JP7482031B2 - 新規の抗ｐｄ－１抗体 - Google Patents

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Description

配列表
本出願は配列表を含み、その全体が参照により本明細書に援用される。
発明の分野
概して、本出願は抗体に関する。より具体的には、本出願は、ＰＤ－１に特異的に結合する単一ドメイン抗体と、当該抗体を調製するための方法と、当該抗体の使用とに関する。
前臨床及び臨床の結果からのエビデンスが増えていることにより、免疫チェックポイントの標的化は、がんを有する患者を治療するための最も有望なアプローチになりつつある。ＣＤ２８との相同性を有する免疫グロブリンスーパーファミリーの阻害性メンバーであるタンパク質プログラム死１（ＰＤ－１）はＴ細胞、活性化Ｂ細胞、及び骨髄細胞上に発現し（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ（前掲）；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９－８２；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８）、免疫系における刺激シグナル及び阻害シグナルの調節に不可欠な役割を果たしている（Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔａｋｕ ｅｔ ａｌ．２００７ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９：８１３－８２４）。ＰＤ－１はアポトーシス細胞における差次的発現のスクリーニングを通じて発見された（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ ２０ １１：３８８７－９５）。
ＰＤ－１は、Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーの一部であるＩ型膜貫通タンパク質であり（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ｂｉｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：７６５－７２）、ＰＤ－１の構造は、１つの免疫グロブリン可変様細胞外ドメインと、免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ：ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ）及び免疫受容体互換性チロシンモチーフ（ＩＴＳＭ：ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｔｉｆ）を含む細胞質ドメインとからなる。ＰＤ－１は、ＣＴＬＡ－４と構造的に類似しているが、Ｂ７－１及びＢ７－２結合に不可欠なＭＹＰＰＰＹモチーフが欠如している。ＰＤ－１は、２つの既知のリガンドであるＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１、ＣＤ２７４）及びＰＤ－Ｌ２（Ｂ７－ＤＣ、ＣＤ２７３）を有し、これはＢ７ファミリーの細胞表面発現メンバーである（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２はいずれもＢ７相同体であり、ＰＤ－１に結合するが他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しない。
免疫チェックポイントタンパク質の１つとしてのＰＤ－１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び骨髄細胞上で発現するＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーであり（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ（前掲）；Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４： ３９１７７９－８２；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７０：７１１－８）、主要な免疫耐性機構をもたらすＴ細胞の活性を制限することにおいて主要な役割を担っており、腫瘍細胞はこの機構によって免疫監視を免れている。ＰＤ－１は、Ｔ細胞のアネルギーまたは無反応状態を誘導し、その結果、細胞は最適なレベルのエフェクターサイトカインを産生できなくなる。またＰＤ－１は、生存シグナルを阻害する能力を介しＴ細胞のアポトーシスを誘導する場合もある。ＰＤ－１欠損動物は、自己免疫性心筋症や、関節炎及び腎炎を伴うループス様症候群を含めた様々な自己免疫表現型を生じる（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １１：１４１－５１；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９１：３１９－２２）。加えて、ＰＤ－１は、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病、及び関節リウマチにおいて役割を担っていることが分かった（Ｓａｌａｍａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９８：７１－７８：Ｐｒｏｋｕｎｉｎａ ａｎｄ Ａｌａｒｃｏｎ－Ｒｉｑｕｅｌｍｅ（２００４）Ｈｕｍ ＭｏＩ Ｇｅｎｅｔ １３：Ｒ１４３；Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｌｕｐｕｓ １１：５１０）。マウスＢ細胞腫瘍株において、ＰＤ－１のＩＴＳＭがＢＣＲ媒介性Ｃａ２＋流束及び下流エフェクター分子のチロシンリン酸化を遮断するのに必須であることが示された（Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＰＮＡＳ ９８：１３８６６－７１）。
活性化Ｔ細胞上で発現するＰＤ－１及び腫瘍細胞上で発現するＰＤ－Ｌ１の相互作用は、免疫応答を負に調節し、抗腫瘍免疫を弱める。ＰＤ－Ｌ１は様々なヒトのがんに豊富に存在する（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ ８：７８７－９）。腫瘍上でのＰＤ－Ｌ１発現は、食道、膵臓、及びその他のタイプのがんにおける生存率低下と相関しており、この経路を腫瘍免疫療法の有望な標的として強調するものである。いくつかのグループは、ＰＤ－１－ＰＤ－Ｌ１相互作用が疾患を増悪し、その結果腫瘍浸潤リンパ球が減少し、Ｔ細胞受容体媒介性増殖が減少し、がん性細胞が免疫回避を行うことを示している（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ．ＭｏＩ．Ｍｅｄ．８１：２８１－７；Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３０７－３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１０：５０９４－１００）。免疫抑制は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって反転させることができ、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２との相互作用も遮断されるときには効果が相加的となる。
単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体である。全抗体と同様、特異的抗原に選択的に結合することができる。単一ドメイン抗体は、２つのタンパク質重鎖と２つの軽鎖とから構成されている一般的な抗体よりもはるかに小さい。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物に見いだされた重鎖抗体から操作された（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ，Ａｔａｒｈｏｕｃｈ Ｔ，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｇ，Ｈａｍｅｒｓ Ｃ，Ｓｏｎｇａ ＥＢ，Ｂｅｎｄａｈｍａｎ Ｎ，Ｈａｍｅｒｓ Ｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｅｖｏｉｄ ｏｆ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ ３６３（６４２８）：４４６－４４８．）。これはＶＨＨフラグメントと呼ばれている。現在、単一ドメイン抗体に関するほとんどの研究は、重鎖可変ドメインに基づくものである。
単一ドメイン抗体には多くの利点がある。例えば、概して単一ドメイン抗体は、高い溶解性及び安定性を示し、また酵母、植物、及び哺乳類細胞内で容易に産生することもできる（Ｈａｒｍｓｅｎ ＭＭ，Ｄｅ Ｈａａｒｄ ＨＪ（２００７）Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７７（１）：１３－２２．）。さらに、熱安定性が良好で、組織浸透性も良好である。また、産生のコスト効率も高い。単一ドメイン抗体のこれらの利点は、様々なバイオテクノロジー及び治療の用途に適したものにしている。例えば、単一ドメイン抗体は、限定されるものではないが、がん、感染性疾患、炎症性疾患、及び神経変性疾患を含めた疾患の治療に有用である。
ＰＤ－１に対する抗体は開発されているが、ＰＤ－１に対する抗体は、まだ治療剤として改善の余地がある。さらに、現状、ＰＤ－１に対する単一ドメイン抗体がほとんど存在しないことは注目に値する。したがって、当技術分野では、新規の抗ＰＤ－１抗体、詳細にはＰＤ－１に対する単一ドメイン抗体の開発が所望されている。
Ｏｋａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９－８２
これら及びその他の目的は、広い意味において、有効性が改善された抗体を提供する新規の化合物、方法、組成物、及び製造品を対象とする本発明によって提供される。本発明によって提供される利益は、抗体治療法及び診断法の分野に幅広く適用可能であり、様々な標的に反応する抗体と共に使用することができる。本発明は、抗ＰＤ－１抗体、好ましくは単一ドメイン抗体を提供する。また、本発明は、抗体を調製する方法、抗ＰＤ－１抗体をコードする核酸分子、抗ＰＤ－１抗体の発現に使用される発現ベクター及び宿主細胞も提供される。本発明の抗体は、ＰＤ－１に関連する状態を治療または防止するための方法を提供する。
いくつかの態様において、本発明はＰＤ－１結合分子を対象とする。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合分子は、下記のうちの１つ以上の性質を有する；
（ａ）１×１０－７Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合する、
（ｂ）ＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１／２の結合を阻害する、
（ｃ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞内でのＩＦＮ－γ産生を誘導する、
（ｄ）ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、及びＢＴＬに実質的に結合しない、
（ｅ）ヒトＰＤ－１との交差反応性を有しないがマウスＰＤ－１との交差反応性を有する、及び
（ｆ）ＤＳＦアッセイによる測定において少なくとも６０℃で安定している。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合分子は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は、配列番号１に対し少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２に対し少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３に対し少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合分子は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は、２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失、または置換によって配列番号１とアミノ酸配列が相違し、ＣＤＲ２は、２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失、または置換によって配列番号２とアミノ酸配列が相違し、及び／またはＣＤＲ３は、２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失、または置換によって配列番号３とアミノ酸配列が相違する。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合分子は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、下記からなる群より選択される：
（ａ）ＤＳＩＸ１ＳＸ２ＶＮＭＧ（式中、Ｘ１＝ＤまたはＱであり、Ｘ２＝ＭまたはＬである）によって表されるＣＤＲ１、
（ｂ）ＬＩＡＸ３ＹＩＴＨＹＡＤＦＶＫＧ（式中、Ｘ３＝Ｎ、Ｔ、Ｙ、Ｒ、またはＷである）によって表されるＣＤＲ２、
（ｃ）ＲＸ４ＩＸ５Ｘ６ＤＹ（式中、Ｘ４＝ＮまたはＳであり、Ｘ５＝Ｉ、ＲまたはＹであり、Ｘ６＝ＶまたはＥである）によって表されるＣＤＲ３。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合分子は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、下記からなる群より選択される：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｅ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｆ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｇ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｈ）配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｉ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｊ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｋ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、ならびに
（ｌ）配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合分子は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ＶＨＨは、
（Ａ）配列番号３７～４９のいずれかに示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号３７～４９のいずれかに対し少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、または
（Ｃ）配列番号３７～４９のいずれかと比較して１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０）のアミノ酸の付加、欠失、及び／または置換を伴うアミノ酸配列
を含む。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書で開示されているＰＤ－１結合分子をコードする核酸配列を含む、単離核酸分子を対象とする。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書で開示されているＰＤ－１結合分子をコードする核酸分子を含む、発現ベクターを対象とする。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書で開示されている発現ベクターを含む、宿主細胞を対象とする。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書で開示されている少なくとも１つのＰＤ－１結合分子と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物を対象とする。
いくつかの態様において、本発明は、ＰＤ－１結合分子を調製するための方法であって、宿主細胞内でＰＤ－１結合分子を発現させることと、宿主細胞からＰＤ－１結合分子を単離することとを含む、方法を対象とする。
いくつかの態様において、本発明は、対象におけるＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１の結合を阻害または遮断するための方法であって、本明細書で開示されているＰＤ－１結合分子の治療有効量を対象に投与することを含む、方法を対象とする。
いくつかの態様において、本発明は、対象におけるＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ２の結合を阻害または遮断するための方法であって、本明細書で開示されているＰＤ－１結合分子の治療有効量を対象に投与することを含む、方法を対象とする。
いくつかの態様において、本発明は、対象におけるＰＤ－１に関連する状態を治療する方法であって、本明細書で開示されているＰＤ－１結合分子の治療有効量を対象に投与することを含む、方法を対象とする。
いくつかの態様において、本発明は、対象における、免疫応答の上方調節から利益を得ると考えられる状態を治療する方法であって、本明細書で開示されているＰＤ－１結合分子の治療有効量を対象に投与することを含む、方法を対象とする。
いくつかの態様において、本発明は、がんなどの増殖性障害を治療または防止するための医薬品の製造における、本明細書で開示されているＰＤ－１結合分子の使用を対象とする。
いくつかの態様において、本発明は、免疫応答の上方調節から利益を得ると考えられる状態を治療または防止するための医薬品の製造における、本明細書で開示されているＰＤ－１結合分子の使用を対象とする。
いくつかの態様において、本発明は、本明細書で開示されているＰＤ－１結合分子を用いるキットまたはデバイス及び関連する方法、ならびに本明細書で開示されている医薬組成物を対象とし、これらはがんなどの増殖性障害の治療に有用である。この目的に向けて、本発明は、好ましくは、このような障害の治療に有用な製造品であって、本明細書で開示されているＰＤ－１結合分子と、増殖性障害またはその進行もしくは再発を緩和または防止するためのＰＤ－１結合分子を使用するための説明書とを含む容器を含む、製造品を提供する。選択された実施形態において、デバイス及び関連する方法は、少なくとも１つの循環腫瘍細胞を、本明細書で開示されているＰＤ－１結合分子に接触させるステップを含む。
上記は発明の概要であるため、必然的に簡略化及び一般化され、詳細が省かれている。その結果、当業者であれば、この概要が例示的に過ぎず、いかなる形にも限定的であるようには意図されていないことを理解するであろう。本明細書で説明される方法、組成物、及び／またはデバイス、及び／または主題についてのその他の態様、特徴、及び利点は、本明細書に記載される教示で明らかとなる。発明の概要は、後述の発明を実施するための形態でさらに説明される概念のセレクションを簡略的な形で紹介するために示されるものである。この発明の概要は、特許請求される主題における主要な特徴または必須の特徴を特定することは意図されておらず、また、特許請求される主題の範囲を決定するための補助として使用されることも意図されていない。さらに、本出願全体で引用される全ての参考文献、特許、及び公開された特許出願の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１）
少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含むプログラム死１（ＰＤ－１）結合分子であって、前記ＶＨＨが、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１が、配列番号１に対し少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２が、配列番号２に対し少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３が、配列番号３に対し少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、前記プログラム死１（ＰＤ－１）結合分子。
(項目２）
ＣＤＲ１が、２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失、または置換によって配列番号１とアミノ酸配列が相違し、ＣＤＲ２が、２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失、または置換によって配列番号２とアミノ酸配列が相違し、及び／またはＣＤＲ３が、２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失、または置換によって配列番号３とアミノ酸配列が相違する、項目１に記載のＰＤ－１結合分子。
(項目３）
ＣＤＲ１が、１アミノ酸のアミノ酸付加、欠失、または置換によって配列番号１とアミノ酸配列が相違し、ＣＤＲ２が、１アミノ酸のアミノ酸付加、欠失、または置換によって配列番号２とアミノ酸配列が相違し、及び／またはＣＤＲ３が、１アミノ酸のアミノ酸付加、欠失、または置換によって配列番号３とアミノ酸配列が相違する、項目１に記載のＰＤ－１結合分子。
(項目４）
前記ＶＨＨが、下記からなる群より選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、先行項目のいずれかに記載のＰＤ－１結合分子：
（ａ）ＤＳＩＸ １ ＳＸ ２ ＶＮＭＧ（式中、Ｘ １ ＝ＤまたはＱであり、Ｘ ２ ＝ＭまたはＬである）によって表されるＣＤＲ１、
（ｂ）ＬＩＡＸ ３ ＹＩＴＨＹＡＤＦＶＫＧ（式中、Ｘ ３ ＝Ｎ、Ｔ、Ｙ、Ｒ、またはＷである）によって表されるＣＤＲ２、
（ｃ）ＲＸ ４ ＩＸ ５ Ｘ ６ ＤＹ（式中、Ｘ ４ ＝ＮまたはＳであり、Ｘ ５ ＝Ｉ、ＲまたはＹであり、Ｘ ６ ＝ＶまたはＥである）によって表されるＣＤＲ３。
(項目５）
前記ＰＤ－１結合分子がＰＤ－１アンタゴニスト、例えば抗ＰＤ－１抗体である、先行項目のいずれかに記載のＰＤ－１結合分子。
(項目６）
前記ＶＨＨが、下記からなる群より選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、先行項目のいずれかに記載のＰＤ－１結合分子：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｅ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｆ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｇ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｈ）配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｉ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｊ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｋ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、ならびに
（ｌ）配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３。
(項目７）
前記ＶＨＨが、
（Ａ）配列番号３７～４９のいずれかに示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号３７～４９のいずれかに対し少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、または
（Ｃ）配列番号３７～４９のいずれかと比較して１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０）のアミノ酸の付加、欠失、及び／または置換を伴うアミノ酸配列
を含む、項目１または２に記載のＰＤ－１結合分子。
(項目８）
前記ＰＤ－１結合分子が単一ドメイン抗体、例えば、重鎖単一ドメイン抗体、キメラ型抗体、またはヒト化抗体である、先行項目のいずれかに記載のＰＤ－１結合分子。
(項目９）
前記ＶＨＨが、ラクダ科動物、例えば、アルパカまたはリャマ由来である、先行項目のいずれかに記載のＰＤ－１結合分子。
(項目１０）
前記ＶＨＨが、別の分子と、例えば、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）のＦｃ領域、蛍光タンパク質、または異なる特異性を有するＶＨＨと融合している、先行項目のいずれかに記載のＰＤ－１結合分子。
(項目１１）
前記ＰＤ－１結合分子がキメラ型抗体である、先行項目のいずれかに記載のＰＤ－１結合分子。
(項目１２）
前記ＰＤ－１結合分子が、ラクダ科動物からのＶＨＨ及びヒトＩｇＧのＦｃドメインのキメラ型抗体である、項目１１に記載のＰＤ－１結合分子。
(項目１３）
前記ＰＤ－１結合分子が、ラクダ科動物からのＶＨＨ及びヒトＩｇＧ４のＦｃドメインのキメラ型抗体である、項目１２に記載のＰＤ－１結合分子。
(項目１４）
前記ＰＤ－１結合分子がヒト化抗体である、項目１２に記載のＰＤ－１結合分子。
(項目１５）
前記ＰＤ－１結合分子が下記のうちの１つ以上の性質を有する、先行項目のいずれかに記載のＰＤ－１結合分子：
（ａ）１×１０ －７ Ｍ以下のＫ Ｄ でヒトＰＤ－１に結合する、
（ｂ）ＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の結合を阻害する、
（ｃ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞内でのＩＦＮ－γ産生を誘導する、
（ｄ）ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、及びＢＴＬに実質的に結合しない、
（ｅ）ヒトＰＤ－１との交差反応性を有しないがマウスＰＤ－１との交差反応性を有する、及び
（ｆ）少なくとも６０℃で安定している。
(項目１６）
先行項目のいずれかに記載のＰＤ－１結合分子と同じエピトープに対し競合する、ＰＤ－１結合分子。
(項目１７）
先行項目のいずれかで定義されたＶＨＨをコードする核酸配列を含む、単離核酸分子。
(項目１８）
配列番号５０～６２のいずれかに示される核酸配列を含むまたはそれからなる、項目１７に記載の単離核酸分子。
(項目１９）
項目１７または１８に記載の単離核酸分子を含む、発現ベクター。
(項目２０）
項目１９に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
(項目２１）
前記宿主細胞が、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、真菌細胞（例えば、酵母）、または哺乳類細胞である、項目２０に記載の宿主細胞。
(項目２２）
項目１～１６のいずれかで定義された少なくとも１つのＰＤ－１結合分子と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
(項目２３）
項目１～１６のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子を調製するための方法であって、以下ステップ：
項目２０または２１に記載の宿主細胞内で、項目１～１６のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子を発現させることと、
前記宿主細胞から前記ＰＤ－１結合分子を単離することと
を含む、前記方法。
(項目２４）
対象におけるＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の結合を阻害または遮断するための方法であって、項目１～１６のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目２５）
対象におけるＰＤ－１に関連する状態を治療する方法であって、項目１～１６のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目２６）
前記対象が、ＰＤ－１アンタゴニストに応答する可能性がある障害または状態を有すると同定されている、項目２５に記載の方法。
(項目２７）
前記対象が、前記対象からの試験生体試料中の前記ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の存在またはレベルの上方調節に対し陽性であると同定されている、項目２６に記載の方法。
(項目２８）
対象における、免疫応答の上方調節から利益を得ると考えられる状態を治療または防止する方法であって、項目１～１６のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子の治療有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
(項目２９）
前記対象がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の発現を上方調節した、項目２８に記載の方法。
(項目３０）
免疫応答の上方調節から利益を得ると考えられる状態を治療または防止するための医薬品の製造における、項目１～１６のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子の使用。
(項目３１）
前記状態が増殖性障害、例えば、がんまたは慢性ウイルス感染症である、項目３０に記載の使用。
(項目３２）
ＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１の結合の阻害または遮断で使用するための、項目１～１６のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子。
(項目３３）
ＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ２の結合の阻害または遮断で使用するための、項目１～１６のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子。
(項目３４）
対象におけるＰＤ－１に関連する状態（例えば、前記対象がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の発現を上方調節した）の治療または防止で使用するための、項目１～１６のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子。
(項目３５）
がんなどの増殖性障害を治療または診断するためのキットであって、項目１～１６のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子を含む容器を含む、前記キット。
細胞表面のヒトＰＤ－１に対する抗ＰＤ－１抗体の結合を示しており、ＭＦＩ（蛍光強度中央値）で表され、ＦＡＣＳにより測定されたものである。 細胞表面のマウスＰＤ－１に対する抗ＰＤ－１抗体の結合を示しており、ＭＦＩで表され、ＦＡＣＳにより測定されたものである。 細胞表面のカニクイザルＰＤ－１に対する抗ＰＤ－１抗体の結合を示しており、ＭＦＩで表され、ＦＡＣＳにより測定されたものである。 ＦＡＣＳによる測定におけるヒトＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１遮断を示している。 ＦＡＣＳによる測定におけるマウスＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１遮断を示している。 ＥＬＩＳＡによる測定におけるヒトＰＤ１／ＰＤ－Ｌ２遮断を示している。 ＥＬＩＳＡによる測定におけるカニクイザルＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１遮断を示している。 ＥＬＩＳＡによる測定におけるヒトＰＤ－１、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、及びＢＴＬＡとの交差反応性を示している。 抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２（Ａ及びＢ）ならびに抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）（Ｃ及びＤ）のベンチマーク抗体ＢＭＫ１及びＢＭＫ３それぞれに対するエピトープビニングを示している。 抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２（Ａ及びＢ）ならびに抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）（Ｃ及びＤ）のベンチマーク抗体ＢＭＫ１及びＢＭＫ３それぞれに対するエピトープビニングを示している。 抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２（Ａ及びＢ）ならびに抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）（Ｃ及びＤ）のベンチマーク抗体ＢＭＫ１及びＢＭＫ３それぞれに対するエピトープビニングを示している。 抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２（Ａ及びＢ）ならびに抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）（Ｃ及びＤ）のベンチマーク抗体ＢＭＫ１及びＢＭＫ３それぞれに対するエピトープビニングを示している。 ヒト同種混合リンパ球反応（同種ＭＬＲ）に及ぼす抗ＰＤ－１抗体の効果を示しており、ＥＬＩＳＡにより測定され、ＩＬ－２レベル（Ａ）及びＩＦＮ－γレベル（Ｂ）により反映されている。 ヒト自家ＭＬＲ（自家ＭＬＲ）に及ぼす抗ＰＤ－１抗体の効果を示しており、ＩＦＮ－γ産生レベル（Ａ）及びＴ細胞増殖レベル（Ｂ）により反映されている。 ヒトＴｒｅｇ ＭＬＲに及ぼす抗ＰＤ－１抗体の効果を示しており、ＩＦＮ－γ産生レベル（Ａ）及びＴ細胞増殖レベル（Ｂ）により反映されている。 抗ＰＤ－１抗体のＡＤＣＣアッセイを示している。 ＤＳＦ（示差走査型蛍光定量法）アッセイによる熱安定性試験の結果を示している。 ＦＡＣＳによる血清処置試料の標的結合によって測定された、３７℃のヒト血清中におけるＷ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）の安定性を示している。
本発明は多くの異なる形態で具現することができるが、本明細書で開示されるのは、本発明の原理の例となる、本発明の特定の例示的な実施形態である。本発明が例示されている特定の実施形態に限定されないことは強調されるべきである。さらに、本明細書で使用されるいずれの節の見出しも、編成上の目的にとどまるものであり、記載されている主題を限定するものと解釈すべきではない。
別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈による別段の要求がない限り、単数形の用語は複数形も含むものとし、複数形の用語は単数形も含むものとする。より具体的には、本明細書及び付属の請求項で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明確な定めがない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「（１つの）タンパク質」と言及された場合は複数のタンパク質が含まれ、「（１つの）細胞」には細胞の混合物が含まれる、などとなる。本出願において、「または」が使用された場合、別段の記載がない限り「及び／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」や他の形式、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は限定的なものではない。加えて、本明細書及び添付の請求項に示される範囲は、両端及び両端の間の全ての点を含む。
概して、本明細書で説明されている細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される名称及びこれらの技法は、当技術分野で周知され一般的に使用されている。本発明の方法及び技法は、概して、当技術分野で周知されている従来的な方法に従って、また本明細書全体で引用され論じられている様々な全般的及びより具体的な参考文献で説明されているように実施される。例えば、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏｍｐａｎｙ（２０１０）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０００）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００２）；Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９８）；及びＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（２００３）を参照。本明細書で説明されている分析化学、合成有機化学、ならびに医療化学及び製薬化学に関連して使用されている命名法、ならびにこれらの実験室手順及び技法は、当技術分野で周知され一般的に使用されている。さらに、本明細書で使用されるいずれの節の見出しも、編成上の目的にとどまるものであり、記載されている主題を限定するものと解釈すべきではない。
定義
本発明をより十分に理解するため、関連する用語の定義及び説明を以下に示す。
本明細書で使用する場合、「抗体」または「Ａｂ」という用語は、所望の生物学的または結合活性を示す任意の形態の抗体を意味する。当該用語は、限定されるものではないが、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、キメラ型抗体、及び単一ドメイン抗体を網羅する。抗体は、重鎖（複数可）及び軽鎖（複数可）を含むことができる。重鎖は、μ、δ、γ、α、及びεに分類することができ、これらはそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとしての抗体のアイソタイプを定義する。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）からなる。重鎖定常領域は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなる。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）に分類することができ、ＣＤＲ間の空間は比較的保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）が占有する。各々のＶＨ及びＶＬは、以下の順序の３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなる：Ｎ末端からＣ末端方向へＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。様々な領域またはドメインにおけるアミノ酸の分布は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９８７ ａｎｄ １９９１））、またはＣｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３の定義に従う。抗体は、異なる抗体アイソタイプ、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体であり得る。
本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を意味する。ヒトフレームワーク配列内でさらなるフレームワーク領域の修飾を行ってもよい。
本明細書で使用する場合、「キメラ型抗体」という用語は、可変領域配列がある種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体（例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体）を意味する。
本明細書で使用する場合、「ＰＤ－１」という用語はプログラム細胞死タンパク質を意味し、これは免疫グロブリンのスーパーファミリーに属し、免疫系を負に調節する共阻害受容体として機能する。ＰＤ－１は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーのメンバーであり、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２を含めた２つの既知のリガンドを有する。ＰＤ－１の代替的名称及び同義語としては、ＰＤＣＤ１、ＰＤ１、ＣＤ２７９、及びＳＬＥＢ２などが挙げられる。ヒトＰＤ－１の代表的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００５００９．２の下で開示されており、ヒトＰＤ－１をコードする代表的な核酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿００５０１８．２の下で示されている。
本明細書で使用する場合、「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、プログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１、例えば、Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９２：１０２７を参照）を意味する。ＰＤ－Ｌ１の代替的名称または同義語としては、ＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤＬ１、Ｂ７Ｈ１、ＣＤ２７４、及びＢ７－Ｈなどが挙げられる。ヒトＰＤ－Ｌ１の代表的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０５４８６２．１の下で開示されており、ヒトＰＤ－Ｌ１をコードする代表的な核酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＭ＿０１４１４３．３の下で示されている。ＰＤ－Ｌ１は、胎盤、脾臓、リンパ節、胸腺、心臓、胎児肝臓で発現し、また多くの腫瘍またはがん細胞でも見られる。ＰＤ－Ｌ１は、活性化したＴ細胞、Ｂ細胞、及び骨髄細胞で発現するその受容体ＰＤ－１またはＢ７－１に結合する。ＰＤ－Ｌ１及びその受容体が結合することにより、サイトカイン産生及びＴ細胞増殖のＴＣＲ媒介性活性化を抑制するようにシグナル伝達が誘導される。したがって、ＰＤ－Ｌ１は、特定の事象（例えば、妊娠、自己免疫疾患、組織同種移植）の間の免疫系抑制において大きな役割を担っており、また、腫瘍またはがん細胞が免疫学的チェックポイントを回避し免疫応答を免れるのを許容すると考えられている。
本明細書で使用する場合、「ＰＤ－Ｌ２」という用語は、プログラム細胞死リガンド２を意味する。ＰＤ－Ｌ２の代替的名称または同義語としては、ＰＤＣＤ１Ｌ２、ＰＤＬ２、Ｂ７－ＤＣ、Ｂｔｄｃ、及びＣＤ２７３などが挙げられる。ヒトＰＤ－Ｌ２の代表的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿０７９５１５．２の下で開示されている。
本明細書で使用する場合、「抗ＰＤ－１抗体」という用語は、ＰＤ－１（例えば、ヒト、サル、またはサルＰＤ－１）に対する特異的結合が可能な抗体を意味する。抗ＰＤ－１抗体が、診断及び／または治療使用をもたらすのに十分な親和性でＰＤ－１に特異的に結合することは、有利である。
本明細書で使用する場合、「Ｋａ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の会合速度を意味するように意図されており、一方、本明細書で使用する場合、「Ｋｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を意味するように意図されている。抗体のＫｄ値は、当技術分野で十分確立した方法を用いて定量することができる。本明細書で使用する場合、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体－抗原反応の解離定数を意味するように意図されており、解離定数はＫｄのＫａに対する比率（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。抗体のＫｄを定量する好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによる方法であり、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いる。
本明細書で使用する場合、「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、２つの分子間（例えば、抗体と抗原との間）の非ランダム結合反応を意味する。
本明細書で使用する場合、「結合を阻害する」、「結合を遮断する」、または「同じエピトープに対し競合する」能力とは、２つの分子間（例えば、ヒトＰＤ－１及び抗ＰＤ－１抗体）の結合相互作用を任意の検出可能な程度に阻害する抗体の能力を意味する。いくつかの実施形態において、２つの分子間の結合を遮断する抗体は、２つの分子間の結合相互作用を少なくとも５０％阻害する。いくつかの実施形態において、この阻害は、６０％超、７０％超、８０％超、または９０％超であり得る。
本明細書で使用する場合、ＩｇＧ抗体に対する「高親和性」という用語は、標的抗原に対するＫＤが１×１０－７Ｍ以下、より好ましくは５×１０－８Ｍ以下、さらにより好ましくは１×１０－８Ｍ以下、さらにより好ましくは５×１０－９Ｍ以下、さらにより好ましくは１×１０－９Ｍ以下である抗体を意味する。
本明細書で使用する場合、「ＥＣ５０」（「半数効果濃度」とも称される）という用語は、ベースラインと指定曝露時間後の最大値との中間の応答を誘導する薬物、抗体、または毒物の濃度を意味する。本発明の文脈では、ＥＣ５０は「ｎＭ」単位で表現される。
本明細書で使用する場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原の部分を意味する。「エピトープ」は、「抗原決定基」の別名でも知られている。概してエピトープまたは抗原決定基は、アミノ酸、炭水化物、または糖側鎖などの分子の化学的活性の表面群からなり、概して、特異的な３次元構造及び特異的な電荷特性を有する。例えば、概してエピトープは、固有の立体構造内に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続したまたは連続していないアミノ酸を含み、これらは「線状」の場合もあれば「立体構造」の場合もある。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照。線状エピトープの場合、タンパク質と相互作用分子（例えば、抗体）との間の全ての相互作用部位が、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に存在する。立体構造エピトープの場合、相互作用部位が、タンパク質内の互いに離れたアミノ酸残基にまたがって広がる。抗体は、同じエピトープに対する結合の競合性に応じ、当業者に知られている従来的技法によってスクリーニングすることができる。例えば、抗原（例えば、ＲＳＶ融合タンパク質）に対する結合において互いに競合または交差競合する抗体を得るために、競合または交差競合に関する試験を行うことができる。同じエピトープに結合する抗体を得るための、交差競合に基づく高スループット法は国際特許出願第ＷＯ０３／４８７３１号で説明されている。
本明細書で使用する場合、「単離された」という用語は、人工的手段によって天然状態から得られる状態を意味する。ある「単離された」物質または構成要素が天然に存在する場合、それが可能なのは、自然環境が変化したためか、またはその物質が自然環境から単離されたためか、またはこの両方によるものである。例えば、ある単離されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、生きているある動物の体内に存在するとき、このような天然状態から単離された高純度の同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドと呼ばれる。「単離された」という用語は、単離された物質の活性に影響を及ぼさない混在する人工または合成物質もその他の純粋でない物質も除外しない。
本明細書で使用する場合、「単離抗体」という用語は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味するように意図されている（例えば、ＰＤ－１タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、ＰＤ－１タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。ただし、ヒトＰＤ－１タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、他の抗原（例えば、他の種由来のＰＤ－１タンパク質）に対する交差反応性を有する場合がある。さらに、単離抗体は、他の細胞材料及び／または化学物質を実質的に含まない可能性がある。
本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入させることができる核酸ビヒクルを意味する。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドがコードするタンパク質の発現を許容する場合、このベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞内への形質転換、形質導入、または形質移入によって、運搬された遺伝子材料を宿主細胞内で発現させることができる。ベクターは当業者に周知されており、限定されるものではないが、プラスミド、ファージ、コスミド、人工染色体、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）；ファージ、例えば、λファージまたはＭ１３ファージ、及び動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして使用することができる動物ウイルスとしては、限定されるものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。ベクターは、発現を制御するための複数のエレメントを含むことができ、このようなエレメントとしては、限定されるものではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、及びレポーター遺伝子が挙げられる。加えて、ベクターは複製起点を含むことができる。
本明細書で使用する場合、「宿主細胞」という用語は、ベクターを導入することができる細胞を意味し、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓなどの原核細胞、酵母細胞またはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの真菌細胞、Ｓ２ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞またはＳｆ９などの昆虫細胞、及び線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、またはヒト細胞などの動物細胞が挙げられる。
本明細書で使用する場合、「Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞、Ｔヘルパー２型Ｔ細胞、Ｔヘルパー１７型Ｔ細胞、及び阻害性Ｔ細胞を含む。
本明細書で使用する場合、「同一性」という用語は、配列のアラインメント及び比較によって定量される２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の間の関係を意味する。「同一性パーセント」とは、比較する分子内のアミノ酸間またはヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較している分子の最も小さいサイズに基づいて計算される。このような計算については、アラインメントにおけるギャップ（存在する場合）は、好ましくは特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）で対処する。アラインメントした核酸またはポリペプチドの同一性を計算するのに使用され得る方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ；及びＣａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ，１９８８，ＳＩＡＭＪ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．４８：１０７３で説明されているものが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「免疫原性」という用語は、生物内の特異的抗体または感作リンパ球の形成を刺激する能力を意味する。免疫原性は、最終的に抗体及び感作リンパ球などの免疫学的エフェクター物質を生成するように特異的な免疫細胞を活性化、増殖、及び分化を刺激する抗原の性質を意味するだけではなく、抗原で生物を刺激した後に生物の免疫系で抗体または感作リンパ球が形成され得る特異的な免疫応答も意味する。免疫原性は、抗原における最も重要な性質である。抗原が宿主内の免疫応答生成を首尾よく誘導することができるかどうかは、３つの因子、抗原の性質と、宿主の反応性と、免疫化手段とに依存する。
本明細書で使用する場合、「形質移入」または「形質移入する」という用語は、核酸が真核細胞、特に哺乳類細胞内に導入されるプロセスを意味する。形質移入のためのプロトコル及び技法としては、限定されるものではないが、脂質形質移入ならびにエレクトロポレーションなどの化学的及び物理的な方法が挙げられる。複数の形質移入技法が当技術分野で周知されており、本明細書で開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｕｐｒａ；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ，１９８１，Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照。
本明細書で使用する場合、「ＳＰＲ」または「表面プラズモン共鳴」という用語は、例えば、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度変化を、例えばＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ ａｎｄ Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）を用いて検出することにより、リアルタイムの生体特異的な相互作用の解析を可能にする光学的現象を意味し、これを含む。さらなる説明については、実施例５ならびにＪｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９－２６；Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：６２０－６２７；Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．８：１２５－１３１；及びＪｏｈｎｎｓｏｎ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８：２６８－２７７を参照。
本明細書で使用する場合、「蛍光活性化セルソーティング」または「ＦＡＣＳ」という用語は、フローサイトメトリーの特殊なタイプを意味する。蛍光活性化セルソーティングは、生体細胞の不均一な混合物を、各細胞の特定の光散乱及び蛍光特性に基づいて、一度に１つの細胞ずつ、２つ以上の容器に選別するための方法を提供する（ＦｌｏｗＭｅｔｒｉｃ．“Ｓｏｒｔｉｎｇ Ｏｕｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ”．Ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ ２０１７－１１－０９．）。ＦＡＣＳを行うための装置は当業者に知られており、一般に市販されている。このような装置の例としては、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）製のＦＡＣＳ Ｓｔａｒ Ｐｌｕｓ、ＦＡＣＳｃａｎ、及びＦＡＣＳｏｒｔ装置、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｈｉａｌｅａｈ，Ｆｌａ．）製のＥｐｉｃｓ Ｃ、ならびにＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ Ｓｐｒｉｎｇｓ，Ｃｏｌｏ．）製のＭｏＦｌｏが挙げられる。
「対象」という用語は、任意のヒトまたは非ヒト動物、好ましくはヒトを含む。
本明細書で使用する場合、「ＰＤ－１に関連する状態」または「ＰＤ－１に関する状態」という用語は、ＰＤ－１（例えば、ヒトＰＤ－１）の発現または活性の増加または減少によって引き起こされるか、それによって悪化するか、またはそれと別の形で結びついた任意の状態を意味する。
本明細書で使用する場合、「がん」という用語は、任意のものまたは腫瘍もしくは悪性細胞の成長、増殖、または転移媒介性の固形腫瘍及び非固形腫瘍（例えば、白血病）を指し、医学的状態を開始する。
状態を治療する文脈において本明細書で使用する場合、「治療」、「治療する」、または「治療される」という用語は、いくらかの所望される治療効果（例えば、状態の進行の阻害）が達成されるヒトまたは動物のいずれかの治療及び療法に広く関係し、進行速度の低減、進行速度の停止、状態の軽減、状態の寛解、及び状態の治癒を含む。予防的措置（例えば、予防、防止）としての治療も含まれる。がんに関しての「治療する」とは、腫瘍または悪性細胞の成長、増殖、もしくは転移、またはこれらの何らかの組合せを弱めるまたは遅らせることを意味し得る。腫瘍に関しての「治療」とは、腫瘍の全部もしくは一部を除去すること、腫瘍の成長及び転移を阻害するもしくは遅らせること、腫瘍の発達を防止もしくは遅延すること、またはこれらの何らかの組合せを含む。
本明細書で使用する場合、「治療有効量」という用語は、所望される治療レジメンに従って投与したときに、妥当なベネフィット／リスク比に見合ったいくらかの所望される治療効果をもたらすのに有効な活性化合物、または活性化合物を含む材料、組成物、もしくは剤形の量に関係する。具体的には、「治療有効量」とは、ヒトＰＤ－１関連の疾患または状態を治療するのに有効な量または濃度における抗体またはその抗原結合部分を意味する。
本発明は、「宿主細胞」において、本明細書で使用する場合、外来のポリヌクレオチドの導入を伴う細胞を意味する。
本明細書で使用する場合、「治療有効量」または「有効量」という用語は、ヒトＰＤ－１関連の疾患または状態を治療するのに有効な量または濃度における薬物を意味する。
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される」という用語は、ビヒクル、希釈剤、賦形剤、及び／またはこれらの塩が、製剤中の他の成分と化学的及び／または物理的に適合性であり、かつレシピエントと生理的に適合性であることを意味する。
本明細書で使用する場合、「医薬的に許容される担体及び／または賦形剤」という用語は、対象及び活性薬剤と薬理学的及び／または生理的に適合性の担体及び／または賦形剤を意味し、これは当技術分野で周知されており（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ． Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ，１９ｔｈ ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照）、限定されるものではないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、及びイオン強度増強剤が挙げられる。例えば、ｐＨ調整剤としては、限定されるものではないが、リン酸バッファーが挙げられ、界面活性剤としては、限定されるものではないが、カチオン性、アニオン性、または非イオン性の界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ－８０が挙げられ、イオン強度増強剤としては、限定されるものではないが、塩化ナトリウムが挙げられる。
本明細書で使用する場合、「アジュバント」という用語は、抗原と共に生物に送達されたときまたは予め生物に送達されたときに、抗原に対する免疫応答を強化できるまたは生物内の免疫応答のタイプを変更できる、非特異的な免疫賦活剤を意味する。様々なアジュバントが存在し、限定されるものではないが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）、ｃｏｒｙｎｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、リポ多糖、サイトカインなどが挙げられる。フロイントアジュバントは、現在動物実験で最も一般的に使用されているアジュバントである。水酸化アルミニウムアジュバントは、臨床試験ではより一般的に使用されている。
ＰＤ－１結合分子
いくつかの態様において、本発明はＰＤ－１結合分子を含む。
ＰＤ－１結合分子には、一般的な意味では、ＰＤ－１に特異的に結合する任意の分子が含まれ得る。いくつかの状況において、「ＰＤ－１結合分子」には「ＰＤ－１アンタゴニスト」が含まれ得る。「ＰＤ－１アンタゴニスト」とは、ＰＤ－Ｌ１が免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＮＫＴ細胞）上に発現したＰＤ－１に結合するのを遮断し、好ましくはＰＤ－Ｌ２が免疫細胞発現ＰＤ－１に結合するのも遮断する、任意の化学的化合物または生体分子を意味する。ＰＤ－１結合分子またはＰＤ－１アンタゴニストはポリペプチドまたはタンパク質とすることができ、例えば、抗体、より詳細には抗ＰＤ－１抗体とすることができる。
抗体としては、限定されるものではないが、キメラ型抗体、ヒト化抗体、または単一ドメイン抗体が挙げられる。特定の実施形態において、ＰＤ－１結合分子は単一ドメイン抗体であり、単一ドメイン抗体とは、概して、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体を意味する。全抗体と同様に、単一ドメイン抗体は特定の抗原に選択的に結合することができる。
より具体的には、ＰＤ－１結合分子は単一ドメイン重鎖抗体であり、これは「ＶＨＨ」、「ＶＨＨ抗体」、「ＶＨＨドメイン」、「ＶＨＨ抗体フラグメント」、「ＶＨＨ」、または「ナノボディ」などという用語と互換的に使用される。ラクダ科動物抗体に由来するＶＨＨ分子は、既知の最も小さなインタクト抗原結合ドメイン（およそ１５ｋＤａ、すなわち従来的ＩｇＧより１０倍小さい）に含まれ、そのため高密度組織への送達や巨大分子間の限られた空間へのアクセスに十分適合している。
本明細書で開示されている本発明の単一ドメイン抗体は、当業者が当技術分野で知られている方法または任意の将来的な方法に従って作製することができる。例えば、ＶＨＨは、当技術分野で知られている方法を用いて入手することができ、例えば、ラクダを免疫化しそこからハイブリドーマを得ることにより、または当技術分野で知られている分子生物学技法を用いて本発明のＶＨＨのライブラリーをクローニングし、次にファージディスプレイを使用して選択することにより入手することができる。
例えば、単一ドメイン抗体は、所望の抗原でリャマまたはアルパカを免疫化し、次に重鎖抗体をコードするｍＲＮＡを単離することにより、入手することができる。逆転写及びポリメラーゼ鎖反応により、数百万個のクローンを含む単一ドメイン抗体の遺伝子ライブラリーが産生される。ファージディスプレイ及びリボソームディスプレイのようなスクリーニング技法は、抗原に結合するクローンの同定に役立つ。１つの技法はファージディスプレイであり、（例えば、ヒト）抗体のライブラリーをファージ上で合成し、ライブラリーを目的抗原またはその抗体結合部分でスクリーニングし、抗原に結合するファージを単離し、そこから免疫反応性フラグメントを入手することができる。このようなライブラリーを調製及びスクリーニングするための方法は当技術分野で周知されており、ファージディスプレイライブラリーを生成するためのキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ組換え型ファージ抗体系、カタログ番号２７－９４００－０１；及びＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）。抗体ディスプレイライブラリーの生成及びスクリーニングで使用することができる方法及び試薬は、他にも存在する（例えば、Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７９７８－７９８２（１９９１）を参照）。
最も強力なクローンが同定されたら、例えば親和性成熟またはヒト化によって、そのＤＮＡ配列を最適化する。ヒト化することにより、ヒト生体の抗体に対する免疫学的反応を防止することができる。
したがって、単一ドメイン抗体は、（１）天然の重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離する、（２）天然のＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列を発現させる、（３）天然のＶＨＨドメインを（後述のように）「ヒト化」するか、もしくはこのようなヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸を発現させる、（４）任意の動物種（詳細には哺乳類種、例えば、ヒト）からの天然のＶＨドメインを「ラクダ化」するか、もしくはこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸を発現させる、（５）Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ（前掲）で説明されている「ドメイン抗体」すなわちＤａｂを「ラクダ化」するか、もしくはこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸を発現させる、（６）タンパク質、ポリペプチド、もしくはその他のアミノ酸配列を調製するための合成もしくは半合成の技法を使用する、（７）核酸合成の技法を用いてＶＨＨをコードする核酸を調製し、このようにして得られた核酸を発現させる、及び／または（８）上記の任意の組合せ、によって入手することができる。上記を実施するための好適な方法及び技法は、本明細書の開示内容に基づけば当業者には明らかであり、例えば、本明細書で以下により詳細に説明される方法及び技法が挙げられる。
単一ドメイン抗体は、通常、免疫化動物から得られる血液、リンパ節、または脾臓ｃＤＮＡからの可変ドメインレパートリーをファージディスプレイベクター内でＰＣＲクローニングすることによって生成される。抗原特異的単一ドメイン抗体は、一般的に、固定化した抗原、例えば、試験管のプラスチック表面にコーティングされた抗原、ストレプトアビジンビーズ上に固定化したビオチン化抗原、または細胞の表面上に発現した膜タンパク質上で、ファージ（ｐｈａｓｅ）ライブラリーをパニングすることにより選択される。ａｄＡｂの親和性は、この戦略をｉｎ ｖｉｔｒｏで模倣することにより、例えば、ＣＤＲ領域の部位特異的変異誘発を行い、ストリンジェンシーを高めた条件下でさらなるラウンドで固定化抗原をパニングすることにより、改善できることが多い（Ｗｅｓｏｌｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００９）１９８：１５７－１７４）。
抗原またはエピトープに特異的に結合するＶＨＨを調製するための方法は、参考文献で説明されており、例えば、Ｒ．ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４０（２０００）１８５－１９５；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．，２８７（２０１２）１３７１３－１３７２１；Ｄｅｆｆａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｆｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．８（１２），ｐｐ．２６４５，１７ Ｊｕｎｅ，２００９、及びＷＯ９４／０４６７８で説明されている。
いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合分子内のＶＨＨは、抗体のＦｃドメインと、例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１）のＦｃドメインと融合している。特定の実施形態において、ＦｃドメインはＩｇＧ４のＦｃドメインである。ＶＨＨをＦｃドメインと融合させることにより、ＡＤＣＣ及びＣＤＣなどのエフェクター機能の動員がより効率的になり得る。また、ＶＨＨをＦｃドメインと融合させることは、ＰＤ－１結合分子が二量体を形成する一助となり得、さらに、ｉｎ ｖｉｖｏのＰＤ－１結合分子の半減期を長くする一助にもなり得る。
本明細書で使用する場合、「抗体依存性細胞媒介性障害」または「ＡＤＣＣ」という用語は、ある特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌Ｉｇによって、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合し、次に標的細胞を細胞毒素で殺滅することが可能になる、細胞傷害の一形態を意味する。抗体は細胞傷害性細胞を「武装」させ、またこのような殺滅に必ず必要とされる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介するための初代細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現し、一方単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現については、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７－９２（１９９１）の４６４ページの表３にまとめられている。目的分子のＡＤＣＣアッセイを評価するには、米国特許第５，５００，３６２号及び第５，８２１，３３７号で説明されているようなｉｎ ｖｉｔｒｏのＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイ向けに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的または追加的に、目的分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２－６５６（１９９８）で開示されているような動物モデルで、ｉｎ ｖｉｖｏで評価することができる。
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」という用語は、補体の存在下での標的細胞の溶解を意味する。古典的補体経路の活性化は、補体系の第１の構成要素（Ｃ１ｑ）が、同族抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体に結合することによって開始される。補体活性化を評価するには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）で説明されているＣＤＣアッセイを実施することができる。
説明の便宜のため、以下のセクションではＰＤ－１結合分子を抗ＰＤ－１抗体として説明する。
ある特定の性質を有する抗ＰＤ－１抗体
本発明の抗体は、抗体の特定の機能的特徴または性質によって特徴づけられる。いくつかの実施形態において、抗体は、下記のうちの１つ以上の性質を有する：
（ａ）１×１０－７Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ－１に結合する、
（ｂ）ＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の結合を阻害または遮断する、
（ｃ）ＣＤ４＋ Ｔ細胞内でのＩＦＮ－γ産生を誘導する、
（ｄ）ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、及び／またはＢＴＬに実質的に結合しない、
（ｅ）ヒトＰＤ－１との交差反応性を有しないがマウスＰＤ－１との交差反応性を有する、及び
（ｆ）少なくとも６０℃で安定している。
本発明の抗体は、細胞表面のＰＤ－１に高い親和性で結合する。ＰＤ－１に対する本発明の抗体の結合は、当技術分野で十分に確立している１つ以上の技法（例えば、ＥＬＩＳＡ）を用いて評価することができる。また、本発明の抗体の結合特異性は、ＰＤ－１タンパク質を発現する細胞に対する抗体の結合を、例えばフローサイトメトリーにより、モニターすることによっても定量することができる。例えば、抗体は、フローサイトメトリーアッセイにより、抗体をヒトＰＤ－１を発現する細胞株、例えば、細胞表面上にＰＤ－１を発現するように形質移入したＣＨＯ細胞と反応させて試験することができる。追加的または代替的に、抗体の結合は、結合動態（例えば、Ｋｄ値）を含めて、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで試験することができる。さらに他の好適な結合アッセイとしては、例えば、組換え型ＰＤ－１タンパク質を用いたＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。例えば、本発明の抗体は、細胞表面タンパク質（例えば、ヒトＰＤ－１）に１×１０－７Ｍ以下、５×１０－８Ｍ以下、２×１０－８Ｍ以下、５×１０－９Ｍ以下、４×１０－９Ｍ以下、３×１０－９Ｍ以下、２×１０－９Ｍ以下、１×１０－９Ｍ以下、５×１０－１０Ｍ以下、１×１０－１０Ｍ以下のＫＤで結合する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ＦＡＣＳの測定において、カニクイザルまたはサルのＰＤ－１に約１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、または０．０１ｎＭ以下のＥＣ５０で結合する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、競合アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）での測定において、０．２ｎＭ～１００ｎＭ（例えば、０．２ｎＭ～５０ｎＭ、０．２ｎＭ～３０ｎＭ、０．２ｎＭ～２０ｎＭ、０．２ｎＭ～１０ｎＭ、または１ｎＭ～１０ｎＭ）のＩＣ５０でヒトＰＤ－１のそのリガンドに対する結合を阻害する。
本発明の抗ＰＤ－１抗体はＰＤ－１に特異的である。いくつかの実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、及び／またはＢＴＬに結合しない。例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、及び／またはＢＴＬに対する結合親和性は、ＰＤ－１に対する結合親和性の１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％未満である。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＰＤ－１のそのリガンドに対する結合を遮断することにより、例えば、活性化Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞）からのサイトカイン産生の誘導、活性化Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞）の増殖の誘導、及びＴ ｒｅｇの抑制性機能の反転を含めた生物学的活性をもたらす。例示的なサイトカインとしては、ＩＬ－２及びＩＦＮγが挙げられる。「ＩＬ－２」という用語はインターロイキン２を意味し、これは免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の一タイプであり、白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）（例えば、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ））の活性を調節する。「インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）」という用語は、ナチュラルキラー（ＮＫ）、ＮＫ Ｔ細胞、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞によって産生されるサイトカインであり、マクロファージの不可欠な活性化物質であり、かつ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子発現の誘導物質である。サイトカイン産生は、当技術分野で知られている方法を用いて（例えば、ＥＬＩＳＡにより）定量することができる。［３Ｈ］チミジン取込みアッセイを含めて、Ｔ細胞の増殖を検出するための方法も使用することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、ヒトＰＤ－１との交差反応性を有しないがマウスＰＤ－１との交差反応性を有する。現在臨床試験で試験されているＰＤ－１に対するモノクローナル抗体のほとんどは、ヒトＰＤ－１に対するものであり、それによって前臨床ｉｎ ｖｉｖｏアッセイが制限され、マウス由来タンパク質配列の免疫原性のために有効性が低下している。マウスＰＤ－１に対する交差反応性を有するヒト化抗体は、このような欠点を克服し、ｉｎ ｖｉｖｏでより高い忍容性及び効率性を示した。
特定の配列に対する配列同一性を有するＣＤＲを含む抗ＰＤ－１抗体
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は、配列番号１に対し少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ２は、配列番号２に対し少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ３は、配列番号３に対し少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む。
各ＣＤＲに対するアミノ酸の割当ては、別段の記載がない限り、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ Ｅｄ．），ＵＳ Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＰＨＳ，ＮＩＨ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，ＰＭＩＤ： ３６８１９８１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，ＰＭＩＤ：２６８７６９８；ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６，ＰＭＩＤ：８８７６６５０；またはＤｕｂｅｌ，Ｅｄ．（２００７）Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｗｉｌｙ－ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ ａｎｄ Ｃｏ．が提供するナンバリングスキームのうちの１つに従い得る。
抗体配列内の可変領域及びＣＤＲは、当技術分野で開発された（上記のような、例えば、Ｋａｂａｔナンバリングシステムのような）一般規則に従って、または既知の可変領域のデータベースに対し配列をアラインメントすることにより、同定することができる。これらの領域を同定するための方法は、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００１及びＤｉｎａｒｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２０００で説明されている。抗体配列の例示的なデータベースについては、Ｒｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３３（Ｄａｔａｂａｓｅ ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６７１－Ｄ６７４（２００５）で説明されているように、ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓの「Ａｂｙｓｉｓ」ウェブサイト（Ａ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ（ｔｈｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）による管理）及びｗｗｗ．ｖｂａｓｅ２．ｏｒｇのＶＢＡＳＥ２ウェブサイトで説明され、またアクセスすることができる。好ましくは、配列は、Ｋａｂａｔ（ＩＭＧＴ）及びＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）からの配列データをＰＤＢからの構造データと統合したＡｂｙｓｉｓデータベースを用いて解析する。Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，ＩＳＢＮ－１３：９７８－３５４０４１３５４７、ｂｉｏｉｎｆｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓウェブサイトも利用可）中のＤｒ．Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎの章、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎｓを参照。Ａｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトはさらに、ＣＤＲを同定するために開発された一般規則を含み、これを本明細書での教示に従って使用することができる。別段の指示がない限り、本明細書に記載された全てのＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従うＡｂｙｓｉｓデータベースウェブサイトに基づき導出されている。
２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ ａｎｄ Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１－１７（１９８８））を用いて定量することができ、このアルゴリズムはＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０加重残基表を使用し、ギャップ長ペナルティを１２、ギャップペナルティを４としている。加えて、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３（１９７０））によって定量することができ、このアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれており、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれかを使用し、ギャップ加重を１６、１４、１２、１０、８、６、または４、長さ加重を１、２、３、４、５、または６としている。
追加的または代替的に、本発明のタンパク質配列はさらに、公開データベースに対し検索を行って例えば関連配列を同定するための、「クエリー配列」として使用することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム（ｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３）で実施して、本発明の抗体分子に相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップありアラインメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２で説明されているようなギャップありＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びギャップありＢＬＡＳＴを利用する際は、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照。
他の実施形態において、ＣＤＲアミノ酸配列は、上記に記載されたそれぞれの配列に対し少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。
アミノ酸の付加、欠失、または置換を有するＣＤＲを含む抗ＰＤ－１抗体
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＰＤ－１抗体は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１は、２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失、または置換によって配列番号１とアミノ酸配列が相違し、ＣＤＲ２は、２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失、または置換によって配列番号２とアミノ酸配列が相違し、及び／またはＣＤＲ３は、２アミノ酸以下のアミノ酸付加、欠失、または置換によって配列番号３とアミノ酸配列が相違する。例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、１つのみのアミノ酸の付加、欠失、または置換によって、それぞれ配列番号１～３に記載されたアミノ酸配列と相違する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗ヒトＰＤ－１抗体は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、下記からなる群より選択される：
（ａ）ＤＳＩＸ１ＳＸ２ＶＮＭＧ（式中、Ｘ１＝ＤまたはＱであり、Ｘ２＝ＭまたはＬである）によって表されるＣＤＲ１、
（ｂ）ＬＩＡＸ３ＹＩＴＨＹＡＤＦＶＫＧ（式中、Ｘ３＝Ｎ、Ｔ、Ｙ、Ｒ、またはＷである）によって表されるＣＤＲ２、
（ｃ）ＲＸ４ＩＸ５Ｘ６ＤＹ（式中、Ｘ４＝ＮまたはＳであり、Ｘ５＝Ｉ、ＲまたはＹであり、Ｘ６＝ＶまたはＥである）によって表されるＣＤＲ３。
好ましくは、単離抗体のＣＤＲまたはその抗原結合部分は、２アミノ酸以下、または１アミノ酸以下の保存的置換を含む。本明細書で使用する場合、「保存的置換」という用語は、そのアミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な性質に対し不利に影響を及ぼさないまたは変更しないと考えられるアミノ酸置換を意味する。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの当技術分野で知られている標準的な技法によって導入することができる。保存的アミノ酸置換には、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換される置換、例えば、物理的または機能的に類似する（例えば、サイズ、形状、電荷、化学的性質（共有結合もしくは水素結合を形成する能力を含む）が類似する）残基で置換される置換が含まれる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。このようなファミリーとしては、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、極性無電荷側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。そのため、対応するアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換されることが好ましい。アミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当技術分野で周知されている（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９－８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４１２－４１７（１９９７）を参照（これらは参照により本明細書に援用される））。
ＣＤＲを含む抗ＰＤ－１抗体
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）において、ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、下記からなる群より選択される：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ２、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ２、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ３、
（ｅ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ３、
（ｆ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ３、
（ｇ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ２、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ３、
（ｈ）配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ２、及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ３、
（ｉ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ２、及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ３、
（ｊ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ２、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ３、
（ｋ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ２、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ３、ならびに
（ｌ）配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ１、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ２、及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなるＣＤＲ３。
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）において、ＶＨＨは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３は、下記からなる群より選択される：
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｄ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｅ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｆ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｇ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｈ）配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｉ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｊ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
（ｋ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、ならびに
（ｌ）配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３。
ＶＨＨの配列によって定義される抗ＰＤ－１抗体
いくつかの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（例えば、ＶＨＨ）を含み、ＶＨＨは、
（Ａ）配列番号３７～４９のいずれかに示されるアミノ酸配列、
（Ｂ）配列番号３７～４９のいずれかに対し少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、または
（Ｃ）配列番号３７～４９のいずれかと比較して１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０）のアミノ酸の付加、欠失、及び／または置換を伴うアミノ酸配列
を含むまたはそれからなる。
他の実施形態において、ＶＨＨのアミノ酸配列は、上記に記載されたそれぞれの配列に対し少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。例示的な例として、抗体は、配列番号３７に対する少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するＶＨＨを含むことができる。
いくつかのさらなる実施形態において、抗ＰＤ－１抗体は、重鎖及び／または軽鎖の可変領域内に保存的置換またはアミノ酸修飾を含むことができる。当技術分野では、抗原結合を除去しないある特定の保存的配列修飾がなされ得ることが理解されている。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２：１１８０－８；ｄｅ Ｗｉｌｄｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５－４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４－２６８７０；Ｈａｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５－１２；Ｋｅｌｌｅｙ ａｎｄ Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２－３５；Ａｄｉｂ－Ｃｏｎｑｕｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１－６；及びＢｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５－４３を参照。
上記で説明されているように、本明細書で使用する場合、「保存的置換」という用語は、そのアミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な性質に対し不利に影響を及ぼさないまたは変更しないと考えられるアミノ酸置換を意味する。例えば、保存的置換は、部位特異的変異誘発及びＰＣＲ媒介変異誘発などの当技術分野で知られている標準的な技法によって導入することができる。保存的アミノ酸置換には、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換される置換、例えば、物理的または機能的に類似する（例えば、サイズ、形状、電荷、化学的性質（共有結合もしくは水素結合を形成する能力を含む）が類似する）残基で置換される置換が含まれる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。このようなファミリーとしては、アルカリ性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、極性無電荷側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。そのため、対応するアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換されることが好ましい。アミノ酸保存的置換を同定するための方法は、当技術分野で周知されている（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９－８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４１２－４１７（１９９７）を参照（これらは参照により本明細書に援用される））。
ビニング及びエピトープマッピング
本開示の抗体が、選択された標的またはそのフラグメントによって提示される別々のエピトープまたは免疫原性決定基と会合または結合することは、さらに理解されよう。いくつかの実施形態において、エピトープまたは免疫原性決定基は、アミノ酸、炭水化物、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的活性の表面群を含む。いくつかの実施形態において、エピトープは、特定の３次元構造特性、及び／または特定の電荷特性を有することができる。したがって、本明細書で使用する場合、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンもしくはＴ細胞受容体への特異的結合、または分子との別の方法による相互作用が可能な任意のタンパク質決定基を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、タンパク質及び／または巨大分子の複合混合物内の標的抗原を優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合する（または免疫特異的に結合もしくは反応する）とされる。いくつかの実施形態において、抗体は、平衡解離定数（ＫＤ）が１０－６Ｍ以下または１０－７Ｍ以下である場合、より好ましくはＫＤが１０－８Ｍ以下である場合、さらにより好ましくはＫＤが１０－９Ｍ以下である場合、抗原に特異的に結合するとされる。
連続したアミノ酸から形成されたエピトープ（「線状」または「連続」エピトープと呼ばれることがある）は、典型的にはタンパク質が変性しても保持されるが、３次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的にはタンパク質が変性すると喪失する。いずれの場合も、抗体エピトープは、典型的には少なくとも３個、より通例的には少なくとも５個または８～１０個のアミノ酸を固有の空間的立体構造内に含む。
この点において、いくつかの実施形態において、エピトープが、例えば、ＰＤ－１タンパク質の１つ以上の領域、ドメイン、またはモチーフに関連し得るまたはその中に存在し得ることは理解されよう。同様に、当技術分野で認識されている「モチーフ」という用語は、その一般的な意味に従って使用され、概して、典型的には１０～２０個の連続したアミノ酸残基である、タンパク質の短い保存された領域を意味するものとする。
いずれの場合も、抗原上の所望のエピトープが決定したら、例えば、本発明で説明されている技法を用いてエピトープを含むペプチドで免疫化することにより、そのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。代替的に、発見プロセス中に、抗体の生成及びキャラクタリゼーションによって、特定のドメインまたはモチーフ内に存在する望ましいエピトープについての情報が解明され得る。次に、この情報から、同じエピトープに結合する抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するためのアプローチは、互いに競合的に結合する抗体を見いだすための競合試験を行うことであり、すなわち、これらの抗体は抗原への結合について競合する。交差競合に基づいて抗体をビニングするための高スループットプロセスがＷＯ０３／４８７３１で説明されている。酵母上での抗体競合または抗原フラグメント発現を含む、その他のビニングまたはドメインレベルまたはエピトープマッピングの方法は、当技術分野で周知されている。
本明細書で使用する場合、「ビニング」という用語は、抗体をその抗原結合特性及び競合に基づいてグループ化または分類するために使用する方法を意味する。この技法は、本発明の抗体を定義及びカテゴリー化するのに有用であるが、ビンは必ずしもエピトープを直接関連づけるものではなく、エピトープ結合についてのこのような初期の判定は、当技術分野で認識され本明細書で説明されている他の方法論によってさらに精緻化及び確証が行われ得る。しかし、経験的に抗体を個別のビンに割り当てることで、本開示の抗体の治療的潜在可能性を示し得る情報がもたらされることは理解されよう。
より具体的には、当技術分野で知られ本明細書の実施例に記載されている方法を使用することにより、選択された参照抗体（またはそのフラグメント）が同じエピトープに結合するか、または第２の試験抗体（すなわち、同じビンにある）と結合が交差競合するかを判定することができる。
その他の適合性のあるエピトープマッピング技法としては、アラニンスキャニング変異体、ペプチドブロット（Ｒｅｉｎｅｋｅ（２００４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４８：４４３－６３）（当該文献全体が参照により本明細書に具体的に援用される）、またはペプチド切断解析が挙げられる。加えて、エピトープ切除、エピトープ抽出、及び抗原の化学修飾などの方法も用いることができる（Ｔｏｍｅｒ（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：４８７－４９６）（当該文献全体が参照により本明細書に具体的に援用される）。
本発明の抗体をコードする核酸分子
いくつかの態様において、本発明は、本明細書で開示されているＶＨＨをコードする核酸配列を含む、単離核酸分子を対象とする。
本発明の核酸は、標準的な分子生物学の技法を用いて入手することができる。（例えば、ファージディスプレイ技法を用いて）免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから得られる抗体については、このような抗体をコードする核酸を遺伝子ライブラリーから回収することができる。
本発明の例示的な核酸分子は、それぞれ配列番号５０～６２に記載された分子である。いくつかの実施形態において、核酸は、それぞれ配列番号１７～２０に対する少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態において、同一性のパーセンテージは遺伝暗号の縮重から導出され、コードされるタンパク質配列は不変のまま保たれる。
抗ＰＤ－１抗体をコードする核酸分子は、当技術分野で知られている組換え技法を用いて、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現のためにベクター内に挿入することができる。別の実施形態において、抗体は、当技術分野で知られている相同組換えによって産生することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来的な手順を用いて（例えば、抗体の重鎖をコードする遺伝子への特異的な結合が可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に単離及びシークエンシングされる。多くのベクターが入手可能である。概して、ベクター構成要素には、限定されるものではないが、以下：シグナル配列、複製開始点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１α）、及び転写終結配列、のうちの１つ以上が含まれる。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、第４，６３４，６６５号、及び第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、典型的に選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に薬物（例えば、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサート）に対する耐性を付与する。選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅と共にｄｈｆｒ宿主細胞で使用）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を挙げることができる。
いくつかの実施形態において、ベクター系としては、哺乳類、細菌、酵母系などが挙げられ、例えば、限定されるものではないが、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ、ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ－Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２などのプラスミド、ならびにその他の実験用及び市販のベクターを含む。好適なベクターとしては、プラスミド、またはウイルスベクター（例えば、複製欠損性レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）を挙げることができる。本発明の１つの実施形態において、ベクターは、ｐＥＴ、例えば、ヘキサヒスチジン及びｃ－Ｍｙｃタグの遺伝子を含むｐＥＴｂａｃとすることができる。
ＰＤ－１結合分子をコードする核酸分子を含むベクターは、クローニングまたは遺伝子発現のために宿主細胞に導入することができる。本明細書におけるベクター内でＤＮＡをクローニングまたは発現させるのに好適な宿主細胞は、原核生物、酵母、またはより高等な真核細胞である。この目的において好適な原核生物としては、真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、及びＳｈｉｇｅｌｌａ、さらにＢａｃｉｌｌｉ、例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物も、抗ＰＤ－１抗体コードベクターとして好適なクローニングまたは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、すなわち一般的なパン酵母は、下等な真核宿主微生物の中でも最も一般的に使用されている。しかし、複数の他の属、種、及び株、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主、例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ １８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；ならびに糸状菌、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ， Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、ならびにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主、例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒも一般的に入手可能であり、本明細書において有用である。
本明細書で提供される抗ＰＤ－１抗体の発現に好適なその他の宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ガの幼虫）、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ（カ）、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（カ）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉなどの宿主からの多数のバキュロウイルス株及びバリアントならびに対応する許容的な昆虫宿主細胞が同定されている。形質移入用の様々なウイルス株（例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ＮＰＶのＬ－１バリアント及びＢｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ＮＰＶのＢｍ－５株）が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞の形質移入において、本発明に従って本明細書でウイルスとして使用することができる。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。
宿主細胞は、ＰＤ－１抗体を産生するために上述の発現またはクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜変更された従来的な栄養培地で培養される。
本明細書で提供される抗ＰＤ－１抗体の産生に使用される宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞の培養に好適である。加えて、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）、Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）、米国特許第４，７６７，７０４号；第４，６５７，８６６号；第４，９２７，７６２号；第４，５６０，６５５号；もしくは第５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５、または米国特許再発行第３０，９８５号で説明されているいずれの培地も、宿主細胞用の培地として使用することができる。これらの培地のいずれにも、必要に応じてホルモン及び／または他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩）、バッファー（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬）、微量元素（通常マイクロモルの範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、ならびにグルコースまたは同等のエネルギー源を追加することができる。任意の他の必要な追加物も、当業者に公知であると考えられる濃度で含めることができる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現用に選択した宿主に以前使用したものであり、このような条件は当業者には明らかであると考えられる。
組換え技法を使用する場合、抗体は、細胞内のペリプラズム間隙内で産生させても、培地中に直接分泌させてもよい。抗体を細胞内で産生させる場合、第１のステップとして、微粒子状デブリである宿主細胞または溶解断片は、例えば、遠心分離または限外濾過により除去される。Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム間隙に分泌させる抗体を単離するための手順について説明している。簡潔に説明すると、ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍する。細胞デブリは遠心分離によって除去することができる。抗体を培地中に分泌させる場合、概して、まず、このような発現系からの上清を市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して濃縮する。タンパク質分解を阻害するためにＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害物質が前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、外来性夾雑物の成長を防止するために抗生物質が含まれてもよい。
細胞から調製された抗体は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥセルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿法、塩析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技法である。
任意の予備精製ステップ（複数可）の後、目的抗体及び不純物を含む混合物は、約２．５～４．５のｐＨの溶出バッファーを用いて低ｐＨ疎水相互作用クロマトグラフィーに供することができ、好ましくは低い塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍの塩）で実施する。
医薬組成物
いくつかの態様において、本発明は、本明細書で開示されている少なくとも１つのＰＤ－１結合分子と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物を対象とする。
組成物の構成要素
医薬組成物は、任意選択で、１つ以上のさらなる医薬的に活性の成分、例えば、別の抗体または薬物を含むことができる。本発明の医薬組成物は、抗ＰＤ－１抗体がワクチンに対する免疫応答を強化するように、例えば、別の免疫刺激剤、抗がん剤、抗ウイルス剤、またはワクチンとの併用療法で投与することもできる。医薬的に許容される担体としては、例えば、医薬的に許容される液体、ゲル、もしくは固体担体、水性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、等張剤、バッファー、抗酸化剤、麻酔薬、懸濁／分散剤、キレート剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または無毒性の補助物質、その他の当技術分野で知られている構成成分の様々な組合せなどを挙げることができる。
好適な構成要素としては、例えば、抗酸化剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、バッファー、保存剤、滑沢剤、香味料、増粘剤、着色剤、乳化剤、または安定剤、例えば、糖及びシクロデキストリンを挙げることができる。好適な抗酸化剤としては、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、メルカプトグリセロール、チオグリコール酸、メルカプトソルビトール、ブチルメチルアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、及び／または没食子酸プロピルを挙げることができる。本発明で開示されているように、本発明の抗体または抗原結合フラグメントを含む溶媒において、開示組成物はメチオニンなどの１つ以上の抗酸化剤を含み、還元抗体またはその抗原結合フラグメントは酸化され得る。酸化還元は、結合親和性の減少を防止または低減して、抗体の安定性を強化し貯蔵寿命を長くする。したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、１つ以上の抗体またはその抗原結合フラグメントと、メチオニンなどの１つ以上の抗酸化剤とを含む組成物を提供する。本発明はさらに、貯蔵寿命を長くする及び／または活性を増加させるために、抗体またはその抗原結合フラグメントをメチオニンなどの１つ以上の抗酸化剤と混合し、抗体またはその抗原結合フラグメントの酸化を防止することができる様々な方法を提供する。
さらに例示すると、医薬的に許容される担体としては、例えば、水性ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張ブドウ糖注射液、滅菌注射用水、またはブドウ糖及び乳酸リンゲル注射液、非水性ビヒクル、例えば、植物由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、またはピーナツ油、静菌または静真菌濃度の抗微生物剤、等張剤、例えば、塩化ナトリウムまたはブドウ糖、バッファー、例えば、リン酸またはクエン酸バッファー、抗酸化剤、例えば、重硫酸ナトリウム、局所麻酔薬、例えば、プロカイン塩酸塩、懸濁及び分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはポリビニルピロリドン、乳化剤、例えば、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ－８０）、封鎖またはキレート剤、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸を挙げることができる。担体として利用される抗微生物剤を多回用量容器内の医薬組成物に添加してもよく、これにはフェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチル及びプロピルエステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、及び塩化ベンゼトニウムが含まれる。好適な賦形剤としては、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、またはエタノールを挙げることができる。好適な無毒性補助物質としては、例えば、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解度増強剤、または酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、もしくはシクロデキストリンなどの薬剤を挙げることができる。
投与、製剤化、及び薬用量
本発明の医薬組成物は、その必要のある対象に対しｉｎ ｖｉｖｏで、限定されるものではないが、経口、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、頭蓋内、心臓内、心室内、気管内、頬側、直腸、腹腔内、皮内、局所、経皮、及び髄腔内、または留置もしくは吸入による他の方法を含めた様々な経路によって、投与することができる。主題組成物は、固体、半固体、液体、または気体形態の調製物に製剤化することができ、このような調製物には、限定されるものではないが、錠剤、カプセル、粉末、粒剤、軟膏、溶液、坐薬、浣腸、注射液、吸入剤、及びエアロゾルが含まれる。適切な製剤及び投与経路は、意図された適用及び治療レジメンに応じて選択することができる。
経腸投与に適した製剤としては、ハードもしくはソフトゼラチンカプセル、丸薬、錠剤（コーティング錠を含む）、エリキシル、懸濁液、シロップ、または吸入剤、及びこれらの制御性放出形態が挙げられる。
非経口投与（例えば、注射による投与）に適した製剤としては、水性または非水性、等張性、パイロジェンフリーの滅菌液（例えば、溶液、懸濁液）が挙げられ、活性成分をその中に溶解もしくは懸濁させるか、または他の方法で（例えば、リポソームまたは他の微粒子で）提供する。このような液体は、他の医薬的に許容される成分、例えば、抗酸化剤、バッファー、保存剤、安定剤、静菌剤、懸濁剤、増粘剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液（または他の関連する体液）と等張にする溶質、をさらに含むことができる。賦形剤の例としては、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが挙げられる。このような製剤での使用に適した等張性担体の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、または乳酸リンゲル注射液が挙げられる。同様に、特定の薬用量レジメン（すなわち、用量、タイミング、及び反復）は、特定の個体及びその個体の病歴に加えて、薬物動態（例えば、半減期、クリアランス速度など）などの経験的な考慮事項に依存する。
投与頻度は、治療過程を通じて決定及び調整することができ、増殖性または腫瘍形成細胞の数の低減、このような新生物性細胞の低減の維持、新生物精細胞の増殖の低減、または転移の発生の遅延に基づく。いくつかの実施形態において、投与する薬用量は、潜在的な副作用及び／または毒性を管理するように調整するまたは減らすことができる。代替的に、主題治療組成物の持続性継続放出製剤が適切であり得る。
当業者であれば、適切な薬用量は患者によって変動し得ることを理解するであろう。最適な薬用量の決定は、概して、治療利益レベルと任意のリスクまたは有害な副作用とのバランス調整を伴う。選択された薬用量レベルは、限定するものではないが、特定の化合物の活性、投与経路、投与時間、化合物の排出速度、治療持続期間、組み合わせて用いられる他の薬物、化合物、及び／または物質、状態の重症度、ならびに患者の種、性、年齢、体重、状態、全体的健康状態、及び過去の病歴を含めた様々な因子に依存する。化合物の量及び投与経路は、最終的には医師、獣医師、または臨床医の自由裁量で行われるが、概して、薬用量は、実質的に危険または有害な副作用を引き起こすことなく望ましい効果を作用部位で達成するような濃度を達成するように選択される。
概して、ＰＤ－１結合分子は様々な範囲で投与され得る。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＰＤ－１結合分子は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇ）の治療有効薬用量で投与することができる。これらのうちのある特定の実施形態において、抗体は、約５０ｍｇ以下の薬用量で投与され、これらのうちのある特定の実施形態において、薬用量は、１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下、または０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。ある特定の実施形態において、投与薬用量は治療過程を通じて変化し得る。例えば、ある特定の実施形態において、最初の投与薬用量は、後続の投与薬用量よりも高い場合がある。ある特定の実施形態において、投与薬用量は、対象の反応に応じて、治療過程を通じて変動し得る。
いずれの場合も、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、必要に応じてその必要のある対象に投与されることが好ましい。投与頻度の決定は、主治医などの当業者によって、治療中の状態、治療中の対象の年齢、治療中の状態の重症度、治療中の対象の全般的健康状態などの考慮に基づいて行われる。
ある特定の好ましい実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合部分を伴う治療過程は、数週間または数ヵ月の期間にわたる選択された薬物製品の複数回用量を含む。より具体的には、本発明の抗体またはその抗原結合部分は、１日に１回、２日に１回、４日に１回、１週間に１回、１０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、１ヵ月に１回、６週間に１回、２ヵ月に１回、１０週間に１回、または３ヵ月に１回投与することができる。この点において、患者の応答及び臨床診療に基づいて薬用量が変更されるかまたは間隔が調整される場合があることは理解されよう。
また、薬用量及びレジメンは、１回以上の投与（複数可）が行われた個体における本開示の治療組成物についても経験的に判断され得る。例えば、個体は、本明細書で説明されているように産生した治療組成物の漸増的な薬用量を投与され得る。選択された実施形態において、薬用量は、経験的な判断または観察された副作用もしくは毒性に基づいて、それぞれ徐々に増加させるかまたは低減もしくは減らすことができる。選択された組成物の有効性を評価するには、特定の疾患、障害、または状態のマーカーを先の説明に従って用いることができる。がんに関しては、これらには、触診もしくは目視観察による腫瘍サイズの直接的測定値；ｘ線もしくはその他の画像診断技法による腫瘍サイズの間接的測定値；直接の腫瘍生検もしくは腫瘍試料の顕微鏡検査により評価された改善；間接的な腫瘍マーカー（例えば、前立腺癌のＰＳＡ）もしくは本明細書で説明されている方法に従って同定された腫瘍形成性抗原の測定値；痛みもしくは麻痺の減少；発話、視力、呼吸、もしくはその他の腫瘍関連機能障害の改善；食欲の改善、または容認された試験により測定されたクオリティーオブライフの増加もしくは生存期間の延長が含まれる。薬用量が、個体、新生物性状態のタイプ、新生物性状態の段階、新生物状態が個体の他の部位への転移を開始したかどうか、及び過去及び使用中の併用治療に応じて変動することは、当業者には明らかであろう。
非経口投与（例えば、静脈内注射）用の適合性の製剤は、本明細書で提供されるＰＤ－１結合分子を約１０μｇ／ｍｌ～約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で含むことができる。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１結合分子の濃度は、２０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００，μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、または１ｍｇ／ｍｌを含むことができる。他の好ましい実施形態において、ＰＤ－１結合分子の濃度は、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、１６ｍｇ／ｍｌ、１８ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、３５ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、４５ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、または１００ｍｇ／ｍｌを含む。
本発明の用途
本発明のＰＤ－１結合分子は、多数のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの有用性を有する。例えば、このような分子は、様々な状況下で免疫を強化するために、培養下の細胞、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏ、またはヒト対象に（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏで）投与することができる。免疫応答は、増強、刺激、または上方調節され得る。
好ましい対象としては、免疫応答の強化を必要とするヒト患者が挙げられる。当該方法は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞媒介性の免疫応答）の増強によって治療され得る障害を有するヒト患者の治療に特に適している。特定の実施形態において、当該方法は、ｉｎ ｖｉｖｏのがんの治療に特に適している。免疫の抗原特異的強化を達成するために、抗ＰＤ－１抗体は目的抗原と共に投与することができ、または抗原が治療を行う対象の中に既に存在していてもよい（例えば、担腫瘍または担ウイルス対象）。抗ＰＤ－１抗体が別の薬剤と共に投与される場合、この２つはいずれの順序で投与されても同時に投与されてもよい。
本発明はさらに、試料中のＰＤ－１抗原の存在を検出する、またはヒトＰＤ－１抗原の量を測定するための方法であって、ＰＤ－１結合分子とＰＤ－１との間の複合体の形成を可能にする条件下で、試料及び対照試料をＰＤ－１結合分子に接触させることを含む、方法を提供する。次に複合体の形成が検出され、このとき、対照試料と比較して異なる複合体が形成された場合、試料中にＰＤ－１抗原が存在することを示す。さらに、本発明のＰＤ－１結合分子は、免疫親和性精製によるヒトＰＤ－１の精製に使用することができる。
がんの治療
ＰＤ－１に関連する状態及び障害は、免疫関連の疾患または状態であり得る。いくつかの実施形態において、ＰＤ－１関連の状態及び障害としては、腫瘍及びがん、例えば、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎細胞癌、結腸直腸癌、卵巣癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、中皮腫、黒色腫、頭頚部癌、甲状腺癌、肉腫、前立腺癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、胸腺癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、菌状息肉症、メルケル細胞癌、ならびにその他の血液学的悪性腫瘍、例えば、古典的ホジキンリンパ腫（ＣＨＬ）、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型Ｂ細胞リンパ腫、ＥＢＶ陽性及び陰性ＰＴＬＤ、及びＥＢＶ関連びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、形質芽球性リンパ腫、節外性ＮＫ／Ｔ細胞性リンパ腫、鼻咽頭癌、及びＨＨＶ８関連原発性滲出性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、例えば、原発性ＣＮＳリンパ腫、脊髄軸椎腫瘍、脳幹神経膠腫が挙げられる。ある特定の実施形態において、腫瘍及びがんは転移性であり、特にＰＤ－Ｌ１を発現する転移性腫瘍である。ある特定の実施形態において、ＰＤ－１関連の状態及び障害には、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、全身性強皮症、自己免疫性糖尿病などが含まれる。ある特定の実施形態において、ＰＤ－１関連の状態及び障害には、感染性疾患、例えば、慢性ウイルス感染症、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルス２型、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、カポジウエスト肉腫関連ヘルペスウイルス伝染病、シンリング（ｔｈｉｎ ｒｉｎｇ）ウイルス（トルクテノウイルス（Ｔｏｒｑｕｅｔｅｎｏｖｉｒｕｓ））、ＪＣウイルス、またはＢＫウイルスのウイルス感染症が含まれる。
抗体またはその抗原結合部分は、化学療法または放射線療法と組み合わせて使用することができる。
化学療法との併用
抗体またはその抗原結合部分は、抗がん剤、細胞傷害性薬剤、または化学療法剤と組み合わせて使用することができる。
「抗がん剤」または「抗増殖剤」という用語は、がんなどの細胞増殖性障害の治療に使用することができる任意の薬剤を意味し、限定されるものではないが、細胞傷害性薬剤、細胞分裂抑制剤、抗血管新生剤、減量剤、化学療法剤、放射線療法及び放射線療法剤、標的型抗がん剤、ＢＲＭ、治療抗体、がんワクチン、サイトカイン、ホルモン療法、放射線療法及び転移抑制剤及び免疫療法剤が含まれる。上記で論じられている選択された実施形態において、このような抗がん剤は、複合体を含む場合があり、また、投与の前に本開示の部位特異的抗体と会合する場合があることが理解されよう。より具体的には、いくつかの実施形態において、選択された抗がん剤は、操作された抗体の対のないシステインと結合して、本明細書に記載されているような操作された結合体をもたらす。したがって、このような操作された結合体は、本発明の範囲内にあるものとして明示的に企図されている。他の実施形態において、本開示の抗がん剤は、上記のような異なる治療剤を含む部位特異的結合体と組み合わせて投与される。
本明細書で使用する場合、「細胞傷害性薬剤」という用語は、細胞に対し毒性であり、細胞の機能を減少もしくは阻害する、及び／または細胞の破壊を引き起こす物質を意味する。いくつかの実施形態において、この物質は、生物に由来する天然の分子である。細胞傷害性薬剤の例としては、限定されるものではないが、細菌（例えば、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素及び外毒素、ブドウ球菌性エンテロトキシンＡ）、真菌（例えば、α－サルシン、レストリクトシン）、植物（例えば、アブリン、リシン、モデシン、ビスキュミン、ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリン、ゲロニン、モモルジン（ｍｏｍｏｒｉｄｉｎ）、トリコサンチン、オオムギ毒素、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミテゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、及びトリコテセン）、または動物（例えば、細胞傷害性ＲＮアーゼ、例えば、細胞外膵臓ＲＮアーゼ；ＤＮアーゼＩ（そのフラグメント及び／またはバリアントを含む））の小分子毒素または酵素活性毒素が挙げられる。
本発明の目的において、「化学療法剤」は、がん細胞の成長、増殖、及び／または生存を非特異的に減少または阻害する化学的化合物（例えば、細胞傷害性薬剤または細胞分裂抑制剤）を含む。このような化学薬剤は、細胞成長または細胞分裂に必要な細胞内プロセスに向けられることが多く、そのため、概して急速に成長及び分裂するがん性細胞に対しては特に有効である。例えば、ビンクリスチンは微小管を脱重合するため、細胞が有糸分裂に入るのを阻害する。概して、化学療法剤は、がん性細胞、またはがん化するもしくは腫瘍形成性後代を生成する可能性のある細胞（例えば、ＴＩＣ）を阻害するまたは阻害するように設計された任意の化学薬剤を含むことができる。このような薬剤は、例えば、ＣＨＯＰまたはＦＯＬＦＩＲＩなどのレジメンと組み合わせて投与されることが多く、またこのような組合せが最も有効であることが多い。
本発明の部位特異的コンストラクトと組み合わせて（部位特異的結合体の構成要素として、または非結合体化状態で）使用することができる抗がん剤の例としては、限定されるものではないが、アルキル化剤、アルキルスルホネート、アジリジン、エチレンイミン及びメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）、アセトゲニン、カンプトテシン、ブリオスタチン、カリスタチン、ＣＣ－１０６５、クリプトフィシン、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エロイテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン、スポンジスタチン、ナイトロジェンマスタード、抗生物質、エンジイン抗生物質、ダイネミシン、ビスホスホネート、エスペラミシン、色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；抗代謝剤、エルロチニブ、ベムラフェニブ、クリゾチニブ、ソラフェニブ、イブルチニブ、エンザルタミド、葉酸補充物、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄｅ）、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、エニルウラシル、アムサクリン、ベストラブシル、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジアジコン、エルフォルニチン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナン、ロニダニン、マイタンシノイド、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダンモール、ニトラエリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２－エチルヒドラジド、プロカルバジン、ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）、ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロン酸；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１１）、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン；レチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン；オキサリプラチン；細胞増殖を低減するＰＫＣ－アルファ、Ｒａｆ、Ｈ－Ｒａｓ、ＥＧＦＲ、及びＶＥＧＦ－Ａの阻害剤、ならびに上記のいずれかの医薬的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレーター、酵素アロマターゼ（副腎でのエストロゲン産生を調節）を阻害するアロマターゼ阻害剤及び抗アンドロゲン、ならびにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、例えば、ＶＥＧＦ発現阻害剤及びＨＥＲ２発現阻害剤；ワクチン、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）ｒＩＬ－２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）トポイソメラーゼ１阻害剤；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラミシン、ならびに上記のいずれかの医薬的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。
放射線療法との併用
本発明は、抗体またはその抗原結合部分と放射線療法（すなわち、腫瘍細胞内で局所的にＤＮＡ損傷を誘導する任意の機構、例えば、ガンマ放射線照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子放出など）との組合せも提供する。放射性同位体の腫瘍細胞への指向性送達を用いた併用療法も企図されており、本開示の結合体は、標的型抗がん剤またはその他の標的化手段と共に使用することができる。典型的には、放射線照射療法は、約１～約２週間の期間にわたってパルス投与される。放射線照射療法は、頭頚部癌を有する対象に約６～７週間投与することができる。任意選択で、放射線照射療法は、単回用量、または複数回の経時的用量として投与することができる。
診断
本発明は、増殖性障害を検出、診断、またはモニターするためのｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの方法と、患者からの細胞をスクリーニングして腫瘍形成細胞を含めた腫瘍細胞を同定する方法とを提供する。このような方法は、治療またはがんの進行のモニターのためのがんを有する個体を同定することであって、患者または患者から得られた試料を（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで）本明細書で説明されている抗体に接触させることと、試料中の標的分子と結合したまたは結合していない抗体の存在もしくは不在、または会合のレベルを検出することとを含む、同定することを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、本明細書で説明されているような検出可能な標識またはレポーター分子を含む。
いくつかの実施形態において、抗体が試料中の特定の細胞と会合した場合、試料が腫瘍形成細胞を含む可能性があることを意味し、それによってがんを有する個体が本明細書で説明されている抗体で有効に治療され得ることを示すと考えられる。
試料は、多数のアッセイによって、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、競合結合アッセイ、蛍光イムノアッセイ、イムノブロットアッセイ、ウェスタンブロット解析、及びフローサイトメトリーアッセイによって解析することができる。適合性のあるｉｎ ｖｉｖｏのセラグノティックまたは診断アッセイは、当技術分野で認識されている画像診断またはモニタリング技法、例えば、磁気共鳴画像法、コンピューター断層撮影（例えば、ＣＡＴスキャン）、ポジトロン断層撮影（例えば、ＰＥＴスキャン）、レントゲン撮影、超音波などを含むことができ、これらは当業者に知られていると考えられる。
医薬パック及びキット
１つ以上の容器を含み、抗体またはその抗原結合部分の１回以上の用量を含む、医薬パック及びキットも提供される。いくつかの実施形態において、単位薬用量は、例えば、抗体またはその抗原結合部分を、１つ以上のさらなる薬剤を伴ってまたは伴わずに含む組成物の所定の量を含むように提供される。他の実施形態において、このような単位薬用量は、使い捨ての充填済み注射用シリンジで供給される。さらに他の実施形態において、単位薬用量に含まれる組成物は、食塩水、スクロースなど；リン酸などのバッファー、その他；を含むことができ、及び／または安定した有効なｐＨ範囲内で製剤化することができる。代替的に、いくつかの実施形態において、凍結乾燥粉末としての結合体組成物を提供することができ、これは適切な液体（例えば、滅菌水または食塩液）を添加すれば再構成することができる。ある特定の好ましい実施形態において、組成物は、タンパク質凝集を阻害する１つ以上の物質を含み、このような物質には、限定されるものではないが、スクロース及びアルギニンが含まれる。容器（複数可）上にあるまたはそれに付随する任意のラベルは、封入された結合体組成物が、選択された新生物性疾患状態を治療するために使用されることを示す。
本発明は、部位特異的結合体及び任意選択で１つ以上の抗がん剤の単回用量または多回用量の投与単位を産生するためのキットも提供する。キットは、容器と、容器上にあるまたはそれに付随するラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができ、本開示の結合体の医薬的有効量を結合形態または非結合体形態で含むことができる。他の好ましい実施形態において、容器（複数可）は、無菌のアクセスポートを有することができる（例えば、容器は、皮下注射針により貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。このようなキットは、概して、操作された結合体の医薬的に許容される製剤を好適な容器内に含み、さらに任意選択で１つ以上の抗がん剤を同じまたは異なる容器内に含む。また、キットは、他の医薬的に許容される製剤も、診断用または併用療法用に含むことができる。例えば、本発明の抗体またはその抗原結合部分に加えて、このようなキットは、一連の抗がん剤、例えば、化学療法薬もしくは放射線療法薬、抗血管新生剤、転移抑制剤、標的型抗がん剤、細胞傷害性薬剤、及び／またはその他の抗がん剤、のうちの任意の１つ以上を含むことができる。
より具体的には、キットは、本開示の抗体もしくはその抗原結合部分をさらなる構成要素を伴ってもしくは伴わずに含む単一の容器を有してもよく、または各所望の薬剤用に異なる容器を有してもよい。合わせた治療薬が結合体化用に提供される場合、単一の溶液を同等のモルの組合せでプレミックスする場合もあれば、一方の構成成分が他方よりも多いようにプレミックスする場合もある。代替的に、キットの結合体及び任意の任意選択の抗がん剤は、患者に投与する前に、異なる容器内で別々に維持されてもよい。また、キットは、医薬的に許容される滅菌バッファーまたはその他の希釈剤、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル液、及びブドウ糖液を含むための第２／第３の容器手段を含んでもよい。
キットの構成成分が１つ以上の溶液で提供される場合、この溶液は好ましくは水性溶液であり、無菌の水性溶液または食塩水が特に好ましい。ただし、キットの構成成分は、乾燥粉末（複数可）として提供されてもよい。試薬または構成成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は好適な溶媒の添加によって再構成されてもよい。このような溶媒も別の容器で提供され得ることが想定される。
上記で簡潔に示したように、キットは、抗体またはその抗原結合部分及び任意の任意選択の構成要素を患者に投与するための手段、例えば、１つ以上の針、静注用バッグもしくはシリンジ、またはさらに点眼器、ピペット、もしくはこれらに類する他の装置も含むことができ、このような手段から、製剤を動物の体内に注射もしくは導入するか、または身体の疾患領域に適用することができる。また、本発明のキットは、典型的には、バイアルまたはそれに類するもの及び他の構成要素を市販向けに密閉して収容するための手段（例えば、所望のバイアル及びその他の装置を中に配置及び保持する射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器）も含む。
配列表の概要
本出願には、複数の核酸及びアミノ酸配列を含む配列表が添付されている。下記の表Ａは、含まれている配列の概要を示す。



このように一般的に説明してきた本発明は、以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。なお、実施例は例として提供されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。実施例は、下記の実験が、実施された全てまたは唯一の実験であることを表すようには意図されていない。
実施例１
材料の調製
１．材料の調製
１．１市販の材料
実施例で使用する市販の材料の情報を表１に示す。

１． ２ 材料コード
材料のコードまたは略称（ベンチマーク抗体、細胞外ドメイン、及び細胞を含む）を表２に集約する。
２．抗原の産生
抗原ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００５００９．２）、ｈＰｒｏＬ１．ＥＣＤ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０５４８６２．１）、ｈＣＴＬＡ－４．ＥＣＤ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００５２０５．２）、ｈＣＤ２８．ＥＣＤ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００６１３０．１）、ｈＩＣＯＳ．ＥＣＤ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０３６２２４．１）、及びｍＰｒｏ１．ＥＣＤ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０３２８２４．１）、ｍＰｒｏＬ１．ＥＣＤ（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿０６８６９３．１）をコードするＤＮＡ配列をＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｈｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）で合成し、次いでこれらをＣ末端に異なるタグ（例えば、６×ｈｉｓ、ヒトＦｃ、またはマウスＦｃ）を有する修飾ｐｃＤＮＡ３．３発現ベクター内でサブクローニングした。得られた発現ベクターをさらに精製した。Ｅｘｐｉ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ａ１４５２７）に精製した発現ベクターを形質移入した。形質移入した細胞を５日間培養し、上清を収集して、Ｎｉ－ＮＴＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７５２４８）またはプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７５４３８）またはプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７０６１８）を用いたタンパク質精製を行った。得られた抗原をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣサイズ排除クロマトグラフィーによって品質管理し、次いで－８０℃で保存した。
３．ベンチマーク抗体の産生
抗ＰＤ－１抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列をＳａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｈｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）で合成し、ヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）の定常領域を有する修飾ｐｃＤＮＡ３．３発現ベクター内でサブクローニングした。ＢＭＫ１の重鎖及び軽鎖可変領域配列は、承認済みの抗ＰＤ－１抗体Ｏｐｄｉｖｏ（ＰＣＴ出願第ＷＯ２００６／１２１１６８Ａ１号のクローン５Ｃ４の配列）と同じである。ＢＭＫ３抗体の重鎖及び軽鎖可変領域配列は、米国特許第ＵＳ８１６８７５７Ｂ２号のクローン１Ｂ８の配列と同じである。
それぞれの抗－ＰＤ－１抗体の重鎖及び軽鎖領域をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞に同時形質移入した。形質移入した細胞を５日間培養し、上清を収集して、プロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７５４３８）またはプロテインＧカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７０６１８）を用いたタンパク質精製を行った。得られた抗体をＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＳＥＣによって解析し、次いで－８０℃で保存した。
３．安定した細胞株の確立
Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を用いて、ＣＨＯ－Ｓまたは２９３Ｆ細胞に、全長ヒトＰＤ－１またはマウスＰＤ－１をコードする遺伝子を含む発現ベクターを形質移入した。細胞を適切な選択圧を含む培地中で培養した。ヒトＰＤ－１高発現安定細胞株（ＷＢＰ３０５．ＣＨＯ－Ｓ．ｈＰｒｏ１．Ｃ６）及びマウスＰＤ－１高発現安定細胞株（ＷＢＰ３０５．２９３Ｆ．ｍＰｒｏ１．Ｂ４）を限界希釈により得た。
実施例２
ＶＨＨ及びキメラＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ４）タンパク質の産生
１．免疫化
ラクダ科動物のＰＤ－１に向けた液性免疫応答を誘導するため、動物にヒト及び／またはマウスＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質の７～９回用量を１～３週間間隔で皮下注射した。用量は注射１回当たり５０ｕｇ～２００ｕｇの範囲とした。
２．血清力価の検出
免疫化後、抗ＰＤ－１特異的抗体の血清力価をＥＬＩＳＡによって定量した。ＥＬＩＳＡ試験のために、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＭＮ，ＵＳＡ）を、１μｇ／ｍｌの組換え型ｈｉｓタグ化ヒトＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質及びマウスＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質でそれぞれコーティングし、４℃で終夜インキュベートした。ブロック及び洗浄した後、免疫前血清及び免疫血清の段階希釈物を添加し、室温で２時間室温でインキュベートし、次いでヤギ抗リャマＩｇＧ－ＨＲＰ（Ｎｏｖａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加し、２Ｍ ＨＣｌによって反応を停止した。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
３．ファージライブラリーの構築
５０ｍｌの血液試料を、最後の２回の注射からそれぞれ６～７日後に収集した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）上の濃度勾配遠心分離によって精製し、およそ８×１０７ＰＢＭＣの単離物を得た。全ＲＮＡをＰＢＭＣから抽出し、オリゴ－ｄＴプライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ ＳｕｐｅｒＭｉｘシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を製造業者の推奨に従って用いて、ｃＤＮＡに転写した。
ｃＤＮＡを精製し、これを、シグナルペプチドドメイン特異的プライマー及びＣＨ２ドメイン特異的プライマーを用いてＩｇ重鎖コード遺伝子セグメントのレパートリーを増幅するための鋳型として使用した。この増幅により、およそ９００ｂｐ（従来的なＩｇＧに相当）及び７００ｂｐ（ＣＨ１ドメインが欠如した重鎖ＩｇＧに相当）のＰＣＲフラグメントが得られた。次に、重鎖コード遺伝子の２つのクラスをアガロースゲル上でサイズ分離し、重鎖のみのＩｇＧをコードする遺伝子をＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。精製したフラグメントを、フレームワーク１（ＦＲ１）及びフレームワーク４（ＦＲ４）特異的プライマー対を用いてＶＨＨレパートリーを増幅するための鋳型として使用した。この増幅手順はＦＲ１の５’末端にＳｆｉ Ｉ制限部位を導入し、ＦＲ４の３’末端にＮｏｔ Ｉ制限部位を導入した。約３００～４００ｂｐのＰＣＲ増幅ＶＨＨ遺伝子のレパートリーをアガロースゲルに装填し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットによって精製した。次いで、精製したフラグメントをＳｆＩ Ｉ及びＮｏｔ Ｉで切断し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって精製した。ＶＨＨ遺伝子フラグメントを最終的にファージミドベクターｐＦＬ２４９内でライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１内で電気的形質転換した。形質転換後、ＴＧ１細胞をＳＯＣ培地中、２００ｒｐｍで振とうしながら１時間培養し、次にＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１を、１００μｇ／ｍＬ Ｃａｂ及び１％（ｗ／ｖ）グルコースを追加した固体２ＹＴ培地を含むプレートに平板培養し、３７℃で終夜培養した。翌日、コロニーを掻き取って、１／３（ｖ／ｖ）の８０％グリセロールを追加した液体２ＹＴ培地の中に入れ、－８０℃で保存した。
４．抗ＰＤ－１特異的ＶＨＨフラグメントのファージディスプレイ選択
ＰＤ－１に有効に結合するＶＨＨフラグメントを選択するため、タンパク質パニング及び細胞パニングの方法を採用した。
タンパク質パニングについては、２０μｇの組換え型ｈｉｓタグ化ヒト及びマウスＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質を、それぞれ５ｍｌ免疫チューブ（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＭＮ，ＵＳＡ）内に４℃で終夜、４００ｒｐｍで振とうしながら固定化した。翌日、未結合タンパク質を洗い流した後、チューブを２５℃の１０％スキムミルクで１時間ブロックした。免疫ファージライブラリーからのおよそ１０１２ｃｆｕのファージを、１０％スキムミルクでブロッキングした非コーティング免疫チューブ内に添加して非特異的結合ファージを枯渇させ、次いで処置したファージをチューブに添加し、２５℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳＴで広範に洗浄した後，非特異的に吸着したファージを廃棄し、標的に特異的結合したファージをグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．２）によって溶出し、次いで、指数関数的に成長するＴＧ１細胞の感染に対し１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。
感染ＴＧ１細胞を、２％（ｗ／ｖ）グルコース及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＹＴ寒天プレート上で平板培養し、３７℃で終夜培養した。翌日、３ｍｌ ２ＹＴでプレートからコロニーを掻き取り、１／３（ｖ／ｖ）８０％グリセロールを添加することにより－８０℃で凍結した。掻き取った細菌ライブラリーを１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２ＹＴ－Ｃａｒｂに接種し、ファージレスキューのために５０μｇ／ｍｌカナマイシン及び１ｍＭ ＩＰＴＧを有する２ＹＴ培地中のヘルパーファージＭ１３Ｋｏ７に感染させ、次ラウンドのパニングのためのインプットとして使用した。
細胞パニングについては、非特異的結合ファージ粒子を枯渇させるために１０１２ｃｆｕファージと２×１０６～１×１０７ ＣＨＯ－Ｓまたは２９３Ｆ細胞とのプレインキュベートを実施した。次いで、処置したファージを２×１０６～１×１０７ ＰＤ－１形質移入ＣＨＯ－Ｓまたは２９３Ｆ細胞と共に４℃で１時間、１２ｒｐｍで転がしながらインキュベートした。細胞を氷冷５％ ＦＢＳ－ＰＢＳで洗浄し、細胞結合ファージ粒子を上記のように溶出した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓによるパニングについては、非特異的結合ファージ粒子を枯渇させるために、まず約１０１２ｃｆｕのファージを２００μｌ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）とインキュベートし、次いで処置したファージを、２０μｇビオチン化ＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質で飽和させたさらなる２００μｌ Ｄｙｎａｂｅａｄｓと共に、室温で１時間、穏やかに混合しながらインキュベートした。徹底的に洗浄した後、ビーズに結合したファージを上記のように溶出した。
５．ＶＨＨタンパク質の発現及びスクリーニング
所望のパニングステップの後、プレート上で成長させたファージ感染ＴＧ１細胞コロニーを掻き取り、ＶＨＨフラグメントを含むｐＦＬ２４９ファージミドを抽出した。ＶＨＨフラグメントを、Ｓｆｉ Ｉ及びＮｏｔ Ｉを用いたｐＦＬ２４９プラスミドの消化によってクローニングし、その後、ヘキサヒスチジンタグ及びｃ－Ｍｙｃタグの遺伝子を含む発現ベクターｐＥＴｂａｃ内でライゲーションした。ライゲーション産物をＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞内で形質転換し、次いでＺＹＭ－５０５２培地中で２５℃で４８時間、２３０ｒｐｍで振とうしながら培養した。次いで、細菌培養上清をＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ試験用に収集した。
ＥＬＩＳＡは、ヒトＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質に対するＶＨＨの結合を試験するための最初のスクリーニング法として使用した。簡潔に説明すると、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＭＮ，ＵＳＡ）を、４℃で終夜、組換え型ｈｉｓタグ化ヒト及びマウスＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質でコーティングした。ブロック及び洗浄した後、ＢＬ２１ Ｅ．ｃｏｌｉ上清をコーティングプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。次いでプレートを洗浄し、次に二次抗体ヤギ抗ｃ－Ｍｙｃ－ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）と共に１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、２Ｍ ＨＣｌによって反応を停止した。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
細胞膜上で発現した立体構造的ＰＤ－１分子に対する抗ＰＤ－１ ＶＨＨのネイティブ結合を確認するため、ヒトＰＤ－１形質移入ＣＨＯ－Ｓ細胞及びマウスＰＤ－１形質移入２９３Ｆ細胞を用いてフローサイトメトリー解析を実施した。親ＣＨＯ－Ｓまたは２９３Ｆ細胞株を陰性対照として用いた。細胞は、最初にＥ．ｃｏｌｉ培養上清試料と共に、９６ウェルＵ底プレート（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）内で１×１０５細胞／ウェルの密度で４℃で１時間インキュベートし、次いで二次抗体ヤギ抗ｃ－Ｍｙｃ－ＰＥ（Ｂｅｔｈｙｌ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＴＸ，ＵＳＡ）と共に、４℃で３０分間インキュベートした。各ステップ間に２回の洗浄を適用し、フローサイトメトリー解析用に細胞を１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡ（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ，Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ，ＮＭ，ＵＳＡ）に再懸濁させた。
６．シークエンシング
ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳスクリーニングによって選択された陽性Ｅ．ｃｏｌｉクローンをＢｉｏｓｕｎｅ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）に送付し、ＶＨＨ遺伝子のヌクレオチドシークエンシングを行った。ＣＬＣ Ｍａｉｎ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてシークエンシング結果を解析した。
１つのリード抗体は「ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２」と称されるＶＨＨであった。この抗体の配列情報は、表Ａ及び配列表に示されている。この抗体は、最適化（ヒト化及び親和性成熟を含む）のための「親」としても機能した。ヒト化及び親和性成熟は、以下の実施例３でより詳細に説明する。
７．ＶＨＨの産生
ＶＨＨ遺伝子を有するＢＬ２１ Ｅ．ｃｏｌｉクローンを、４０ｍｌのＺＹＭ－５０５２培地中で２５℃で４８時間、２３０ｒｐｍで振とうしながら培養した。ＢＬ２１上清中のｈｉｓタグ及びｃ－Ｍｙｃタグ融合ＶＨＨタンパク質の発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥによって確認し、Ｎｉ－ＮＴＡカラムを用いて精製した。ＶＨＨの純度をＳＥＣ－ＨＰＬＣによって定量した。上清の低発現クローンについては、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を破壊する超音波（Ｓｃｉｅｎｔｚ，Ｎｉｎｇｂｏ，Ｃｈｉｎａ）を使用して可溶性のＶＨＨタンパク質を解放した。
８．キメラ型ＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ４）タンパク質の産生
目的クローンをＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ４）融合抗体に変換した。簡潔に述べると、適切な制限部位を含むＶＨＨ特異的クローニングプライマーを用いてＶＨＨ遺伝子をｐＥＴ－ｂａｃベクターからＰＣＲ増幅し、次いでヒトｈＩｇＧ４．Ｓ２２８ＰのＦｃを含む修飾発現ｐｃＤＮＡ３．３ベクター内への融合によってクローニングして、ＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ４．ＳＰ）キメラ型抗体の対応クローンを作成した。抗体を発現させるために２９３ＦまたはＥｘｐｉ２９３細胞にベクターを一過性に形質移入した。抗体を含む細胞培養上清を採取し、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製した。
実施例３
抗体最適化
１．ヒト化
ＰＤ－１に対する親和性及び特異性が高いＶＨＨをヒト化用に選択した。「ベストフィット」アプローチを使用してＶＨＨ鎖をヒト化した。
ＶＨＨフレームワーク領域のアミノ酸配列をヒト生殖系列Ｖ－ｇｅｎｅデータベースに対しｂｌａｓｔ処理し、Ｋａｂａｔ ＣＤＲ定義を用いてトップヒット内のヒトＣＤＲ配列をＶＨＨ ＣＤＲ配列で置き換えることにより、ヒト化ＶＨＨ配列を生成した。フレームワーク領域内のある特定の残基は、親和性を維持するためＶＨＨに復帰変異させた。ヒト化遺伝子を逆翻訳し、哺乳類発現に対しコドン最適化し、ＧＥＮＥＷＩＺによって合成した。これらの遺伝子を適切な制限部位を含むクローニングプライマーで再増幅し、修飾ｐｃＤＮＡ３．３ベクター内でクローニングしてヒト化ＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ４．ＳＰ）を発現させた。ＳＰＲを用いてＰＤ－１結合を試験した後、適切な親和性を有するバリアントをヒト化抗体リードとして選択した。親抗体「ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２」に対するＶＨＨ－Ｆｃ（ｈＩｇＧ４）形態を「ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｆｃ（ＩｇＧ４）」または「Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｆｃ（ＩｇＧ４．ＳＰ）」と称する。
２．親和性成熟
部位特異的変異誘発法を用いて、親クローンの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）の各アミノ酸を個別に他の２０個のアミノ酸に変異させた。２０個のアミノ酸をコードするＮＮＳコドンを含むＤＮＡプライマーを使用して、各標的ＣＤＲ位置に変異を導入した。リン酸化された個別の縮重プライマーを部位特異的変異誘発反応で使用した。２００ｎｇの反応産物をＢＬ２１内にエレクトロポレーションし発現させた。
競合ＥＬＩＳＡアッセイを使用することにより変異体クローンをスクリーニングした。簡潔に説明すると、９６ウェルＭａｘｓｏｒｐ ＩｍｍｕｎｏｐｌａをｐＨ９．２のコーティングバッファー（２００ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３）中０．５ｕｇ／ｍｌの抗ｃ－Ｍｙｃ抗体で４℃で終夜コーティングした。翌日、プレートを室温で１時間、カゼインでブロックした。ブロック後、上記の変異体クローンのＥ．ｃｏｌｉ上清及び親ＶＨＨ（すなわち、ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２）クローンをプレートに添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄した後、ｈＰｒｏ１．ｈＦｃ－ビオチン（０．２５ｕｇ／ｍｌ）及びＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－ＦＣ（ＩｇＧ４．ｓｐ）（０．２５ｕｇ／ｍｌ）のプレミックスをウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。この後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ結合体と共に室温で１時間インキュベートした。ＨＲＰ活性をＴＭＢ基質で検出し、２Ｍ ＨＣｌで反応を停止した。プレートを４５０ｎｍで読み取った。親ＶＨＨ（すなわちＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２）クローンの１．５倍を上回る４５０ｎｍの光学密度（ＯＤ）シグナルを示すクローンをピックアップし、シークエンシングした。これらの変異体クローンをＢＬ２１内で再発現させ、精製した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して変異体の親和性を検出した。ヒト化及び親和性成熟により一連のバリアントを得た。
３．ＳＰＲによるＫＤランク付け
ＷＢＰ３０５６ ＶＨＨ抗体を親和性成熟からスクリーニングするため、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋを用いたＳＰＲアッセイにより、ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ、ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ、及びｃｙｎｏＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＡｃｒｏｂｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）に対するｋｏｆｆを検出した。抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体固定化ＣＭ５センサーチップを用いて、ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ、ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ、またはｃｙｎｏＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ（ＡｃｒｏｂｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を捕捉した。各ＶＨＨ抗体を、１２０秒の会合相、続いて１５０秒の解離相において、３０ｕＬ／分の流速でセンサーチップに注入した。ラングミュア解析を用いて会合及び解離曲線を１：１モデルに適合させた。結果を表３に示す。

表３では、親和性成熟の後、親和性成熟ＶＨＨが、親和性成熟の前よりも良好な親和性でｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ、ｍＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ、及びｃｙｎｏＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃにそれぞれ結合していることが示されている（例えばＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－ｚ１、ヒト化ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２）。
表３に挙げられているＶＨＨタンパク質の配列情報は、上記の表Ａ及び添付の配列表に示されている。
実施例４
ＦＡＣＳによる測定におけるヒト、マウス、及びカニクイザルＰＤ－１に対する結合のｉｎ ｖｉｔｒｏキャラクタリゼーション
１．１ ヒトＰＤ－１の結合
細胞ＣＨＯ－Ｓ．ｈＰｒｏ１．Ｃ６（２×１０５細胞／ウェル）を、様々な濃度の抗ＰＤ－１抗体（１３３．３ｎＭ～０．００８ｎＭの４倍段階希釈）と共に４℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡで洗浄した後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを適用し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－１抗体ＢＭＫ１及びＢＭＫ３を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次いで細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁させた。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって解析した。データは、図１及び表４に示されている。
図１及び表４に示されているように、抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）及び抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－ＦＣ（ＩｇＧ４）を含むＷ３０５６抗体は、用量依存的に細胞表面のヒトＰＤ－１に有効に結合した。
１．２ マウスＰＤ－１結合
細胞２９３Ｆ．ｍＰｒｏ１．Ｂ４（２×１０５細胞／ウェル）を、様々な濃度の抗ＰＤ－１抗体（１３３．３ｎＭ～０．００８ｎＭの３倍段階希釈）と共に４℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡで洗浄した後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを適用し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次いで細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁させた。細胞のＭＦＩをフローサイトメーターによって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって解析した。データは、図２及び表５に示されている。
図２及び表５に示されているように、抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）及び抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－ＦＣ（ＩｇＧ４）を含むＷ３０５６抗体は、用量依存的に細胞表面のマウスＰＤ－１に有効に結合した。
１．３ カニクイザルＰＤ－１結合
カニクイザルＰＤ－１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＮＰ＿００１２７１０６５．１）一過性形質移入２９３Ｆ細胞（２×１０５細胞／ウェル）を、様々な濃度の抗ＰＤ－１抗体（１３３．４ｎＭ～０．００８ｎＭの３倍段階希釈）と共に４℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡで洗浄した後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを適用し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。抗ヒトＰＤ－１抗体ＢＭＫ１及びＢＭＫ３を陽性対照として使用した。ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次いで細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁させた。細胞のＭＦＩをフローサイトメーターによって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって解析した。データは、図３及び表６に示されている。
図３及び表６に示されているように、抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）及び抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－ＦＣ（ＩｇＧ４）を含むＷ３０５６抗体は、用量依存的に細胞表面のカニクイザルＰＤ－１に有効に結合した。
２．ＰＤ１に対するＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の結合の遮断
２．１ ＦＡＣＳによる測定におけるヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断
ヒトＰＤ－１形質移入ＣＨＯ－Ｓ．ｈＰｒｏ１．Ｃ６細胞を２×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートに移した。様々な濃度の抗体（１３３．３ｎｍ～０．００８ｎｍの４倍段階希釈）及び一定濃度のマウスＦｃタグ化ＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤタンパク質（ｈＰｒｏＬ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ）（５μｇ／ｍＬ）をプレミックスし、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡで洗浄した後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを適用し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁させた。細胞のＭＦＩをフローサイトメーターによって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって解析した。データは、図４及び表７に示されている。
図４及び表７に示されているように、抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）及び抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－ＦＣ（ＩｇＧ４）を含むＷ３０５６抗体は、用量依存的に細胞表面のヒトＰＤ－１に対するヒトＰＤ－Ｌ１の結合を有効に遮断した。
２．２ ＦＡＣＳによる測定におけるマウスＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断
マウスＰＤ－１形質移入２９３Ｆ．ｍＰｒｏ１．Ｂ４細胞を２×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートに移した。様々な濃度の抗ＰＤ－１抗体（１３３４ｎｍ～０．０７ｎｍの３倍段階希釈）及び一定濃度のマウスＦｃタグ化マウスＰＤ－Ｌ１ ＥＣＤタンパク質（ｍＰｒｏＬ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ）（５μｇ／ｍＬ）をプレミックスし、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡで洗浄した後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗マウスＩｇＧを適用し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁させた。細胞のＭＦＩをフローサイトメーターによって測定し、ＦｌｏｗＪｏ（バージョン７．６．１）によって解析した。データは、図５及び表８に示されている。
図５及び表８に示されているように、抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）及び抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－ＦＣ（ＩｇＧ４）を含むＷ３０５６抗体は、用量依存的に細胞表面のＰＤ－１に対するマウスＰＤ－Ｌ１の結合を有効に遮断した。
２．３ ＥＬＩＳＡによる測定におけるヒトＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ２遮断
プレートを１μｇ／ｍＬ（ウェル当たり１００μＬ）のヒトＰＤ－１ ＥＣＤ（ｈＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｍＦｃ）で４℃で終夜プレコーティングした。２００μＬの１×ＰＢＳ／２％ ＢＳＡを用いて１時間ブロックした後、一定濃度のｈｉｓタグ化ヒトＰＤ－Ｌ２ ＥＣＤ（ｈＰｒｏ１Ｌ２．ＥＣＤ．Ｈｉｓ）及び様々な濃度の試験抗体（６６．７ｎｍ～０．００３ｎＭの３倍段階希釈）をプレミックスし、プレートに添加した。周囲温度で２時間インキュベートした後、固定化タンパク質に対するリガンドの結合をＨＲＰ標識ヤギ抗Ｈｉｓ抗体によって検出した。１００μＬのＴＭＢ基質の分注によって発色させ、次いで１００μＬの２Ｎ ＨＣｌによって停止した。マイクロプレート分光光度計を用いて、４５０ｎｍ及び５４０ｎｍにおける吸光度を読み取った。データは、図６及び表９に示されている。
図６及び表９に示されているように、抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）及び抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－ＦＣ（ＩｇＧ４）を含むＷ３０５６抗体は、用量依存的に固定化ＰＤ－１に対するヒトＰＤ－Ｌ２の結合を有効に遮断した。
２．４ ＥＬＩＳＡによる測定におけるカニクイザルＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断
プレートを１μｇ／ｍＬ（ウェル当たり１００μＬ）のカニクイザルＰＤ－１ ＥＣＤタンパク質（ｃｙｎｏＰｒｏ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ）で４℃で終夜プレコーティングした。２００μＬの１×ＰＢＳ／２％ ＢＳＡを用いて１時間ブロックした後、一定濃度のビオチン化カニクイザルＰＤ－Ｌ１（ｃｙｎｏＰｒｏＬ１．ＥＣＤ．ｈＦｃ．ｂｉｏｔｉｎ）（２．５μｇ／ｍＬ）及び様々な濃度の試験抗体、陽性及び陰性対照（１３３．４ｎｍ～０．００７ｎＭの３倍段階希釈）をプレミックスし、プレートに添加した。プレートを周囲温度で１時間インキュベートした。固定化タンパク質に対するリガンドの結合をストレプトアビジン－ＨＲＰによって検出した。１００μＬのＴＭＢ基質の分注によって発色させ、次いで１００μＬの２Ｍ ＨＣｌによって停止した。マイクロプレート分光光度計を用いて、４５０ｎｍ及び５４０ｎｍにおける吸光度を読み取った。データは、図７及び表１０に示されている。
図７及び表１０に示されているように、抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）及び抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－ＦＣ（ＩｇＧ４）を含むＷ３０５６抗体は、用量依存的に固定化カニクイザルＰＤ－１に対するカニクイザルＰＤ－Ｌ１の結合を有効に遮断した。
３．ＥＬＩＳＡによる測定におけるファミリー間タンパク質結合アッセイ
プレートを１μｇ／ｍＬ（ウェル当たり１００μＬ）のｈＰＤ－１．ＥＣＤ．ｍＦｃ、ｈＣＤ２８．ＥＣＤ．ｍＦｃ、ｈＣＴＬＡ－４．ＥＣＤ．Ｈｉｓ、ｈＩＣＯＳ．ＥＣＤ．ｍＦｃ、またはｈＢＴＬＡ．ＥＣＤ．Ｈｉｓで４℃で終夜プレコーティングした。２００μＬの１×ＰＢＳ／２％ ＢＳＡを用いて１時間ブロックした後、試験抗体を１００ｎＭの濃度でプレートに添加した。プレートを周囲温度で１時間インキュベートした。固定化タンパク質に対する抗体の結合をＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体によって検出した。１００μＬのＴＭＢ基質の分注によって発色させ、次いで１００μＬの２Ｎ ＨＣｌによって停止した。マイクロプレート分光光度計を用いて、４５０ｎｍ及び５４０ｎｍにおける吸光度を読み取った。データは、図８に示されている。
図８に示されているように、抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）及び抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－ＦＣ（ＩｇＧ４）を含むＷ３０５６抗体は、固定化ヒトＰＤ－１に特異的に結合し、ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、及びＢＴＬＡとは交差反応しなかった。
４．ＦＡＣＳによるエピトープビニング
ヒトＰＤ－１形質移入細胞ＣＨＯ－Ｓ．ｈＰｒｏ１．Ｃ６を１～２×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルＵ底プレートに移した。試験用抗体の段階希釈液（１３３．３ｎＭ～０．００８ｎｍの４倍段階希釈）を、一定濃度のビオチン化ＢＭＫ１（１μｇ／ｍＬ）またはビオチン化ＢＭＫ３（１μｇ／ｍＬ）とそれぞれ混合した。次いで、混合液を９６ウェルプレート内の細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡで洗浄した後、二次抗体ＳＡ－ＰＥを適用し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁させた。細胞のＭＦＩをフローサイトメーターによって測定し、ＦｌｏｗＪｏによって解析した。データは、図９に示されている。
図９に示されているように、Ｗ３０５６抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）及びＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２は、ＢＭＫ１及びＢＭＫ３と同様のエピトープビンを共有している。
５．ヒト細胞ベースの機能アッセイ
一方向混合リンパ球反応（一方向ＭＬＲ）を使用して、ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞のサイトカイン分泌に対するＰＤ－１抗体のアゴニスト効果を試験した。
ｉ）細胞単離、細胞培養及び誘導
Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳ勾配遠心分離を用いて、健康ドナーから新たにヒトＰＢＭＣを単離した。１００Ｕ／ｍＬ組換え型ヒトＩＬ－２を追加した完全ＲＰＭＩ－１６４０（１０％ ＦＢＳ及び１％ ＰＳを含む）中で単離ＰＢＭＣを培養した。
ヒト単球エンリッチメントキットを製造業者の指示に従って用いて、ヒト単球を単離した。８００Ｕ／ｍＬの組換え型ヒトＧＭ－ＣＳＦ及び５０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－４を追加した完全ＲＰＭＩ－１６４０培地中で細胞濃度を２×１０６細胞／ｍＬに調整した。細胞懸濁液を、６ウェルプレートに２．５ｍＬ／ウェルで播種した。細胞を５～７日間培養して樹状細胞（ＤＣ）に分化させた。サイトカインを追加した新鮮培地で培地の半分を置き換えることにより、サイトカインを２～３日ごとに補充した。
ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エンリッチメントキットを製造業者のプロトコルに従って用いて、ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞を単離した。
ｉｉ）混合リンパ球反応
ヒト同種ＭＬＲについては、精製したＣＤ４＋ Ｔ細胞を同種未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）と共培養し、ヒト自家ＭＬＲについては、ＰＢＭＣをＣＤ４＋ Ｔ細胞単離前の５日間ＣＭＶペプチドで処置した。アッセイ当日、ＤＣをＣＭＶペプチドで１時間処置し、次いで自家ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞と共培養した。
完全ＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて、ＭＬＲを９６ウェル丸底プレートにセットアップした。ＣＤ４＋ Ｔ細胞、様々な濃度の抗体、及び同種ＤＣを適切な比率でプレートに添加した。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２でインキュベートした。３～５日間のインキュベート後、サイトカイン産生または細胞増殖が検出された。
ｉｉｉ）サイトカイン検出
ｍａｔｃｈｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐａｉｒキットを用いて、ＥＬＩＳＡによりヒトＩＬ－２及びＩＦＮ－γ放出を測定した。組換え型ヒトＩＬ－２及びＩＦＮ－γを標準物質として用いた。ＩＬ－２の段階濃度は、２ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、０．２５ｎｇ／ｍｌ、０．１２５ｎｇ／ｍｌ、０．０６３ｎｇ／ｍｌ、０．０３１ｎｇ／ｍｌ、０．０１６ｎｇ／ｍｌ、０．００８ｎｇ／ｍｌとし、ＩＦＮ－γの段階濃度は、８ｎｇ／ｍｌ、４ｎｇ／ｍｌ、２ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、０．５ｎｇ／ｍｌ、０．２５ｎｇ／ｍｌ、０．１２５ｎｇ／ｍｌ、０．０６３ｎｇ／ｍｌ、０．０３１ｎｇ／ｍｌとした。プレートを、それぞれヒトＩＬ－２またはＩＦＮ－γに特異的な捕捉抗体でプレコーティングした。ブロック後、１００μＬの標準物質または試料を各ウェルにピペットで注入し、周囲温度で２時間インキュベートした。未結合の物質を除去した後、ビオチン結合体化検出抗体をウェルに添加し、１時間インキュベートした。次いで、ストレプトアビジン－ＨＲＰを周囲温度で３０分間ウェルに添加した。１００μＬのＴＭＢ基質の分注によって発色させ、次いで１００μＬの２Ｎ ＨＣｌによって停止した。マイクロプレート分光光度計を用いて、４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。上清中のサイトカイン濃度を標準曲線から計算した。
ｉｖ）増殖の検出
培養下の生細胞の数は、製造業者の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙにより定量した。
図１０のＡ及びＢに示されているように、Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）及びＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｆｃ（ＩｇＧ４）を含むＷ３０５６抗体は、ヒト同種ＭＬＲ反応ではＩＬ－２及びＩＦＮ－γの産生を促進した。図１１のＡ及びＢは、Ｗ３０５６抗体ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）が、自家ＭＬＲ反応でＩＦＮ－γ産生及びＴ細胞増殖を促進したことを示している。
ｖ）抑制性Ｔｒｅｇ阻害アッセイ
健康ドナー１例のＰＢＭＣからヒトＣＤ４＋ Ｔリンパ球を濃縮し、別の健康ドナー１例からヒト単球を単離した。ヒトＣＤ４＋ＣＤ２５ＨＩＧＨ Ｔ細胞単離キットを用いてヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞から制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を単離し、残りのＴリンパ球をＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ細胞とした。ＤＣは、上記のように単球から誘導した。
１００００個の未成熟ＤＣ、１×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔエフェクター細胞、１×１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔｒｅｇ細胞、及び１６６．７ｎＭの抗ＰＤ－１抗体を９６ウェルプレート内で２００μＬの総体積でインキュベートした。プレートを３７℃で５日間、５％ ＣＯ２インキュベーター内で維持した。ＩＦＮ－γ放出及びＴ細胞増殖を調べた。ＢＭＫ１及びＢＭＫ３を陽性対照として使用し、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。Ｔｒｅｇ細胞も抗ＰＤ－１抗体も含まないウェルも対照として含めた。
図１２に示されているように、Ｗ３０５６抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）は、ヒトＴｒｅｇ誘導Ｔエフェクター細胞抑制を反転させることができ、これはＩＦＮ－γ産生（図１２のＡ）及びＴ細胞増殖（図１２のＢ）によって測定されている。
ｖｉ）抗体依存性細胞媒介性傷害（ＡＤＣＣ）
ヒトＰＤ－１形質移入細胞株ＷＢＰ３０５－ＣＨＯ－Ｓ．ｈＰｒｏ１．Ｃ６細胞及び様々な濃度の試験抗体を９６ウェルプレート内で混合し、ＰＢＭＣをエフェクター／標的比５０：１で添加した。プレートを３７℃で４～６時間、５％ ＣＯ２インキュベーター内で維持した。ＬＤＨベースの細胞傷害性検出キットによって標的細胞の溶解を定量した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ誘導性ＡＤＣＣがＳＫ－Ｂｒ－３細胞に及ぼす効果を陽性対照として使用した。結果からは、図１３に示されているように、Ｗ３０５６抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）がヒトＰＤ－１形質移入細胞にＡＤＣＣ効果を誘導しないことが示された。
６．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるヒト、マウス、及びカニクイザルＰＤ－１に対する親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋを用いて、ヒト、マウス、及びカニクイザルのＰＤ－１に対する抗体結合親和性を検出した。抗ヒトＦｃ ＩｇＧ抗体を固定化したＣＭ５センサーチップ（ＧＥ）上でＷ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）を捕捉した。異なる濃度のヒト、マウス、及びカニクイザルＰＤ－１を、１２０秒の会合相、続いて１５０秒の解離相において、３０ｕＬ／分の流速でセンサーチップに注入した。次いで、各結合サイクルの後、チップを１０ｍＭグリシンｐＨ１．５により再生した。
試験センサーグラムからブランク表面及びバッファーチャネルのセンサーグラムを差し引いた。ラングミュア解析を用いて１：１モデルによって実験データを適合させた。分子量４０、４５、及び４０ｋＤａを使用して、それぞれアナライトのヒト、マウス、及びカニクイザルＰＤ－１のモル濃度を計算した。ＳＰＲの結果からは、ヒト、カニクイザル、及びマウスＰＤ－１に対するＷ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）の親和性がそれぞれ３．４５Ｅ－０９Ｍ、８．５３Ｅ－０９Ｍ、及び２．８７Ｅ－０８Ｍであることが示されている（表１１）。
７．ＤＳＦアッセイによる熱安定性
リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＤＳＦアッセイを実施した。簡潔に説明すると、１９μＬの抗体溶液を１μＬの６２．５×ＳＹＰＲＯオレンジ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合し、９６ウェルプレート（Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に添加した。プレートを２℃／分の速度で２６℃から９５℃に加熱し、得られた蛍光データを収集した。
異なる温度に対する蛍光変化の負の微分係数を計算し、最大値は融解温度Ｔｍとして定義した。タンパク質が複数のアンフォールディング転移を有する場合、最初の２つのＴｍが報告され、これらをＴｍ１及びＴｍ２と称する。Ｔｍ１は常に正式な融解温度Ｔｍとして解釈され、異なるタンパク質間の比較を容易にする。データ収集及びＴｍ計算は、その運用ソフトウェアによって自動で行われた。一度、異なる温度の負の微分係数のプロットが、ソフトウェア（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｖ１．３）によって報告された。ＤＳＴ結果は表１２に示され、ＤＳＦプロファイルは図１４に示されている。Ｗ３０５６抗体は正常なＤＳＦプロファイルを有し、Ｔｍ値は６０．３～６２℃である。
８．ヒト血清安定性アッセイ
健康ドナー１例から遠心分離により、新たにヒト血清を単離した。抗体をヒト血清中で１０倍希釈した。試料の５つのアリコートを３７℃でインキュベートした。０日目、１日目、４日目、７日目、及び１４日目の試料を収集し、それぞれ液体窒素中で凍結した。
ヒトＰＤ－１形質移入細胞株ＷＢＰ３０５－ＣＨＯ－Ｓ．ｈＰｒｏ１．Ｃ６細胞（１×１０５細胞／ウェル）を、様々な濃度の血清で処置したＷ３０５６抗ＰＤ－１抗体（１２９．９ｎＭ～０．０００７ｎＭの３倍段階希釈）と共に４℃で１時間インキュベートした。１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡで洗浄した後、二次抗体ＰＥ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧを適用し、細胞と共に４℃で１時間インキュベートした。ヒトＩｇＧ４アイソタイプ抗体を陰性対照として使用した。次いで細胞を洗浄し、１×ＰＢＳ／１％ ＢＳＡに再懸濁させた。細胞のＭＦＩをフローサイトメーター（ＢＤ）によって測定し、ＦｌｏｗＪｏによって解析した。
図１５に示されている結果からは、Ｗ３０５６抗体Ｗ３０５６－ＡＰ１７Ｒ１－２Ｈ２－Ｚ１－Ｒ１－１４Ａ１－ＦＣ（ＩｇＧ４．ＳＰ）がヒト血清中で少なくとも１４日間安定していたことが示されている。
本発明が、その趣旨または中心的特質から逸脱することなく他の特定の形態で具現化され得ることを、当業者はさらに理解されよう。本発明の上記の説明はその例示的な実施形態のみを開示しているという点において、他の変形形態も本発明の範囲内にあるものとして企図されていることを理解されたい。したがって、本発明は、本明細書で詳細に説明されている特定の実施形態に限定されるものではない。そうではなく、添付の請求項が本発明の範囲及び内容を示すものとして参照されるべきである。

Claims (26)

  1. １つの免疫グロブリン単一可変ドメインＶＨＨを含むプログラム死１（ＰＤ－１）結合分子であって、前記ＶＨＨが、下記からなる群より選択されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、ＰＤ－１結合分子：
    （ａ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
    （ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
    （ｃ）配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
    （ｄ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
    （ｅ）配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
    （ｆ）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
    （ｇ）配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
    （ｈ）配列番号２２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
    （ｉ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
    （ｊ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、
    （ｋ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３２に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３、ならびに
    （ｌ）配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２、及び配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３。
  2. 前記ＶＨＨが、
    配列番号３７～４９のいずれかに示されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＰＤ－１結合分子。
  3. 前記ＰＤ－１結合分子が単一ドメイン抗体、キメラ型抗体、またはヒト化抗体である、請求項１または２に記載のＰＤ－１結合分子。
  4. 前記ＶＨＨが、ラクダ科動物由来である、請求項１～３のいずれかに記載のＰＤ－１結合分子。
  5. 前記ＶＨＨが、免疫グロブリンのＦｃ領域、蛍光タンパク質、または異なる特異性を有するＶＨＨと融合している、請求項１～４のいずれかに記載のＰＤ－１結合分子。
  6. 前記ＰＤ－１結合分子がキメラ型抗体である、請求項１～５のいずれかに記載のＰＤ－１結合分子。
  7. 前記ＰＤ－１結合分子が、ラクダ科動物からのＶＨＨ及びヒトＩｇＧのＦｃドメインのキメラ型抗体である、請求項６に記載のＰＤ－１結合分子。
  8. 前記ＰＤ－１結合分子が、ラクダ科動物からのＶＨＨ及びヒトＩｇＧ４のＦｃドメインのキメラ型抗体である、請求項７に記載のＰＤ－１結合分子。
  9. 請求項１～８のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子をコードする核酸配列を含む、単離核酸分子。
  10. 配列番号５０～６２のいずれかに示される核酸配列を含むまたはそれからなる、請求項９に記載の単離核酸分子。
  11. 請求項９または１０に記載の単離核酸分子を含む、発現ベクター。
  12. 請求項１１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  13. 前記宿主細胞が、細菌細胞、真菌細胞、または哺乳類細胞である、請求項１２に記載の宿主細胞。
  14. 請求項１～８のいずれかで定義された少なくとも１つのＰＤ－１結合分子と、医薬的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  15. 請求項１～８のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子を調製する方法であって、以下ステップ：
    前記ＰＤ－１結合分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞内で、請求項１～８のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子を発現させることと、
    前記宿主細胞から前記ＰＤ－１結合分子を単離することと
    を含む、前記方法。
  16. 対象におけるＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の結合を阻害または遮断するための組成物であって、請求項１～８のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子を含む、前記組成物。
  17. 対象におけるＰＤ－１に関連する状態を治療するための組成物であって、請求項１～８のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子を含む、前記組成物。
  18. 前記対象が、ＰＤ－１アンタゴニストに応答する可能性がある障害または状態を有すると同定されている、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記対象が、前記対象からの試験生体試料中の前記ＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の存在またはレベルの上方調節に対し陽性であると同定されている、請求項１８に記載の組成物。
  20. 対象における、免疫応答の上方調節から利益を得ると考えられる状態を治療または防止するための組成物であって、請求項１～８のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子を含む、前記組成物。
  21. 前記対象がＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２の発現を上方調節した、請求項２０に記載の組成物。
  22. 免疫応答の上方調節から利益を得ると考えられる状態を治療または防止するための医薬品の製造における、請求項１～８のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子の使用。
  23. 前記状態が増殖性障害である、請求項２２に記載の使用。
  24. ＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１の結合の阻害または遮断で使用するための、請求項１～８のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子を含む組成物。
  25. ＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ２の結合の阻害または遮断で使用するための、請求項１～８のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子を含む組成物。
  26. 増殖性障害を治療または診断するためのキットであって、請求項１～８のいずれかで定義されたＰＤ－１結合分子を含む容器を含む、前記キット。
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