JP7473339B2 - 代替の抗原特異的抗体変異体を発見するための方法 - Google Patents
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Description
現在、抗体は通常、ファージディスプレイによって作製されるか、または実験動物を免疫化して該実験動物から抗体産生B細胞を単離することによって作製される。後者の場合、B細胞または分泌される各抗体の特性に基づいて、処理されるB細胞の数が減らされる。その後、配列情報が取得される。したがって、候補の選択は、主に抗体の結合性および機能的特性に基づいて行われるが、アミノ酸配列に関しては「分からないまま」行われ、そのため例えば開発可能性(developability)の局面(例えば、対になっていないCys残基、異常なグリコシル化部位、分解ホットスポット(Asp、Asn、Metなど))に関して「分からないまま」行われる。
この方法は、以下の段階:
(i)1つまたは複数の抗体可変ドメインコード核酸をそれぞれが含む、多数のDNA含有試料を提供する段階;
(ii)コンセンサス配列特異的プライマーを用いて、(i)の多数の抗体可変ドメインコード核酸のPCR増幅を実施して、増幅産物を得る段階;
(iii)(シーケンシングリード中の)各位置における各ヌクレオチドの相対比率を明らかにするために、段階(ii)で得られた複数の増幅産物をシーケンシングする段階;
(iv)(iii)のシーケンシング(リード)結果と参照抗体可変ドメインコード核酸との配列アライメントを実施する段階;
(v)鋳型配列である参照抗体可変ドメインコード核酸との(iv)の前記配列アライメントにおいて、抗体可変ドメインコード核酸の配列同一性または相同性に基づくランク付けを実施する段階;および
(vi)段階(v)の配列ランキングの上位10位までの配列のうちの1つから変異抗体可変ドメインコード核酸を選択する段階
を含み、段階(vi)で選択される変異体は、開発可能性が改善されておりかつ/または少なくとも1つの翻訳後修飾されるアミノ酸残基が変更されているように選択される。
- 参照抗体と同じ標的に特異的に結合する抗体をそれぞれが産生する多数のB細胞クローンに由来する核酸をシーケンシングすることによって作成されるシーケンシングデータを得る段階;
- シーケンシングデータを、鋳型配列である参照抗体の配列とアラインする段階;
- 参照配列に対して最も高い構造的/機能的同一性/類似性を有するが、参照抗体可変ドメインの少なくとも1つの翻訳後修飾されるアミノ酸残基を有さない、配列を選択する段階。
i)以下を提供する段階:
α)ある標的/抗原に特異的に結合する参照抗体のアミノ酸配列または核酸配列、
β)該参照抗体の少なくとも1つの生物学的特性、および任意で、該少なくとも1つの生物学的特性を測定するための1種または複数種のアッセイ法、
γ)次世代シーケンシングによって決定された、参照抗体と同じ標的に特異的に結合する変異抗体の多数のアミノ酸配列または核酸配列
ii)(関係する)VH配列または/およびVL配列の1つまたは複数のセットを作る段階であって、これらの配列が、
α)同じ長さのVHもしくは/およびVL、または/ならびに
β)同じ長さの全てのβシートフレームワーク領域、または/ならびに
γ)同じ長さの全てのHVR/CDR、または/ならびに
δ)同一のHVR3/CDR3配列(フレームワークおよび/もしくは他のHVR/CDR中の変異は3個までのアミノ酸交換が許容される)、または/ならびに
ε)相同なHVR/CDR3配列(2個までのアミノ酸交換が許容される)ならびに同一のHVR/CDR1および2、または/ならびに
ζ)フレームワークおよびHVR/CDR中の変異が許容される
に基づいてアラインされる、段階;
iii)ii)の1つまたは複数のセット中のアラインされた配列を、
α)参照抗体配列に対するアミノ酸差異の数、および/または
β)参照抗体配列に対するアミノ酸差異の位置、および/または
γ)参照抗体配列に対するアミノ酸差異に起因する、物理化学的特性の変化、および/または
δ)参照抗体配列に対するアミノ酸差異に起因する、VH/VL配向性の違い
に基づいてランク付けする段階;
iv)上位10個のアラインされランク付けされた抗体のうちの1つを参照抗体の変異抗体と同定する段階であって、該変異抗体が有する翻訳後修飾されるアミノ酸残基が、参照抗体と比べて少なくとも1つ少ない、段階。
ここで、101~125位は重鎖可変ドメインフレームワーク1に対応し、151~199位はCDR-H1に対応し、201~214位は重鎖可変ドメインフレームワーク2に対応し、251~299位はCDR-H2に対応し、301~332位は重鎖可変ドメインフレームワーク3に対応し、351~399位はCDR-H3に対応し、401~411位は重鎖可変ドメインフレームワーク4に対応する。
- 先の局面のいずれか1つに記載の方法を用いて得られる核酸および機能的抗体の発現に必要な他の全ての核酸を含む細胞を培養する段階、
- 細胞または培養培地から抗体を回収する段階。
i)α)ある標的/抗原に特異的に結合する参照抗体のアミノ酸配列または核酸配列、
β)該参照抗体の少なくとも1つの生物学的特性、および任意で、該少なくとも1つの生物学的特性を測定するための1種または複数種のアッセイ法、
γ)次世代シーケンシングによって決定された、(任意で、参照抗体と同じ免疫化キャンペーンにおいて/から得られた)参照抗体と同じ標的に特異的に結合する変異抗体の多数(少なくとも10個、少なくとも100個、少なくとも1,000個、少なくとも10,000個)のアミノ酸配列または核酸配列
を提供する段階;
ii)関係するVH配列または/およびVL配列の1つまたは複数のセットを作る段階であって、これらの配列が、
α)同じ長さのVHもしくは/およびVL、または/ならびに
β)同じ長さの全てのβシートフレームワーク領域、または/ならびに
γ)同じ長さの全てのHVR/CDR、または/ならびに
δ)同一のHVR3/CDR3配列(フレームワークおよび/もしくはHVR/CDR中の1個もしくは2個の変異(1~3個のアミノ酸交換)は許容される)、または/ならびに
ε)相同性が高いHVR/CDR3配列(1個もしくは2個のアミノ酸交換は許容される)ならびに同一のHVR/CDR1および2(フレームワーク中の変異は許容される)、または/ならびに
ζ)フレームワークおよびHVR/CDR中の変異が許容されること
に基づいてアラインされる、段階;
iii)ii)の1つまたは複数のセット中のアラインされた配列を、
α)参照抗体配列に対するアミノ酸差異の数、および/または
β)参照抗体配列に対するアミノ酸差異の位置、および/または
γ)参照抗体配列に対するアミノ酸差異に起因する、物理化学的特性の変化、および/または
δ)参照抗体配列に対するアミノ酸差異に起因する、VH/VL配向性(角度)の違い
に基づいてランク付けする段階;
iv)上位10個の(または上位5個、もしくは上位3個、もしくは最上位の)アラインされランク付けされた抗体のうちの1つを参照抗体の変異抗体と同定する段階。
ここで、WolfGuyインデックスにより、101~125位は重鎖可変ドメインフレームワーク1に対応し、151~199位はCDR-H1に対応し、201~214位は重鎖可変ドメインフレームワーク2に対応し、251~299位はCDR-H2に対応し、301~332位は重鎖可変ドメインフレームワーク3に対応し、351~399位はCDR-H3に対応し、401~411位は重鎖可変ドメインフレームワーク4に対応する。
i)α)ある標的/抗原に特異的に結合する参照抗体のアミノ酸配列または核酸配列、
β)該参照抗体の少なくとも1つの生物学的特性、
γ)次世代シーケンシングにより、多数(少なくとも10個、少なくとも100個、少なくとも1,000個、少なくとも10,000個)の変異抗体について、それらのアミノ酸配列または核酸配列(ここで、変異抗体は、参照抗体と同じ標的/抗原に特異的に結合し、任意で、参照抗体と同じ免疫化キャンペーンにおいて/から得られる)、
を明らかにする/作製する/測定する段階;
ii)以下に基づいてVH配列または/およびVL配列をアラインして、関係するVH/VL配列の1つまたは複数のセットを作る段階
α)同じ長さのVHもしくは/およびVL、または/ならびに
β)同じ長さの全てのβシートフレームワーク領域、または/ならびに
γ)同じ長さの全てのHVR/CDR、または/ならびに
δ)同一のHVR3/CDR3配列(フレームワークおよび/またはHVR/CDR1もしくは2中の変異(1~3個のアミノ酸交換)は許容される)、または/ならびに
ε)相同性が高いHVR3/CDR3配列(1個もしくは2個のアミノ酸交換は許容される)ならびに同一のHVR/CDR1および2(フレームワーク中の変異は許容される)、または/ならびに
ζ)フレームワークおよびHVR/CDR中の変異が許容される;
iii)ii)の1つまたは複数のセット中のアラインされた配列を、
α)参照抗体配列に対するアミノ酸差異の数、および/または
β)参照抗体配列に対するアミノ酸差異の位置、および/または
γ)参照抗体配列に対するアミノ酸差異に起因する、物理化学的特性の変化、および/または
δ)参照抗体配列に対するアミノ酸差異に起因する、VH/VL配向性(角度)の違い
に基づいてランク付けする段階;
iv)上位10個の(または上位5個、もしくは上位3個、もしくは最上位の)アラインされランク付けされた抗体のうちの1つを参照抗体の変異抗体と同定する段階。
ここで、WolfGuyインデックスにより、101~125位は重鎖可変ドメインフレームワーク1に対応し、151~199位はCDR-H1に対応し、201~214位は重鎖可変ドメインフレームワーク2に対応し、251~299位はCDR-H2に対応し、301~332位は重鎖可変ドメインフレームワーク3に対応し、351~399位はCDR-H3に対応し、401~411位は重鎖可変ドメインフレームワーク4に対応する(501~523位は軽鎖可変ドメインフレームワーク1に対応し、551~599位はCDR-L1に対応し、601~615位は軽鎖可変ドメインフレームワーク2に対応し、651~699位はCDR-L2に対応し、701~734位は軽鎖可変ドメインフレームワーク3に対応し、751~799位はCDR-L3に対応し、801~810位は軽鎖可変ドメインフレームワーク4に対応する)。
a)(参照抗体と同じ動物種から得られる)、参照抗体と同じ標的/抗原に結合する(多数の)異なる抗体を産生/発現する多数のB細胞を提供する段階;
b)多数のB細胞から抗体をコードする核酸を単離(および増幅)する段階;
c)次世代シーケンシング法を用いて抗体をコードする核酸をシーケンシングする段階;
d)以下の段階によって、抗体をコードする核酸の配列の配列アライメントを作成する段階;
i)以下に基づいてVH配列または/およびVL配列をアラインして、関係するVH/VL配列の1つまたは複数のセットを作る段階
α)同じ長さのVHもしくは/およびVL、または/ならびに
β)同じ長さの全てのβシートフレームワーク領域、または/ならびに
γ)同じ長さの全てのHVR/CDR、または/ならびに
δ)同一のHVR3/CDR3配列(フレームワークおよび/またはHVR/CDR1もしくは2中の変異(1~3個のアミノ酸交換)は許容される)、または/ならびに
ε)相同性が高いHVR3/CDR3配列(1個もしくは2個のアミノ酸交換は許容される)ならびに同一のHVR/CDR1および2(フレームワーク中の変異は許容される)、または/ならびに
ζ)フレームワークおよびHVR/CDR中の変異が許容される;
ii)ii)の1つまたは複数のセット中のアラインされた配列を、
α)参照抗体配列に対するアミノ酸差異の数、および/または
β)参照抗体配列に対するアミノ酸差異の位置、および/または
γ)参照抗体配列に対するアミノ酸差異に起因する、物理化学的特性の変化、および/または
δ)参照抗体配列に対するアミノ酸差異に起因する、VH/VL配向性(角度)の違い
に基づいてランク付けする段階;
e)参照抗体の1つまたは複数の変異抗体を同定する段階;
f)変異抗体の1つまたは複数の生物学的特性を明らかにする段階;ならびに
g)同等または向上した1つまたは複数の生物学的特性を有する変異抗体を選択し、それによって参照抗体の変異抗体を同定する段階。
(i)多数の抗体コード核酸を含む、1つまたは複数のDNA含有試料を提供する段階;
(ii)多数の抗体コード核酸のうちの複数の遺伝子に共通するコンセンサス配列に結合するコンセンサス配列特異的プライマーを用いて、(i)の各試料中の抗体コード核酸の領域のPCR増幅を実施し、それによって増幅産物のプールを生成段階;
(iii)(シーケンシングリード中の)各位置における各ヌクレオチドの相対比率を明らかにするために、前記増幅産物をシーケンシングする段階;
(iv)(iii)のシーケンシング(リード)結果と少なくとも1つの参照配列との(配列同一性に基づく)配列アライメントを実施する段階であって、参照配列は、望ましい特性を有する抗体に対応する、段階;および
(v)参照抗体の1つまたは複数の変異抗体を同定する段階。
a)抗体可変ドメインコード核酸を含む生物試料に由来する関心対象の1つまたは複数の領域を増幅する段階であって、関心対象の各領域の複数のアンプリコンが作製される、段階;
b)アダプターおよびランダム構成要素を、(a)で作製された各アンプリコンに結合させ、該伸長された各アンプリコンを増幅する段階;
c)(b)で作製された、ランダム構成要素を含むアンプリコンをシーケンシングし、コンセンサス配列を同定する段階であって、シーケンシングの際、冗長なリードが生じ、該冗長なリードが該ランダム構成要素に基づいてグループ分けされる、段階;
d)該コンセンサス配列を参照配列と比較する段階であって、該参照配列と異なるコンセンサス配列が、変異/変化を含む、段階;ならびに
e)段階d)の結果に基づいて、1つまたは複数の変異抗体を同定する段階。
a)抗体可変ドメインコード核酸を含む生物試料に由来する関心対象の1つまたは複数の領域に特異的な1つまたは複数のプライマー対を含むプライマープールをハイブリダイズし、該プライマー対の上流プライマーから該プライマー対の下流プライマーまで伸長させ、伸長産物を該プライマー対の該下流プライマーにライゲーションする段階であって、増幅に必要とされる配列にはさまれた、該関心対象の領域を含む産物が作製される、段階;
b)(a)の産物に、ランダム構成要素を含むアダプターを結合させ、インデックス配列を含むアダプターを結合させ、前記伸長された配列のそれぞれを増幅する段階;
c)(b)で作製された、ランダム構成要素を含む産物をシーケンシングし、コンセンサス配列を同定する段階であって、シーケンシングの際、冗長なリードが生じ、該冗長なリードが該ランダム構成要素に基づいてグループ分けされる、段階。
(i)1つまたは複数の抗体可変ドメインコード核酸をそれぞれが含む、多数のDNA含有試料(抗体分泌B細胞のゲノム物質)を提供する段階;
(ii)コンセンサス配列特異的プライマーを用いて、(i)の抗体可変ドメインコード核酸のPCR増幅を実施して、増幅産物を得る段階(該コンセンサス配列特異的プライマーは、該核酸中の複数の遺伝子に共通するコンセンサス配列に結合し、それによって増幅産物のプールを生成);
(iii)(シーケンシングリード中の)各位置における各ヌクレオチドの相対比率を明らかにするために、段階(ii)で得られた複数の増幅産物をシーケンシングする段階;
(iv)(iii)のシーケンシング(リード)結果と参照抗体可変ドメインコード核酸との(配列同一性に基づく)配列アライメントを実施する段階;
(v)完全/鋳型/参照配列である参照抗体可変ドメインコード核酸との配列アライメントにおいて、抗体可変ドメインコード核酸の配列同一性/相同性に基づくランク付けを実施する段階;および
(vi)段階(v)の配列ランキングに基づいて変異抗体可変ドメインコード核酸を選択する段階
を含み、段階(vi)で選択される変異抗体可変ドメインは、開発可能性ホットスポットが除かれるように(すなわち、その結合部位のうちの1つにおいて、該ドメインが含む翻訳後修飾されるアミノ酸残基が参照抗体と比べて少なくとも1つ少なく、その結果、前記参照抗体可変ドメインを含む参照抗体の生物学的特性の変化が小さくなる(その標的/抗原への結合親和性の低下が少なくなる)ように)、選択される。
- 参照抗体と同じ標的に特異的に結合する抗体をそれぞれが産生する多数のB細胞クローンに由来する核酸をシーケンシングすることによって作成されるシーケンシングデータを得る段階;
- シーケンシングデータを、完全/鋳型/参照配列である参照抗体可変ドメインの配列とアラインする段階;
- 参照抗体可変ドメイン配列に対して最も高い構造的/機能的同一性/類似性を有するが開発可能性ホットスポットを有さない配列を選択する段階。
- 本明細書において報告される方法のうちの1つを用いて得られた、参照抗体の変異抗体をコードする核酸と、機能的抗体の発現に必要な他の全ての核酸とを含む細胞を培養する段階、
- 細胞または培養培地から抗体を回収する段階。
[本発明1001]
参照抗体可変ドメインコード核酸の変異体を選択するための方法であって、該参照抗体可変ドメインコード核酸の該変異体によってコードされる変異抗体可変ドメインのアミノ酸配列が、該参照抗体可変ドメインコード核酸によってコードされる参照抗体可変ドメインのアミノ酸配列と比べて改善された開発可能性を有するか、または該参照抗体可変ドメインコード核酸の該変異体によってコードされる該変異抗体可変ドメインのアミノ酸配列において、該参照抗体可変ドメインコード核酸によってコードされる該参照抗体可変ドメインのアミノ酸配列と比べて、少なくとも1つの翻訳後修飾されるアミノ酸残基が変更されており、該変異抗体可変ドメインおよび該参照抗体可変ドメインが、それぞれの他方のドメインとペアになると、同じ抗原に結合し、
該方法が、
(i)1つまたは複数の抗体可変ドメインコード核酸をそれぞれが含む多数のDNA含有試料の抗体可変ドメインコード核酸の、増幅産物を得るためのコンセンサス配列特異的プライマーを用いるPCR増幅で得られた複数の増幅産物を、シーケンシングする段階;
(ii)(i)のシーケンシングの結果と、鋳型配列である該参照抗体可変ドメインコード核酸との配列アライメントにおいて、抗体可変ドメインコード核酸の配列同一性/相同性に基づくランク付けを実施する段階;および
(iii)段階(ii)の配列ランキングの上位10位までの配列のうちの1つから該変異抗体可変ドメインコード核酸を選択する段階
を含み、
段階(iii)で選択される変異体が、開発可能性が改善されておりかつ/または少なくとも1つの翻訳後修飾されるアミノ酸残基が変更されているように選択される、前記方法。
[本発明1002]
参照抗体可変ドメインの変異体を選択するための方法であって、該参照抗体可変ドメインが、少なくとも1つの翻訳後修飾されるアミノ酸残基を有し、該方法が、
- 参照抗体と同じ標的に特異的に結合する抗体をそれぞれが産生する多数のB細胞クローンに由来する核酸をシーケンシングすることによって得られる抗体可変ドメインコード核酸を、鋳型配列である参照抗体の配列とアラインする段階;ならびに
- 参照配列に対して最も高い構造的または/および機能的な同一性または/および類似性を有する配列を選択する段階であって、該参照抗体可変ドメインの該少なくとも1つの翻訳後修飾されるアミノ酸残基のうちの少なくとも1つが、翻訳後修飾されないアミノ酸残基に置換/変更されている、段階
を含む、前記方法。
[本発明1003]
同じ標的/抗原に特異的に結合する参照抗体の変異抗体を同定するための方法であって、
i)次世代シーケンシングによって決定された、該参照抗体と同じ標的に特異的に結合する該参照抗体の変異抗体の多数のアミノ酸配列または核酸配列のVH配列または/およびVL配列の1つまたは複数のセットを作る段階であって、これらの配列が、
α)同じ長さのVHもしくは/およびVL、または/ならびに
β)同じ長さの全てのβシートフレームワーク領域、または/ならびに
γ)同じ長さの全てのHVR/CDR、または/ならびに
δ)同一のHVR3/CDR3配列、フレームワークおよび/もしくはHVR/CDR中の変異は3個までのアミノ酸交換が許容される、または/ならびに
ε)2個までのアミノ酸交換が許容される相同なHVR/CDR3配列、ならびに同一のHVR/CDR1および2、または/ならびに
ζ)フレームワークおよびHVR/CDR中の変異が許容されること
に基づいて、鋳型としての参照抗体のアミノ酸配列または核酸配列とアラインされ、該参照抗体が標的/抗原に特異的に結合する、段階;
ii)i)の1つまたは複数のセット中のアラインされた配列を、
α)該参照抗体配列に対するアミノ酸差異の数、および/または
β)該参照抗体配列に対するアミノ酸差異の位置、および/または
γ)該参照抗体配列に対するアミノ酸差異に起因する、物理化学的特性の変化、および/または
δ)該参照抗体配列に対するアミノ酸差異に起因する、VH/VL配向性の違い
によってランク付けする段階;
iii)上位10個のアラインされランク付けされた抗体のうちの1つを参照抗体の変異抗体と同定する段階であって、該変異抗体が有する翻訳後修飾されるアミノ酸残基が、該参照抗体の場合と比べて少なくとも1つ少ない、段階
を含む、前記方法。
[本発明1004]
段階i)が、Wolfguy番号付与方式である同じ番号付与方式を用いて前記配列にアノテーションを付することをさらに含む、本発明1003の方法。
[本発明1005]
前記配列の差異が、参照抗体のアミノ酸残基-位置-変異抗体のアミノ酸残基の形式でアノテーションを付され、変異タプルにグループ分けされる、本発明1003または1004の方法。
[本発明1006]
前記物理化学的特性の変化が、電荷、疎水性、および/またはサイズの変化によって判定される、本発明1003~1005のいずれかの方法。
[本発明1007]
前記物理化学的特性の変化が、変異リスクスコアを用いて判定される、本発明1003~1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記変異リスクスコアが、以下の表に基づいて決定され、この表で明示的に与えられていない残基は、値1の重みを付けられる、本発明1007の方法:
ここで、101~125位は重鎖可変ドメインフレームワーク1に対応し、151~199位はCDR-H1に対応し、201~214位は重鎖可変ドメインフレームワーク2に対応し、251~299位はCDR-H2に対応し、301~332位は重鎖可変ドメインフレームワーク3に対応し、351~399位はCDR-H3に対応し、401~411位は重鎖可変ドメインフレームワーク4に対応する。
[本発明1009]
前記参照抗体と同じ標的に特異的に結合する変異抗体の多数のアミノ酸配列または核酸配列が、該参照抗体と同じ免疫化キャンペーンに由来するB細胞から得られ、該B細胞が、抗原特異的抗体を発現するB細胞について富化されている、本発明1003~1009のいずれかの方法。
[本発明1010]
前記変異体において、i)可変ドメインまたはHVR中の対になっていないCys残基、ii)グリコシル化部位、およびiii)分解ホットスポット(Asp、Asn、またはMet)のうちの1つまたは複数が除かれている、本発明1001~1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
参照抗体可変ドメインの変異体を選択するための方法であって、該参照抗体可変ドメインが、少なくとも1つの翻訳後修飾されるアミノ酸残基を有し、該方法が、本発明1001~1010のいずれかの方法の段階を含む、前記方法。
[本発明1012]
抗体を製造するための方法であって、
- 本発明1001または1002の方法を用いて得られる核酸および機能的抗体の発現に必要な他の全ての核酸を含む細胞を培養する段階、
- 該細胞または培養培地から抗体を回収する段階
を含む、前記方法。
[本発明1013]
本発明1001~1010のいずれかの方法を用いて得られる核酸を含む、細胞。
本明細書において一般に説明するような態様は例示的であることが、容易に理解されるであろう。様々な態様の、以下のより詳細な説明は、本開示の範囲を限定することを意図せず、様々な態様を代表するにすぎない。さらに、本明細書において開示される方法の段階または行為の順序は、本開示の範囲から逸脱しないように、当業者が変更してよい。言い換えると、態様を適切に実施するのに、特定の順序の段階または行為が必要とされない限り、個々の段階または行為の順序または使用は、修正されてよい。
ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的情報は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において示されている。
(a)アミノ酸残基26~32(L1)、50~52(L2)、91~96(L3)、26~32(H1)、53~55(H2)、および96~101(H3)に存在する超可変ループ(Chothia, C. and Lesk, A.M., J. Mol. Biol. 196 (1987) 901-917);
(b)アミノ酸残基24~34(L1)、50~56(L2)、89~97(L3)、31~35b (H1)、50~65(H2)、および95~102(H3)に存在するCDR(Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.);
(c)アミノ酸残基27c~36(L1)、46~55(L2)、89~96(L3)、30~35b(H1)、47~58(H2)、および93~101(H3)に存在する抗原接触部分(MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));ならびに
(d)HVRアミノ酸残基46~56(L2)、47~56(L2)、48~56(L2)、49~56(L2)、26~35(H1)、26~35b(H1)、49~65(H2)、93~102(H3)、および94~102(H3)を含む、(a)、(b)、および/または(c)の組合せ
が含まれる。
100×X/Y比
式中、Xは、配列アライメントプログラムALIGN-2によって、そのプログラムによるAおよびBのアライメントにおいて同一のマッチとして採点された残基の数であり、Yは、B中の残基の総数である。配列Aの長さが配列Bの長さに等しくない場合、Bに対するAの配列同一性%は、Aに対するBの配列同一性%と等しくならないことが認識されるであろう。
ヒト抗体は、重鎖CH2ドメインの297位あたりのアスパラギン残基(Asn297)の位置で、またはFAB領域中で、主にグリコシル化されており、多少フコシル化されたバイアンテナ型複合型オリゴ糖を有する(抗体アミノ酸残基の番号付与は、上記のKabatに基づく)。バイアンテナ型糖鎖構造は、各アームにおいて2個までの連続したガラクトース(Gal)残基が末端部をなすことができる。これらのアームは、中央のマンノース残基へのグリコシド結合に基づいて(1,6)および(1,3)と表記される。G0と表記される糖鎖構造は、ガラクトース残基を含まない。
Asn残基およびAsp残基は、環状スクシンイミド中間体の形成を介して先に起こる、共通の分解経路を有する。スクシンイミド形成は、Asn/Asp側鎖γ-カルボニル基に対する、後続のアミノ酸の主鎖窒素の求核攻撃によるAsnの脱アミドまたはAspの脱水後の分子内転位の結果として生じる。準安定な環状イミドは、その2つのカルボニル基のうちのいずれか1つの位置で加水分解して、加水分解条件および立体構造的拘束に応じて、異なる比率でアスパルチル結合またはイソアスパルチル結合を形成することができる。さらに、代替の分解メカニズムも提唱され、例えば、環状イソイミドを形成させるか、またはAsnからAspへの水に補助された加水分解を指示する、主鎖のカルボニル酸素による求核攻撃が提唱された。分解産物、すなわちスクシンイミド、Asp、またはisoAspのいずれかを検出するには、いくつかの分析方法、主に、電荷を感知する方法、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたは等電点電気泳動が、当業者に公知である。タンパク質中の分解部位の定量および位置確認のために最も適しているのは、液体クロマトグラフィータンデム型質量分析(LC-MS/MS)による解析である。
Wolfguy番号付与では、KabatおよびChothiaの定義の和集合としてCDR領域を定義する。さらに、この番号付与スキームでは、CDR位置のインデックスによって、あるCDR残基が上行するループまたは下行するループの一部分であるかどうかが示されるように、CDR長に基づいて(および、配列にある程度基づいて)CDRループの先端にアノテートを付す。確立されている番号付与スキームとの比較を、以下の表に示す。
(a)サンプル調製
特定の局面において、本明細書において報告される方法は、一つには、核酸を含む生物試料から関心対象の1つまたは複数の領域を増幅する段階を含む。この増幅により、関心対象の各領域の複数のアンプリコンが生じる。
特定の局面において、本明細書において報告される方法は、一つには、セクション(a)で生じた各アンプリコンまたは産物にアダプターおよび/またはインデックス配列を結合させる段階を含む。
特定の局面において、本明細書において報告される方法は、一つには、指数関数的PCRの産物をシーケンシングする段階を含む。指数関数的PCR産物のシーケンシングは、冗長なリードを生じる。冗長なリードをランダム構成要素に基づいてグループ分けし、これらの冗長なリードが配列エラーを減らすように、コンセンサス配列を同定する。
エラーが訂正されたコンセンサス配列(ECCS)が同定された後、ECCSを参照配列と比較して、1つまたは複数の差異の存在を明らかにしてよい。参照配列は、同じ生物学的特性を有するが開発可能性の問題(ホットスポット)などの不利な特徴を有さない変異体を探索するための、抗体の配列であってよい。
当技術分野では、例えば元の候補の開発可能性障害に対処するためにアミノ酸配列に変異を導入することによって、または選択されなかった抗体の新規なスクリーニングを実施することによって、バックアップ/代替候補を同定するのが通常である。前者の場合、開発可能性障害を取り除くことによって、抗体の結合特性および/または治療特性も影響を受け得ることを無視することはできない。後者の場合、真の代替候補を発見できるかどうかが疑わしい。
- 例えば、コンピュータープログラムによる、ペアの(Illumina MiSeq)リードのアセンブリ(任意で、訂正を含む:UMIバーコード抽出および完全なVH配列のコンセンサス構築に基づくエラー訂正を可能にするMolecular Identifier Group-based Error Correction(MiGec)ソフトウエェアパイプライン);
- 任意で訂正、すなわち配列複製物の訂正、n≧3のCDR3クラスターのみの考慮、シグナルペプチド検出、および品質評価を含む、抗体可変ドメインの抽出:
- 抗体変異体の構造を手引きとしたクラスター化およびランク付け;ならびに
- VH/VLの対形成、結合、および機能を保持する能力についての、参照配列に対する変異のランク付け。任意で、このランク付けは、行列に基づき、変異の保存によっても変わる。
抗体可変領域変異体の特徴決定
本明細書において報告される方法は、重鎖可変領域(VH)配列および軽鎖可変領域(VL)配列が公知である所与の参照抗体に基づいている(以下、「参照」または「参照抗体」と表記される)。
- HVR/CDR中に(遊離)システインがないこと
- 可変ドメイン中に、分解が起こりやすいAsp、Asn、Met残基/モチーフがないこと。
配列変異体の所与のセットは、大規模かつ冗長であり得るため、各アミノ酸置換の数、位置、および種類に関して同一または類似である変異体を同定するクラスター化を実施することは有意義である。この目的のために、例えば、十分に確立されているk-メドイドクラスター化アルゴリズムを使用することができる。
1. 2つのタプル間の、位置に基づく距離行列を計算する(残基番号の距離:293-211=82など):
2. 距離が最も短い変異ペア、すなわちS295NおよびR306Kを選ぶ(残基番号の距離は11)。
このペアの距離寄与は、(11+abs(BLOSUM62(S,N)-BLOSUM62(R,K)))2である。
上記で選ばれたペアが除かれるように、距離行列を更新する:
全ての変異をペアにし終わるまで、手順(段階2)を繰り返す。
3. タプル当たりの変異数が一致しない場合、ペアにされていない変異が残ることになる(この例ではT322P)。ペアにされていない変異T322Pを計上するために、距離に(310+abs(BLOSUM62(T,T)-BLOSUM62(T,P)))2を加える。
310という値は、VH Wolfguyインデックスの見地からの理論上の最大距離である(411-101)。ペアにされていない全ての変異を計上するまで、手順(3)を繰り返す。
変異_タプル_距離[(E211A,R306K),(Y293D,S295N,T322P)]=sqrt((11+abs(BLOSUM62(S,N)-BLOSUM62(R,K)))2+(82+abs(BLOSUM62(Y,D)-BLOSUM62(E,A)))2+(310+abs(BLOSUM62(T,T)-BLOSUM62(T,P)))2)
=sqrt(122+842+3162)≒327.194
変異リスクスコアは、上記に定義した変異タプルによって指定される抗体変異体が、参照抗体によって示される機能を失うリスクを定量化するための手段である(通常、機能は、所与の標的/抗原に対する結合親和性である)。変異リスクスコアは負の値を常にとり、負の値の絶対値が大きいほど、機能損失のリスクが大きいことが示される。
所与の変異体について変異リスクを定量することに加えて、その変異体が参照抗体のVH-VL配向性を保存している可能性が高いかどうかを評価することは有意義である。目標は、参照抗体と同じ抗原結合特性および安定性を保持している抗体変異体を得ることである。この目的のために、Dunbarら(Prot.Eng.Des.Sel. 26 (2013) 611-620)によって定義された6種類のABangle配向性尺度HL、HC1、LC1、HC2、LC2、およびdc(5種類の角度尺度および1種類の直線距離尺度)を用いて、VH-VL配向性が特徴決定された。参照抗体およびその変異体の個々のABangle値は、Bujotzekらによって説明された機械学習に基づくアプローチを用いて予測される(Bujotzek, A., et al., Prot. Struct. Funct. Bioinform., 83 (2015) 681-695)。このアプローチにおいて、VH-VL配向性のパラメーターは、VHドメインとVLドメインのドメイン境界面の大きな影響力を持つ残基の配列フィンガープリントから予測される。
アミノ酸をベースとする任意の2つの構造を比較する場合、通常、等価な原子の平均二乗偏差(RMSD)のような距離に基づく測定基準が使用される。
- 各物体表面の基準系
- 周囲の配向性パラメーターを測定するための軸
- これらのパラメーターを説明し定量するための専門用語。
- Cの長さ、dc、
- Cの周りで測定されるH1からL1までのねじれ角、HL、
- H1とCの間の屈曲角、HC1、
- H2とCの間の屈曲角、HC2、
- L1とCの間の屈曲角、LC1、および
- L2とCの間の屈曲角、LC2。
- Cの長さ、dc、
- Cの周りで測定されるH1からL1までのねじれ角、HL、
- H1とCの間の屈曲角、HC1、
- H2とCの間の屈曲角、HC2、
- L1とCの間の屈曲角、LC1、および
- L2とCの間の屈曲角、LC2、
によって定義され、
ここで、基準系平面は、i)VHの8つの位置H36、H37、H38、H39、H89、H90、H91、およびH92に対応するCα座標を整列させ、それらを通る平面を当てはめる段階、ならびにii)VLの8つの位置L35、L36、L37、L38、L85、L86、L87、およびL88に対応するCα座標を整列させ、それらを通る平面を当てはめる段階、iii)各平面に配置物を配置する段階であって、各構造が等価なメッシュ点および等価なVH-VLメッシュ点のペアを有する段階、ならびにiv)各構造におけるメッシュ点の各ペアについてユークリッド距離を測定する段階によって登録され、ベクトルCは、分離距離の分散が最小である点のペアをつなぎ、
ここで、H1は、VH平面の第1の主成分と平行するベクトルであり、H2は、VH平面の第2の主成分と平行するベクトルであり、L1は、VL平面の第1の主成分と平行するベクトルであり、L2は、VL平面の第2の主成分と平行するベクトルであり、HL角度は、この2つのドメイン間のねじれ角であり、HC1およびLC1は、一方のドメインの、他方のドメインに対する傾斜様の変化量と等価な屈曲角であり、HC2屈曲角およびLC2屈曲角は、一方のドメインの他のドメインに対するねじれ様の変化量と等価である。
(より詳細な情報については、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられるDunbar, J., et al., Protein Eng. Des. Sel., 26 (2013) 611-620およびBujotzek, A., et al., Prot. Struct. Funct. Bioinf. 83 (2015) 681-695を参照されたい)
- 多数の変異抗体配列から、および参照抗体について、Fv断片を作製する段階、
- 参照Fv断片について、および多数の変異抗体Fv断片の各変異抗体Fv断片について、抗体Fv断片の配列フィンガープリントに基づいてVH-VL配向性を明らかにする段階、
- 参照抗体のVH-VL配向性と比べたVH-VL配向性の違いが最も小さい変異抗体Fv断片を同定/選択/取得/ランク付けする段階。
- 参照抗体のVH-VLドメイン間角度と比べてVH-VLドメイン間角度の(構造的)類似性が最も高い変異抗体Fv断片を同定/選択/取得/ランク付けする段階。
と定義する。その場合、ABangleパラメーターの2つのセット間のユークリッド距離は、
である。
SCaRAbの適用により、特定の配列特徴(例えば、参照抗体中に存在する潜在的なグリコシル化部位の除去)または障害(例えば、参照抗体には存在しない新しい遊離システイン残基の導入)について変異タプルをスクリーニングすることができ、それに応じてフィルターを適用することができる。
B細胞クローニング結合体(BCC結合体、結合ELISA)の単離および特性
3回目の免疫化後の6日目に、免疫化したウサギR176から血液15mlを採取し、108.6×10E6個のPBMCを単離した。VHのNGSの場合、4.2×10E6個のPBMCをRLT緩衝液に再懸濁し、一方、残りのPBMCを、B細胞クローニング処理によって抗原特異的B細胞クローンを単離するためにさらに処理した(マクロファージ除去、抗原に基づく富化)(例えば、Seeber, S., et al, PLoS One, 9 (2014) e86184を参照されたい)。
全体として、B細胞クローニングによって同定された4個の結合体を、NGSレパートリーにおけるVH変異体の同定のために選択した;クローンはいずれも、抗原特異的富化後にB細胞クローニングによって単離し、全クローンが、抗原に対する特異性を示し(20ng/ml未満のEC50)、それらのうちの2個が、マウス抗原に対する交差反応性を示した(20ng/ml未満のEC50)(以下の表を参照されたい)。
上記に概説したように、同定された変異体のクラスター化を実施した。これらの結果を以下の表に提示する。クラスター化メドイドに相当する変異体、すなわち、クラスター中の他の全ての変異体に対する平均dist_ABangleが最小である、クラスター中の変異体を、灰色の背景を用いて目立たせていることに留意されたい。一般的に公知であるk-メドイドに基づくクラスター化を、距離に関係する関数を用いて、本明細書において報告される方法に拡大適用した。これらの変異体は、変異体の所与のクラスターの代表または典型と解釈することができる。
変異VHプラスミドおよび親VLプラスミドをHEK293細胞に一過性に同時トランスフェクトした。さらに、参照B細胞クローンもトランスフェクトし、参照として使用した。上清を精製した後、下記の実験セクションで説明するように、ヒト抗原およびマウス抗原への結合に関して全クローンを解析した。EC50に基づく解析は、様々な機会に反復して実施して、統計学的正確さを保証した。
開発可能性ホットスポットを有するB細胞クローニング(BCC)結合体のNGS変異体
全体として、7種のB細胞クローニング結合体について、本明細書において報告される方法を用いて、NGSレパートリーにおいてクローン関係にある結合体を同定した;クローンはすべて、hu-CDCP1特異的富化後(富化のタイプは、以下の表に示している)にB細胞クローニングによって単離され、いずれもhu-CDCP1に対する特異性を示し(EC50/IC50 abs(ng/ml)範囲が200ng/ml未満)、VHはいずれも、HCDR中にシステインまたはN-グリコシル化部位スポットを有していた。
変異VHプラスミドおよび親VLプラスミドをHEK293細胞に一過性に同時トランスフェクトした。さらに、7種の親抗体もトランスフェクトし、参照として使用した。上清を精製した後、実施例のセクションで説明するように、ヒトCDCP1抗原への結合に関して全クローンを解析した。
共通の軽鎖を発現するトランスジェニック動物が免疫化のために使用される場合、単にVHレパートリーの解析だけで十分である。他のトランスジェニックモデルまたは野生型動物において、VH/VLペアが一体を成し、両方とも等しい様式で抗原特異性に寄与していることを確認する必要がある。このために、単細胞クローニングと組み合わせた単細胞選別から特殊なRNA捕捉まで多岐にわたる、幅広い方法を使用することができる。例えば、融合PCRは、UMIエラー訂正方法と組み合わせるのに非常に良く適している。ペアの鎖の情報は、各単細胞に由来するαおよびβ(または重鎖および軽鎖)転写物の物理的結合を通じて保持される。転写物の融合は、(多重化)オーバーラップ伸長PCRによって遂行することができる。
ウサギの免疫化
ヒトLRP8のKLHコンジュゲートを、ニュージーランド白ウサギの免疫化のために使用した。0日目に皮内適用によって、完全フロイントアジュバントを用いて乳化した500μgの免疫原で、7、14、28、42日目に、交互の筋肉内適用および皮下適用によって、各500μgで、各ウサギを免疫化した。その後、毎月、500μgの皮下免疫化をウサギに施し、血清力価を測定するために、免疫化後7日目に少量の血液試料を採取した。より多量の血液試料(推定される総血液量の10%)を、3ヶ月目、4ヶ月目、および5ヶ月目の免疫化の間に(免疫化後5~7日目に)採取し、末梢単核細胞を単離し、それらをB細胞クローニングプロセスにおいて抗原特異的B細胞の供給源として使用した。
血清力価の測定(ELISA)
PBS中0.5μg/mlビオチン標識ヒトLRP8を、100μl/ウェルの分量で、ストレプトアビジンでコーティングした96ウェルプレートに固定化し、続いて、200μl/ウェルのPBS中2% CroteinCを用いてプレートをブロックした。その後、0.5% CroteinCを含むPBSに溶かした2つ1組の100μl/ウェルの抗血清段階希釈物を、添加した。検出は、0.5% CroteinCを含むPBSに溶かしてそれぞれ希釈したHRP結合型ロバ抗ウサギIgG抗体(Jackson Immunoresearch/Dianova、カタログ番号711-036-152;1/16000)を100μl/ウェルの分量で用いて行った。全ての段階において、プレートを37℃で1時間インキュベートした。各段階の間は常に、PBS中0.05% Tween 20を用いてプレートを3回洗浄した。100μl/ウェルのBM Blue POD(peroxidase)-基質可溶性物質(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を添加することによってシグナルを発現させ、100μl/ウェルの1M HClを添加することによって停止させた。吸光度を450nmで読み取り、参照としての690nmと比較した。力価は、最大半量シグナルをもたらす、抗血清の希釈度と定義した。
ウサギ末梢血単核細胞(PBMC)の単離
血液試料は、免疫化した野生型ウサギ(NZW)から採取した。製造業者の仕様書に従って哺乳動物用リンフォライト(Cedarlane Laboratories, Burlington, Ontario, Canada)を用いて密度遠心分離する前に、EDTAを含む全血を1×PBS(PAA, Pasching, Austria)で2倍に希釈した。PBMCを1×PBSで2回洗浄した。
マクロファージ/単球の除去
KLHでコーティングした滅菌済みSA-6ウェルプレートにPBMCを播種して、非特異的接着を利用してマクロファージおよび単球を除去し、KLHへの細胞結合を取り除いた。各ウェルを4mlの培地および免疫化ウサギに由来する最高6×10E6個のPBMCで最大限に満たし、37℃および5%CO2で1時間、結合させた。上清中の細胞(末梢血リンパ球(PBL))を、抗原パニング段階に使用した。
B細胞の富化
ストレプトアビジンでコーティングした滅菌済み6ウェルプレート(Microcoat, Bernried, Germany)を、PBSに溶かした2μg/mlのビオチン標識KLHタンパク質またはビオチン標識LRP8/CDCP1タンパク質のいずれかで、室温で3時間コーティングした。パニング段階の前に、これらの6ウェルプレートを無菌PBSで3回洗浄した。コーティングしたプレートに、培地4ml当たり最高6×10E6個のPBLを播種し、37℃および5%CO2で1時間結合させた。ウェルを1×PBSで1~2回注意深く洗浄することによって、非接着細胞を除去した。37℃および5%CO2で10分間トリプシンを用いて、残存する粘着性細胞を剥離させた。EL-4 B5培地を用いてトリプシン処理を止めた。免疫蛍光染色するまで、これらの細胞を氷上で保存した。
10%FCS(Hyclone, Logan, UT, USA)、2mMグルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン溶液(PAA, Pasching, Austria)、2mMピルビン酸ナトリウム、10mM HEPES(PAN Biotech, Aidenbach, Germany)、および0.05mM β-メルカプトエタノール(Gibco, Paisley, Scotland)を添加されたRPMI 1640(Pan Biotech, Aidenbach, Germany)。
免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー
抗IgG抗体FITCコンジュゲート(AbD Serotec, Dusseldorf, Germany)を、単細胞選別に使用した。表面染色のために、除去段階および富化段階(実施例4および5)で前処理したB細胞を、PBS(phosphate buffered saline solution)に溶かした抗IgG抗体FITCコンジュゲートと共にインキュベートし、暗所、4℃で45分間インキュベートした。染色後、これらの細胞を氷冷PBSで2回洗浄した。最後に、標識されたB細胞を氷冷PBSに再懸濁し、直ちにFACS解析に供した。FACS解析前に濃度5μg/mlのヨウ化プロピジウム(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)を加えて、死細胞と生細胞とを区別した。
B細胞培養
選別された単一B細胞の培養は、Seeberらによって説明されている方法に従って行った(Seeber, S., et al., PLoS One, 9 (2014) e86184.)。簡単に説明すると、選別された単一のウサギB細胞を、Pansorbin細胞(1:100,000)(Calbiochem (Merck) , Darmstadt, Germany)、5%ウサギ胸腺細胞上清(MicroCoat, Bernried, Germany)、およびγ線照射されたマウスのEL-4 B5胸腺腫細胞(5×10E5個の細胞/ウェル)を含むEL-4 B5培地をウェル当たり200μl入れた96ウェルプレート中で、インキュベーターにおいて37℃で7日間、インキュベートした。B細胞培養の上清をスクリーニングのために取り除き、残存する細胞を直ちに回収し、100μlのRLT緩衝液(Qiagen, Hilden, Germany)に入れて-80℃で凍結した。
酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)
ヒト抗原
抗原、すなわちビオチン標識ヒトLRP8を、384ウェルマイクロタイタープレート(Maxisorb(ストレプトアビジン付き)、Nunc)において、PBS、0.5% BSA、および0.05% Tweenに溶かして合計体積25μLで、濃度250ng/mLの抗LRP8抗体を含む5μLの試料と共にインキュベートした。25℃で1.5時間のインキュベーションの後、90μLのPBSで6回洗浄することによって未結合抗体を除去した(分注および吸引)。PODにコンジュゲートされた抗ウサギ抗体(ECL抗ウサギIgG-POD、カタログ番号NA9340V;POD=ペルオキシダーゼ)を用いて、抗原-抗体複合体を検出した。35μLのPOD基質3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB;Piercenet、カタログ番号34021)を添加してから20~30分後に、光学濃度を370nmで測定した。GraphPad Prism 6.0ソフトウェアによって4変数のロジスティックモデルを用いて、EC50値を計算した。
抗原、すなわちビオチン標識マウスLRP8を、384ウェルマイクロタイタープレート(Maxisorb(ストレプトアビジン付き)、Nunc)において、PBS、0.5% BSA、および0.05% Tweenに溶かして合計体積25μLで、濃度250ng/mLの抗LRP8抗体を含む5μLの試料と共にインキュベートした。25℃で1.5時間のインキュベーションの後、90μLのPBSで6回洗浄することによって未結合抗体を除去した(分注および吸引)。PODにコンジュゲートされた抗ウサギ抗体(ECL抗ウサギIgG-POD、カタログ番号NA9340V)を用いて、抗原-抗体複合体を検出した。35μLのPOD基質3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン(TMB、Piercenet、カタログ番号34021)を添加してから20~30分後に、光学濃度を370nmで測定した。GraphPad Prism 6.0ソフトウェアによって4変数のロジスティックモデルを用いて、EC50値を計算した。
SLICクローニングのためのVドメインのPCR増幅
製造業者のプロトコールに従ってNucleoSpin 8/96 RNAキット(Macherey&Nagel;カタログ番号740709.4、740698)を用いて、RLT緩衝液(Qiagen、カタログ番号79216)に再懸濁したB細胞溶解物から全RNAを調製した。60μlのRNaseフリー水を用いて、RNAを溶出させた。製造業者の取扱い説明書に従ってSuperscript III第一鎖合成SuperMix (Invitrogen、カタログ番号18080-400)およびオリゴdTプライマーを用いる逆転写酵素反応によって、6μlのRNAを利用してcDNAを作製した。段階はすべて、Hamilton ML Starシステムを用いて実施した。重鎖に対するプライマーrbHC.upおよびrbHC.doならびに軽鎖に対するプライマーrbLC.upおよびrbLC.doを用い、最終体積50μlで、AccuPrimeス―パーミックス(Invitrogen、カタログ番号12344-040)を用いて、4μlのcDNAを利用して免疫グロブリンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域(VHおよびVL)を増幅した。
PBMCおよび抗原を用いて富化したB細胞からの、NGS VH-PCR
4.2×10E6個のPBMCおよび1.2×10E6個の、抗原を用いて富化したB細胞を、300μlのRLT緩衝液(Qiagen;カタログ番号79216)中に再懸濁した。製造業者のプロトコールに従ってRNeasy MiniキットまたはMicroキット(Qiagen;カタログ番号74134)を用いて、B細胞溶解物から全RNAを調製した。PBMCおよび抗原を用いて富化したB細胞について、それぞれ50μlおよび30μlのRNaseフリー水でRNAを溶出させた。製造業者の取扱い説明書に従ってSuperscript III第一鎖合成SuperMix (Invitrogen、カタログ番号18080-400)およびオリゴdTプライマーを用いる逆転写酵素反応によって、6μlのRNAを利用してcDNAを作製した。
NGSシーケンシングのための鋳型の調製
ペアードエンドラン 2×300塩基:試料用の最小DNA量:100ng、十分な500ng
クローン関係にあるVH変異体を同定するための、NGS配列のバイオインフォマティクス解析
Illumina MiSeqからのデータは、配列につき2つの、ペアの通常重複しているリードからなる。データはすべて、以下のワークフローを用いて解析した:
>FLASH(他の任意のソフトウェアツールも同様にうまくいくはずである)によるペアリードのアセンブリ
○ FLASHはhttp://ccb.jhu.edu/software/FLASH/から入手可能
○ Flash v1.2.10を初期設定パラメーター(出っ張りなし、最小オーバーラップ10bp、最大オーバーラップ65bp)で使用
○ 結果:Illuminaアダプターを含まない重複した配列
>抗体可変ドメインの抽出:
○ DNAを全ての6つのORFに翻訳
○ 各ORFについて:
・コンセンサスFW1配列と比較することによってFW1のペプチド配列を探し、違いを数える。その値が所定の閾値を上回る場合、継続する。
・FW2を同様に探して、FW1への連結を試みる(両者の間の領域はCDR1である)
・FW3を同様に探して、FW2への連結を試みる(両者の間の領域はCDR2である)
・FW4を同様に探して、FW3への連結を試みる(両者の間の領域はCDR3である)
○ 通常、6つのORFのうちのただ1つにおいて、前述の手順を用いて可変ドメインを同定することができる。複数が発見される場合、コンセンサスへの距離を説明したスコアを計算し、最も良いORFを選択する。
○ 発見された可変ドメインについて、いくつかの値がある。関係が最も近い生殖系列が、可変ドメイン配列をIMGTによって提供される入手可能な生殖系列レパートリーに対してアラインするだけで検出されたこと、そしてそれらがベストヒットを記録することが、最も重要である。これによって、これらの配列の起源である可能性が非常に高いV/D/J生殖系列も、配列ごとに報告される。
○ 結果:含まれる可変ドメインについての全情報を含む、配列1つにつき1行の表。
○ 実施される追加の解析:参照配列と比較した、DNA/PEPレベルで各CDR/FRについて計算された変異数。
親VLによる、NGS VH変異体の一過性トランスフェクション
NGS変異体の組換え発現のために、B細胞クローンの親VLをコードするPCR産物を、オーバーハングクローニング法(Haun, R.S., et al., BioTechniques 13 (1992) 515-518;Li, M.Z., et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256)によって、発現ベクター中の、VL領域を受け入れるためのウサギ定常領域を含む発現カセット中にcDNAとしてクローニングした。発現ベクターは、イントロンAを含む5'CMVプロモーターおよび3'BGHポリアデニル化配列からなる発現カセットを含んでいた。発現カセットに加えて、プラスミドは、pUC18由来の複製起点および大腸菌(E. coli)におけるプラスミド増幅のためのアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。さらに、発現ベクターは、VL領域を受け入れるためのウサギκLC定常領域も含んでいた。
抗原(CDCP1)特異的選別のための染色手順
マクロファージ除去段階から得られた細胞を用いて、抗原特異的選別を実施した。1巡目に、これらの細胞を、濃度5μg/mlのビオチン標識CDCP1抗原と共に氷上でインキュベートした。2回の洗浄段階の後、ビオチン標識され細胞に結合したCDCP1を、A647-ストレプトアビジンコンジュゲート(Invitrogen)を用いて検出した。並行して、抗IgG FITC(AbD Serotec, Dusseldorf, Germany)および抗IgM PE(BD Pharmingen)抗体を添加した。染色した細胞を2回洗浄した。最後に、PBMCを氷冷PBSに再懸濁し、直ちにFACS解析に供した。単細胞選別に使用した細胞ゲートは、rbIgM-/rbIgG/CDCP1+であった。
Hu CDCP1結合体のスクリーニング
ストレプトアビジンでコーティングされたNunc Maxisorbプレート(MicroCoat、カタログ番号11974998001)を、濃度200ng/mlのビオチン標識ヒトCDCP1-AviHis融合タンパク質を25μl/ウェル用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。洗浄(PBST緩衝液(Phosphate Buffered Saline Tween-20)を用いて2×90μl/ウェル)後、25μlの抗CDCP1抗体試料を添加し、室温で1時間インキュベートした。洗浄(PBST緩衝液を用いて3×90μl/ウェル)後、25μl/ウェルのヤギ抗ヒトIgG-HRPコンジュゲート(Millipore、カタログ番号AP502P)を1:1,000希釈で添加し、振盪機に載せて室温で1時間インキュベートした。洗浄(PBST緩衝液を用いて4×90μl/ウェル)後、25μl/ウェルのTMB基質(Roche Diagnostics GmbH、カタログ番号 11835033001)を添加し、ODが1.5~2.5に達するまでインキュベートした。25μl/ウェルの1N HClを添加することによって反応を停止させた。測定は、370/492nmで行った。
PBMCおよび抗原を用いて富化した(パニング試料)B細胞からのNGS VH-PCR
4×10E6個のPBMCおよび抗原を用いて富化したB細胞352個を、350μlのRLT緩衝液(Qiagen、カタログ番号79216)中に再懸濁した。製造業者のプロトコールに従ってRNeasy MiniキットまたはMicroキット(Qiagen、カタログ番号74134)を用いて、B細胞溶解物から全RNAを調製した。PBMCおよび抗原を用いて富化したB細胞について、それぞれ50μlおよび30μlのRNaseフリー水でRNAを溶出させた。製造業者の取扱い説明書に従ってSuperscript III第一鎖合成SuperMix(Invitrogen、カタログ番号18080-400)およびオリゴdTプライマーを用いる逆転写酵素反応によって、6μlのRNAを利用してcDNAを作製した。
親VLによる、NGS VH変異体のHEK一過性トランスフェクション
NGS変異体の組換え発現のために、B細胞クローンの親VLをコードするPCR産物を、オーバーハングクローニング法(Haun, R.S., et al., BioTechniques 13 (1992) 515-518;Li, M.Z., et al., Nature Methods 4 (2007) 251-256)によって、発現ベクター中にcDNAとしてクローニングした。発現ベクターは、イントロンAを含む5'CMVプロモーターおよび3'BGHポリアデニル化配列からなる発現カセットを含んでいた。発現カセットに加えて、プラスミドは、pUC18由来の複製起点および大腸菌におけるプラスミド増幅のためのアンピシリン耐性を与えるβ-ラクタマーゼ遺伝子を含んでいた。さらに、発現ベクターは、VL領域を受け入れるためのウサギκLC定常領域も含んでいた。
ヒトCDCP1結合ELISA
ストレプトアビジンでコーティングされたNunc Maxisorbプレート(MicroCoat、カタログ番号11974998001)を、濃度200ng/mlのビオチン標識ヒトCDCP1-AviHis融合タンパク質を25μl/ウェル用いてコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。洗浄(PBST緩衝液を用いて2×90μl/ウェル)後、25μlの抗CDCP1抗体試料を、5μg/mlから始まる1:2希釈系列で添加した。プレートを室温で1時間インキュベートした。洗浄(PBST緩衝液を用いて3×90μl/ウェル)後、25μl/ウェルの、ヤギ抗ヒトIgG-HRPコンジュゲート(Jackson、カタログ番号109-036-098)およびロバ抗ウサギIgG(GE Healthcare、カタログ番号 NA9340V、ロット番号389592)の混合物を1:9,000希釈で添加し、振盪機に載せて室温で1時間インキュベートした。洗浄(PBST緩衝液を用いて4×90μl/ウェル)後、25μl/ウェルのTMB基質(Roche、カタログ番号 11835033001)を添加し、ODが1.5~2.5に達するまでインキュベートした。25μl/ウェルの1N HClを添加することによって反応を停止させた。測定は、370/492nmで行った。
Claims (5)
- 参照抗体可変ドメインコード核酸の変異体を選択するための方法であって、該参照抗体可変ドメインコード核酸の該変異体によってコードされる該変異抗体可変ドメインのアミノ酸配列において、該参照抗体可変ドメインコード核酸によってコードされる該参照抗体可変ドメインのアミノ酸配列と比べて、i)可変ドメインまたはHVR中の対になっていないCys残基、ii)グリコシル化部位、およびiii)分解ホットスポット(Asp、Asn、またはMet)のうちの1つまたは複数が除かれており、該変異抗体可変ドメインおよび該参照抗体可変ドメインが、それぞれの他方のドメインとペアになると、同じ抗原に結合し、該変異体が、該参照抗体と同じ免疫化キャンペーンに由来するB細胞から得られ、
該方法が、
(i)1つまたは複数の抗体可変ドメインコード核酸をそれぞれが含む多数のDNA含有試料の抗体可変ドメインコード核酸の、増幅産物を得るためのコンセンサス配列特異的プライマーを用いるPCR増幅で得られた複数の増幅産物を、次世代シーケンシング(NGS)によりシーケンシングする段階;
(ii)(i)のシーケンシングの結果と該参照抗体可変ドメインコード核酸との配列アライメントにおいて、鋳型配列である該参照抗体可変ドメインコード核酸との、抗体可変ドメインコード核酸の配列同一性/相同性に基づくランク付けを実施する段階;および
(iii)段階(ii)の配列ランキングの上位10位までの配列のうちの1つから該変異抗体可変ドメインコード核酸を選択する段階
を含み、
段階(iii)で選択される変異体が、i)可変ドメインまたはHVR中の対になっていないCys残基、ii)グリコシル化部位、およびiii)分解ホットスポット(Asp、Asn、またはMet)のうちの1つまたは複数が除かれているように選択される、前記方法。 - 参照抗体可変ドメインの変異体を選択するための方法であって、該変異抗体可変ドメインにおいて、該参照抗体可変ドメイン中に存在するi)可変ドメインまたはHVR中の対になっていないCys残基、ii)グリコシル化部位、およびiii)分解ホットスポット(Asp、Asn、またはMet)のうちの1つまたは複数が除かれており、該変異体が、該参照抗体と同じ免疫化キャンペーンに由来するB細胞から得られ、該方法が、
- 参照抗体と同じ標的に特異的に結合する抗体をそれぞれが産生する多数のB細胞クローンに由来する核酸を次世代シーケンシング(NGS)によりシーケンシングすることによって得られる抗体可変ドメインコード核酸を、鋳型配列である参照抗体の配列とアラインする段階;
- 該参照抗体可変ドメイン中に存在するi)可変ドメインまたはHVR中の対になっていないCys残基、ii)グリコシル化部位、およびiii)分解ホットスポット(Asp、Asn、またはMet)のうちの1つまたは複数が除去されている、該変異抗体可変ドメインのみを含むセットを作る段階;ならびに
- 当該セットから参照配列に対して最も高い構造的または/および機能的な同一性または/および類似性を有する配列を選択する段階
を含む、前記方法。 - 該参照抗体と同じ免疫化キャンペーンに由来するB細胞が、抗原特異的抗体を発現するB細胞について富化されている、請求項1~2のいずれか一項記載の方法。
- 該参照抗体可変ドメインが、少なくとも1つの翻訳後修飾されるアミノ酸残基を有する、請求項1~3のいずれか一項記載の方法。
- 抗体を製造するための方法であって、
- 請求項1または2記載の方法を用いて得られる核酸および機能的抗体の発現に必要な他の全ての核酸を含む細胞を培養する段階、
- 該細胞または培養培地から抗体を回収する段階
を含む、前記方法。
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WO2020200944A1 (en) * | 2019-03-29 | 2020-10-08 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for generating avid-binding multispecific antibodies |
MX2021015537A (es) * | 2019-06-19 | 2022-02-10 | Hoffmann La Roche | Metodo para la generacion de una celula que expresa anticuerpo biespecifico multivalente mediante la integracion diana de casetes de expresion multiples en una organizacion definida. |
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