MXPA03001606A - Metodo de seleccion de peptidos. - Google Patents

Abstract

Se provee un metodo para seleccionar un peptido tolerogenico mediante la seleccion de un peptido que es capaz de unirse a una molecula de MHC de clase I o II sin procesamiento ulterior; se produce tambien un peptido seleccionado por tal metodo y su uso en una composicion farmaceutica y un metodo para el tratamiento y/o la prevencion de una enfermedad.

Description

METODO DE SELECCION DE PEPTIDOS La presente invención se relaciona con un método para seleccionar un péptido tolerogénico, con un péptido identificado por dicho método y con su uso en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad. La presente invención se relaciona asimismo con una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de dichos péptidos tolerogénicos.

ANTECEDENTES En una respuesta inmune adaptativa, los linfocitos T tienen capacidad para reconocer epítopes internos de un antígeno proteico. Las células presentadoras de antígenos (APC) captan los antígenos proteicos y los degradan hasta obtener fragmentos peptldicos cortos. Un péptido se puede unir a una molécula de clase I o II de un complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) dentro de la célula o ser transportado a la superficie celular. Cuando se presenta en la superficie celular conjuntamente con una molécula de MHC, el péptido puede ser reconocido por una célula T (por medio del receptor de células T (TCR)), en cuyo caso el péptido es un epítope de células T. Los epítopes de células T desempeñan una función central en la respuesta inmune adaptativa de cualquier antígeno, ya sea propio o extraño. La función central desempeñada por los epítopes de células T en las enfermedades de hipersensibilidad (que incluyen alergia, enfermedades autoinmunes y rechazo de transplantes) ha quedado demostrada por medio del uso de modelos experimentales. Es posible inducir enfermedades inflamatorias o alérgicas por inyección de péptidos sintéticos (basándose en la estructura de los epítopes de células T) en combinación con un adyuvante. Por el contrario, se ha demostrado que es posible inducir tolerancia inmunológica hacia determinados epítopes peptídicos mediante la administración de los epítopes peptídicos en forma soluble. La administración de antígenos peptídicos solubles ha quedado demostrada como medio eficaz para inhibir la enfermedad en la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE - un modelo de esclerosis múltiple (ÉM)) (Metzler y Wraith (1993) Int. Immunol. 5: 1159-1165; Liu y Wraith (1995) Int. Immunol. 7: 1255-1263; Anderton y Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251-1261 ) y modelos experimentales de artritis, diabetes y uveorretinitis (reseñada en el trabajo de Anderton y Wraith (1998) antes citado. También ha quedado demostrado como medio para tratar una enfermedad existente en la EAE (Anderton y Wraith (1998) antes citado) El uso de péptidos tolerogénicos para el tratamiento o prevención de enfermedades ha atraído considerable atención. Una razón para ello es que se ha demostrado que ciertos epítopes tolerogénicos pueden aminorar las respuestas de las células T para antígenos diferenciados dentro del mismo tejido. Este fenómeno, conocido como "supresión inespecífica" (bystander suppression) significa que debería ser posible inducir tolerancia a más de un epítope (preferentemente todos los epítopes) dentro de un determinado antígeno, y a más de un antígeno para una enfermedad dada, utilizando un péptido tolerogónico específico (Anderton y Wraith (1998) obra antes mencionada). Esto eliminaría la necesidad de identificar todos los antígenos patogénicos dentro de una enfermedad determinada. Los péptidos constituyen además una opción favorable para terapia en virtud de su costo relativamente bajo y el hecho de que se pueden producir análogos peptídicos con propiedades inmunológicas modificadas. Los péptidos pueden ser modificados así para alterar sus interacciones con el MHC o TCR. Un posible problema asociado con este enfoque es que se ha demostrado que no todos los péptidos que actúan como epítopes de células T son capaces de inducir tolerancia. El póptido de proteína básica de mielina (MBP) 89-101 es un antígeno inmunodominante después de la inmunización y también es un inmunógeno muy efectivo tanto en términos de la iniciación de reactividad de células T como la inducción de EAE. Sin embargo, ha quedado demostrado que este póptido es ineficaz para inducir tolerancia cuando se administra en solución (Anderton y Wraith (1998) obra antes mencionada). Se ha sugerido un número de explicaciones para la jerarquía observada en la capacidad de los epítopes de células T para inducir tolerancia (reseñado en la obra citada de Anderton y Wraith (1998). Específicamente, se ha propuesto que existe una correlación entre la afinidad del péptido por el MHC y la tolerogenicidad (Liu y Wraith (1995) obra citada), aunque esto no concuerda con alguna de las observaciones. Por ejemplo, MBP[89-101], que no es tolerogénico, se une a l-As con afinidad relativamente elevada. Por consiguiente, no es correcto predecir qué péptidos han de inducir tolerancia. Si hubiera una explicación racional de por qué sólo una proporción de los epítopes peptídicos es capaz de inducir tolerancia, esto facilitaría la selección de los péptidos tolerogénicos que sirven para el tratamiento y prevención de los trastornos de hipersensibilidad.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Los inventores de la presente han puesto de manifiesto que si un epítope peptídico es de un tamaño apropiado para ser presentado por APC inmaduro sin el procesamiento del antígeno, puede inducir tolerancia inmunológica. La observación de que ciertos epítopes de células T son tolerogénicos y otros son incapaces de inducir tolerancia puede explicarse, por lo tanto, por el hecho de que algunos epítopes requieren mayor procesamiento antes de poder ser presentados por una molécula de MHC. Estos epítopes que requieren más procesamiento no inducen tolerancia cuando se los administra en forma soluble, pese a su capacidad para inducir enfermedad al inyectárselos en combinación con un adyuvante. Los epítopes que no requieren mayor procesamiento son capaces de inducir tolerancia, y los inventores los han denominado "apítopes" (Antigen Processing Independent epiTOPES).

Este hallazgo provee un método basado en la regla para la selección de epítopes de células T tolerogénicos, lo que elimina la necesidad de examinar la capacidad tolerogénica de un péptido in vivo. Esto es particularmente ventajoso en el desarrollo de estrategias para tratar o prevenir enfermedades para las cuales no se dispone de modelos animales. Incluso para enfermedades que tienen un modelo animal, el método de selección debería hacer que el desarrollo de composiciones para inducir tolerancia sea más sencillo y seguro, ya que provee un mecanismo por el cual se puede analizar la capacidad para la inducción de tolerancia en las células T humanas (antígeno de reconocimiento en combinación con moléculas de MHC humano) in vitro, antes de su uso in vivo. Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención presenta un método para seleccionar un péptido tolerogénico, que comprende el paso de seleccionar un péptido con capacidad para unirse a una molécula de MHC de clase I o II sin más procesamiento. En una modalidad preferida, el péptido tiene capacidad para unirse a una molécula de MHC de clase I o II sin más procesamiento. En la técnica se conoce un número de métodos para detectar los póptidos con capacidad para actuar como epítopes de células T para un determinado antígeno. Por lo tanto, habitualmente se ha de utilizar el método para seleccionar un péptido tolerogénico entre una pluralidad de péptidos, cada uno de los cuales comprende un epítope de células T.

Para investigar si un péptido tiene capacidad para unirse a una molécula de HC de clase I o II sin más procesamiento, se puede estudiar la capacidad del péptido para unirse a las moléculas de MHC de clase I o II utilizando un sistema de presentación independiente del procesamiento de antígenos (APIPS). En una modalidad preferida, el método comprende, por lo tanto, los siguientes pasos: (i) tratar un APIPS con un péptido y (ü) analizar la unión del péptido a las moléculas de MHC de clase I o II dentro del APIPS. En un segundo aspecto, la presente invención presenta un péptido seleccionado por el método de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención. El péptido puede servir para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad. Específicamente, el péptido puede servir para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad que es mediada por las células T autorreactivas. Las reacciones de hipersensibilidad se presentan especialmente al tratamiento/prevención utilizando el péptido de la presente invención, por ejemplo la alergia, autoinmunidad y rechazo de transplantes. Los inventores de la presente invención han identificado ya un número de apltopes para la proteína básica de mielina, que es un autoantígeno en la esclerosis múltiple. Por lo tanto, en una modalidad especialmente preferida, los póptidos de la presente invención son útiles en el tratamiento y/o prevención de la esclerosis múltiple.

Se sabe que algunos péptldos tienen capacidad para inducir tolerancia a otros epítopes desde el mismo antígeno y otros epítopes de otro antígeno (por el fenómeno conocido como supresión inespecífica). Sin embargo, los inventores de la presente estiman que para suprimir adecuadamente todas las células T autorreactivas, sería ventajoso la administración de una combinación de diversos apítopes a un paciente para tratar o prevenir una determinada enfermedad. En consecuencia, en un tercer aspecto, la presente invención presenta una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de póptidos de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, donde cada péptido se basa en un epítope de células T. En un cuarto aspecto, la presente invención presenta un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad en un sujeto, que comprende el paso de administrar al sujeto un péptido de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención. Una estrategia general para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad en un sujeto puede comprender los siguientes pasos: (i) identificar un antígeno para un enfermedad (ii) identificar un apítope para el antígeno; y (iii) administrar el apítope al sujeto.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A y 1 B ilustran un ejemplo típico del perfil cinético del derivado de proteína purificada de Mycobacterium tuberculosis (PPD) y MBP en pacientes con Esclerosis Múltiple (EM) y en individuos sanos. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de un paciente con EM (1A) y un individuo normal (1 B) son analizadas para determinar su capacidad para proliferar en presencia de PPD y MBP entera; se compara el perfil cinético de la respuesta proliferativa a la MBP con el del antígeno PPD secundario. La figura 2 ilustra un ejemplo de un paciente con EM (EM 49) que responde a múltiples péptidos en 2 diferentes momentos, aunque en quienes el perfil durante el segundo período, medido 4 meses más tarde, difiere considerablemente. Se cultivaron PBMC en presencia de MBP y un panel de péptidos que abarcaban toda la extensión de la MBP, y se midió la proliferación por la captación de 3H-timidina. La amplia respuesta proliferativa de las células T observada en el primer momento fue considerablemente diferente de la medida 7 meses más tarde (segundo punto de tiempo). La figura 3 ilustra un ejemplo de un paciente cuya amplia respuesta a los epítopes (primer punto de tiempo) revierte (segundo punto de tiempo) y reaparece en el curso de un período de doce meses (tercer punto de tiempo).

Las figuras 4 y 5 ilustran la presentación de diversos péptidos de MBP a clones de células T por medio de APC vivas y fijas. La figura 4A-30-44, Fig. 4B-110-24, Fig. 5A-130-144, Fig. 5B-156-170. La figura 6 ilustra la respuesta de las células T aisladas de un ratón transgónico DR2:MBP82-100 a la presentación de póptidos anidados de MBP en la región 77-100 por APC. La figura 7 ilustra la respuesta del clon de células MS17:43 a la presentación de póptidos anidados de MBP en la región T 25-148 por el APC. La figura 8 es una ilustración del reconocimiento de los epítopes de células T dentro de la secuencia MBP 89-101. Hay tres epítopes de células T diferenciados pero traslapados dentro de la secuencia: 89-94, 92-98 y 95-101. Se ilustra el potencial de segmentación entre los residuos 94 y 95 por la acción de la asparginil endopeptidasa (AEP). Las figuras 9A y 9B ilustran la capacidad de los péptidos de MBP 87-96 (9A) y 89- 01 (9B) para actuar como apítope para las células T que responden al epítope 89-94.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con un método para seleccionar un póptido tolerogénico.

Tolerancia En el presente contexto, el término "tolerogénico" significa capaz de inducir tolerancia. La tolerancia es la falta de respuesta a un antígeno. La tolerancia a los autoantlgenos es una característica esencial del sistema inmune. Cuando ésta se pierde, se puede producir una enfermedad autoinmune. El sistema inmune adaptativo debe mantener la capacidad para responder a una enorme variedad de agentes infecciosos evitando al mismo tiempo el ataque autoinmune de los autoantlgenos contenidos dentro de sus propios tejidos. Esto se controla en gran parte por la sensibilidad de los linfocitos T inmaduros a la muerte celular apoptótica en el timo (tolerancia central). Sin embargo, no todos los autoantlgenos son detectados en el timo, por lo que la muerte de los timocitos autorreactivos queda incompleta. Por consiguiente, también hay mecanismos por los cuales los linfocitos T maduros autorreactivos pueden adquirir tolerancia en los tejidos periféricos (tolerancia periférica). Una revisión de los mecanismos de la tolerancia central y periférica se da en la obra de Anderton y otros (1999) (Immunological Reviews 169: 123-137).

La tolerancia puede ser el resultado o caracterizarse por la inducción de anergia en por lo menos una porción de las células T CD4+. Para activar una célula T, un péptido se debe asociar con un APC "profesional" con capacidad para enviar dos señales a las células T. La primera señal (señal 1 ) es enviada por el complejo MHC-péptido en la superficie celular del APC y es recibido por la célula T por medio del TCR. La segunda señal (señal 2) es transferida por las moléculas coestimulatorias en la superficie del APC, tal como CD80 y CD86 y recibida por CD28 en la superficie de la célula T. Se piensa que cuando una célula T recibe la señal 1 en ausencia de la señal 2, no se activa y, de hecho, se torna anérgico. Las células T anórgicas son refractarias al posterior desafío antigénico y pueden tener capacidad para suprimir otras respuestas inmunes. Se piensa que las células T anérgicas están implicadas en la mediación de la tolerancia a las células T. Sin que sea su deseo restringirse a teoría alguna, los Inventores de la presente predicen que los péptidos que requieren procesamiento antes de que puedan ser presentados en combinación con moléculas de MHC no inducen tolerancia porque deben ser tratados por las células maduras de presentación de antígenos. Las células maduras de presentación de antígenos (como por ejemplo macrófagos, células B y células dendríticas) son capaces de procesar antígenos, aunque también de administrar señales 1 y 2 a una célula T, lo que lleva a la activación de la célula T. Por otro lado, los apítopes han de poder unirse al MHC de clase II en APC inmaduras. De ese modo, serán presentadas a las células T sin coestimulación, llevando a la anergia y tolerancia de las células T. Naturalmente, los apítopes también tienen capacidad para unirse a moléculas de MHC en la superficie celular de las APC maduras. Sin embargo, el sistema inmune contiene una mayor abundancia de APC inmaduras que de las inmaduras (se ha sugerido que menos del 10 % de las células dendríticas se activan, Summers y otros (2001 ) Am. J. Pathol. 159: 285-295). La posición por omisión con respecto a un apítope será, por lo tanto, de anergia/tolerancia, en lugar de activación. Se ha demostrado que, al inducir tolerancia por medio de la inhalación de póptidos, se reduce la capacidad de las células T CD4+ para proliferar. Además, la producción de IL-2, IFN-? e IL-4 por estas células se reduce, aunque se incrementa la producción de IL-10. Se ha demostrado que la neutralización de la IL-10 en ratones en estado de tolerancia inducida por péptidos restaura por completo la susceptibilidad a la enfermedad. Se ha sugerido que una población de células regulatorias persiste en el estado tolerante, lo que produce IL-10 y media la regulación inmune (Burkhart y otros (1999) Int. Immunol. 1 1 : 1625-1634). La inducción de tolerancia puede ser monitoreada, por lo tanto, por diversas técnicas, entre las que se incluyen: (a) susceptibilidad reducida a contraer la enfermedad para la cual el péptido es un epltope objetivo in vivo; (b) la inducción de anergia en las células T CD4+ (que puede detectada por el posterior desafio con antígeno in vitro); (c) cambios en la población de células T CD4+ que incluyen (i) reducción de la proliferación; (ii) disminución de la producción de IL-2, IFN-? e IL-4 y (iii) aumento de la producción de IL-10.

Epftopes independientes del procesamiento de antfqenos (APITOPES) El método de la presente invención comprende el paso de seleccionar un póptido que tiene capacidad para unirse a una proteína de MHC de clase I o II sin más procesamiento. En este contexto, dichos póptidos son conocidos como "apítopes" (epíTOPES independientes del procesamiento de antígenos). La presentación en la superficie celular de los póptidos derivados de un determinado antígeno no es aleatoria y tiende a estar dominada por un pequeño número de epítopes de frecuente aparición. La dominancia de un póptido determinado depende de numerosos factores, como por ejemplo la afinidad relativa por la unión a la molécula de MHC, el punto espacio-temporal de generación dentro de las APC y la resistencia a la degradación. La jerarquía de los epítopes por un antígeno puede cambiar con el progreso de una respuesta inmune, lo que tiene implicancias importantes para la autotolerancia y la autoinmunidad. Es probable que las regiones determinantes inmunodominantes sean buenos tolerógenos. Por ende, en una modalidad preferida, el apftope de la presente invención se basa en un epítope dominante. Sin embargo, después de una respuesta inmune primaria a los péptidos inmunodominantes, se puede producir la "diseminación" de los epítopes hacia los determinantes subdominantes (Lehmann y otros (1992) Nature 358:155-157). La presentación de los epítopes subdominantes puede ser importante para disparar la autoinmunidad. En consecuencia, el apftope de la presente invención puede basarse en un epítope subdominante. Para cualquier antfgeno dado, también pueden existir epítopes crípticos. Los epítopes crípticos son aquellos que pueden estimular una respuesta a las células T cuando se los administra en forma de peptido, pero que no producen dicha respuesta si se los administra en forma de antfgeno entero. Puede ser que durante el procesamiento del antfgeno para obtener péptidos en las APC, se destruya el epítope críptico. Los inventores de la presente han demostrado que el péptido 92-98 es un epítope críptico para la MBP (Ejemplo 2C). Es interesante notar que hay un sitio de escisión putativo para la asparaginil endopeptidasa dentro de esta región peptídica, lo que puede significar que durante el procesamiento natural, las APC no generan péptidos que contengan esta región. Un epítope críptico puede actuar asimismo como epítope in vitro, por el hecho de que puede tener capacidad para unirse a una molécula de MHC sin más procesamiento e inducir anergia en una célula T que reconoce el epítope críptico. Sin embargo, no sería probable que ese tipo de apítope sea de utilidad terapéutica, puesto que sería incapaz de conferir tolerancia a las células T que reconocen un epítope naturalmente procesado del antígeno. Los epítopes para un antígeno pueden ser identificados midiendo la respuesta de las células T a los péptidos traslapados que abarcan la totalidad del antígeno (ver más adelante) al ser presentados por las APC. Esos estudios habltualmente dan lugar a "series anidadas" de péptidos y el epítope mínimo para una determinada línea de células T/clon puede ser evaluado midiendo la respuesta a los péptidos truncados. No se puede presumir que un epítope mínimo de un antígeno se comporte como apítope. Puede ocurrir perfectamente que los aminoácidos flanqueantes del epítope mínimo sean indispensables para la unión óptima al MHC. El apítope debe estar diseñado para cubrir la posibilidad de que pueda haber diferencias sutiles entre los epítopes mínimos de diferentes clones de células T. Se debe hacer énfasis en que puede no ser posible identificar un apítope para todos los epítopes. Existe clara evidencia de que algunos epítopes se unen al MHC de una manera dependiente de la carga de MHC en los endosomas y, por ende, requieren procesamiento (Viner y otros (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. 92: 2214-2218). Esta es otra razón por la cual no se puede presumir que cada epítope mínimo se comporte inevitablemente como apítope.

Identificación de los péptidos que contienen epítopes de células I Existe un número de métodos conocidos en la técnica para identificar los epítopes de células T dentro de un antígeno determinado. Los epítopes naturalmente procesados pueden ser identificados por análisis espectrofotomótrico de masas de los péptidos eluidos de las APC con carga antigénica. Estas son APC que han sido estimuladas para captar antígeno, o bien que han sido forzadas a producir la proteína intracelularmente mediante transformación con un gen apropiado. Típicamente, las APC son incubadas con protelna, ya sea en solución o adecuadamente dirigidas a la superficie celular de las APC. Después de la incubación a 37°C las células son sometidas a lisis en un detergente y la proteína de clase II es purificada, por ejemplo por cromatografía de afinidad. El tratamiento del MHC purificado con un medio químico adecuado (por ejemplo, en condiciones ácidas) da lugar a la elución de los péptidos del MHC. Este grupo de péptidos se separa y se lo compara el perfil con el póptido de las APC control tratadas de la misma manera. Los picos específicos de las células que expresan o son alimentadas con la proteína son analizados (por ejemplo por espectrometría de masas) y se identifican los fragmentos peptídicos. Este procedimiento habitualmente genera información sobre la gama de péptidos (habitualmente encontrados en "series anidadas") generados a partir de un antígeno específico mediante el procesamiento del antígeno.

Otro método para la identificación de epítopes consiste en seleccionar una genoteca sintética de péptidos que se traslapan y abarcan la longitud del antígeno en un ensayo in vitro. Por ejemplo, se pueden utilizar péptidos que tienen una longitud de 15 aminoácidos y que se traslapan en 5 o 10 aminoácidos. Los péptidos son analizados en un sistema de presentación de antígenos que comprende células presentadoras de antígenos y células T. Por ejemplo, el sistema de presentación de antígenos puede ser una preparación de esplenocitos murinos, una preparación de células humanas de amígdalas o PBMC. Por otro lado, el sistema de presentación de antígenos puede comprender una determinada línea de células T o clon y/o un tipo de células presentadoras de antígenos específico. La activación de las células T se puede medir por la proliferación de las células T (por ejemplo utilizando la incorporación de 3H-timidina) o la producción de citocina. La activación de las células T CD4+ del tipo TH1 puede ser detectada, por ejemplo, por la producción de IFNy que puede ser detectada por técnicas estándares tal como el ensayo ELISPOT. Los estudios de péptidos traslapados habitualmente indican el área del antígeno en el cual está ubicado un epftope. Luego se puede evaluar el epítope mínimo para una determinada célula T midiendo la respuesta a los péptidos truncados. Por ejemplo, si se obtiene una respuesta al péptido que comprende los residuos 1-15 en la genoteca de traslapados, se pueden utilizar las series que están truncadas en ambos extremos (es decir, 1-14, 1-13, 1-12, etc. y 2-15, 3-15, 4-15, etc.) para identificar el epítope mínimo.

Los inventores de la presente estiman que la identificación de las regiones inmunodominantes de un antígeno utilizando ensayos in vitro (especialmente los que utilizan líneas de células T) presenta un patrón sesgado de reactividad de los póptidos. En el estudio para identificar los epftopes de la MBP que han sido descritos en los ejemplos, utilizan un ensayo de respuesta cinética en el cual se mide la proliferación de PBMC de pacientes con EM e individuos sanos contra una genoteca de péptidos traslapados. Este ensayo se basa en el hallazgo de que, si bien las células T de individuos normales y pacientes con EM responden de manera similar al antígeno proteico purificado, responden de modo diferente a los póptidos basados en la secuencia de la MBP. Las células T de pacientes con EM responden con mayor magnitud y cinética más rápida a los antígenos peptídicos en comparación con los donantes sanos normales. Esto permite efectuar la selección y la identificación del epítope al cual responde el paciente específico en un momento dado. En el estudio descrito en la presente, este enfoque ha revelado un número de regiones con contenido de epítopes que no fueron identificadas utilizando técnicas estándares. Más aún, se demuestra que el reconocimiento de las células T exhibe un patrón cíclico, apareciendo en un momento, revirtiendo y luego reapareciendo en una fecha posterior. El ensayo cinético descrito por los inventores provee una herramienta de valor, puesto que revela el epítope al cual el paciente está respondiendo en un momento dado. Esta información puede ser utilizada para diseñar especialmente un enfoque terapéutico de administración de apítopes para un paciente especifico identificando y administrando un apítope para el epítope pertinente (en caso de haberlo). Esta información puede permitir además el trazado de un patrón general para el progreso de la enfermedad, por lo que la composición terapéutica puede ser diseñada de manera que incluya los apítopes para los epítopes que probablemente se presenten en una determinada etapa durante la enfermedad.

Sistemas de presentación independientes del procesamiento de antlaenos (APIPS Una vez identificado un epítope, el siguiente paso consiste en investigar si también se comporta como apítope. Un apítope debe ser presentado a las células T sin necesidad del procesamiento de antígenos. Una vez identificados los péptidos que contienen los epítopes de células T, se pueden identificar los apítopes utilizando un sistema sin procesamiento. Se pueden analizar los péptidos truncados y los análogos de los péptidos para determinar la activación utilizando un sistema de presentación independiente del procesamiento de antígenos (APIPS). Entre los ejemplos de APIPS se cuentan: a) APC fijas (con o sin anticuerpos contra CD28); b) Membranas lipídicas con contenido de moléculas de MHC Clase I o II (con o sin anticuerpos contra CD28) y c) MHC purificado natural o recombinante en forma unida a la placa (con o sin anticuerpos contra CD28). Se conoce el uso de APC fijas para investigar las respuestas de las células T, por ejemplo en estudios para investigar el epítope mínimo dentro de un polipóptido, midiendo la respuesta a los péptidos truncados (Fairchild y otros (1996) Int. Immunol. 8: 1035-1043). Las APC pueden ser fijadas, por ejemplo, utilizando formaldehído (habitualmente paraformaldehído) o glutaraldehfdo. Las membranas lipídicas (que pueden ser membranas planas o liposomas) se pueden preparar utilizando lípidos artificiales o pueden ser fracciones plasmáticas de membranas/microsomas de las APC. En la práctica, se pueden aplicar los APIPS a los pozos de una placa de cultivo tisular. A continuación se agregan los antígenos peptídicos y se detecta la unión del péptido a la porción de MHC del APIPS mediante la adición de líneas o clones específicos de células T. La activación de la línea o clon de células T se puede medir a través de cualquiera de los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo por medio de la incorporación de 3H-timidina o la secreción de citocinas.

Péptidos El segundo aspecto de la presente invención se relaciona con un péptido. El término "péptido" se utiliza en el sentido normal para referirse a una serie de residuos, típicamente L-aminoácidos, conectados entre sí típicamente por enlaces peptídicos entre los grupos a-amino y carboxilo de los aminoácidos adyacentes. El término incluye péptidos modificados y análogos sintéticos de péptidos. Un péptido de acuerdo con la presente invención puede tener cualquier longitud que pueda unirse a una molécula de MHC de clase I o II sin más procesamiento. Los péptidos que se unen a las moléculas de MHC de clase I tienen típicamente una longitud de 7 a 13, más habitualmente de 8 a 10 aminoácidos. La unión del péptido se estabiliza en sus dos extremos mediante contactos entre átomos de la cadena principal del péptido y los sitios invariantes de la muesca de unión de péptidos de todas las moléculas de MHC de clase I. Hay sitios invariantes en ambos extremos de la muesca que se unen a los términos amino y carboxi del péptido. Se da lugar a las variaciones de longitud de los péptidos mediante una torsión de la columna vertebral del péptido, con frecuencia en los residuos de prolina o glicina, que permiten la flexibilidad indispensable. Los péptidos que se unen a las moléculas de MHC de clase II tienen típicamente una longitud de 8 a 20 aminoácidos, más habitualmente una longitud de entre 10 y 17 aminoácidos y pueden ser incluso mucho más largos. Estos póptidos yacen en conformación extendida a lo largo de la muesca de unión de póptidos al MHC II que (a diferencia de la muesca de unión de póptidos al MHC I) está abierta en ambos extremos. El póptido se mantiene en su lugar fundamentalmente por los contactos de los átomos de la cadena principal con residuos conservados que alinean la muesca de unión de póptidos. El póptido de la presente invención se puede preparar utilizando métodos químicos (Peptide Chemlstry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlín). Por ejemplo, se pueden sintetizar póptidos por técnicas en fase sólida (Roberge JY y otros (1995) Science 269: 202-204), escindidos de la resina y purificados por cromatografía líquida de alta resolución de preparación (por ejemplo, Creighton (1983) Proteins Structures and Molecular Principies, WH Freeman and Co, Nueva York, NY). Se puede obtener la síntesis automática, por ejemplo utilizando el Sintetizador de Póptidos ABI 43 1 A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones provistas por el fabricante. Por otro lado, se puede preparar el péptido por medios recombinantes, o por escisión de un polipóptido más largo. Por ejemplo, se puede obtener el póptido por escisión de un antígeno objetivo. Se puede confirmar la composición de un péptido mediante el análisis o secuenciación de los aminoácidos (por ejemplo, el procedimiento de degradación de Edman).

En una modalidad preferida, el péptido se deriva de un antígeno objetivo. Un antígeno objetivo es una molécula (por ejemplo una proteína o glucoproteína) que es procesada por las APC y reconocida por las células T durante el curso de la enfermedad. Naturalmente, el antígeno objetivo dependerá de la enfermedad objetivo. De preferencia, el péptido es derivado de un fragmento del antígeno que surge del procesamiento natural del antígeno por las APC. Para fines prácticos, hay diversas características más que el péptido debería exhibir. Por ejemplo, el péptido debe ser soluble en una concentración que permita su uso in vivo. De preferencia, el péptido debe ser soluble en concentraciones de hasta 0.5 mg/ml, más preferentemente el péptido debe ser soluble en concentraciones de hasta 1 mg/ml, muy preferentemente el péptido debe ser soluble en concentraciones de hasta 5 mg/ml. Para la administración intranasal, el volumen máximo de la dosis que se puede captar utilizando los procedimientos actuales es de aproximadamente 200 µ? por fosa nasal. Si el péptido es soluble a razón de 1 mg/ml, una doble dosis en cada fosa nasal da lugar a la administración de 800 µg al paciente. No es habitual administrar más de 5 mg en ninguna dosis individual. También es importante que el péptido sea suficientemente estable in vivo para ser terapéuticamente útil. Los inventores de la presente han encontrado que, in vivo, 30 minutos después de la administración, la cantidad total de un póptido de ensayo cae a aproximadamente 50%, 4 horas después de la administración la cantidad cae a aproximadamente 30%, pero al cabo de 5 días el póptido sigue siendo detectable (a razón de aproximadamente 5%). La vida media del póptido ¡n vivo debe ser de por lo menos 10 minutos, preferentemente por lo menos 30 minutos, más preferentemente de por lo menos 4 horas, muy preferentemente de por lo menos 24 horas. Los inventores de la presente han descubierto que después de la administración intranasal, la cantidad de péptido en el nódulo linfático en drenaje hace pico a aproximadamente 4 horas después de la administración, si bien el péptido es aún detectable (en niveles de aproximadamente 5% como máximo) al cabo de 5 días. Es preferible que el póptido sea suficientemente estable para estar presente en una concentración terapéuticamente activa en el nódulo linfático de drenaje durante el tiempo suficiente para ejercer un efecto terapéutico. El péptido debe demostrar asimismo una buena biodisponibilidad in vivo. El póptido debe mantener una conformación in vivo que le permita unirse a una molécula de MHC en la superficie de la célula sin indebidos impedimentos.

Enfermedades objetivo En una modalidad, el póptido de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención es para usarse en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad. Es probable que un apítope para MHC de clase II sea especialmente ventajoso en las enfermedades mediadas por las respuestas de las células T CD4+. Por ejemplo, enfermedades que se establecen o mantienen debido a una respuesta inapropiada o excesiva de las células T CD4+. Es probable que dicho tipo de péptido sea especialmente ventajoso, por ejemplo, en el tratamiento de los trastornos de hipersensibilidad. Las reacciones de hipersensibilidad incluyen: (i) alergias, que se producen como resultado de respuestas incorrectas a sustancias extrañas inocuas; (il) enfermedades autoinmunes, que se producen como resultado de respuestas a autoantígenos tisulares; y (iii) rechazo de injertos, que son consecuencia de respuestas a un transplante. Entre los ejemplos de alergias se cuentan, aunque sin limitaciones, fiebre de heno, asma extrínseca, alergias a las mordeduras y picaduras de insectos, alergias a alimentos y fármacos, rinitis alérgica, bronquitis crónica y asma bronquial, síndrome anafiláctico, urticaria, angioedema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto, eritema nodoso, eritema multiforme, Síndrome de Stevens-Johnson, rinoconjuntivitis, conjuntivitis, venulitis necrosante cutánea, enfermedad inflamatoria pulmonar y enfermedades cutáneas bullosas. Entre las enfermedades autoinmunes se cuentan, aunque sin restricciones, la artritis reumatoidea (RA), miastenia gravis (MG), esclerosis múltiple (EM), lupus eritematoso sistémico (SLE), tiroiditis autoinmune (tiroiditis de Hashimoto), enfermedad de Graves, enfermedad inflamatoria intestinal, uveorretinitis autoinmune, polimiositis y ciertos tipos de diabetes, vasculitis sistómica, polimiositis-dermatomiositis, esclerosis sistémica (escleroderma), Síndrome de Sjogren, espondilitis anquilosante y espondiloartropatías relacionadas, fiebre reumática, pneumonitis por hipersensibiiidad, aspergilosis broncopulmonar alérgica, pneumoconiosis por el polvo inorgánico, sarcoidosis, anemia hemolítica autoinmune, trastornos plaquetarios intnunológicos, criopatías tales como criofibrinogenemia y poliendocrinopatías autoinmunes. En medicina clínica se transplanta comúnmente una variedad de tejidos, incluyendo riñon, hígado, corazón y pulmón, piel, córnea y médula ósea. Todos los injertos, excepto los injertos de córnea y algunos de médula ósea, habitualmente requieren actualmente la inmunosupresión a largo plazo. En una modalidad de acuerdo con este aspecto de la presente invención, el péptido es para uso en el tratamiento y/o prevención de la diabetes. En esta modalidad, el péptido se puede derivar del antígeno objetivo IA2.

En otra modalidad de acuerdo con este aspecto de la presente invención, el póptido está destinado al uso en el tratamiento y/o prevención de la esclerosis múltiple (EM). La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza por múltiples lesiones desmielinizantes diseminadas por toda la materia blanca del SNC y se produce en diversos sitios y momentos (McFarlin y McFarland, 1982 New England J. Medicine 307: 1183-1188 y 1246-1251). Se piensa que la EM es mediada por células T autorreactivas. En esta modalidad, el póptido puede ser derivado de uno de los autoantígenos, en especial la proteína básica de mielina (MBP) o proteína proteolipídica (PLP). La MBP es posiblemente más apropiada que la PLP, puesto que la PLP es sumamente hidrófoba y los péptidos derivados de la misma tienden a aglomerarse. La MBP es inmunogénica y los linfocitos T específicos de la MBP tienen actividad encefalitogénica en animales (Segal y otros, 1994, J. Neuroimmunol. 51: 7-19; Voskuhl y otros, 1993 J. Neuroimmunol. 42: 187-192; Zamvil y, 1985 Nature 317:355-8). En una modalidad preferida, el péptido es derivado de una de las regiones inmunodominantes de la MBP, es decir 1-24, 30-54, 75-99, 90-114, 105-129, 120-144, 135-159 y 150-170. En una modalidad especialmente preferida, el péptido es seleccionado entre uno de los péptidos de MBP que los inventores de la presente han demostrado que actúan como apítopes, entre los que se incluyen los siguientes péptidos: 30-44, 80-94, 83-99, 81-95, 82-96, 83-97, 84-98, 1 10-124, 130-144, 131-145, 132-146 y 133-147. Se pueden utilizar apítopes para el MHC de clase I, por ejemplo para modificar las respuestas antivirales de CD8+ en forma tolerogónica.

Composición farmacéutica Los inventores de la presente estiman que, pese a la "supresión inespecífica" puede ser necesario dirigir un número de clones diferentes de células T a fin de inducir tolerancia con eficacia. Por ende, se puede administrar una pluralidad de péptidos a un individuo para prevenir o tratar una enfermedad. En un tercer aspecto, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de apltopes. La composición farmacéutica puede comprender, por ejemplo, entre 3 y 50 apítopes, preferentemente entre 2 y 15 apítopes. Los apítopes puede ser derivados del mismo o de otro antígeno objetivo (o antlgenos objetivo). De preferencia, los apítopes pueden unirse todos a MHC de clase I, o pueden unirse todos al MHC de clase II, sin más procesamiento. En una modalidad preferida, todos los apítopes en la composición farmacéutica pueden unirse al MHC de clase I o de clase II sin más procesamiento. La composición farmacéutica puede presentarse en forma de un equipo, en el cual algunos o cada uno de los apítopes se presentan por separado para la administración simultánea, separada o consecutiva.

Por otro lado, (o además), si la composición farmacéutica (o parte de la misma) ha de ser administrada en múltiples dosis, cada dosis puede ser envasada por separado. La composición farmacéutica puede comprender una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de todos o cada apltope y optativamente un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Además, en las composiciones farmacéuticas de la presente invención, el o cada uno de los apítopes puede estar mezclado con cualquier aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de revestimiento o agente(s) solubilizante.

Administración El póptido debe ser administrado en forma soluble en ausencia de adyuvantes. De preferencia, el póptido es administrado por la vía de las mucosas. Los estudios han demostrado que el péptido, si se lo administra en forma soluble por vía intrapehtoneal (i.p.), intravenosa (i.v.) o intranasal (i.n.) u oral, puede inducir tolerancia a las células T (Anderton y Wraith (1998), antes mencionada, Liu y Wraith (1995) antes mencionada; Metzler y Wraith (1999) Immunology 97: 257-23). De preferencia, el péptido se administra por vía intranasal.

Los estudios en ratones han demostrado que la duración de la administración del péptido necesaria para inducir tolerancia depende de la frecuencia precursora de las células T del receptor (Burkhart y otros (1999) obra mencionada). En muchos estudios experimentales, se ha demostrado que se necesitan dosis repetidas del péptido para inducir tolerancia (Burkhart y otros ( 999) obra mencionada). Por lo tanto, la dosis exacta y el número de dosis del péptido dependerá del individuo, aunque en una modalidad preferida se administra una pluralidad de dosis. Si se administra una pluralidad de péptidos en forma simultánea, éstos pueden estar en forma de "cocktail" que es adecuado para la administración en dosis únicas o múltiples. Por otro lado, puede ser preferible administrar múltiples dosis pero variar las concentraciones relativas de los péptidos entre dosis. En una modalidad preferida se puede seguir un protocolo de "escalada de dosis", en el que se administra a un paciente una pluralidad de dosis en concentraciones crecientes. Dicho enfoque ha sido utilizado, por ejemplo, en el caso de péptidos de fosfolipasa A2 en aplicaciones inmunoterapéuticas contra la alergia por el veneno de abejas (Müller y otros (1998) J. Allergy Clin Immunol. 101 : 747-754 y Akdis y otros (1998) J. Clin. Invest. 102: 98-106).

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos tienen por fin ilustrar la presente invención, aunque no deben ser considerados limitaciones de la misma. La invención se relaciona en especial con las modalidades específicas descritas en estos ejemplos.

EJEMPLO 1 Identificación de los epítopes de células T en MBP Materiales y métodos Antígenos Se prepara MBP humana de materia blanca cerebral de acuerdo con lo descrito por Deibler y otros (Deibler y otros, 1972 Preparativa Biochemistry 2: 139) y su pureza es evaluada por SDS-PAGE. Se utiliza MBP y derivado purificado de Mycobacterium tuberculosis (PPD) (RU Central Veterinary Laboratory, Surrey) en ensayos de proliferación en concentraciones óptimas previamente determinadas; la concentración óptima de cada antígeno es de 50 µ9/???. Se sintetiza un panel de péptidos traslapados de 15-meros que abarcan la totalidad de la molécula de MBP utilizando química estándar de F-moc en un sintetizador de péptidos múltiples Abimed AMS 422 (Abimed, Langenfeld, Alemania). Cada péptido está desplazado en 5 aa y traslapado en 10 aa. Se producen 33 péptidos que están agrupados en grupos de 3 y los grupos son analizados en una concentración óptima de 50 µ9/???, de tal manera que cada péptido esté presente, in vitro, en una concentración de 16.6 9 ???.

Pacientes y sujetos control Los sujetos de este estudio consisten en 12 pacientes con EM clínica cierta o confirmada por laboratorio (Poser y otros, 1983), con una escala de edades de 29-51 años. Ocho de los 12 pacientes están inmersos en una prueba con interferón^, por lo demás todos los otros pacientes no han recibido tratamiento con corticoesteroides durante por lo menos 3 meses antes del comienzo del estudio. El grupo control consistía en 13 individuos sanos con una escala de edades de 25-55 años y ninguno había recibido terapia inmunosupresora durante por lo menos 3 meses anteriores a la obtención de la muestra de sangre.

Medio de cultivo tisular Se utiliza medio RPMI-1640 suplementado con HEPES 20 mM (Sigma, Poole, RU), penicilina (100 U/ml), sulfato de estreptomicina (100 mg/ml) y L-glutamina 4 mM (todo de Life Technologies, Paisley, Escocia), como medio de cultivo tisular. Se utiliza medio sin suero para lavar las células linfoides y TCL. En todas las condiciones de cultivo y ensayos, el medio está suplementado con 10 % de plasma autólogo termoinactivado.

Condiciones de cultivo y ensayos de proliferación de células T Se recoge sangre periférica con citrato (50-100 mi) por venopuntura de cada sujeto después de obtener el consentimiento informado. Se aislan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de sangre por centrifugación de densidad en Histopaque-1077 (Sigma, Poole, RU), y se las cultiva en volúmenes de 1.5 mi en placas de cultivo tisular de 24 pozos (Nunc International, Costar, Corning Inc., Nueva York, USA) en una concentración de 1 x10e por mi, con contenido de PPD; MBP o péptidos de MBP. Las placas son incubadas a 37°C en atmósfera humedecida de CO2 5%/aire 95%. Entre los días 5 y 14 se retiran alícuotas por duplicado de 100 µ? de cada cultivo, se las transfiere a una placa microtituladora de 96 pozos de fondo redondo y se les aplica pulsaciones de 0.4 µ?'? de [3H]-timidina (Amersham International, Amersham, RU). Al cabo de 18 horas las células son cosechadas en rejillas de fibra de vidrio (LKB-Wallac, Turku, Finlandia) utilizando una cosechadora Mach 1 11 96 (Tomtec, Orange, Nueva Jersey, USA). La incorporación de [3H]-timidina se determina utilizando un contador de centelleo de líquido Microbeta (LKB-Wallac). Los pozos de ensayo que contienen antígeno son considerados positivos cuando tienen la 6cpm > 1000 y el índice de estimulación (IE) > 3, donde IE = CPM de cultivo con contenido de antígeno/CPM de cultivo sin antígeno.

Generación de líneas de células T y clones de células T Se generan líneas de células T (TCL) de 8 pacientes con EM y 2 donantes sanos control. Se separan las PBMC de cada sujeto de acuerdo con lo descrito anteriormente y se las cultiva en placa a razón de 1 x 106 células/ml en placas de 6 pozos en presencia de MBP (50 µg ml); se congela una porción de las PBMC de cada sujeto regularmente y se la almacena para reestimulaciones posteriores. Siete días más tarde las células son alimentadas con medio fresco que contiene IL-2 al 2% (Lymphocult-HT, Biotest LTD, Birmingham, RU) y el día 12 del cultivo todas las células vuelven a ser estimuladas con antígeno, IL-2 y PBMC autólogas irradiadas (2500 Rad) como fuente de células presentadoras de antígeno (APC) en una relación de 1 célula T:5 APC. Las células se expanden en IL-2 cada 3-4 días y el día 14 son reestimuladas con antígeno, IL-2 y PBMC, de acuerdo con lo descrito anteriormente. El día de la primera reestimulación las células son examinadas para verificar la proliferación específica con MBP. En pocas palabras, se cultivan 2x104 células T y 1 x 105 PBMC autólogas irradiadas por triplicado en placas de fondo redondo de 96 pozos, en presencia de MBP. Las células son cultivadas durante 2 días y se les aplica pulsaciones de (3H)-timidina a razón de 0.4 µ?/???? durante las últimas 18 horas del cultivo. A continuación, las células son cultivadas de la manera antes descrita y se considera que una TCL es específica para MBP con una 5cpm >1000 y un IE > 3. Después de 3 ciclos de reestimulación/expansión las TCL son clonadas utilizando PHA (Sigma, Poole, Dorset, RU) en presencia de PBMC autólogas irradiadas como APC. Las células T son cultivadas en condiciones de dilución limitada a razón de 0.1 célula/pozo, 0.3 células/pozo y 1 célula/pozo y cultivadas en placas Terasaki (Nunc International, Costar) con 1x104 PBMC irradiadas, 5 u¾/ml de PHA y 2 % de IL-2. Al cabo de 10-12 días, se expanden los pozos con cultivo positivo a placas de fondo redondo de 96 pozos, utilizando 1x105 PMBC irradiadas, 5 µ9 ?t?? de PHA e IL-2. Tres días más tarde se alimenta a los pocilios medio fresco con contenido de IL-2, y el día 7 los clones son expandidos a placas de 48 pozos utilizando 5x105 PBMC irradiadas, PHA e IL-2; en este momento los clones son analizados en estudios de proliferación para determinar las respuestas especificas a la MBP. Los clones específicos para MBP son expandidos una semana más tarde a placas de 24 pozos, utilizando 1x106 PMBC irradiadas con PHA o Dynabeads (Dynal, RU) e IL-2. Los clones son mantenidos en placas de 24 pozos utilizando un ciclo de reestimulación/expansión de 7-10 días, esencialmente de acuerdo con lo descrito anteriormente. Se analiza la capacidad de los clones de células T (TCC) para reconocer el panel de póptidos de MBP mediante ensayos de proliferación, según lo descrito anteriormente.

Resultados Reconocimiento de péptidos de MBP entre pacientes con EM e individuos sanos Los inventores de la presente hacen uso de un ensayo de respuesta cinética en el cual se analizan las PBMC de pacientes con EM y sujetos sanos para determinar su capacidad para responder a un panel de péptidos sintéticos 15-meros traslapados que abarcan la longitud total de la MBP humana. Se examina la respuesta proliferativa de las PBMC de cada cultivo en 5 puntos de tiempo en un período de 2 semanas y se compara el perfil cinético de la respuesta a la MBP y los péptidos con la respuesta al PPD, donde este último representa un antígeno secundario de respuesta/memoria. No se encuentra ninguna diferencia significativa en la respuesta de las PBMC a la MBP y/o los péptidos entre pacientes que reciben lnterferón-ß y los que no reciben tratamiento alguno (no se ilustran datos). La respuesta a la MBP tanto en pacientes con EM como en controles sanos hizo pico con posterioridad a la respuesta al PPD, siguiendo así las características cinéticas de la respuesta a un antígeno no memorizado. La figura 1 ilustra un ejemplo típico de perfil cinético con respecto a PPD y MBP en pacientes con EM e individuos sanos. Como se ilustra en el cuadro 1 , los dos péptidos más comúnmente reconocidos por los pacientes con EM son 90-1 14 y 75-99 (6/12 pacientes cada uno), seguidos por las regiones 30-54, 135-159 y 150-170 (5/12 pacientes) y 1 -24 y 105-129 (4/12 pacientes). Tres pacientes responden a los aa 15-39 y 20- 44. Dos pacientes reconocen 45-69 y ninguno de los pacientes con EM responden a la región 60-84.

CUADRO 1 Respuesta a péptidos MBP en pacientes con EM: 1er punto de tiempo MBP 1 a 24 15-39 30-54 45-69 60-84 75-99 90-114 105-129 120-144 135-159 150-170 MS 10 + + - + + - - - + MS 17 + MS 19 - MS39 + + + - - - - + + MS41 + - - - - . - . + + MS43 + + + + - - + + . + MS49 + - + + - - + - + . _ + MS57 + + MS59 + - - + - - + + . . . + MS60 + - - + + . + + + + + + MS67 + - - - - - - . . . + MS80 + - - - - - - - . . . + (,? Respuesta a péptidos MBP en pacientes con EM: 2° punto de tiempo n MS 10 + - - - - . + + - . + . MS 17 + - - - - - - - . . _ + MS 1 + MS 9 + - + + - - - + . . + + MS57 + MS59 + MS60 + - - + - - + MS43 + Respuesta a péptidos MBP en pacientes con EM: 3** punto de tiempo MS41 + - - - - . + . . . + MS60 + - - + - . - - _ + + MS 59 + De acuerdo con cuadro 5, en el que todos los pacientes son HLS-DR2 positivos, los dos péptidos más comúnmente reconocidos por los pacientes con EM son 90-1 14 y 75-99 (6/11 pacientes cada uno), seguidos por las regiones 120-144, 135-159 y 150-170 (5/11 pacientes) y 1-24, 15-39, 30-54 y 105-129 (4/1 1 pacientes). Tres pacientes responden a los aa 45-69 y una vez más, ninguno de los pacientes con EM responden a la región 60-84.

Por el contrario, los individuos sanos reconocen considerablemente menos péptidos, con sólo 2 sujetos control que responden a más de 2 péptidos (C y J; cuadro 2). Los individuos control C y J son los únicos dos que reconocen los aa 60-84, una región no vista por este grupo de pacientes. Es interesante notar que estos dos individuos expresan el alelo DRB1*0701. Las regiones 45-69 y 105-129 no son reconocidas por ninguno de los donantes sanos, en tanto que 75-99 y 150-170 son reconocidos por 4 individuos sanos; 135-159es reconocida por tres individuos sanos; 1-24, 30-54, 60-84 y 120-144 son reconocidas por dos individuos sanos y 15-39 y 90-114 son reconocidas por un individuo. En suma, 8/13 individuos sanos no responden a ninguno de los péptidos traslapados, en tanto que sólo 1/12 pacientes con EM (MS19) deja de reconocer consistentemente los péptidos de MBP. Notablemente, este paciente es el único que no responde a la proteína MBP.

CUADRO 2 Respuesta a péptidos MBP en individuos sanos: 1w punto de tiempo Individuo MBP 1 a 24 15-39 30-54 45-69 60-84 75-99 90-114 105-129 120-144 135-159 150-170 A + - - - - - - - - - - - B + - - - - - - - - - - - C + - - + - + + + - - - + D + - + - - - - - - - + - E + - _ _ _ - . . - - - F + - - - - - + - - - - - G + - - - - - - - - - - - H + - - - - - - - - - - - J + + - - - + - - - - + - K + - - - - . - - - + - - L + - - - - - - - - - - M + - - - - - + - - - + - R espuesta a péptidos MBP en individuos sanos: 2° punto de tiempo G D + - - - - - - - - - - - M F + - - - - - - - - - - - j + _ _ . . . . . _ _ _ K + - - - - - - - - - - - M + - - - - - - - - - - - C + - - - - - - - - - - - | + . . . - - - . . . . L + - - - - - - - - - - + Respuesta a péptidos MBP en individuos sanos: 3er punto de tiempo D + - + + - - + - - + - - J + - . . . . . . . . . + M + - - - - - + - - - + + F + + - - . + . . . . .

El cuadro 6 también ilustra la respuesta de los individuos sanos a los póptidos de MBP. En este estudio, sólo 1 sujeto control responde a más de 2 péptidos (N1 1 ). N11 también es el único individuo que reconoce los aa 60-84, una región no vista por este grupo de pacientes. Las regiones 15-39, 45-69 y 105-129 no son reconocidas por ninguno de los donantes sanos, en tanto que 120-144 y 135-159 son reconocidas por dos individuos sanos y 1 -24, 30-54, 60-84, 75-99, 90-1 14 y 150-170 son reconocidos por un individuo. En suma, 9/12 individuos sanos no responden a ninguno de los péptidos traslapados.

En general, el día en el cual hizo pico la respuesta a la MBP y/o los póptidos no difirió significativamente entre los individuos sanos y los pacientes, y la cinética de ambos grupos se asemejó a los de una respuesta antigénica primaria. Más aun, la magnitud de la respuesta a la MBP y los péptidos no difirió entre pacientes e individuos sanos.

Cambios de reconocimiento de MBP-péptidos en el tiempo Habiendo establecido que los pacientes con EM responden a un amplio espectro de péptidos de MBP, los inventores de la presente decidieron examinar si el reconocimiento de las PBMC en los mismos individuos es focalizada y estable en el curso de aproximadamente 4-12 meses. Como se ilustra en los cuadros 1 , 5 y 2, ni los pacientes con EM ni los individuos sanos exhibieron el mismo patrón de reconocimientos de póptidos. La figura 2 representa un ejemplo de un paciente con EM (MS 49) que responde a múltiples póptidos en 2 puntos de tiempo diferentes, si bien el perfil de reconocimiento durante el segundo punto de tiempo, medido 4 meses después, difiere considerablemente. Es decir, que en el segundo ensayo cinético, la respuesta de las PMBC a los aa 15-39, 30-54 y 150-170 persiste, en tanto que la respuesta a 75-99 y 105-129 revierte y se transfiere a las regiones 90-114 y 135-159. La figura 3 (EM 60) ilustra un ejemplo de paciente cuya respuesta amplia a los epítopes revirtió a una respuesta focalizada en el curso del período de 4 meses. Los Individuos sanos analizados en la segunda ronda no responden a ninguno de los póptidos (cuadro 2). En suma, los resultados demuestran que los pacientes con EM no exhiben patrones fijos de reconocimiento. Dentro de cada paciente la respuesta de las PBMC a diversos póptidos puede persistir, revertir y desplazarse a nuevas regiones de la MBP, como se ve en el paciente MS 49.

Ciclos de reconocimiento de los péptidos Cuando la respuesta de los péptidos es analizada en 3 puntos de tiempo diferentes en el curso de un período de 12 meses, queda claro que en ciertos pacientes, el reconocimiento de epítopes parece fluctuar en lugar de desplazarse irreversiblemente a nuevas regiones del póptido. Por ejemplo, como se ¡lustra en los cuadros 1 y 5, el paciente MS 60 exhibe un patrón de ciclos de reconocimiento a los aa 120-144 y 135-159, es decir, que los residuos 120-144 y 135-159 están entre los muchos reconocidos en el primer punto de tiempo analizado, la respuesta a estas 2 regiones se revierte en la segunda ocasión y luego reaparece en el tercer punto de tiempo medido a los 4 meses. Del mismo modo, el perfil cinético del paciente MS 41 demuestra que el reconocimiento de los aa 135-159 fluctúa entre los varios puntos de tiempo (ver cuadros 1 y 5). Entre el grupo control sano (cuadro 2), un individuo (M) exhibe una respuesta fluctuante a las regiones 75-99 y 135-159, un segundo individuo (F) reconoce 75-99 en dos de los tres puntos temporales analizados, en tanto que un tercer sujeto (D) exhibe una respuesta cíclica a los residuos 15-39.

Mapeo fino de la respuesta a la MBP Se generan TCC de 8 pacientes con EM y 2 individuos sanos, y se los utiliza para aclarar la especificidad fina de las regiones peptídicas identificadas en el ensayo de respuesta cinética. Se analiza la especificidad de cada TCC por su respuesta proliferativa al panel de póptidos 15-meros. El clon SD:A7 reconoció la región 1-24, y dentro de esta región este TCC respondió a los aa 5-19. La región 30-54 es reconocida por 4 clones (MS49:D3, MS49:C8, MS49:A8, MS49:B6) y el epítope dentro de esta región es 30-44. Un clon ( S39:D7) de un paciente con EM reconoce el póptido 60-74 y es interesante notar que un individuo sano responde a esta región (60-84) en nuestro ensayo de respuesta cinética. Cinco clones (MS43:A7, MS41 :B6, MS41 :A2, MS41 C6, N5:8) reconocen los aa 110-134 (MS60:A2, MS60:B3), contenidos dentro del grupo 105-129, y otro TCC del mismo paciente es específico con respecto a 130-144 (MS60:E1 ), que se encuentra en la región 120-144. Cinco individuos producen clones que reconocen epítopes dentro de la región 135-159, MS60:F7, MS60:D1 , MS59:F1 y N5:19 reconocen los aa 140-154; MS57A1 es específico con respecto a 150-149 y el TCC MS 17:A3 responde a la secuencia 130-144. Este panel de clones demuestra claramente la presencia de por lo menos 2 epítopes de células T dentro de la región 135-159 de la MBP. Por último, la región 150-170 es reconocida por dos clones específicos con respecto a los aa 156-169. La especificidad de todos los TCC está resumida en el cuadro 3.

CUADRO 3 TCC Región de MBP Péptido específico MS 39:A7* 1-24 5-19 MS 49 : D3* 30-54 30-44 MS 49 : C8* 30-54 30-44 MS 49 : A8* 30-54 30-44 MS 48 : B6* 30-54 30-44 MS 39 : D7* 60-84 60-74 MS 43 : A7* 75-99 83-99 MS 41 : B6* 75-99 83-99 MS 41 : A2* 75-99 83-99 MS 41 : C6* 75-99 83-99 N5 : 8** 75-99 83-99 MS 60 : A2* 105-129 1 10-124 MS 60 : B3* 105-129 1 10-124 MS 60 : E1 * 120-144 130-144 MS 17 : A3* 120-144 130-144 MS 60 : F7* 135-159 140-154 MS 60 : D1 * 135-159 140-154 MS 57 : A1* 135-159 140-154 MS 59 : F1* 135-159 140-154 N5 : 19** 135-159 140-154 MS 43 : A3* 150-170 156-169 MS 43 : D2* 150-170 156-169 EJEMPLO 2 Identificación de los apítopes en MBP Materiales v métodos Ensayo de presentación de anttgenos utilizando un APIPS La presentación de los póptidos a los clones de células T se mide por proliferación. Se fijan las APC en paraformaldehldo al 0.5% y se las aplica a razón de 1 x 105 por pozo de una placa de cultivo de 96 pozo. Los clones de células T son aplicados a razón de 2 x 104 por pozo en presencia de diversas concentraciones del péptido. Después de la incubación durante 48 h a 37°C, se mide la proliferación por la incorporación de [3H] timidina en el curso de 16-20 h. Se comparan los resultados con la capacidad de las células T para responder al epítope presentado por las APC vivas. La presentación de los péptidos a las células T aisladas de ratones transgónicos DR2:MBP82-100 fue esencialmente la descrita anteriormente, excepto que las APC fueron cultivadas a razón de 5 x 105 células por pozo, las células T fueron cultivadas a razón de 1 x 105 células por pozo y se dejó que la incubación prosiguiera durante 72 horas antes de la adición de [3H]-timidina.

Resultados En este experimento, se examinan los péptidos que han sido identificados como epítopes en el ejemplo anterior para determinar su capacidad para presentarse utilizando un APIPS. Los resultados están consignados en el cuadro 4b. De los cinco epítopes examinados hasta ahora, se encontró que cuatro eran apítopes (30-44, 80-94, 110-124 y 130-144) y se encontró que uno de ellos actuaba como epítope pero no como apítope (156-170).

CUADRO 4A REGION DE PROTEINA EPITOPES IDENTIFICADOS ESTUDIADA UTILIZANDO CLONES DE CELULAS T 1-24 5-19 15-39 No común 30-54 30-44 45-69 No común 60-84 60-74 75-99 80-94 83-99 90-1 14 No común 105-29 110-124 120-144 130-144 135- 59 130-144 140-154 150-170 150-164 156-169 CUADRO 4B EJEMPLO 2A Investigación de los póptidos de MBP 30-44, 110-124. 130-144 v 156-170 Para investigar si diversos péptidos de MBP son apítopes, se investiga su capacidad para ser presentados a las células T por APC fijas. Se pre-pulsan células vivas o con pulsos anteriores de Mgar (HLS-DR2+ve) con el póptido en suero o con suero solo por espacio de 3.5 horas. Luego se retira el exceso de péptido de las células y se agrega el clon apropiado de células T. Se mide la respuesta proliferativa de las células T por captación de 3H-timidina. Como se ¡lustra en las figuras 4 y 5, los péptidos 30-44 (Fig. 4A), 1 10-124 (Fig. 4B) y 130-144 (Fig. 5A) pueden ser presentados por APC fijas sin más procesamiento. Estos péptidos se definen, por lo tanto, como apítopes. Por otro lado, el péptido 156-170 requiere mayor procesamiento para la presentación a las células T (Fig. 5B). Las APC fijas no pueden presentar este epltope a las células T, por lo que 156-170 no es un apítope.

EJEMPLO 2B Identificación de apítopes dentro de las reglones 77-100 y 125-148 de la MBP Para cualquier epítope dado, puede existir uno o más apítopes con capacidad para presentarse a las APC sin más procesamiento. La presencia de apítopes dentro de dos regiones de la MBP es investigada incubando células Mgar vivas o fijadas en p-formaldehído (HLA-DR2+ve), incubadas con póptidos traslapados en suero de las regiones MBP 77-100 (figura 6) y 125-148 (figura 7) o en suero solo. Se agregaron las células T y al cabo de 72 horas (figura 6) o después de 48 h (figura 7) se midió la respuesta proliferativa de las células T por captación de 3H-timidina. En el caso de MBP 77-100, las células T son aisladas de un ratón transgónico DR2:MBP 82-100, en tanto que en el caso de MBP 130-144, se utiliza el clon de células T MS17:A3. En el caso de la región de MBP 77-100, se definen como apítopes los siguientes péptidos: MBP 83-99 ENPWHFFKNIVTPRTP MBP 80-94 TQDENPWHFFKNIV MBP 81-95 QDENPVVHFFKNIVT MBP 82-96 DENPWHFFKNIVTP MBP 83-97 ENPWHFFKNIVTPR MBP 84-98 MPWHFFKNIVTPRT La secuencia mínima de MBP reconocida por las células T del ratón transgónico DR2 MBP 82-100 es la región 85-94. En el caso de la región de MBP 125-148 se definen como apítopes los siguientes péptidos: MBP 130-144 RASDYKSAHKGFKGV MBP 131-145 ASDYKSAHKGFKGVD MBP 132-146 SDYKSAHKGFKGVDA MBP 133-147 DYKSAHKGFKGVDAQ La secuencia mínima de MBP reconocida por el clon de células T MS17:A3 es la región 133-144.

EJEMPLO 2C Investigación da la región 89-101 da la MBP Los inventores de la presente han demostrado ya que, a diferencia de otros epítopes de células T de la mielina, la administración del péptido 89-101 en forma soluble no previene la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) inducida por mielina entera o por el póptido 89-101 mismo (Anderton y Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28: 1251 ).

MBP 89-101 comprende tres epítopes de células T Para investigar la reactividad de las células T a la región 81-111 de MBP, se estimulan las células de los nódulos linfáticos de ratones estimulados con 81-111 con 81-111 in vitro y estas células son analizadas con un panel de póptidos 10-meros traslapados con dos desplazamientos de residuos que cubren la región 81-111 (es decir: 81-90, 83-92, 85-94, 87-96, 89-98, 91-100, 93-102, 95-104, 97-106, 99-108 y 101-111 ). El patrón de respuesta a los péptidos que cubren la 89-101 demuestra capacidad estimulante de los 5 póptidos adyacentes (N terminal 87-06 a 95-104), reflejando la presencia de por lo menos dos (y tal vez tres) epítopes diferenciados. Para investigar en más profundidad esta región, se generaron tres sublíneas a partir de la línea original de células T que respondían a 81-111 y se las volvió a analizar con un panel de póptidos 10-meros traslapados con un desplazamiento de residuos que cubría la región 84-106. Los resultados revelan la existencia de tres epítopes de células T diferenciados pero traslapados dentro de la secuencia 89-101 : 89-94, 92-98 y 95-101 (ver figura 8).

El péptido de MBP 92-98 es un epítope críptico Las tres líneas de células T de epítopes específicos (TCL) exhiben diferencias interesantes al analizarlas en cuanto a la reactividad del péptido 89-101 y la MBP recombinante entera. Las tres TCL responden al póptido (89-101) aunque sólo la TCL específica de 89-94 y 95-101 responde a la MBP entera. Esto indica que el procesamiento antigónico de la MBP intacta genera de modo preferencial ligandos para las células T que reconocen 89-94 y 95-101 pero no las que reconocen 92-98. Esto sugiere que el epitope 92-98 es críptico (es decir, que no puede generarse por el procesamiento del antígeno natural). Parece que el péptido de MBP 89-101 puede participar en tres interacciones diferentes con la molécula de MHC produciendo ligandos péptido/MHC que son reconocidos por tres poblaciones separadas de células T. Sin embargo, el procesamiento de MBP sólo genera ligandos para dos de estas poblaciones de células T (ver Fig. 8). La inducción de EAE requiere el reconocimiento por las células T de los epítopes autoantigénicos expresados en el SNC como resultado de la degradación de la MBP intacta. La inmunización de ratones con póptidos que comprenden sólo uno de los tres epítopes de células T antes identificados revela que sólo los que contienen un epitope procesado naturalmente (89-94 ó 95-101 ) tienen capacidad para inducir EAE. Esto también confirma el hallazgo de que 92-98 es un epitope críptico.

El péptido de MBP 92-98 es el epitope dominante de la región de MBP 89-101 Como se mencionó anteriormente, la región 89-101 contiene tres póptidos diferenciados pero traslapados. De éstos, el póptido 92-98 parece ser el dominante de esta región. Por ejemplo, cuando se generan clones de células T de ratones estimulados con el póptido 89-101 , los seis clones generados responden al 92-98. Utilizando los péptidos análogos de 89-101 que contienen sustituciones individuales de alanina en cada posición, se ha encontrado que la sustitución de cualquiera de las posiciones 92-98 lleva a una falta de capacidad de respuesta, demostrando que la alteración de cualquiera de los residuos dentro del núcleo 92-98 tiene fuertes efectos sobre el reconocimiento de este epítope.

El péptido de MBP 89-101 no confiere tolerancia a las células T correspondientes a EAE que reconocen un epítope naturalmente procesado de MBP Para resumir los hallazgos mencionados, los inventores de la presente han encontrado que a) la secuencia 89-101 tiene el potencial de generar 3 epítopes de células T diferenciados; b) sólo dos de estos epítopes (89-94 y 95-101 ) se generan por el procesamiento antigónico de MBP intacta (tanto ¡n vitro como in vivo); c) sólo los péptidos que contienen los epítopes naturalmente procesados y no los que contienen un epítope críptico son efectivos para la inducción de EAE; d) el péptido 89-101 no protege contra la EAE en experimentos con terapia peptídica. Esta información brinda una base para investigar la hipótesis de que el péptido 89-101 no confiere tolerancia contra la EAE por la incapacidad de ligarse directamente a las células T relevantes para la enfermedad. Para confirmar la hipótesis, el póptido (89-101) debe ser incapaz de inducir tolerancia para el epítope encefalitogónico mayor (89-94), ya que no se liga directamente al elemento de restricción del MHC (l-A8) en la conformación apropiada. En otras palabras, 89- 01 no actúa como epítope de las células T que responden a 89-94. A fin de evaluar esta posibilidad, se llevan a cabo experimentos con los péptidos 89-101 y 87-96 (Figs. 9 A & B). El péptido 87-96 contiene el epítope (89-94) muy eficaz para inducir la EAE. Ver a continuación el cuadro A y cuadro B.

CUADRO A CUADRO B Péptido Péptido para Péptido para Símbolo intraperitoneal estimulación memoria in vitro ? Ninguno 87-96 87-96 ? Ninguno 87-96 89-101 ? 89-101 87-96 87-96 • 89-101 87-96 89-101 Métodos Los ratones recibieron 200 µ9 del póptido en PBS o PBS solo por vía intraperitoneal los dfas -8, -6 y -4 antes de los 100 µg de póptido en adyuvante completo de Freund el día 0. Al cabo de 10 días, se cultivaron las células de nódulos linfáticos de drenaje (6 x 105 por pozo en medio X-Vivo 15 suplementado con 2-mercaptoetanol 5 x 10"5M y L-glutamina 2M con o sin antígeno por espacio de 72 horas. Los cultivos recibieron, durante las últimas 16 horas, pulsaciones de 0.5 µ de 3H-timidina y se midió la incorporación utilizando un contador de centelleo de líquido. Los resultados se expresan en términos de conteos medios por minuto por cultivos triplicados.

Resultados La estimulación con 87-96 indujo una fuerte respuesta de memoria para el mismo y una respuesta más débil a 89-101 (Fig. 9 A y B ? y o respectivamente, ver cuadros A y B). Esto concuerda con la necesidad del procesamiento antigónico para generar 89-94 a partir de 89-101. El uso de 87-96 como tolerógeno antes de la estimulación con 87-96 suprimió las respuestas de memoria tanto a 87-96 como a 89-101 (Fig. 9 A ¦ y ·, ver cuadro A). Esto coincide con las células T reactivas de 89-94, una vez que se las incapacita para responder in vivo, no pudiendo responder in vitro a 89-94 ya sea que hayan sido generadas a partir de 89-96 o de 89- 01. Sin embargo, lo crucial es que el uso de 89-101 como tolerógeno antes de la estimulación con 87-96 no pudo inhibir las respuestas e memoria a 87-96 o a 89-101 (Fig. 9 B A ¦ y ·, ver cuadros A y B). Estos datos demuestran que la administración del péptido 89-101 en forma tolerogónica no confiere tolerancia al epítope encefalitogénico naturalmente procesado basado en la secuencia 89-94; el péptido 89- 01 no puede comportarse como apítope del epítope 89-94. Sin que sea su deseo limitarse a teoría alguna, los inventores de la presente creen que se las observaciones se pueden explicar por la posición del péptido 89-101 en el sitio de unión de póptidos del MHC. Si el péptido se une de preferentemente de manera que la región 92-98 esté en el bolsón de unión de péptidos, luego éste será reconocido por las células T específicas de MBP92-98. Esto explicaría la razón por la cual, cuando se estimula a los ratones con el péptido MBP 89-101 , todos los clones de células T generados reconocen el epítope MBP92-98. De igual modo, cuando se utiliza 89-101 para conferir tolerancia a las células T, confiere tolerancia principalmente a las células que reconocen el epítope MBP 92-98. Si MBP92-98 es un epítope críptico, no es generado por el procesamiento natural del antígeno entero y las células T que reconocen este epítope probablemente no existan in vivo. Incluso en caso de existir las células T específicas de MBP92-98 in vivo, no serían relevantes a la enfermedad. Por ende, 89-101 no previene la EAE inducida con MBP entera.

EJEMPLO 3 Terapia peptfdica para un modelo de EM en ratones Los inventores de la presente han demostrado ya que una sola dosis de antígeno peptídico administrada sistémicamente ya sea por la vía peritoneal (Liu y Wraith (1995) Int Immunol 8: 1255-1263) o intranasal (Metzler y Wraith (1993) 5: 1 159-1165) protege con eficacia a los ratones de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) durante hasta tres meses (Metzler y Wraith (1999) Immunology 97: 257-263). Se requirieron por lo menos 5 dosis de péptido para inducir tolerancia en el ratón transgénico Tg4 (Burkhart y otros (1999) 1 1 : 1625-1634) que expresaba un receptor de células T específico de EAE (Liu y otros (1995) Immunity 3: 407-415). El reciente trabajo ha revelado que la vía intranasal (IN) es más segura que la vía intraperitoneal (IP) en el ratón Tg4, si bien ambos enfoques son igualmente seguros en el ratón no transgénico. Se analiza el péptido 83-99 en el ratón transgénico Fug/D6 que expresa tanto la molécula de MHC de clase II HLA-DR2 como un TCR de un clon de células T humanas específico para este péptido. Se trata a los ratones con péptido después de la dosis estándar utilizada para el tratamiento del ratón transgénico Tg4 (protocolo Tg4) o con el protocolo de desensibillzación por escalada de dosis del péptido utilizado en el tratamiento de pacientes que padecen alergia (protocolo de desensibilización).

Protocolo Tg4: Se trata a los ratones por administración intranasal del póptido 83-99 (4 mg/ml en solución salina regulada de fosfato (PBS)) o PBS solo en un volumen total de 25 µ?. Se trata a los ratones los días 1 y 5 de la semana durante 5 semanas, para dar un total de 10 dosis. Al comienzo de la semana 6 se inyecta a cada ratón el póptido 83-99 en Adyuvante Completo de Freund (ACF) y también se les aplica una inyección IP de la Toxina Pertussis (200 ng) el día 1 y 3. Se monitores el progreso de la EAE durante por lo menos 30 días. Protocolo de desensibilización: Se tratan grupos de ratones mediante la administración intranasal de una dosis en aumento del péptido 83-99 o PBS solo, en un volumen total de 25 µ?. La escalada de dosis se inicia con 0.1 µg y procede pasando por 1 , 3, 6, 12, 50 y luego tres veces 100 µ9. Se trata a los ratones los días 1 y 5 de la semana durante 5 semanas, para dar un total de 10 dosis. Al comienzo de la semana 6 se inyecta a cada ratón el póptido 83-99 en Adyuvante Completo de Freund (ACF) y también se les aplica una inyección IP de la Toxina Pertussis (200 ng) el día 1 y 3, Se monitorea el progreso de la EAE durante por lo menos 30 días.

EJEMPLO 4 Administración nasal de un cocktail de apítopes a pacientes con EM Se prepara una vacuna que comprende los péptidos de MBP 30-44, 83-99, 1 10-124 y 130-144 (es decir, algunos de los epítopes de MBP que han sido Identificados como apítopes). Se da la vacuna a treinta y cinco pacientes en un estudio de Fase la/Ib. El estudio es una sola prueba cruzada en la cual los pacientes permanecen sin tratamiento durante tres meses seguidos por una sola dosis del póptido (la). Luego se monitorea a los pacientes por espacio de tres meses después de la dosis única de la vacuna para evaluar la seguridad. El tratamiento consiste entonces en la administración dos veces por semana por aplicación intranasal. Para cada paciente, se analiza la actividad clínica mensualmente por imágenes de resonancia magnética; se monitorea la actividad inmunológica utilizando un ensayo de respuesta cinética para comprobar la proliferación y se monitorea la producción de citocinas utilizando un ELISA celular. En un principio la prueba incluye el tratamiento de 5 pacientes que sufren una enfermedad progresiva crónica (PC). Estos pacientes son seleccionados sobre la base de la baja reactividad de MRI y son tratados en primer lugar con la dosis más elevada de los péptidos. Se da comienzo al tratamiento en el grupo de pacientes con PC puesto que es más probable que demuestren los posibles efectos nocivos evidenciados por un aumento de la actividad de MRI. El tratamiento de los pacientes en remisión con recurrencia comienza una vez que queda claro que el tratamiento con una sola dosis y con múltiples dosis es seguro en el grupo con PC. Se recluta un grupo más grande de 30 pacientes en remisión con recurrencia sobre la base de su padecimiento de lesiones intensificadas de MRI durante un período de monitoreo de 3 meses. Estos se dividen en tres grupos a tratar con una dosis elevada, mediana o baja del péptido.

Tiempo (meses) Pacientes con Pacientes en remisión enfermedad progresiva con recurrencia (RR) crónica (PC) 0 Comienza el monitoreo mensual 3 Comienza la Fase la (dosis única del péptido) con MRI a 1-2 semanas después del tratamiento y monitoreo mensual 6 Comienza la Fase Ib Comienza el monitoreo (una dosis del péptido mensual y el dos veces por semana) reclutamiento de y continúa el monitoreo pacientes con lesiones mensual en aumento 9 Comienza la Fase Ib (una dosis del péptido dos veces por semana) y continúa el monitoreo mensual 12 Finaliza el tratamiento y continúa el monitoreo mensual durante 6 meses más 15 Finaliza el tratamiento y continúa el monitoreo mensual durante 6 meses más Abreviaturas: APC = células presentadoras de antígeno; MHC = complejo mayor de histocompatibilidad; TCR =receptor de células T; EAE = encefalomielitis autoinmune experimental; APITOPE = epítope independiente del procesamiento de antígenos; APIPS = sistema de presentación independiente del procesamiento de antígenos; aa = aminoácido; EM = Esclerosis Múltiple; MBP = protefna básica de mielina; PLP = proteína proteolipídica; TCL = línea de células T; TCC = clon de células T; PBMC = células mononucleares de sangre periférica; PPD = derivado proteico purificado de Mycobacterium tuberculosis; PHA= fitohemaglutinina. Los expertos en la técnica considerarán evidentes las diversas modificaciones y variaciones de los métodos y el sistema descritos de acuerdo con la presente invención. Si bien se ha descrito la invención en conexión con modalidades preferidas específicas, se ha de entender que la invención reivindicada no ha de limitarse indebidamente a dichas modalidades específicas. Por cierto, se pretende que la presente invención cubra las diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a la práctica la presente invención, que son evidentes para los expertos en química o biología o campos relacionados. Todas las publicaciones mencionadas en la especificación que antecede se incorporan a la presente como referencia.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> The University of Bristol 120> METODO DE SELECCIÓN DE PEPTIDOS <130> P9611WO LCH <140> PCT/GB01/03702 <141> 2001-08-17 <150> 0020618.5 <151> 2000-08-21 150> 0114547 151> 2001-06 <160> 11 <170> Patentln versión 3.0 <210> 1 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg Thr 1 5 10 15 Pro <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400=» 3 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Aap Glu Asn Pro Val Val Hls Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg 1 5 10 15 <210> 6 <211=- 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg Thr 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Arg Ala Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Qly Val 1 5 10 15 <210> T <211> 15 <212 PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Ser Asn Tvr Lva Ser Ala His Lvs Glv Phe Lvs Glv Val ABB <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ser Asp Tyr Lys Ser Ala His Lye Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala i 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Asp Tyr Lys Ser Ala His Lys Gly Phe Lys Gly Val Asp Ala Gln 1 5 10 15 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Val His Phe Phe Lys Asn lie Val Thr Pro Arg Thr Pro 1 5 10

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un método para seleccionar un péptido tolerogénico que comprende el paso de seleccionar un péptido con capacidad para unirse a una molécula de MHC de clase I o II sin más procesamiento. 2. - El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el péptido tiene capacidad para unirse a una molécula de MHC de clase II sin más procesamiento. 3. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el péptido es seleccionado entre una pluralidad de póptidos, cada uno de los cuales comprende un epítope de células T. 4. - El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque la pluralidad de péptidos es eluida de las moléculas de MHC de clase II de una célula presentadora de antígeno. 5. - El método de conformidad con la reivindicación 3 ó 4, caracterizado además porque cada péptido de la pluralidad de póptidos tiene capacidad para inducir una enfermedad asociada con el antígeno en un sujeto al ser administrada al sujeto con adyuvante. 6. - El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado además porque el péptido es seleccionado entre una serie anidada de péptidos truncados. 7. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado además porque el péptido comprende un epítope de células T y la presencia del epítope de células T se determina: (I) tratando: una muestra de células de un sujeto que padece la enfermedad, y una muestra de células de un sujeto que no tiene la enfermedad, con el péptido; y (ii) comparando las respuestas de las células T entre las muestras de células. 8. - El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado además porque comprende los siguientes pasos: (i) tratar un sistema de presentación independiente del procesamiento antigénico (APIPS) con un péptido; y (i) analizar la unión del péptido a las moléculas de MHC de clase I o II dentro del APIPS. 9. - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque se analiza la unión del péptido a las moléculas de MHC de clase I o II agregando células T y midiendo la activación de las células T. 10 - El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el APIPS comprende: (i) células presentadoras de antígeno fijadas; (ii) membranas lipídicas que comprenden moléculas de MHC de clase I o II; o (iii) moléculas de MHC de clase I o II adheridas a las placas. 11.- Un péptido seleccionado por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 12.- El péptido de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque es seleccionado entre los siguientes póptidos de proteína básica de mielina: 30-44, 80-94, 83-99, 81-95, 82-96, 83-97, 84-98, 110-124, 130-144, 131-145, 132-146 y 133-147. 13.- Una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de póptidos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12, en la cual cada péptido comprende un epítope de células T para la enfermedad. 14. - El uso de un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 12 para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de un trastorno de hipersensibilidad en un sujeto. 15. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde el péptido se selecciona mediante los siguientes pasos: (i) identificar un antígeno para la enfermedad; e (ii) identificar un apltope para el antígeno. 16.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 14 ó 15, en donde el medicamento que comprende el péptido o apítope es administrare en múltiples dosis. 17.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 14 a 16, en donde el medicamento que comprende el péptido o apítope es administrable por vía intranasal.