폐쇄된 시스템에서 수행된다. 여전히 폐쇄된 시스템 구성에서 T 세포를 수집 용기로 유동시킴으로써 이들을 수집하고/거나 냉동보존 배지로 옮길 수 있다.
세포-기반 면역요법 생성물을 형성하는 방법의 일반적인 개요를 도시하는 도 11을 참고한다. 본 발명의 특정한 실시양태에 따라 세포 치료 생성물을 생성하는 단계는 세포 배양 챔버를 함유하는 생물학적 반응기에서 자극된 항원-제시 세포 (예를 들어 DC)를 T 세포 함유 세포와 공동-배양하는 것을 포함한다. 확장된 치료 T 세포 생성물을 함유하는 상청액이 배양하는 동안에 생성된다. 특정한 측면에서, 환자에서 치료 반응을 유도하는데 충분한 양의 항원-특이적인 T 세포를 생성하기 위해, T 세포는 1개 이상의 추가의 세포 배양 챔버에서 추가로 배양되어야 한다. 이 추가의 배양을 실행하기 위해, 상청액이 생성된 배양 챔버로부터의 상청액을 항원-제시 세포의 신선한 공급을 함유하는 후속적인 세포 배양 챔버로 옮겨야 한다. 세포 배양 챔버 사이에서 상청액을 옮기는 것은 제1 세포 배양 챔버로 기체 유동의 도입을 수반할 수 있고, 이는 제1 세포 생성물을 포함하는 상청액을 유체 커넥터를 통해 새로운 세포 배양 챔버로 옮긴다. 추가로, 각각의 배양 단계 동안에, 예를 들어 배지 및 시토카인을 함유하는 관류 유체를 챔버로 관류시킬 수 있다. 특정한 측면에서, 관류 유체는 수직 유동 경로를 따라 챔버를 통해 유동하여, 배양하는 동안에 세포가 챔버 내에 남아 있는 것을 보장한다. 1개 이상의 후속적인 세포 배양 챔버를 시스템에 연결시킬 수 있고, 각각의 챔버는 항원 펩티드-펄스된 자가 항원-제시 세포의 새로운 배치를 함유한다.
항원-특이적인 T 세포를 자극하고 확장시키기 위해, 세포 배양 챔버에서 T 세포 함유 세포를 동일한 개체로부터 수득된 항원-제시 세포 (APC)와 공동-배양하여 공정을 시작한다. 특별한 실시양태에서, T 세포 함유 세포는 말초 혈액 단핵구 세포 (PBMC)를 포함하고, APC는 DC를 포함한다. T 세포 함유 세포 및 APC는 약 1000:1 내지 1:1000, 예를 들어 비제한적으로 약 1000:1, 900:1, 800:1, 700:1, 600:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 75:1, 50:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:50, 1:75; 1:100, 1:200: 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000의 비, 또는 그 사이의 임의의 비 (T-세포 함유 세포:APC)로 세포 배양 챔버에 제공될 수 있다. 한 측면에서, 10:1의 비가 바람직하다.
APC와 T-세포 함유 세포의 상호작용으로부터 T 세포의 자극 및 확장을 개시하기 위해, APC를 자극할 필요가 있다. 이는 1개 이상의 자극성 분자의 사용을 통해 수행될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 자극성 분자는 비-종양 특이적이다. 다른 실시양태에서, 자극성 분자는 종양 특이적이다. 예를 들어, 자극성 분자는 상이한 항원 펩티드와 같이 개체의 종양의 1개 이상의 특징으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 자극성 분자는 바람직하게는 배양 주기를 시작할 때에만 첨가된다. 자극성 분자는 대략 수분, 1 시간, 수시간 또는 그보다 긴 기간에 걸쳐 첨가된다. 한 바람직한 실시양태에서, 자극성 분자는 약 1 시간 기간에 걸쳐 첨가된다.
APC 및 T-세포의 공동-배양은 배양 배지에서 일어난다. 예시적인 배양 배지에는 RPMI 배지, 및 셀제닉스(Cellgenix)® 배지가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 적합한 배양 배지는 본 발명의 실시양태에 따라 사용될 수 있다. 시토카인, 예컨대 IL-4 및 GM-CSF 또한 배양 배지에 첨가될 수 있다.
일반적으로 1회의 공동-배양을 수행하는 것만으로는 충분하지 않다. 개시된 시스템은 T 세포를 현탁액에서 빼낼 수 있게 한다. 여기서, T 세포를 신선한 수지상 세포로 다시 자극할 수 있고, 다중 공동-배양을 폐쇄된 시스템에서 수행할 수 있다. 본 발명의 병행 가공 방법에 의해, 카트리지는 연쇄적으로 연결될 수 있고, 세포를 한 카트리지로부터 또 다른 것으로 밀어 넣을 수 있다. 성숙한 부착된 DC를 함유하는 한 반응기에 PBMC를 로딩하고, 배지 및 시토카인의 관류에 의해 자극 주기에 적용될 것이다. 병행 가공에 의해, 항원 펩티드에 의해 펄싱되어 제1 세포 배양 챔버에서 생성되는 신선한 DC에 확장된 T-세포를 연속적으로 노출시킬 수 있다. T 세포의 치료 용량에 대해 충분히 많은 수의 세포를 생성하기 위해 필요한 만큼 자극 공정은 계속될 수 있다.
멸균 연결을 통해 다중 챔버를 함께 연결하는 것은 도 3과 관련하여 상기 논의된 다중 챔버의 구성을 수반할 수 있다. 연결은 제1 세포 배양 챔버로 멸균 공기의 주입을 가능하게 하여, 확장된 T-세포를 함유하는 상청액을 제2 세포 배양 챔버로 옮긴다. 특정한 실시양태에서, 생물학적 반응기의 세포 배양 챔버 내에서 발생하는 공정 이전에, 그와 동시에 또는 후속적으로 다양한 다른 공정을 실행하기 위한 모듈을 함유하는 시스템에 1개 이상의 생물학적 반응기가 제공될 수 있다.
1개의 카트리지를 멸균 용접 및 밀봉을 통해 수확 백으로 또는 새로운 카트리지로 옮길 수 있다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포를 생성한 다음, 수확하고, 냉동보존하고, 요구에 따라 사용될 수 있다. 한편, 시스템은 신선한 수지상 세포 생성을 위해 제2 카트리지를 독립적으로 작동시킬 수 있다.
특정한 측면에서, 컴퓨터 모델링 접근법을 이용하여, T-세포와 항원-제시 세포의 상호작용을 최적화한다. 본 발명에 따른 컴퓨터 모델은 관류의 영향 및 자극을 위해 필요한 최적의 시간을 고려하며, 입자 상호작용-기반 뿐만 아니라 운동 파라미터-기반 접근법 둘 다를 통합시킨다. 예시적인 입자 상호작용-기반 및 운동 파라미터-기반 접근법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 이 중 일부는 본원에 기재되어 있다. 예를 들어, 입자 상호작용-기반 접근법과 관련하여, 데이(Day) 및 리테(Lythe)는 하기 식을 이용하여 T 세포가 림프절의 표면 상에서 APC를 찾기 위해 필요한 시간을 설명하며, 여기서 D는 T 세포의 확산도이고, b는 반경 R의 구형 림프절 내의 중앙에 위치한 APC의 반경이다. [Day et al., Mathematical Models and Immune Cell Biology; 2011]을 참고한다.
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운동 파라미터-기반 접근법과 관련하여, 발리투티(Valitutti)는 도 9에 도시된 바와 같이 T-세포와 항원-제시 세포 사이의 상호작용 모델을 개발하였다. [Valitutti et al., FEBS Lett. 2010]. 그러나, 이러한 상호작용은 배양 챔버 또는 생물반응기의 맥락 내에서 모델링되지 않았다.
본 발명의 컴퓨터 모델에 입자 상호작용-기반 뿐만 아니라 운동 파라미터-기반 접근법 둘 다를 통합시킴으로써, 세포 배양 챔버 내에서 두 세포 유형이 서로 접촉할 확률을 최대화하기 위해 관류 유체 (예를 들어, 시토카인 주입된 배지)의 최적의 관류 속도의 자동화 결정 및 모니터링이 달성될 수 있다.
예를 들어, 특정한 실시양태에서, 세포 배양 챔버, 및 중앙 처리 장치에 의해 실행가능한 명령을 함유하는 메모리를 포함하는 중앙 처리 장치를 포함하는 세포 배양 시스템이 제공된다. 특정한 측면에서, 명령은 시스템이 세포 배양 챔버의 크기를 포함하는 제1 입력 데이터를 수신하고, 세포 배양 챔버에 도입되는 1개 이상의 유체에서 제1 세포 유형의 제1 농도 및 제2 세포 유형의 제2 농도를 포함하는 제2 입력 데이터를 수신하고, 제1 및 제2 입력을 기반으로 하여, 세포 배양 챔버 내에서 제1 세포 유형 및 제2 세포 유형이 서로 접촉할 확률을 최대화하는 세포 배양 챔버에 도입되는 관류 유체의 관류 속도를 계산하게 한다. 세포 배양 시스템 내에서 본 발명의 방법을 실시하기 위한 컴퓨터 시스템에 대한 추가의 상세한 내용은 하기에 제공된다.
일부 측면에서, 시스템은 또한 1개 이상의 관류 유체 저장소에 작동가능하게 커플링되고, 중앙 처리 장치에 작동가능하게 커플링된 1개 이상의 펌프를 포함하여, 중앙 처리 장치는 1개 이상의 펌프를 제어함으로써 관류 유체의 관류 속도를 또한 제어한다.
재순환 배지
세포 배양 배지 및 보충제 (예컨대 시토카인)는 고가이고, 사용된 배지는 종종 그 안에 폐기되는 잔류 영양소를 갖는다. 이를 인식하여, 개시된 시스템은 부분적으로 사용된 배지의 일부를 재포획하고 그를 재순환시키는 방식을 제공한다. 본 발명의 특정한 방법에서, 세포는 개시된 세포 배양 챔버 중 하나에서 배양되며, 세포 배양 배지는 세포 배양 챔버를 통해 유동한다. 일반적으로, 유체는 주입구로 및 배출구로부터 유동한다. 세포 배양 챔버를 통해 배출구로부터 이미 유동한 세포 배양 배지의 일부는 세포 배양 공정 동안에 세포 배양 챔버로 다시 재순환된다.
사용된 배지의 얼마의 양 및/또는 어느 부분이 세포 배양 챔버로 반환되어야 하는지를 결정하기 위해, 본 발명은 재순환 전에 하나 이상의 파라미터, 예컨대 사용된 배지의 영양소 함량 또는 pH를 측정한다. 측정된 영양소는 글루코스, 락테이트, 용존 산소, 또는 세포 대사물일 수 있다. 관심 파라미터를 측정하고, 프로세서는 파라미터가 재순환될 수 있음을 나타내는 예정된 역치를 충족하는지 여부를 결정한다. 그러한 경우, 배지는 세포 배양 챔버로 다시 보내어 진다.
사용된 배지는 그 자체로 재순환될 수 있거나, 또는 신선한 배지의 볼루스와 조합될 수 있다. 한편, 사용된 배지가 예정된 역치를 충족하지 않는 경우에는, 이를 폐기한다. 일부 실시양태에서, 밸브는 사용된 배지를 폐기물 저장소로 또는 다시 세포 배양 챔버로 지정하도록 작동한다.
다양한 실시양태에서, 재순환은 임의의 빈도로 수행될 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 센서는 사용된 배지를 규칙적인 간격으로, 예컨대 매초, 매분, 10 분마다, 매시간 등으로 점검할 수 있다. 다른 실시양태에서, 1개 이상의 센서는 폐기물 라인을 통해 지나감에 따라 배지를 측정함으로써 연속적으로 작동할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폐기물 배지가 재사용될 수 있는지 또는 소비되었는지를 결정하기 위해 이를 모니터링하는 외부 여과기 또는 센서로부터의 피드백을 통해 재순환이 제어된다. 일부 실시양태에서, 인라인 센서를 시스템에 내장하여, 폐기물 배지를 모니터링하고, 재순환될 수 있는지를 결정한다.
재순환없이 배지가 바로 관류되는 공정에 비해 공정에 의해 소모되는 배지의 양을 감소시키면서, 재순환은 세포 배양 챔버의 외부와 그에 함유된 세포 사이의 기체 교환을 가능하게 하는 목적을 달성한다.
재순환 속도는 필요한 기체 교환 및 영양소 공급을 기반으로 하여 조절될 수 있다. 예를 들어, T 세포가 적은 수에서 훨씬 더 많은 수로 확장되는 세포 배양 공정에서, 배양 초기 단계는 100% 재순환하면서 낮은 유동 속도 관류로 수행될 수 있다. 이는 폐쇄된 관류 루프의 영양소가 적은 수의 세포에 대해 적절하고, 유동 속도가 충분한 기체 교환 (산소 유입, CO2 배출)을 보장하기에 충분하도록 설정되기 때문이다. 이어서, 세포가 확장하기 시작함에 따라, 영양소 및 기체 교환에 대한 그들의 요구가 커진다. 성장을 모니터링하고, 관류 유동 속도를 증가시키고 (기체 교환을 증가시키기 위해), 재순환 정도를 변경시키는 (배지의 일부만을 재순환시키고, 새로운 배지를 점진적으로 증가하는 분율로 첨가함) 것과 연관된 결정 기준을 형성할 수 있다. 원칙적으로, 이는 동적으로 및 자동으로 수행될 수 있다.
실시양태에서, 세포 배양 챔버는 세포 배양 챔버에 작동가능하게 커플링된 1개 이상의 센서를 포함한다. 시스템은 상이한 파라미터를 모니터링하고, 제어 시스템과 통합하기 위해 다양한 센서 구성으로 구성될 수 있다. 센서는 세포 배양 챔버 내의 하나 이상의 파라미터, 예컨대 pH, 용존 산소, 총 바이오매스, 세포 직경, 글루코스 농도, 락테이트 농도, 및 세포 대사물 농도를 측정할 수 있다. 시스템은 관류 유출 유체를 샘플링하고 데이터를 전송하는 글루코스 및 락테이트에 대한 규격품 일회용 센서로 맞춤화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 카트리지는 광학적으로 투명하고, 광학 밀도 또는 라만과 같은 감지 양식과 인터페이스될 수 있다. 일부 실시양태에서, 센서는 폐기물 라인 또는 폐기물 저장소에 작동가능하게 커플링될 수 있고, 그 안에서 유동하는 유체의 하나 이상의 파라미터를 측정하도록 구성된다. 특정한 측면에서, 1개 이상의 센서는 명령을 수행하기 위한 중앙 처리 장치를 갖는 컴퓨터 시스템에 작동가능하게 커플링되어, 파라미터의 자동 모니터링 및 조정이 가능하다. 시스템은 유체가 특정한 파라미터를 충족하는 경우, 시스템은 자동으로 유체를 주입구를 통해 챔버로 다시 지정하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 계측은 공정 관리를 위해 컴퓨터, 네트워크, 및 그래픽 사용자 인터페이스, 및 공정 설비 기계와의 인터페이스를 위한 다른 주변 기기를 이용하여 제어 시스템 아키텍쳐와 인터페이스한다. 폐기물 튜브는 예를 들어 유체가 충분한 수준의 영양소를 갖는지 여부에 따라 유체를 한 위치로 또는 또 다른 위치로 지정할 수 있는 밸브를 가질 수 있다. 세포 배양 챔버를 사용하여 본 발명의 방법을 실시하기 위한 컴퓨터 시스템과 관련된 추가의 상세한 내용은 하기에 제공된다.
시스템 아키텍쳐
본원에 기재된 개시내용의 측면, 예컨대 상기 기재된 바와 같이 시스템을 통한 유체 이동의 제어, 및 다양한 파라미터의 모니터링 및 제어는 프로세서, 예를 들어 중앙 처리 장치를 포함하는 임의의 유형의 컴퓨팅 기기, 예컨대 컴퓨터 또는 프로그래밍가능한 로직 제어장치 (PLC), 또는 컴퓨팅 기기의 임의의 조합을 이용하여 수행될 수 있으며, 각각의 기기는 공정 또는 방법의 적어도 일부를 수행한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템 및 방법은 시스템을 위해 생성된 핸드헬드 기기, 예를 들어 스마트 태블릿, 스마트 폰, 또는 특수 기기에 의해 수행될 수 있다.
본 개시내용의 방법은 소프트웨어, 하드웨어, 펌웨어, 하드와이어링, 또는 이들의 임의의 조합을 이용하여 수행될 수 있다. 기능을 실행하는 특징은 또한 다양한 위치에서 물리적으로 위치할 수 있으며, 예를 들어 기능의 일부가 상이한 물리적 위치에서 실행되도록 분산될 수 있다 (예를 들어, 한 방에는 영상화 장치 및 또 다른 방에는 호스트 워크스테이션, 또는 예를 들어 무선 또는 유선 연결에 의해 별도의 빌딩에서).
컴퓨터 프로그램의 실행에 적합한 프로세서에는 예를 들어 두 범용 및 특수 목적 마이크로프로세서, 및 임의의 종류의 디지털 컴퓨터의 임의의 1개 이상의 프로세서가 포함된다. 일반적으로, 프로세서는 읽기-전용 메모리 또는 랜덤 액세스 메모리 또는 이들 둘 다로부터 명령 및 데이터를 수신할 것이다. 컴퓨터의 부재는 명령을 실행하기 위한 프로세서, 및 명령 및 데이터를 저장하기 위한 1개 이상의 메모리 기기이다. 일반적으로, 컴퓨터는 또한 데이터 저장을 위한 1개 이상의 비-일시성 대용량 기기, 예를 들어 자기, 광자기 디스크 또는 광학 디스크를 포함하거나, 또는 그로부터 데이터를 수신하거나 또는 그로 데이터를 전송하기 위해 작동가능하게 커플링되거나, 또는 이들 둘 다일 것이다. 컴퓨터 프로그램 명령 및 데이터를 구현하는데 적합한 정보 캐리어에는 예를 들어 반도체 메모리 기기 (예를 들어, EPROM, EEPROM, 솔리드 스테이트 드라이브 (SSD), 및 플래쉬 메모리 기기); 자기 디스크 (예를 들어, 내부 하드 디스크 또는 이동식 디스크); 광자기 디스크; 및 광학 디스크 (예를 들어, CD 및 DVD 디스크)를 비롯하여 모든 형태의 비휘발성 메모리가 포함된다. 프로세서 및 메모리는 특수 목적 로직 회로에 의해 보완되거나 또는 그에 통합될 수 있다.
사용자와의 상호작용을 제공하기 위해, 본원에 기재된 주제는 사용자에게 정보를 디스플레이하기 위한 I/O 기기, 예를 들어 CRT, LCD, LED, 또는 프로젝션 기기를 갖는 컴퓨터, 및 사용자가 컴퓨터에 입력을 제공할 수 있는 입력 또는 출력 기기, 예컨대 키보드 및 포인팅 기기 (예를 들어, 마우스 또는 트랙볼) 상에서 실행될 수 있다. 다른 종류의 기기를 사용하여 사용자와의 상호작용을 또한 제공할 수 있다. 예를 들어, 사용자에게 제공된 피드백은 임의의 형태의 감각적 피드백 (예를 들어, 시각적 피드백, 청각적 피드백, 또는 촉각적 피드백)일 수 있고, 사용자로부터의 입력은 음향, 음성 또는 촉각 입력을 비롯한 임의의 형태로 수신될 수 있다.
본원에 기재된 주제는 백-엔드 성분 (예를 들어, 데이터 서버), 미들웨어 성분 (예를 들어, 어플리케이션 서버), 또는 프런트-엔드 성분 (예를 들어, 사용자가 본원에 기재된 주제의 실행과 상호작용할 수 있는 그래픽 사용자 인터페이스 또는 웹 브라우저를 갖는 클라이언트 컴퓨터), 또는 이러한 백-엔드, 미들웨어 및 프런트-엔드 성분의 임의의 조합물을 포함하는 컴퓨팅 시스템에서 실행될 수 있다. 시스템의 성분은 디지털 데이터 소통, 예를 들어 통신 네트워크의 임의의 형태 또는 매체에 의해 네트워크를 통해 상호연결될 수 있다. 통신 네트워크의 예에는 셀 네트워크 (예를 들어, 3G 또는 4G), 근거리 네트워크 (LAN), 및 광역 네트워크 (WAN), 예를 들어 인터넷이 포함된다.
본원에 기재된 주제는 1개 이상의 컴퓨터 프로그램 제품, 예컨대 데이터 가공 장치 (예를 들어, 프로그래밍가능한 프로세서, 컴퓨터, 또는 다중 컴퓨터)에 의한 실행을 위해 또는 그의 작업의 제어를 위해 정보 캐리어에서 (예를 들어, 비-일시성 컴퓨터-판독가능한 매체에서) 유형으로 구현되는 1개 이상의 컴퓨터 프로그램으로서 실행될 수 있다. 컴퓨터 프로그램 (프로그램, 소프트웨어, 소프트웨어 어플리케이션, 앱, 매크로 또는 코드로도 공지됨)은 컴파일된 또는 해석된 언어 (예를 들어, C, C++, Perl)를 비롯한 임의의 형태의 프로그래밍 언어로 작성될 수 있으며, 이는 독립형 프로그램으로서 또는 컴퓨팅 환경에서 사용하기에 적합한 모듈, 성분, 서브루틴 또는 다른 유닛으로서 임의의 형태로 배포될 수 있다. 본 발명의 시스템 및 방법은 C, C++, Perl, 자바(Java), 액티브엑스(ActiveX), HTML5, 비쥬얼 베이직(Visual Basic), 또는 자바스크립트(JavaScript)를 비롯하여 비제한적으로 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 프로그래밍 언어로 작성되 명령을 포함할 수 있다.
컴퓨터 프로그램은 반드시 파일에 해당하는 것은 아니다. 프로그램은 다른 프로그램 또는 데이터를 보유하는 파일 또는 파일의 일부로, 해당 프로그램 전용의 단일 파일로, 또는 다중 조정 파일로 (예를 들어, 1개 이상의 모듈, 서브-프로그램, 또는 코드의 일부를 저장하는 파일) 저장될 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 한 지역에서 1개의 컴퓨터에서 또는 다중 컴퓨터에서 실행되도록 배포될 수 있거나, 또는 여러 지역을 거쳐 반포될 수 있고, 통신 네트워크에 의해 상호연결될 수 있다.
파일은 예를 들어 하드 드라이브, SSD, CD, 또는 다른 유형의 비-일시성 매체에 저장된 디지털 파일일 수 있다. 파일은 네트워크를 통해 (예를 들어 네트워크 인터페이스 카드, 모뎀, 무선 카드 등을 통해 예를 들어 서버로부터 클라이언트에게 전송되는 패킷으로서) 한 기기로부터 또 다른 기기로 전송될 수 있다.
본 발명의 실시양태에 따른 파일의 작성은 예를 들어 입자를 추가, 제거 또는 재배열함으로써 (예를 들어, 판독/작성 헤드에 의한 자화 패턴으로 순 전하 또는 쌍극자 모멘트에 의해) 유형의 비-일시성 컴퓨터-판독가능한 매체를 변환하는 것을 수반하고, 패턴은 사용자가 원하고 그에게 유용한 객관적인 물리적 현상에 대한 정보의 새로운 연어를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 작성은 유형의 비-일시성 컴퓨터 판독가능한 매체에서 물질의 물리적 변환을 수반한다 (예를 들어, 광학 판독/작성 기기가 정보의 새로운 및 유용한 연어를 판독할 수 있도록 특정한 광학 성질에 의해, 예를 들어 CD-ROM 굽기). 일부 실시양태에서, 파일의 작성은 물리적 플래쉬 메모리 장치, 예컨대 NAND 플래쉬 메모리 기기를 변환하고, 부동-게이트 트랜지스터로 만들어진 메모리 셀의 어레이에서 물리적 요소를 변환시킴으로써 정보를 저장하는 것을 포함한다. 파일 작성 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 프로그램에 의해 또는 소프트웨어로부터의 저장 명령 또는 프로그래밍 언어로부터의 작성 명령에 의해 수동으로 또는 자동으로 불러올 수 있다.
적합한 컴퓨팅 기기에는 전형적으로 대용량 메모리, 적어도 1개의 그래픽 사용자 인터페이스, 적어도 1개의 디스플레이 기기가 포함되고, 전형적으로 기기 사이의 통신이 포함된다. 대용량 메모리는 컴퓨터-판독가능한 매체의 한 유형, 즉, 컴퓨터 저장 매체를 나타낸다. 컴퓨터 저장 매체에는 정보, 예컨대 컴퓨터 판독가능한 명령, 데이터 구조, 프로그램 모듈, 또는 다른 데이터의 보관을 위한 임의의 방법 또는 기술로 실행되는 휘발성, 비휘발성, 이동식 및 비이동식 매체가 포함될 수 있다. 컴퓨터 저장 매체의 예에는 RAM, ROM, EEPROM, 플래쉬 메모리, 또는 다른 메모리 기술, CD-ROM, 디지털 다목적 디스크 (DVD) 또는 다른 광학 저장, 자기 카세트, 자기 테이프, 자기 디스크 저장 또는 다른 자기 저장 기기, 무선 주파수 식별 태그 또는 칩, 또는 원하는 정보를 저장하기 위해 사용될 수 있고 컴퓨팅 기기에 의해 접근가능한 임의의 다른 매체가 포함된다.
관련 기술분야의 기술자가 본 발명의 방법을 수행하기 위해 필요하거나 또는 가장 적합한 것으로 인식하는 바와 같이, 본 발명의 실시양태에서 이용되는 컴퓨터 시스템 또는 기계는 1개 이상의 프로세서 (예를 들어, 중앙 처리 장치 (CPU) 그래픽 처리 장치 (GPU) 또는 이들 둘 다), 버스를 통해 서로 통신하는 주 메모리 및 정적 메모리를 포함할 수 있다.
도 12에 도시된 예시적인 실시양태에서, 시스템 (600)은 컴퓨터 (649) (예를 들어, 랩탑, 데스크탑, 또는 태블릿)를 포함한다. 컴퓨터 (649)는 네트워크 (609)를 거처 통신하도록 구성될 수 있다. 컴퓨터 (649)는 1개 이상의 프로세서 (659) 및 메모리 (663) 뿐만 아니라 입력/출력 메카니즘 (654)을 포함한다. 본 발명의 방법이 클라이언트/서버 아키텍쳐를 이용하는 경우, 본 발명의 방법의 작업은 서버 (613)를 통해 수행될 수 있고, 이는 데이터, 명령 등을 수득하거나 또는 인터페이스 모듈 (625)을 통해 결과를 제공하거나 또는 파일 (617)로서 결과를 제공할 수 있는 프로세서 (621) 및 메모리 (629) 중 1개 이상을 포함한다. 서버 (613)는 네트워크 (609)를 거쳐 컴퓨터 (649) 또는 터미널 (667)을 통해 연결될 수 있거나, 또는 서버 (613)은 1개 이상의 프로세서 (675) 및 메모리 (679), 뿐만 아니라 입력/출력 메카니즘 (671)을 포함하는 터미널 (667)에 직접적으로 연결될 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시양태에 따른 시스템 (600) 또는 기계는 임의의 I/O (649, 637 또는 671)에 대해 비디오 디스플레이 유닛 (예를 들어, 액정 디스플레이 (LCD) 또는 캐쏘드 레이 튜브 (CRT))을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 따른 컴퓨터 시스템 또는 기계는 또한 알파벳 숫자 입력 기기 (예를 들어, 키보드), 커서 제어 기기 (예를 들어, 마우스), 디스크 드라이브 유닛, 신호 생성 기기 (예를 들어, 스피커), 터치스크린, 가속도계, 마이크로폰, 셀룰러 무선 주파수 안테나, 및 네트워크 인터페이스 기기를 포함할 수 있으며, 이는 예를 들어 네트워크 인터페이스 카드 (NIC), Wi-Fi 카드, 또는 셀룰러 모뎀일 수 있다.
본 발명의 예시적인 실시양태에 따른 메모리 (663, 679 또는 629)는 본원에 기재된 방법 또는 기능 중 임의의 하나 이상을 구현하는 1개 이상의 명령 세트 (예를 들어, 소프트웨어)가 저장된 기계-판독가능한 매체를 포함할 수 있다. 소프트웨어는 또한 컴퓨터 시스템에 의한 그의 실행 동안에 완전히 또는 적어도 부분적으로 주 메모리 내에 및/또는 프로세서 내에 있을 수 있고, 주 메모리 및 프로세서는 또한 기계-판독가능한 매체를 구성한다. 소프트웨어는 네트워크 인터페이스 기기를 통해 네트워크를 거쳐 추가로 전송되거나 또는 수신될 수 있다.
참고문헌의 포함
다른 문헌, 예컨대 특허, 특허 출원, 특허 공보, 저널, 서적, 논문, 웹 컨텐츠에 대한 언급 및 인용이 본 개시내용 전반에 걸쳐 이루어졌다. 이러한 모든 문헌은 모든 목적을 위해 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
등가물
본 발명이 특정한 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 통상의 기술자가 상기 명세서를 읽고 난 후에는 상기 설명된 조성물 및 방법에 대해 다양한 변화, 등가물 치환, 및 다른 변경을 수행할 수 있을 것이다.

Claims (120)

  1. 하기를 포함하는 세포 배양 시스템:
    세포 배양 배지를 포함하는 유체 저장소를 수용하도록 구성된 제1 영역;
    폐기물 저장소를 수용하도록 구성된 제2 영역;
    유체 저장소에 유체적으로 연결가능한 1개 이상의 펌프; 및
    상이한 형상 및/또는 크기의 세포 배양 챔버를 수용하고 보유하도록 구성된 기재.
  2. 제1항에 있어서, 기재는 기재가 상이한 형상 및/또는 크기의 세포 배양 챔버를 수용하고 보유하도록 구성되게 배열된 복수개의 상이한 개구부를 기재에 포함하는 것인 세포 배양 시스템.
  3. 제1항에 있어서, 기재가 다중 세포 배양 챔버를 동시에 수용하고 보유하도록 구성되는 것인 세포 배양 시스템.
  4. 제1항에 있어서, 제1 영역에 위치한 유체 저장소 및 폐기물 영역에 위치한 폐기물 저장소를 추가로 포함하는 세포 배양 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 유체 저장소로부터 1개 이상의 펌프로, 1개 이상의 펌프로부터 세포 배양 챔버로, 및 세포 배양 챔버로부터 폐기물 저장소로 유체적으로 연결하는 1개 이상의 튜브를 추가로 포함하는 세포 배양 시스템.
  6. 제1항에 있어서, 기재의 제1 부분이 제1 크기의 제1 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성되고, 기재의 제2 부분이 제1 크기와 상이한 제2 형상의 제2 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성되는 것인 세포 배양 시스템.
  7. 제1항에 있어서, 기재의 제1 부분이 제1 형상의 제1 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성되고, 기재의 제2 부분이 제1 형상과 상이한 제2 형상의 제2 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성되는 것인 세포 배양 시스템.
  8. 제1항에 있어서, 기재의 제1 부분이 제1 크기 및 형상의 제1 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성되고, 기재의 제2 부분이 제1 크기 및 형상과 상이한 제2 크기 및 형상의 제2 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성되는 것인 세포 배양 시스템.
  9. 제1항에 있어서, 각각의 세포 배양 챔버가 별도의 펌프에 유체적으로 커플링되는 것인 세포 배양 시스템.
  10. 제1항에 있어서, 1개 이상의 펌프에 작동가능하게 연결된 프로세서, 및 세포 배양 시스템에서 유체의 특징을 측정하도록 작동가능한 1개 이상의 센서를 추가로 포함하고, 프로세서가 측정된 특징을 기반으로 하여 1개 이상의 펌프를 작동시키는 것인 세포 배양 시스템.
  11. 세포 배양 배지를 포함하는 유체 저장소를 수용하도록 구성된 제1 영역, 폐기물 저장소를 수용하도록 구성된 제2 영역, 유체 저장소에 유체적으로 연결가능한 1개 이상의 펌프, 및 상이한 형상 및/또는 크기의 세포 배양 챔버를 수용하고 보유하도록 구성된 기재를 포함하는 세포 배양 시스템을 제공하고;
    유체 저장소를 제1 영역에 및 폐기물 저장소를 제2 영역에 로딩하고;
    제1 크기 및/또는 형상의 제1 세포 배양 챔버를 기재의 제1 부분 상에 로딩하고;
    제2 크기 및/또는 형상의 제2 세포 배양 챔버를 기재의 제2 부분 상에 로딩하고;
    유체 저장소, 1개 이상의 펌프, 제1 및 제2 세포 배양 챔버, 및 폐기물 저장소를 튜브로 연결하고;
    제1 및 제2 세포 배양 챔버에서 세포를 배양하도록 시스템을 작동시키는 것을 포함하는,
    세포를 배양하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 기재는 기재가 상이한 형상 및/또는 크기의 세포 배양 챔버를 수용하고 보유하도록 구성되게 배열된 복수개의 상이한 개구부를 기재에 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 제1 세포 배양 챔버가 제1 크기를 갖고, 제2 세포 배양 챔버가 제2 크기를 갖는 것인 방법.
  14. 제11항에 있어서, 제1 세포 배양 챔버가 제1 형상을 갖고, 제2 세포 배양 챔버가 제2 형상을 갖는 것인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 제1 세포 배양 챔버가 제1 크기 및 형상을 갖고, 제2 세포 배양 챔버가 제2 크기 및 형상을 갖는 것인 방법.
  16. 제11항에 있어서, 제1 및 제2 세포 배양 챔버 각각이 별도의 펌프에 유체적으로 커플링되는 것인 방법.
  17. 제11항에 있어서, 세포 배양 시스템이 1개 이상의 펌프에 작동가능하게 연결된 프로세서, 및 세포 배양 시스템에서 유체의 특징을 측정하도록 작동가능한 1개 이상의 센서를 추가로 포함하고, 프로세서가 측정된 특징을 기반으로 하여 1개 이상의 펌프를 작동시키는 것인 방법.
  18. 제11항에 있어서, 세포 배양이 제1 및 제2 세포 배양 챔버에서 완료된 후, 제1 및 제2 세포 배양 챔버 각각에서 배양된 세포를 수집하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제1 및 제2 세포 배양 챔버 각각에서 배양된 세포가 동일한 수집 용기에서 수집되는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 제1 및 제2 세포 배양 챔버 각각에서 배양된 세포가 상이한 수집 용기에서 수집되는 것인 방법.
  21. 제1 및 제2 배양 챔버를 포함하는 세포 배양 장비를 제공하고;
    T 세포를 포함하는 현탁액을 제1 배양 챔버로 유동시키고;
    제1 배양 챔버에서 T 세포를 관류시켜, 제1 배양 챔버에서 확장하는 형질도입된 T 세포를 생성하고;
    형질도입되고 확장된 T 세포를 제1 배양 챔버로부터 제2 배양 챔버로 유동시키고;
    세포 배양 배지를 제2 배양 챔버로 유동시켜, 형질도입되고 확장된 T 세포를 추가로 확장시키는 것을 포함하며,
    방법 전반에 걸쳐 멸균성이 유지되도록 폐쇄된 방식으로 단일 장비에서 수행되는,
    형질도입된 T 세포를 생성하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 제2 배양 챔버가 제1 배양 챔버보다 큰 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 제1 및 제2 배양 챔버가 폴리스티렌으로 제조된 것인 방법.
  24. 제21항에 있어서, 제1 및 제2 배양 챔버가 멸균 튜브를 통해 연결되는 것인 방법.
  25. 제21항에 있어서, 제1 배양 챔버가 활성화 시약 및/또는 세포 형질도입 시약을 추가로 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 세포 형질도입 시약이 CAR 또는 TCR을 발현하는 불활성 바이러스를 포함하는 것인 방법.
  27. 제21항에 있어서, 세포 배양 배지가 멸균 용기에 제공되고, 멸균 튜브 용접에 의해 폐쇄된 시스템에 연결되는 것인 방법.
  28. 제21항에 있어서, 세포 배양 배지를 제1 배양 챔버로 유동시키는 것이 제1 배양 챔버에서 헤드스페이스를 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
  29. 제21항에 있어서, 제1 배양 챔버에서 T 세포를 활성화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 활성화가 항체를 포함하는 시약과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 항체가 비드에 부착된 것인 방법.
  32. 제21항에 있어서, 제2 배양 챔버로부터 유체를 배수시키고;
    형질도입되고 확장된 T 세포를 완충제로 세척하고;
    냉동보존 배지를 제2 배양 챔버로 유동시켜, 형질도입되고 확장된 T 세포를 재현탁시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제21항에 있어서, 형질도입되고 확장된 T-세포를 폐쇄된 방식으로 수확 용기로 유동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  34. 제21항에 있어서, 각각의 유동 단계가 멸균 튜브를 통해 수행되는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 멸균 튜브가 멸균 튜브 용접에 의해 연결되는 것인 방법.
  36. 제21항에 있어서, 세포 배양 배지가 인터류킨-2와 함께 Aim V를 포함하는 것인 방법.
  37. 제1 및 제2 배양 챔버를 포함하는 세포 배양 장비를 제공하고;
    단핵구를 함유하는 세포 배양 배지를 제1 배양 챔버로 유동시키고;
    제1 배양 챔버에서 정제된 단핵구를 관류시켜, 제1 배양 챔버에서 수지상 세포를 생성하고;
    제1 배양 챔버에서 수지상 세포를 항원 물질과 접촉시켜, 성숙한 수지상 세포를 생성하고;
    T 세포를 포함하는 세포 현탁액을 제1 배양 챔버로 유동시켜, 성숙한 수지상 세포 및 T 세포를 공동-배양하고, 이에 의해 확장된 신생항원-표적화 T 세포를 생성하는 것을 포함하며;
    방법 전반에 걸쳐 멸균성이 유지되도록 폐쇄된 방식으로 단일 장비에서 수행되는,
    신생항원 형질도입된 T 세포를 생성하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 제2 배양 챔버에서 성숙한 수지상 세포의 제2 배치를 생성하고;
    확장된 T 세포를 제1 배양 챔버로부터 제2 배양 챔버로 도입시켜, 확장된 T 세포를 성숙한 수지상 세포의 제2 배치와 공동-배양하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 성숙한 수지상 세포의 제2 배치가 제1 배양 챔버로부터의 성숙한 수지상 세포와는 상이한 세트의 펩티드에 의해 자극된 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 성숙한 수지상 세포의 제2 배치와 공동-배양된 확장된 T 세포를 제1 배양 챔버로 다시 옮기는 것을 추가로 포함하며, 제1 배양 챔버가 성숙한 수지상 세포의 제3 배치를 포함하는 것인 방법.
  41. 제37항에 있어서, 항원 물질이 종양-특이적인 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  42. 제37항에 있어서, 제1 및 제2 배양 챔버가 폴리스티렌으로 제조된 것인 방법.
  43. 제37항에 있어서, 제1 및 제2 배양 챔버가 멸균 튜브를 통해 연결되는 것인 방법.
  44. 제37항에 있어서, 세포 배양 배지가 멸균 용기에 제공되고, 멸균 튜브 용접에 의해 폐쇄된 시스템에 연결되는 것인 방법.
  45. 제37항에 있어서, 세포 배양 배지를 제1 배양 챔버로 유동시키는 것이 제1 배양 챔버에서 헤드스페이스를 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
  46. 제37항에 있어서, 제1 배양 챔버로부터 유체를 배수시키고;
    신생항원 형질도입된 T 세포를 완충제로 세척하고;
    냉동보존 배지를 제1 배양 챔버로 유동시켜, 신생항원 형질도입된 T 세포를 재현탁시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  47. 제37항에 있어서, 신생항원 형질도입된 T 세포를 폐쇄된 방식으로 수확 용기로 유동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  48. 제37항에 있어서, 각각의 유동 단계가 멸균 튜브를 통해 수행되는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 멸균 튜브가 멸균 튜브 용접에 의해 연결되는 것인 방법.
  50. 제1 및 제2 배양 챔버를 포함하는 세포 배양 장비를 제공하고;
    단핵구를 포함하는 세포 배양 배지를 제1 배양 챔버로 유동시키고;
    제1 배양 챔버에서 단핵구를 관류시켜, 제1 배양 챔버에서 수지상 세포를 생성하고;
    T 세포를 포함하는 세포 현탁액을 제1 배양 챔버로 유동시켜, 수지상 세포 및 T 세포를 공동-배양하고, 이에 의해 활성화되고 확장된 T 세포를 생성하고;
    활성화되고 확장된 T 세포를 제1 배양 챔버로부터 단핵구의 제2의 별도의 배치로부터 생성된 수지상 세포를 포함하는 제2 배양 챔버로 유동시켜, T 세포를 추가로 배양하는 것인,
    수지상 세포를 생성하고 이와 병행하여 T 세포를 자극하는 방법.
  51. 제50항에 있어서, 멸균성이 방법 전반에 걸쳐 유지되는 것인 방법.
  52. 제50항에 있어서, 배양된 T 세포를 수집 용기로 유동시킴으로써 배양된 T 세포를 제1 배양 챔버로부터 수집하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  53. 제50항에 있어서, 수지상 세포를 항원 물질과 접촉시킴으로써 제1 배양 챔버에서 수지상 세포를 성숙시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 항원 물질이 종양-특이적인 펩티드를 포함하는 것인 방법.
  55. 제50항에 있어서, 제1 및 제2 배양 챔버가 폴리스티렌으로 제조된 것인 방법.
  56. 제50항에 있어서, 제1 및 제2 배양 챔버가 멸균 튜브를 통해 연결되는 것인 방법.
  57. 제50항에 있어서, 세포 배양 배지가 멸균 용기에 제공되고, 멸균 튜브 용접에 의해 폐쇄된 시스템에 연결되는 것인 방법.
  58. 제50항에 있어서, 세포 배양 배지를 제1 배양 챔버로 유동시키는 것이 제1 배양 챔버에서 헤드스페이스를 제거하는 것을 포함하는 것인 방법.
  59. 제50항에 있어서, 제2 배양 챔버에서 T 세포를 활성화시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 활성화가 항체를 포함하는 시약과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  61. 제50항에 있어서, 자극된 T 세포를 완충제로 세척하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 자극된 T 세포를 냉동보존 배지로 옮기는 것을 추가로 포함하는 방법.
  63. 제50항에 있어서, 신생항원 형질도입된 T 세포를 폐쇄된 방식으로 수확 용기로 유동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  64. 제50항에 있어서, 각각의 유동 단계가 멸균 튜브를 통해 수행되는 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 멸균 튜브가 멸균 튜브 용접에 의해 연결되는 것인 방법.
  66. 제50항에 있어서, 세포 배양 장비로부터의 제1 및 제2 세포 배양 챔버 중 하나 또는 둘 다가 교체되고, 방법이 반복되는 것인 방법.
  67. 상부, 하부 및 둘 다의 측벽이 기체 불투과성 물질로 구성되는 것인 세포 배양 챔버.
  68. 제67항에 있어서, 기체 불투과성 물질이 또한 세포가 부착하는 물질인 세포 배양 챔버.
  69. 제68항에 있어서, 기체 불투과성 물질이 폴리스티렌을 포함하는 것인 세포 배양 챔버.
  70. 제67항에 있어서, 세포 배양 챔버가 주입구를 추가로 포함하는 것인 세포 배양 챔버.
  71. 제70항에 있어서, 세포 배양 챔버가 배출구를 추가로 포함하는 것인 세포 배양 챔버.
  72. 제71항에 있어서, 주입구 및 배출구가 세포 배양 챔버의 상부에 위치하는 것인 세포 배양 챔버.
  73. 제72항에 있어서, 주입구 및 배출구 각각이 유체적으로 및 밀봉가능하게 튜브로 커플링되도록 구성되는 것인 세포 배양 챔버.
  74. 제67항에 있어서, 세포 배양 챔버가 일체형으로 형성되는 것인 세포 배양 챔버.
  75. 제67항에 있어서, 세포 배양 챔버가 인큐베이터 내에 맞도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성되는 것인 세포 배양 챔버.
  76. 제67항에 있어서, 세포 배양 챔버가 세포 배양 장비의 기재에 커플링하도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성되는 것인 세포 배양 챔버.
  77. 주입구 및 배출구를 포함하는 세포 배양 챔버를 제공하고, 여기서 상부, 하부 및 둘 다의 측벽은 기체 불투과성 물질로 구성되고;
    세포 배양 챔버에 세포를 로딩하고;
    세포 배양 배지를 주입구를 통해 세포 배양 챔버로 유동시켜, 배양 챔버에서 세포를 배양하고, 배출구를 통해 세포 배양 챔버로부터 유동시키고, 여기서 주입구 및 배출구를 통하는 세포 배양 챔버를 통한 세포 배양 배지의 유동은 세포 배양 챔버를 통한 세포 배양 배지의 연속적인 유동을 유발하고, 세포 배양 챔버의 세포와 세포 배양 배지 사이에서 기체 교환이 발생하도록 하는 것을 포함하는,
    세포를 배양하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 기체 불투과성 물질이 또한 세포가 부착하는 물질인 방법.
  79. 제78항에 있어서, 기체 불투과성 물질이 폴리스티렌을 포함하는 것인 방법.
  80. 제77항에 있어서, 주입구 및 배출구가 세포 배양 챔버의 상부에 위치하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 주입구 및 배출구가 유체적으로 및 밀봉가능하게 튜브로 커플링되는 것인 방법.
  82. 제77항에 있어서, 세포 배양 챔버가 일체형으로 형성되는 것인 방법.
  83. 제77항에 있어서, 세포 배양 챔버가 인큐베이터 내에 맞도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성되는 것인 방법.
  84. 제77항에 있어서, 세포 배양 챔버가 세포 배양 장비의 기재에 커플링하도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성되는 것인 방법.
  85. 제81항에 있어서, 튜브가 고투과성 튜브인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 세포 배양 배지가 고투과성 튜브 내에 있는 동안에 기체를 교환하는 것인 방법.
  87. 세포 배양 배지를 세포 배양 챔버를 통해 유동시킴으로써 세포 배양 장비 상의 세포 배양 챔버에서 세포를 배양하고, 여기서 세포 배양 챔버를 통해 이미 유동한 세포 배양 배지의 일부분은 세포 배양 공정 동안에 세포 배양 챔버로 다시 재순환되는 것을 포함하는, 세포를 배양하는 방법.
  88. 제87항에 있어서, 사용된 배지의 하나 이상의 파라미터를 재순환 전에 측정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 하나 이상의 파라미터 중 적어도 하나가 사용된 배지 내의 1종 이상의 화합물의 농도를 포함하는 것인 방법.
  90. 제89항에 있어서, 1종 이상의 화합물이 글루코스, 락테이트, 용존 산소, 또는 세포 대사물을 포함하는 것인 방법.
  91. 제88항에 있어서, 파라미터가 pH를 포함하는 것인 방법.
  92. 제88항에 있어서, 세포 배양 챔버에 작동가능하게 연결된 프로세서를 이용하여, 사용된 배지의 하나 이상의 파라미터 중 적어도 하나가 재순환 단계 전에 예정된 역치를 충족하는지 여부를 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  93. 제88항에 있어서, 측정 단계가 세포 배양 챔버와 작동가능하게 연관된 1개 이상의 센서에 의해 수행되는 것인 방법.
  94. 제93항에 있어서, 1개 이상의 센서가 세포 배양 챔버와 유체 소통하는 폐기물 저장소와 작동가능하게 연관된 것인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 재순환 단계가 사용된 배지의 일부를 폐기물 저장소로부터 세포 배양 챔버로 다시 재지정하는 하는 것을 포함하는 것인 방법.
  96. 제87항에 있어서, 사용된 배지의 일부를 신선한 배지의 볼루스와 조합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  97. 제87항에 있어서, 세포 배양 챔버가 1개 이상의 펌프에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
  98. 제87항에 있어서, 세포 배양 챔버가 주입구 및 배출구를 포함하는 것인 방법.
  99. 세포를 포함하는 세포 배양 챔버를 제공하고;
    세포 배양 배지를 세포 배양 챔버로 유동시키고;
    사용된 세포 배양 배지를 세포 배양 챔버로부터 제거하고;
    사용된 세포 배양 배지의 파라미터를 평가하고;
    파라미터가 예정된 역치를 충족하는 경우, 사용된 세포 배양 배지를 세포 배양 챔버로 반환시키는 것을 포함하는,
    세포를 배양하는 방법.
  100. 제99항에 있어서, 반환 단계 전에 사용된 세포 배양 배지를 신선한 세포 배양 배지의 볼루스와 조합하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  101. 제99항에 있어서, 평가 단계가 세포 배양 챔버에 작동가능하게 커플링된 센서를 이용하여 파라미터를 측정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  102. 제99항에 있어서, 평가 단계가 프로세서를 이용하여, 파라미터가 예정된 역치를 충족하는지 여부를 결정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  103. 제102항에 있어서, 파라미터가 사용된 세포 배양 배지 내의 1종 이상의 화합물의 측정된 농도를 포함하는 것인 방법.
  104. 제103항에 있어서, 1종 이상의 화합물이 글루코스, 락테이트, 또는 세포 대사물을 포함하는 것인 방법.
  105. 제99항에 있어서, 반환 단계가 사용된 세포 배양 배지를 폐기물 저장소로부터 세포 배양 챔버로 재지정하는 것을 포함하는 것인 방법.
  106. 제99항에 있어서, 파라미터가 예정된 역치를 충족하지 않는 경우, 사용된 세포 배양 배지를 폐기하고;
    신선한 세포 배양 배지를 세포 배양 챔버로 유동시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  107. 하기를 포함하는 세포 배양 시스템:
    제2 선반의 상부에 제1 선반이 적층되고, 각각의 제1 및 제2 선반이 유체 저장소를 수용하도록 구성된 복수개의 선반;
    적어도 1개의 펌프;
    적어도 1개의 펌프에 작동가능하게 커플링된 프로세서; 및
    복수개의 세포 배양 챔버를 동시에 유지하도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성된 기재.
  108. 제107항에 있어서, 시스템이 적어도 1개의 센서를 포함하는 것인 시스템.
  109. 제108항에 있어서, 프로세서가 적어도 1개의 센서에 연결가능하고, 센서에 의해 측정된 특징을 기반으로 하여 적어도 1개의 펌프를 작동시키도록 구성되는 것인 시스템.
  110. 제107항에 있어서, 기재가 상이한 크기 및/또는 형상의 세포 배양 챔버를 수용하도록 구성되는 것인 시스템.
  111. 제107항에 있어서, 적어도 1개의 펌프가 복수개의 펌프인 시스템.
  112. 제111항에 있어서, 제1 선반 상의 제1 유체 저장소로부터 복수개의 펌프로, 복수개의 펌프로부터 복수개의 세포 배양 챔버로, 및 복수개의 세포 배양 챔버로부터 제2 선반 상의 제2 유체 저장소로 유체적으로 연결하는 복수개의 튜브를 추가로 포함하는 시스템.
  113. 제107항에 있어서, 각각의 제1 및 제2 선반이 각각의 제1 및 제2 선반 상에 유체 저장소를 보유하는 보유 메카니즘을 포함하는 것인 시스템.
  114. 제107항에 있어서, 시스템이 인큐베이터에 삽입하기 위한 치수를 갖는 것인 시스템.
  115. 제107항에 있어서, 프로세서가 세포 유형을 배양하기 위한 명령을 수신하고 실행하도록 구성되는 것인 시스템.
  116. 제107항에 있어서, 프로세서가 T 세포를 형질도입하기 위한 명령을 수신하고 실행하도록 구성되는 것인 시스템.
  117. 제2 선반의 상부에 제1 선반이 적층되고, 각각의 제1 및 제2 선반이 유체 저장소를 수용하도록 구성된 복수개의 선반; 적어도 1개의 펌프; 적어도 1개의 펌프에 작동가능하게 커플링된 프로세서; 및 복수개의 세포 배양 챔버를 동시에 유지하도록 하는 크기를 갖고 이와 같이 구성된 기재를 포함하는 세포 배양 시스템을 제공하고;
    제1 유체 저장소를 제1 선반 상에 로딩하고;
    제2 유체 저장소를 제2 선반 상에 로딩하고;
    제1 세포 배양 챔버 및 제2 세포 배양 챔버를 기재 상에 로딩하고;
    유체 및 제2 유체 저장소, 적어도 1개의 펌프, 및 제1 및 제2 세포 배양 챔버를 튜브로 연결하고;
    제1 및 제2 세포 배양 챔버의 내부에서 세포를 배양하기 위해 시스템을 작동시키는 것을 포함하는,
    세포 배양 방법.
  118. 제117항에 있어서, 제1 및 제2 세포 배양 챔버가 상이한 크기 또는 형상을 포함하는 것인 방법.
  119. 제117항에 있어서, 시스템이 적어도 1개의 센서를 포함하는 것인 방법.
  120. 제119항에 있어서, 프로세서가 적어도 1개의 센서에 연결되고, 센서에 의해 측정된 특징을 기반으로 하여 펌프를 작동시키도록 구성되는 것인 방법.
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