NO337988B1 - Tolerogent peptid, farmasøytisk preparat som omfatter det samme, samt dets anvendelse. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et tolerogent peptid, og dets anvendelse i behandling og/eller forebygging av multippel sklerose. Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et farmasøytisk preparat omfattende et tolerogent peptid, samt dets anvendelse.

I en adaptiv immunrespons erT lymfocytter i stand til å gjenkjenne interne epitoper i et proteinantigen. Antigenpresenterende celler (APC) tar opp proteinantigener og ned-bryter dem til korte peptidfragmenter. Et peptid kan binde til et major histocompatability complex (MHC) klasse I eller II molekyl inne i cellen og bæres til celleoverflaten. Når det presenteres ved celleoverflaten i forbindelse med et MHC-molekyl, kan peptidet gjenkjennes av en T-celle (via T-celle-reseptoren (TCR)), i hvilket tilfellet peptidet er en T-celle-epitop.

T-celle-epitoper spiller en sentral rolle i den adaptive immunrespons på et hvilket som helst antigen, hvorvidt det er likt eller fremmed. Den sentrale rollen som spilles av T-celle-epitoper i hypersensitivitetssykdommer (som inkluderer allergi, autoimmune sykdommer og transplantat-rejeksjon) er blitt vist gjennom anvendelsen av forsøksmodel-ler. Det er mulig å indusere inflammatoriske eller allergiske sykdommer ved injeksjon av syntetiske peptider (basert på strukturen av T-celle-epitoper) i kombinasjon med adjuvans.

I motsetning er det blitt vist at det er mulig å indusere immunologisk toleranse mot spesielle peptidepitoper ved administrering av peptidepitoper i oppløselig form. Administrering av oppløselige peptidantigener har blitt påvist som et effektivt middel for inhibering av sykdom i eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE - en modell for multippel sklerose — (MS)) (Metzler og Wraith (1993) Int. Immunol 5:1159-1165; Liu og Wraith (1995) Int. Immunol 7:1255-1265; Anderton og Wraith (1998) Eur. J. Immunol 28:1251-1261); og forsøksmodeller for artritt, diabetes og uveoretinitt (som redegjort for i Anderton og Wraith (1998) som angitt ovenfor). Dette er også blitt påvist som et middel for behandling av pågående sykdom i EAE (Anderton og Wraith

(1998) som angitt ovenfor).

WO 0011027 Al omhandler peptidanaloger av human myelin-basisprotein (MBP) som har en lengde på minst 7 aminosyrer og er avledet fra rester 83-89 i myelin-basisprotein. Analogene er endret fra den native sekvensen i minst posisjon 91, 95 eller 97. Ytterligere endringer kan gjøres i andre posisjoner.

US 5858980 A omhandler peptider som er forbundet med immundominerende områder av humant MBP.

WO 9632957 Al omhandler metoder og sammensetninger for å endre cytokinmønsteret til aktiverte autoreaktive T-celler, særlig inflammasjonsfremmende T-celler i pasienter som er rammet av en autoimmun sykdom, og for å svekke immunresponser forbundet med autoimmun sykdom.

WO 9813378 Al omhandler en metode for å øke opptaket av proteinantigen eller et peptid avledet derfra ved antigenpresenterende celler med en mannose- eller tilsvarende reseptor, hvor antigenet eller peptidet har minst en mannosegruppe.

Anvendelsen av tolerogene peptider til å behandle eller forebygge sykdom har vekket betydelig oppmerksomhet. En årsak til dette er at det er blitt vist at visse tolerogene epitoper kan nedregulere responser av T-celler for distinkte antigener innenfor det samme vevet. Dette fenomenet, kjent som "bystander suppression" betyr at det bør være mulig å indusere toleranse til mer enn en epitop (foretrukket alle epitoper) innenfor et gitt antigen, og til mer enn ett antigen for en gitt sykdom, ved anvendelse av et spesielt tolerogent peptid (Anderton og Wraith (1998) som angitt ovenfor).

Dette ville fjernet behovet for å identifisere alle de patogene antigener innenfor en spesiell sykdom.

Peptider er også et fordelaktig valg for terapi på grunn av deres relativt lave kostnad og det forhold at peptidanaloger kan produseres med endrede immunologisk egenskaper. Peptider kan således modifiseres til å endre deres interaksjoner med enten MHC eller TCR.

Et mulig problem med denne betraktningsmåten er at det er blitt vist at ikke alle peptider som virker som T-celle epitoper er i stand til å indusere toleranse. Myelin-basisprotein (MBP) peptid 89-101 er et immundominant antigen etter immunisering og er også et svært effektivt immunogen både hva angår priming for T-celle-reaktivitet og induksjon av EAE. Det er imidlertid blitt vist at dette peptidet er ineffektivt ved indusering av toleranse når det administreres i oppløsning (Anderton og Wraith (1998), som angitt ovenfor).

Et antall forklaringer for det observerte hierarki i evnen til T-celle-epitoper til å indusere toleranse har blitt foreslått (redegjort for i Anderton og Wraith (1998) som angitt ovenfor). Spesielt er det blitt foreslått at der er en korrelasjon mellom affiniteten til peptidet for MHC og tolerogeniteten (Liu og Wraith (1995) som angitt ovenfor), men dette overensstemmer ikke med enkelte av observasjonene. MBP[89-101] som ikke er tolerogent, binder f.eks. til I-As med relativt høy affinitet. Det er således ikke ukomplisert å forutsi hvilke peptider som vil indusere toleranse.

Hvis der var en rasjonell forklaring på hvorfor kun en andel av peptidepitoper er i stand til å indusere toleranse, ville dette forenkle seleksjonen av tolerogene peptider som er anvendbare i behandling og forebygging av hypersensitivitetssykdommer.

De foreliggende oppfinnere har vist at hvis en peptidepitop er av en passende størrelse til å presenteres ved umoden APC uten antigenbehandling, kan den indusere immunologisk toleranse. Den observasjon at noen T-celle-epitoper er tolerogene og andre er ute av stand til å indusere toleranse kan derfor forklares ved det forhold at noen epitoper krever ytterligere behandling før de er i stand til å presenteres av et MHC molekyl. Disse epitoper som krever ytterligere behandling induserer ikke toleranse når de administreres i en oppløselig form, på tross av deres kapasitet til å indusere sykdom når de injiseres i kombinasjon med adjuvans.

De epitoper som ikke krever ytterligere behandling er i stand til å indusere toleranse, og er blitt betegnet "apitoper" (Antigen Processing Independent epiTOPES) av oppfinnerne.

Dette funnet tilveiebringer en regelbasert metode for seleksjon av tolerogene T-celle-epitoper som fjerner behovet for å undersøke den tolerogene kapasiteten til et peptid in vivo. Dette er spesielt fordelaktig i utviklingen av strategier for å behandle eller forebygge sykdommer som det ikke er noen dyremodeller tilgjengelige for. Selv for sykdommer som har en dyremodell bør seleksjonsmetoden gjøre utviklingen av tole-ranseinduserende enklere og sikrere, fordi den tilveiebringer en mekanisme hvorved toleranseinduksjonskapasiteten til et peptid kan testes på humane T-celler (gjenkjennelse av antigen i forbindelse med humane MHC molekyler) in vitro, før deres anvendelse in vivo.

I et første aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse derfor et tolerogent peptid som er i stand til å binde til et MHC klasse I eller II molekyl uten ytterligere antigen behandling, som er selektert fra de følgende myelin-basisprotein (MBP) peptider: 30-44, 80-94, 83-99, 81-95, 84-98, 110-124, 130-144, 131-145, 132-146

og 133-147, for anvendelse i behandling og/eller forebygging av multippel sklerose.

Et antall metoder er kjent i teknikken for screening med hensyn på peptider som er i stand til å virke som T-celle-epitoper for et gitt antigen. Metoden vil derfor i alminne-lighet anvendes til å selektere et tolerogent peptid fra en flerhet av peptider som hver omfatter en T-celle-epitop.

For å undersøke hvorvidt et peptid er i stand til å binde til et MHC klasse I eller II molekyl uten ytterligere behandling, kan man undersøke kapasiteten til peptidet til å binde MHC klasse I eller II molekyler ved anvendelse av et "antigen processing independent presentation system" (antigenbehandlingsuavhengig presentasjonssystem)

(APIPS). Foretrukket omfatter metoden derfor de følgende trinn:

(i) behandling av et APIPS med et peptid,

(ii) analysering av binding av peptidet til MHC klasse I eller II molekyler innenfor

APIPS.

De foreliggende oppfinnere har allerede identifisert et antall apitoper for myelin-basisprotein, som er et autoantigen i multippel sklerose.

Det er kjent at noen peptider er i stand til å i indusere toleranse overfor andre epitoper fra det samme antigenet, og selv andre epitoper fra et distinkt antigen (ved fenomenet kjent som "bystander suppression"). De foreliggende oppfinnere forutsier imidlertid at for å tilstrekkelig undertrykke alle de autoreaktive T-celler, ville det være fordelaktig at en kombinasjon av forskjellige apitoper administreres til pasienten for å behandle/forebygge multippel slkerose. I et andre aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse derfor et farmasøytisk preparat omfattende en flerhet av peptider i samsvar med det første aspektet av oppfinnelsen, idet hvert peptid er basert på en T-celle-epitop.

I et tredje aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelse anvendelse av et peptid som angitt i krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for anvendelse i behandling og/eller forebygging av multippel sklerose.

En generell strategi for behandling og/eller forebygging av en sykdom i et individ kan omfatte de følgende trinn:

(i) identifisering av et antigen for sykdommen

(ii) identifisering av en apitop for antigenet,

(iii) administrering av apitopen til individet.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE.

Figur 1 viser et typisk eksempel på den kinetiske profilen til Mycobacterium tuberculosis renset proteinderivat (PPD, purified protein derivative PPD) og MBP i multippel sklerose (MS) pasienter og friske individer. Perifert blod-mononukleære celler (PBMC), isolert fra en MS pasient (A) og et normalt individ (B) testes med hensyn på deres evne til å proliferere i nærvær av PPD og helt MBP; den kinetiske profilen av den proliferative responsen på MBP sammenlignes med den av sekundært antigen PPD. Figur 2 er en tabell som oppsummerer PBMC responser på MBP og dets peptider i MS pasienter. Visse individer analyseres på tre separate tidspunkter, med en periode på omtrent 4 til 7 måneder mellom hvert tidspunkt. Figur 3 er en tabell som oppsummerer PBMC responser på MBP og MBP-peptider i friske individer. Mellom 4 og 7 måneder forløp mellom hvert tidspunkt. Figur 4 viser et eksempel på en MS pasient (MS 49) som responderer på multiple peptider ved 2 forskjellige tidspunkter, men for hvem gjenkjennelsesprofilen i løpet av det andre tidspunktet, målt 4 måneder senere, skiller seg betydelig. PBMC ble dyrket i nærvær av MBP og et panel av peptider som spenner over den fulle lengde av MBP, og proliferasjon ble målt ved 3H-thymidin-opptak. Den brede T-celle-proliferative respons observert ved det første tidspunktet var betydelig forskjellig fra responsen målt 7 måneder senere (andre tidspunkt). Figur 5 viser et eksempel på en pasient hvis brede epitoprespons (første tidspunkt) går tilbake (andre tidspunkt) og kommer til syne igjen over en tolv måneders periode (tredje tidspunkt). Figur 6 viser et kart over den fine spesifisiteten av peptidregionene identifisert i den kinetiske responsanalysen som oppnås gjennom anvendelsen av TCC frembrakt fra MS pasienter og friske individer. Mesteparten av peptidene anvendt i screeningsanalyser er 15-mer lange, noen få er imidlertid 10-mer, og 1 peptid er 17-mer. Spesifisiteten av hver TCC testes minst 2 ganger. Figur 7a er en tabell som viser karakteriseringen av T-celle-epitoper innenfor myelin-basisprotein gjenkjent av T lymfocytter fra MS pasienter. Figur 7b er en tabell som viser at alle T-celle-epitoper ikke nødvendigvis presenteres av fikserte APC og derfor ikke apitoper. Figurer 8 og 9 viser presenteringen av forskjellige MBP peptider til T-celle-kloner ved levende og fiksert APC. Fig. 8A-30-44, fig. 8B-110-124, fig. 9A-130-144, fig. 9B-156-170. Figur 10 er en tabell som viser topp-stimmuleringsindeks (SI) verdier til MBP og MBP-peptider i MS pasienter oppnådd på tre separate tidspunkter. Prøver for det andre tidspunktet ble samlet 4-8 måneder etter det 1. tidspunktet, og prøver for det 3. tidspunktet ble oppnådd 35 måneder etter det andre tidspunktet. Bakgrunns-cpm ble målt for hver dag og varierte mellom 80-700 cpm; en positiv respons (halvfet skrift) ble definert i overensstemmelse med SI>3 og 5cpm>1000. (Det var ikke mulig å samle prøver for alle tre tidspunktene fra pasienter MS19 og MS67). Figur 11 er en tabell som viser topp-stimmuleringsindeks (SI) verdier til MBP og MBP-peptider i friske individer. Bakgrunns-cpm ble målt for hver dag og varierte mellom 80-700 cpm; en positiv respons (halvfet skrift) ble definert i overensstemmelse med SI>3 og dcpm>1000. Figur 12 viser responsen av T-celler isolert fra en DR:2MBP82-100 transgen mus på presentering av nestede MBP peptider i regionen 77-100 ved APC. Figur 13 viser responsen av T-celle klon MS17:A3 på presentering av nestede MBP peptider i regionen 125-148 ved APC. Figur 14 er en illustrering av T-celle epitop-gjenkjennelse innefor MBP 89-101 sekvensen. Der er tre distinkte men overlappende T-celle-epitoper innenfor sekvensen: 89-94, 92-98 og 95-101. Potensialet for spalting mellom rester 94 og 95 ved virkningen av asparginylendoepetidase (AEP) er vist. Figur 15 viser kapasiteten til MBP peptider 87-96 (A) og 89-101 (B) til å virke som en apitop for T-celler som responderer på 89-94 epitopen.

En metode for selektering av et tolerogent peptid er beskrevet.

Toleranse

Som anvendt heri, betyr betegnelsen "tolerogen(t)" å være i stand til å indusere toleranse.

Toleranse er den manglende evne til å respondere på et antigen. Toleranse overfor selv-antigener er et essensielt trekk ved immunsystemet, når dette tapes kan autoimmun sykdom bli resultatet. Det adaptive immunsystem må opprettholde kapasiteten til å respondere på et enormt mangfold av infeksiøse midler mens det unngår autoimmunt angrep av selv-antigenene inneholdt innenfor sine egne vev. Dette kontrolleres i stor grad ved sensitiviteten av umodne T lymfocytter overfor apoptotisk celledød i thymus (sentraltoleranse). Ikke alle selv-antigener detekteres imidlertid i thymus, slik at død av selv-reaktive thymocytter forblir ufullstendig. Der er således også mekanismer hvorved toleranse kan erverves ved modne selv-reaktive T lymfocytter i de perifere vev (perifer toleranse). En oversikt over mekanismene for sentral og perifer toleranse er gitt i Anderton et al (1999) (Immunological Reviews 169:123-137).

Toleranse kan resultere fra eller karakteriseres ved induksjonen av anergi i minst en del av CD4+ T-celler. For å aktivere en T-celle, må et peptid assosiere med en "profesjonell" APC som er i stand til å levere to signaler til T-celler. Det første signalet (signal 1) leveres av MHC-peptid-komplekset på celleoverflaten av APC og mottas av T-cellen via TCR. Det andre signalet (signal 2) leveres av ko-stimulerende molekyler på overflaten av APC, slik som CD80 og CD86, og mottas av CD28 på overflaten av T-cellen. Det menes at når en T-celle mottar signal 1 i fravær av signal 2, aktiveres den ikke og blir faktisk anergisk. Anergiske T-celler er motstandsdyktige overfor etterfølg-ende antigen-utfordring, og kan være i stand til å undertrykke andre immunresponser. Anergiske T-celler menes å være involvert i mediering av T-celle-toleranse.

Uten ønske om å bindes av noen teori, forutsier de foreliggende oppfinnere at peptider som krever behandling før de kan presenteres i forbindelse med MHC molekyler ikke induserer toleranse fordi de må håndteres av modne antigenpresenterende celler. Modne antigenpresenterende celler (slik som makrofager, B-celler og dendritiske celler) er i stand til antigenbehandling, men også levering av begge signaler 1 og 2 til en

T-celle, hvilket fører til T-celle-aktivering. Apitoper vil på den annen side være i stand til å binde klasse II MHC på umodne APC. De vil således presenteres overfor T-celler uten kostimmulering, hvilket fører til T-celle-anergi og -toleranse.

Apitoper er naturligvis også i stand til å binde til MHC molekyler ved celleoverflaten av modne APC. Immunsystemet inneholder imidlertid en større rikelighet av umodne enn modne APC (det er blitt foreslått at mindre enn 10% av dendrittiske celler aktiveres, Summers et al. (2001) Am. J. Pathol. 159:285-295). Standardposisjonen til en apitop vil derfor være anergi/toleranse, snarere enn aktivering.

Det er blitt vist at når toleranse induseres ved peptidinhalasjon, reduseres kapasiteten til antigenspesifikke CD4+ T-celler til å proliferere. Videre nedreguleres produksjonen av IL-2, IFN-y og IL-4 i disse cellene, men produksjon av IL-10 økes. Nøytralisering av IL-10 i mus i en tilstand av peptidindusert toleranse er blitt vist og fullstendig gjen-opprette mottagelig het overfor sykdom. Det har blitt foreslått at en populasjon av regulerende celler fastholder den tolerante tilstand som produserer IL-10 og medierer immunregulering (Burkhart et al (1999) Int. Immunol. 11:1625-1634).

Induksjonen av toleranse kan derfor overvåkes ved hjelp av forskjellige teknikker inkluderende: (a) redusert mottagelighet overfor å pådra seg sykdommen for hvilket peptidet er en

mål-epitop in vivo;

(b) induksjonen av anergi i CD4+ T-celler (som kan detekteres ved etterfølgende

utfordring med antigen in vitro) ;

(c) forandringer i CD4+ T-celle-populasjonen, inkluderende

(i) reduksjon i proliferasjon,

(ii) nedregulering i produksjonen av IL-2, IFN-y og IL4, og

(iii) økning i produksjonen av IL-10.

" Antigen Processing Independent Epitopes" ( Antigenbehandlingsuavhengige epitoper)

( APITOPER)

Metoden omfatter trinnet med selektering av et peptid som er i stand til å binde til et MHC klasse I eller II protein uten ytterligere behandling. Slike peptider er kjent heri som "apitoper" (Antigen Processing Independent epiTOPES).

Celleoverflatepresentering av peptider avledet fra et gitt antigen er ikke vilkårlig og har en tendens til å dominere av et lite antall av hyppig forekommende epitoper. Dominansen av et spesielt peptid vil avhenge av mange faktorer, slik som relativ affinitet for binding av MHC molekylet, rom/tid-frembringelsespunkt innenfor APC og resistens overfor nedbrytning. Epitophierarkiet for et antigen kan forandre seg med progresjon av en immunrespons, som har viktige implikasjoner for selvtoleranse og autoimmunitet. Immundominerende determinante regioner er sannsynligvis gode tolerogener. I en foretrukket utførelsesform er apitopen i henhold til den foreliggende oppfinnelse således basert på en dominant epitop.

Etter en primær immunrespons på de immundominante peptider, kan imidlertid epitop-"spredning" forekomme for sub-dominante determinanter (Lehmann et al

(1992) Nature 358:155-157). Presentering av sub-dominante epitoper kan være viktig ved utløsning av a uto immunitet. Apitopen i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan derfor være basert på en sub-dominant epitop.

For et hvilket som helst gitt antigen kan kryptiske epitoper også foreligge. Kryptiske epitoper er slike som kan stimulere en T-celle-respons når administrert som et peptid men som ikke greier å produsere en slik respons når administrert som et helt antigen. Det kan være at den kryptiske epitop ødelegges under behandling av antigenet til peptidet i APC. De foreliggende oppfinnere har vist at peptid 92-98 er en kryptisk epitop for MBP (eksempel 2C). Det er interessant at der er et antatt spaltingssete for asparaginylendopeptidase innenfor denne peptidregionen, hvilket kan bety at under naturlig behandling blir ingen peptider inneholdende denne regionen frembrakt av

APC.

Et kryptisk epitop kan virke som en apitop in vitro, ved at den kan være i stand til å binde til et MHC molekyl uten ytterligere behandling, og å indusere anergi i en T-celle som gjenkjenner den kryptiske epitop. Det ville imidlertid ikke være sannsynlig at en slik apitop er terapeutisk anvendbar fordi den bør være ute av stand til å tolerere T-celler som gjenkjenner en naturlig behandlet epitop av antigenet.

Epitoper for et antigen kan identifiseres ved å måle T-celle-responsen til overlappende peptider som spenner over hele antigenet (se nedenfor) når presentert av APC. Slike undersøkelser resulterer vanligvis i "nestede sett" av peptider, og den minimale epitop for en spesiell T-celle-linje/klon kan vurderes ved å måle responsen på trunkerte peptider.

Det kan ikke antas at en minimal epitop av et antigen vil oppføre seg som en apitop. Det kan godt være at aminosyrer som flankerer den minimale epitop vil være nødvendig for optimal binding til MHC. Apitopen bør være utformet til å dekke den mulighet at der kan være hårfine forskjeller mellom de minimale epitoper av forskjellige T-celle-kloner.

Det skal fremheves at det ikke er sikkert at det er mulig å identifisere en apitop for alle epitoper. Der er tydelige tegn på at noen epitoper binder MHC på en måte som er avhengig av MHC-lasting i endosomer og således krever behandling (Viner et al (1995) Proe. Nati. Acad. Sei. 92:2214-2218). Dette er en annen årsak til at man ikke kan anta at hver minimal epitop uunngåelig vil oppføre seg som en apitop.

Identifisering av peptider inneholdende T- celle epitoper

Der er et antall metoder som er kjent i teknikken for å identifisere T-celle-epitopene innefor et gitt antigen.

Naturlig behandlede epitoper kan identifiseres ved massespektrofotometrisk analyse av peptider eluert fra antigen-lastet APC. Disse er APC som enten er blitt ansporet til å oppta antigen, eller er blitt tvunget til å produsere proteinet intracellulært ved trans-formasjon med det passende gen. APC inkuberes typisk med protein enten i oppløs-ning eller passende targetert til APC celleoverflaten. Etter inkubering ved 37°C lyseres cellene i detergent og klasse II proteinet renses ved f.eks. affinitetskromatografi. Behandling av det rensede MHC med et passende kjemisk medium (f.eks. sure beting-elser) resulterer i elueringen av peptider fra MHC. Denne oppsamlingen av peptider separeres og profilen sammenlignes med peptid fra kontroll-APC behandlet på den samme måten. Toppene som er unike for de proteinuttrykkende/tilførte celler analyseres (f.eks. ved masse spektrometri) og peptidfragmentene identifiseres. Denne prosedyren frembringer vanligvis informasjon om omfanget av peptider (vanligvis funnet i "nestede sett") frembrakt fra et spesielt antigen ved antigenbehandling.

En annen metode for identifisering av epitoper er å screene et syntetisk bibliotek over peptider som overlapper og spenner over lengden av antigenet i en in vitro analyse. Det kan f.eks. anvendes peptider som er 15 aminosyrer lange og som overlapper med 5 eller 10 aminosyrer. Peptidene testes i et antigenpresenteringssystem som omfatter antigenpresenterende celler og T-celler. Antigenpresenteringssystemet kan f.eks. være en murin splenocytt-fremstilling, en fremstilling av humane celler fra tonsill eller PBMC. Alternativt, kan antigenpresenteringssystemet omfatte en spesiell T-celle-linje/klon og/eller en spesiell antigenpresenterende celletype.

T-celle aktivering kan måles via T-celle proliferasjon (f.eks. ved anvendelse av<3>H-thymidin-innlemmelse) eller cytokinproduksjon. Aktivering av THl-type CD4+ T-celler kan f.eks. detekteres via IFNy produksjon som kan detekteres ved hjelp av standard-teknikker, slik som en ELISPOT analyse.

Undersøkelser vedrørende overlappende peptid indikerer vanligvis det området av antigenet hvori en epitop er lokalisert. Den minimale epitop for en spesiell T-celle kan deretter vurderes ved å måle responsen på trunkerte peptider. Hvis det f.eks. oppnås en respons på peptidet omfattende rester 1-15 i overlappingsbiblioteket, kan det anvendes sett som er trunkert i begge ender (dvs. 1-14, 1-13, 1-12 etc. og 2-15, 3-15, 4-15, etc.) til å identifisere den minimale epitop.

Identifiseringen av immundominerende regioner av et antigen ved anvendelse av in vitro analyse (spesielt slike som anvender T-celle-linjer) er av de foreliggende oppfinnere forutsagt å presentere et skjevt mønster av peptidreaktivitet. I undersøkelsen med hensyn på å identifisere MBP epitoper som er beskrevet i eksemplene, anvender de en kinetisk responsanalyse hvori proliferasjonen av PBMC fra MS pasienter og friske individer måles mot et bibliotek over overlappende peptider. Denne analysen er basert på det funnet at selv om T-celler fra normale individer og MS pasienter reponderer på lignende måte på renset proteinantigen, så responderer de på en forskjellig måte på peptider basert på sekvensen av MBP. T-celler fra MS pasienter responderer med høyere størrelsesorden og hurtigere kinetikk på peptidantigener når sammenlignet med normale friske donorer. Dette muliggjør screening for og identifisering av epitopen som den spesielle pasienten responderer på ved et spesielt tidspunkt. I undersøkelsen beskrevet heri har denne fremgangsmåten åpenbart et antall epitop-inneholdende regioner som ikke ble identifisert ved anvendelse av standard-teknikker. Dessuten er det vist at T-celle-gjenkjennelse utviser et cyklisk mønster, som viser seg på et tidspunkt, går tilbake, og kommer deretter til syne igjen på et senere tidspunkt.

Den kinetiske analysen beskrevet av oppfinnerne tilveiebringer et verdifullt verktøy fordi den åpenbarer den epitop som en pasient responderer på ved på et spesielt tidspunkt. Denne informasjonen kan anvendes til å spesialtilpasse en fremgangsmåte for administrering av terapeutisk apitop for en spesiell pasient ved identifisering og administrering av en apitop for den relevante epitop (hvis der er en). Denne informasjonen kan også gjøre det mulig å trekke opp et generelt mønster for sykdomsprogre-sjon, slik at det terapeutiske preparatet kan utformes til å inkludere apitoper til epitopene som det er sannsynlig at er tilstede ved et gitt stadium under sykdommen.

" Antigen Processing Independent Presentation Systems"

( Antigenbehandlingsuavhengige presenteringssystemer) ( APIPS)

Så snart en epitop er blitt identifisert, er det neste trinnet å undersøke hvorvidt det også oppfører seg som en apitop.

En apitop må presenteres for T-celler uten behov for antigenbehandling. Når peptider inneholdende T-celle-epitoper er identifisert, kan apitoper identifiseres ved anvendelse av et behandlingsfritt system. Trunkerte peptider og peptidanaloger kan testes for aktivering ved anvendelse av et antigenbehandlingsuavhengig presenteringssystem

(APIPS).

Eksempler på APIPS inkluderer:

a) fiksert APC (med eller uten antistoffer til CD28),

b) Lipid-membraner inneholdende klasse I eller II MHC molekyler (med eller uten antistoffer til CD28), og c) renset naturlig eller rekombinant MHC i plate-bundet form (med eller uten antistoffer til CD28).

Det er kjent å anvende fiksert APC til å undersøke T-celle-responser, f.eks. i studier for å undersøke den minimale epitop innenfor et polypeptid, ved måling av responsen på trunkerte peptider (Fairchild et al (1996) Int. Immunol 8:1035-1043). APC kan fikseres ved anvendelse av f.eks. formaldehyd (vanligvis paraformaldehyd) eller glutar-aldehyd.

Lipidmembraner (som kan være plane membraner eller liposomer) kan fremstilles ved anvendelse av kunstige lipider eller kan være plasmamembran/mikrosomale fraksjoner fra APC.

I bruk kan APIPS anvendes i brønnene til en vevskulturplate. Peptidantigener tilsettes deretter og binding av peptidet til MHC-delen av APIPS detekteres ved tilsetning av selekterte T-celle-linjer eller -kloner. Aktivering av T-celle-linjen eller -klonen kan måles ved hjelp av en hvilken som helst av metodene som er kjent i teknikken, f.eks. via<3>H-thymidin-innlemmelse eller cytokinutskillelse.

Peptider

Oppfinnelsen vedrører som nevnt et peptid for anvendelse i behandling og/eller forebygging av multippel sklerose.

Betegnelsen "peptid" anvendes i den normale oppfatning til å bety en serie av rester, typisk L-aminosyrer, forbundet med hverandre typisk gjennom peptidbindinger mellom a-aminogruppene og karboksylgruppene til nabo-aminosyrer. Betegnelsen inkluderer modifiserte peptider og syntetiske peptidanaloger.

Et peptid for anvendelse i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan ha en hvilken som helst lengde som er i stand til å binde til et MHC klasse I eller II molekyl uten ytterligere behandling.

Peptider som binder til MHC klasse I molekyler er typisk 7 til 13, mer vanlig 8 til 10 aminosyrer lange. Bindingen av peptidet stabiliseres ved dets to ender ved kontakter mellom atomer i hovedkjeden til peptidet og invariante seter i peptidbindings- fordypningen til alle MHC klasse I molekyler. Der er invariante seter i begge ender av fordypningen som binder amino- og karboksy-endepunktene til peptidet. Variasjoner i peptidlengde tilpasses ved hjelp av en bukting i peptidryggraden, ofte ved prolin- eller glycinrester som tillater den påkrevde fleksibilitet.

Peptider som binder til MHC klasse II molekyler er typisk mellom 8 og 20 aminosyrer

lange, mer vanlig mellom 10 og 17 aminosyrer lange, og kan være mye lenger. Disse peptidene ligger i en forlenget konformasjon langs MHC II peptidbindings-fordypningen som (til forskjell fra MHC klasse I peptidbindings-fordypningen) er åpen i begge ender. Peptidet holdes på plass hovedsakelig ved hovedkjedeatom-kontakter med bevarte rester som fyller peptidbindings-fordypningen.

Peptidet for anvendelse i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan dannes ved anvendelse av kjemiske metoder (Peptide Chemistry, A practical Textbook. Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin). Peptider kan f.eks. syntetiseres ved hjelp av fastfase-teknikker (Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204), spaltes fra harpiksen, og renses ved preparativ høyytelsesvæskekromatografi (f.eks. Creighton

(1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and CO, New York NY). Automatisert syntese kan oppnås f.eks. ved å anvende ABI 43 1 A Peptide Synthesizer (Perkin Eimer) i overensstemmelse med instruksjonene gitt av produsenten.

Peptidet kan alternativt dannes ved hjelp av rekombinante metoder, eller ved spalting fra et lengre polypeptid. Peptidet kan f.eks. oppnås ved spalting fra target-antigenet. Sammensetningen av et peptid kan bekreftes ved aminosyreanalyse eller sekvensering (f.eks. Edman-nedbrytningsprosedyren).

I en foretrukket utførelsesform kan peptidet avledes fra et mål-antigen. Et mål-antigen er et molekyl (f.eks. et protein eller glykoprotein) som behandles av APC og gjenkjennes av T-celler av forløpet av sykdommen. Mål-antigenet vil naturligvis avhenge av målsykdommen. Peptidet kan foretrukket avledes fra et fragment av antigenet som oppstår ved naturlig behandling av antigenet ved en APC.

For praktiske formål er der forskjellige andre egenskaper som peptidet bør utvise. F.eks. bør peptidet være oppløselig ved en konsentrasjon som tillater dets anvendelse in vivo. Peptidet bør foretrukket være oppløselig ved konsentrasjoner på opptil 0,5 mg/ml, mer foretrukket bør peptidet være oppløselig ved konsentrasjoner opptil 1 mg/ml, og mest foretrukket bør peptidet være oppløselig ved konsentrasjoner opptil 5 mg/ml.

For intranasal administrering er det maksimale volum av dose som kan tas opp ved anvendelse av aktuelle prosedyrer omtrent 200 pl pr. nesebor. Hvis peptidet er opp-løselig ved 1 mg/ml, gjør en dobbelt dose til hvert nesebor det mulig å gi 800 ug til pasienten. Det er uvanlig å gi mer enn 50 mg i en hvilken som helst individuell dose.

Det er også viktig at peptidet er tilstrekkelig stabilt in vivo til å være terapeutisk anvendbart. De foreliggende oppfinnere har funnet at in vivo 30 minutter etter administrering faller den totale mengde av et testpeptid til omtrent 50%, 4 timer etter administrering faller mengden til omtrent 30%, men at etter 5 døgn er peptidet fremdeles detekterbart (ved omtrent 5%). Halveringstiden av peptidet in vivo bør være minst 10 minutter, foretrukket minst 30 minutter, mer foretrukket minst 4 timer og mest foretrukket minst 24 timer.

De foreliggende oppfinnere har funnet at etter intranasal administrering når mengden av peptid i den drenerende lymfekjertel en topp ved omtrent 4 timer etter administrering, idet peptidet imidlertid fremdeles er detekterbart (ved nivåer på omtrent 5% maksimum) etter 5 døgn. Peptidet er foretrukket tilstrekkelig stabilt til å være tilstede ved en terapeutisk aktiv konsentrasjon i den drenerende lymfekjertel lenge nok til å utøve en terapeutisk effekt.

Peptidet bør også vise god biotilgjengelighet in vivo. Peptidet bør opprettholde en konformasjon in vivo som gjør det mulig at det kan binde til et MHC molekyl ved celleoverflaten uten ventet hindring.

Målsykdommer

Det er sannsynlig at en apitop for MHC klasse II er spesielt anvendbar i sykdommer som medieres av CD4+ T-celle-responser, f.eks. sykdommer som er etablert eller opprettholdt av en uhensiktsmessig eller overdreven CD4+T-celle-respons.

Peptidet er for anvendelse i behandlingen og/eller forebyggingen av multippel sklerose (MS). Multippel sklerose (MS) er en kronisk inflammatorisk sykdom som kjennetegnes ved multiple demyeliniserende lesjoner som er dissiminert gjennom hele den CNS hvite substans og forekommer ved forskjellige steder og tidspunkter (McFarlin og McFarland, 1982 New England J. Medicine 307:1183-1188 og 1246-1251). MS menes å medieres av autoreaktive T-celler.

Peptidet kan være avledbart fra et av autoantigener, særlig myelin-basisprotein (MBP) eller proteolipid-protein (PLP). MBP er muligens mer formålstjenlig enn PLP, fordi PLP er svært hydrofobt og peptider avledet fra dette har en tendens til å klumpe seg sammen. MBP er immunogent og MBP-spesifikke T-lymfocytter har encefalittogenisk aktivitet i dyr (Segal et al, 1994 J. Neuroimmunol 51:7-19, Voskuhl et al, 1993 J. Neuroimmunol 42:187-192, Zamvil et al, 1985 Nature 317:355-8).

Apitoper for MHC klasse I kan anvendes f.eks. til å modifisere anti-virale CD8+responser på en tolerogen måte.

Farmasøytisk preparat

De foreliggende oppfinnere forutsier at det på tross av "bystander suppresjon" kan være nødvendig å targetere et antall forskjellig T-celle-kloner for å indusere toleranse på en effektiv måte. Et flertall peptider kan således administreres til et individ for å forebygge eller behandle en sykdom.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et farmasøytisk preparat for behandling og/eller forebygging av multippel sklerose, hvor preparatet omfatter et peptid som angitt i krav 1.

I en utførelsesform av oppfinnelsen omfatter det farmasøytiske preparat et flertall av de tolerogene MBP peptider som angitt i krav 1.

Det farmasøytiske preparatet kan f.eks. omfatte mellom 2 og 50 apitoper, foretrukket mellom 2 og 15 apitoper. Apitopene kan være avledbare fra det (de) samme eller forskjellig(e) målantigen(er). Apitopen er foretrukket enten alle i stand til å binde til MHC klass I, eller alle i stand til å binde MHC klasse II, uten ytterligere behandling. I

en foretrukket utførelsesform er alle apitopene i det farmasøytiske preparatet enten i stand til å binde til MHC klasse I eller klasse II uten ytterligere behandling.

Det farmasøytiske preparatet kan være i form av et sett, hvori noen eller hver av apitopene er tilveiebrakt separat for samtidig, separat eller sekvensiell administrering.

Alternativt (eller i tillegg) hvis det farmasøytiske preparatet (eller en hvilken som helst del derav) skal administreres i multiple doser, kan hver dose være pakket separat.

Det farmasøytiske preparatet kan omfatte en terapeutisk eller profylaktisk effektiv mengde av apitopen eller av hver apitop og eventuelt en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel eller eksipiens.

I de farmasøytiske preparatene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan apitopen eller hver apitop videre være blandet med hvilket eller hvilke som helst egnede binde-midler, smøremidler, suspensjonsmidler, belegningsmidler eller solubiliseringsmidler.

Administrering

Peptidet bør administreres i oppløselig form i fravær av adjuvans.

Peptidet administreres foretrukket ved en mukosal rute.

Studier har vist at et peptid, når det i oppløselig form gis intraperitonealt (i.p.), intra-venøst (i.v.) eller intranasalt (i.n.) eller oralt kan indusere T-celle-toleranse (Anderton og Wraith (1998) som angitt ovenfor; Liu og Wraith (1995) som angitt ovenfor, Metzler og Wraith (1999) Immunology 97:257-263).

Peptidet administreres foretrukket intranasalt.

Studier i mus har vist at varigheten av peptidadministrering som er påkrevet for å

indusere toleranse avhenger av forløperhyppigheten av T-celler i recipienten (Burkhart et al (1999) som angitt ovenfor). I mange forsøksstudier er det blitt vist at gjentatte doser av peptid er påkrevet for å indusere toleranse (Burkhart et al (1999) som angitt ovenfor). Den nøyaktige dose og antall doser av peptid vil derfor avhenge av individet, idet et flertall doser imidlertid administreres i en foretrukket utførelsesform.

Hvis et flertall peptider administreres samtidig, kan de være i form av en "cocktail" som er egnet for administrering i enkle eller multiple doser. Alternativt kan det være foretrukket å gi multiple doser men variere de relative konsentrasjoner av peptidene mellom doser.

I en foretrukket utførelsesform kan det følges en "doseeskaleringsprosedyre", hvor et flertall doser gis til pasienten i stigende konsentrasjoner. En slik fremgangsmåte er f.eks. blitt anvendt for fosfolipase A2 peptider i immunterapeutiske anvendelser mot biegiftallergi (Muller et al (1998) J. Allergy Clin Immunol 101:747-754 og Akdis et al

(1998) J. Clin Invest 102:98-106).

EKSEMPLER

De etterfølgende eksempler tjener til å belyse den foreliggende oppfinnelse. Oppfinnelsen vedrører spesielt de spesifikke utførelsesformer som er beskrevet i disse eksemplene.

EKSEMPEL 1 - identifisering av T-celle-epitoper i MBP

Materialer og metoder

Anti<g>ener

Humant MBP fremstilles fra hvit hjernesubstans som beskrevet av Deibler et al.

(Deibler et al, 1972 Preparative Biochemistry 2:139), og dens renhet vurderes ved hjelp av SDS-PAGE. MBP og Mycobacterium tuberculosis renset proteinderivat (PPD, purified protein derivative) (UK Central Veterinary Laboratory, Surrey) anvendes i proliferative analyser ved tidligere bestemte optimale konsentrasjoner; den optimale konsentrasjonen for hvert antigen er 50 ug/ml. Et panel av 15-mer overlappende peptider som spenner over hele MBP molekylet syntetiseres ved anvendelse av standard F-moc kjemi på en Abimed AMS 422 multippel peptid syntetiserings-innretning (Abimed, Langenfeld, Tyskland). Hvert peptid deplasseres av 5 aa og overlappes av 10 aa. Det produseres 33 peptider som skal samles i grupper på 3 og samlingene testes ved den optimale konsentrasjonen på 50 ug/ml, slik at hvert peptid in vitro er tilstede ved en konsentrasjon på 16,6 ug/ml.

Pasienter og kontrollindivider

Individene i denne undersøkelsen består av 12 pasienter med klinisk bestemt eller

laboratorieunderstøttet bestemt MS (Poser et al, 1983), med en alder som varierer fra 29-51 år. Åtte av de 12 pasientene er involvert i et forsøk med interferon-p, ellers har alle andre MS pasienter ikke mottatt noen kortikosteroidbehandling i de siste 3 måned-ene før igangsettelsen av undersøkelsen. Kontrollgruppen bestod av 13 friske individer med en alder som varierer fra 25-55 år, og ingen hadde mottatt immunundertrykkende terapi i minst 3 måneder før blodprøven ble tatt.

Vevskulturmedium

RPMI-1640 medium supplert med 20 mM HEPES (Sigma, Poole, UK), penicillin (100U/ml), streptomycinsulfat (100 mg/ml), og 4 mM L-glutamin (alle fra Life Technologies, Paisley, Scotland), anvendes som vevskulturmediet. Medium uten serum anvendes for vasking av lymfoidceller og TCL. For alle dyrkingsbetingelser og analyser suppleres mediet med 10% varme-inaktivert autologt plasma.

Dyrkingsbetingelser og T- celle- proliferative analyser

Citratbehandlet perifert blod (50-100 ml) samles ved venepunktering fra hvert individ etter opplyst skriftlig samtykke var blitt anskaffet. Perifert blod-mononukleære celler (PBMC) isoleres fra blod ved densitetssentrifugering på Histopaqe-1077 (Sigma, Poole, UK), og dyrkes i 1,5 ml volumer i 24-brønns vevskulturplater (Nunc International, Costar, Corning Inc. New York, USA) ved en konsentrasjon på lxlO<6>celler pr. ml, inneholdende enten PPD, MBP eller peptider av MBP. Platene inkuberes ved 37°C i en fuktet atmosfære av 5% C02/95% luft. Mellom dagene 5 og 14 trekkes duplikate prøvemengder på 100 pl ut fra hver kultur, overføres til en 96-brønns rundbunnet mikrotitre plate og pulseres med 0,4 uCi[<3>H]-Thymidine (Amersham International, Amersham, UK). Etter 18 timer høstes cellene på glassfibermatter (LKB-Wallac, Turku, Finland) ved anvendelse av en Mach 111 høsteinnretning 96 (Tomtec, Orange, New Jersey, USA). [<3>H]-Thymidine-innlemmelse bestemmes ved anvendelse av en mikrobeta væskescintillasjonsteller (LKB-Wallac). Testbrønner inneholdende antigen anses positive når 5CPM>1000 og stimmuleringsindeksen (SI)>3, hvor SI = CPM antigen-inneholdende kultur/CPM-kultur uten antigen.

Frembringelse av T- celle- linier oa T- celle- kloner

MBP-spesifikke T-celle-linjer (TCL) frembringes fra 8 MS-pasienter og 2 friske kontroll-donorer. PBMC fra hvert individ separeres som beskrevet ovenfor og utelates ved lxlO<6>celler/ml i 6-brønns plater i nærvær av MBP (50 ug/ml); en porsjon PBMC fra hvert individ nedfryses regelmessig og lagres for senere re-stimuleringer. Syv dager senere tilføres cellene friskt medium inneholdende 2% IL-2 (Lymphocult-HT; Biotest LTD., Birmingham, UK), og på dag 12 av dyrkingen re-stimuleres alle celler med antigen, IL-2 og bestrålte (2500 Rad) autologe PBMC som en kilde for antigenpresenterende celler (APC), ved et celleforhold på lT-celle:5 APC. Celler ekspanderes i IL-2 hver 3-4 dag og re-stimuleres på dag 14 med antigen, IL-2 og PBMC, som beskrevet ovenfor. På dagen for den første re-stimuleringen undersøkes cellene med hensyn på spesifikk proliferasjon overfor MBP. I kortere trekk dyrkes 2xl0<4>T-celler og lxlO<5>bestrålte autologe PBMC in triplo, i en 96-brønns rundbunnet plate, i nærvær av MBP. Cellene dyrkes i 2 døgn og pulseres med (<3>H)-Thymidine ved 0,4 uCi/brønn under de siste 18 timene av dyrkingen. Cellene høstes deretter som beskrevet ovenfor, og en TCL anses å være MBP-spesifikk med en 5cpm>1000 og en SI>3.

Etter 3 restimulerings-/ekspansjonssykluser klones TCL ved anvendelse av PHA (Sigma, Poole, Dorset, UK)) i nærvær av autologe bestrålte PBMC som APC. T-celler utelates under begrensende fortynningsbetingelser på 0,1 celle/brønn, 0,3 celle/brønn og 1 celle/brønn og dyrket i Terasaki-plater (Nunc International, Costar) med lxlO<4>bestrålte PBMC, 5 ug/ml PHA og 2% IL-2. Etter 10-12 dager ble vekstpositive brønner ekspandert på 96-brønns rundbunnede plater, ved anvendelse av lxlO<5>bestrålte PBMC, 5 ug/ml PHA og IL-2. Tre dager senere tilføres brønnene friskt medium inneholdende IL-2, og på dag 7 ekspanderes klonene på 48-brønns plater ved anvendelse av 5xl0<5>bestrålte PBMC, PHA og IL-2; på dette tidspunktet testes kloner i proliferasjonsanalyser med hensyn på spesifikke responser på MBP. MBP-spesifikke kloner ekspanderes en uke senere på 24-brønns plater, ved anvendelse av lxlO<6>bestrålte PBMC med PHA eller Dynabeads (Dynal, UK) og IL-2. Klonene opprettholdes i 24-brønns plater ved anvendelse av en 7-10 dagers restimulerings-/ekspansjonssyklus, i alt vesentlig som beskrevet ovenfor. Evnen til T-celle-klonene (TCC) til å gjenkjenne panelet av MBP-peptider testes ved hjelp av proliferasjonsanalyser, som beskrevet ovenfor.

Resultater

MBP- peptid- aienkiennelse blant MS- pasienter oa friske individer

De foreliggende oppfinnere anvender en kinetisk responsanalyse hvori PBMC fra MS-pasienter og friske individer testes med hensyn på deres evne til å respondere på et panel av overlappende 15-mer syntetiske peptider som spenner over den fulle lengden av humant MBP. Den proliferative respons av PBMC fra hver kultur undersøkes ved 5 tidspunkter over en periode på 2 uker, og den kinetiske profilen av responsen på MBP og peptider sammenlignes med responsen på PPD, idet sistnevnte representerer et sekundært respons/hukommelse-antigen. Ingen betydelig forskjell finnes i PBMC-responsen på MBP og/eller peptider mellom pasienter som går på Interferon-p og dem som ikke går på noen behandling (data ikke vist). Responsen på MBP i både MS-pasienter og friske kontroller nådde en topp senere enn responsen på PPD, og følger derved de kinetiske karakteristika av responsen på et ikke-recall antigen. Figur 1 viser

et typisk eksempel på den kinetiske profilen av PPD og MBP i MS-pasienter og friske individer.

Som vist i figur 2, er de to peptidene som vanligst gjenkjennes ved MS-pasienter 90-114 og 75-99 (6/12 pasienter hver), etterfulgt av regioner 30-54, 135-159 og 150-170 (5/12 pasienter), og 1-24 og 105-129 (4/12 pasienter). Tre pasienter responderer på aa 15-39 og 120-144. To pasienter gjenkjenner 45-69, og ingen av MS-pasientene responderer på region 60-84.

I overensstemmelse med figur 10, hvor alle pasientene er HLA-DR2 positive, er de to peptidene som vanligst gjenkjennes ved MS-pasienter 90-114 og 75-99 (6/11 pasienter hver), etterfulgt av regioner 120-144, 135-159 og 150-170 (5/11 pasienter), og 1-24, 15-39, 30-54 og 105-129 (4/11 pasienter). Tre pasienter responderer på aa 45-69, og igjen responderer ingen av MS-pasientene på region 60-84.

I motsetning gjenkjenner friske individer betydelig færre peptider, idet kun 2 kontrollindivider responderer på mer enn 2 peptider (C og J; figur 3). Kontrollindivider C og J er de to eneste som gjenkjenner aa 60-84, en region som ikke sees av denne gruppen pasienter. Det er interessant at begge disse individene uttrykker DRB1<*>0701 allelet. Regioner 45-69 og 105-129 gjenkjennes ikke av noen av de friske donorene, mens 75-99 og 150-170 gjenkjennes av 4 friske individer, 135-159 gjenkjennes av tre friske individer, 1-24, 30-54, 60-84 og 120-144 gjenkjennes av to friske individer, og 15-39 og 90-114 gjenkjennes av ett individ. Totalt er det 8/13 friske individer som ikke responderer på noen av de overlappende peptider, mens kun 1/12 MS-pasienter (MS 19) konsistent ikke greier å gjenkjenne MBP peptider. Det bør legges merke til at denne pasienten er unik ved ikke å respondere på MBP-protein.

Figur 11 viser også responsen til friske individer på MBP- peptider. I denne under-søkelsen responderer kun 1 kontrollindivid på mer enn 2 peptider (Nil). Nil er også det eneste individet som gjenkjenner aa 60-84, en region som ikke sees av denne gruppen pasienter. Regioner 15-39, 45-69 og 105-129 gjenkjennes ikke av noen av de friske donorene, mens 120-144 og 135-159 gjenkjennes av to friske individer, og 1-24,30-54, 60-84, 75-99, 90-114 og 150-170 gjenkjennes av ett individ. Totalt responderer 9/12 friske individer ikke på noen av de overlappende peptider.

Samlet, den dag hvorpå responsen på MBP og/eller peptider nådde en topp skilte seg ikke betydelig mellom friske individer og pasienter, og kinetikken i begge gruppene lignet på kinetikken for en primær antigenrespons. Størrelsen av responsen på MBP og peptider er i tillegg ikke forskjellige mellom pasienter og friske individer.

Forandringer overtid av MBP- peptid- qjenkiennelse

Etter at det er etablert at pasienter med MS responderer på et bredt spektrum av MBP-peptider, besluttet de foreliggende oppfinnere å undersøke hvorvidt PBMC-gjenkjennelse i de samme individene er fokusert og stabil over et forløp på omtrent 4-12 måneder. Som vist i figurene 2, 10 og 3 utviste hverken MS-pasientene eller de friske individene det samme peptid-gjenkjennelsesmønster. Figur 4 representerer et eksempel på en MS-pasient (MS 49) som responderer på multiple peptider ved 2 forskjellige tidspunkter, men gjenkjennelsesprofilen under det andre tidspunktet, målt 4 måneder senere, avviker betydelig. Det vil si at i den andre kinetiske analysen vedvarer PBMC-responsen på aa 15-39, 30-54 og 150-170, idet responsen på 75-99 og 105-129 imidlertid går tilbake og forskyves til regioner 90-114 og 135-159. Figur 5 (MS 60) belyser et eksempel på en pasient hvis brede epitoprespons gikk tilbake til en fokusert respons over en periode på 4 måneder. De friske individene som testes den andre gangen igjen greier ikke å respondere på noen av peptidene (figur 3).

Samlet viser resultatene at pasienter med MS ikke utviser faste gjenkjennelses-mønstre. Innen hver pasient kan PBMC-responsen på flere peptider vedvare, gå tilbake og forskyves til nye regioner av MBP, som det sees i pasient MS 49.

Cvkliserinq av peptid- gjenkiennelse

Når PBMC-responsen på peptider analyseres ved 3 eller flere forskjellige tidspunkter over en periode på 12 måneder, blir det klart at i visse pasienter viser epitop-gjenkjennelse seg å fluktuere snarere enn å forskyves irreversibelt til nye peptidregioner. For eksempel, som vist i figurer 2 og 10, utviser pasient MS 60 et cykliserende gjen-kjennelsesmønster overfor aa 120-144 og 135-159; dvs. at rester 120-144 og 135-159 er blant mange som gjenkjennes ved det første tidspunktet som testes, responsen på disse 2 regioner går tilbake ved det andre tidspunktet og kommer deretter igjen til syne ved det tredje tidspunktet målt 4 måneder senere. Den kinetiske profilen til pasient MS 41 viser likeledes at gjenkjennelse av aa 135-159 fluktuerer over flere tidspunkter (se figurer 2 og 10).

Blant den friske kontrollgruppen (figur 3) utviser et individ (M) en fluktuerende respons på regioner 75-99 og 135-159, et andre individ (F) gjenkjenner 75-99 ved to av de tre tidspunktene som analyseres, mens et tredje individ (D) utviser en cyklisk respons på rest 15-39.

Fin- mappinq ( kartlegging) av responsen på MBP

TCC frembringes fra 8 MS-pasienter og 2 friske individer, og anvendes til å klarlegge den fine spesifisiteten til peptidregionene identifisert i den kinetiske responsanalysen. Spesifisiteten til hver TCC testes ved dens proliferative respons på panelet av 15-mer peptider. Klon SD:A7 gjenkjente region 1-24, og innenfor denne regionen responderte denne TCC på aa 5-19. Region 30-54 gjenkjennes av 4 kloner (MS49:D3, MS49:C8, MS49:A8, MS49:B6) og epitopen innenfor denne regionen er 30-44. En klon (MS39:D7) fra en MS-pasient gjenkjenner peptid 60-74, og det er interessant at et friskt individ responderer på denne regionen (60-84) i vår kinetiske responsanalyse. Fem kloner (MS43:A7, MS41:B6, MS41:A2, MS41:C6, N5:8) gjenkjenner aa 83-99 som er inneholdt i region 75-99. En pasient produserte TCC som er spesifikk for aa 110-124 (MS60:A2, MS60:B3), inneholdt innenfor 105-129 samlingen, og en annen TCC fra den samme pasienten er spesifikk for 130-144 (MS60:E1), funnet innenfor 120-144 regionen. Fem individer produserer kloner som gjenkjenner epitoper innenfor regionen 135-159:MS60:F7, MS60:D1, MS59:F1 og N5:19 gjenkjenner aa 140-154, MS57:A1 er spesifikk for 140-149 og TCC MS17:A3 responderer på sekvens 130-144. Dette panelet av kloner viser klart tilstedeværelsen av minst 2 T-celle-epitoper innenfor 135-159 regionen av MBP. Til sist gjenkjennes region 150-170 av 2 kloner som er spesifikke for aa 156-169. Spesifisiteten til alle TCC er oppsummert i figur 6.

EKSEMPEL 2 - identifisering av apitoper i MBP

Materialer og metoder

Antiaen- presenterinasanalvse ved anvendelse av en APIPS

Presentering av peptidene for T-celle-kloner måles ved proliferasjon. APC fikseres i 0,5% paraformaldehyd og utplates ved 1 x 10<5>celler pr. brønn i en 96-brønns vev-kulturplate. T-celle-kloner utplates ved 2 x 10<4>celler pr. brønn i nærvær av varier-ende konsentrasjoner av peptid. Etter inkubering i 48 timer ved 37°C måles proliferasjon ved [<3>H] thymidin-innlemmelse over 16-20 timer. Resultatene sammenlignes med evnen til T-celler til å respondere på epitopen presentert av levende APC.

Presenteringen av peptider for T-celler isolert fra DR2:MBP82-100 transgen mus var i alt vesentlig som beskrevet ovenfor unntatt at APC ble utplatet ved 5 x IO<5>celler pr. brønn, T-celler ble utplatet ved 1 x IO<5>celler pr. brønn, og inkubering fikk forløpe i 72 timer før tilsetning av [<3>H]-thymidin.

Resultater

I dette forsøket blir peptider som er blitt identifisert som epitoper i det foregående eksemplet undersøkt med hensyn på deres kapasitet til å presenteres ved anvendelse av en APIPS. Resultatene er vist i figur 7b. Av de fem epitopene undersøkt så langt ble fire funnet å være apitoper (30-44, 80-94, 110-124 og 130-144) og en ble funnet å virke som en epitop men ikke en apitop (156-170).

Eksempel 2A -undersøkelse av MBP-peptider 30-44, 110-124, 130-144 og

156-170

For å undersøke hvorvidt forskjellige MBP-peptider er apitoper, undersøkes deres kapasitet til å presenteres for T-celler ved hjelp av fikserte APC. Levende eller forhånds-pulserte Mgar (HLA-DR2+ve) celler forhånds-pulseres med peptidet i serum, eller serum alene i 3,5 timer. Overskuddspeptid fjernes deretter fra cellene og den passende T-celle-klon tilsettes. Den T-celle-proliferative respons måles ved<3>H-thymidin-opptak.

Som vist i figurer 8 og 9 kan peptider 30-44 (fig. 8A), 110-124 (fig. 8B) og 130-144 (fig. 9A) presenteres ved hjelp av fikserte APC uten ytterligere behandling. Disse peptidene defineres derfor som apitoper. Peptid 156-170 krever på den annen side ytterligere behandling for presentering for T-celler (fig. 9B). Fikserte APC er ute av stand til å presentere denne epitopen for T-celler, slik at 156-170 er ikke en apitop.

Eksempel 2B -identifisering av apitoper innenfor regionene 77-100 og 125-148 av MBP

For en hvilken som helst gitt epitop kan der foreligge en eller flere apitoper, som er i stand til å presenteres for APC uten ytterligere behandling. Tilstedeværelsen av apitoper innenfor to regioner av MBP undersøkes ved å inkubere levende eller p-formaldehyd-fikserte Mgar (HLA-DR2+ve) celler med overlappende peptider i serum fra MBP-regioner 77-100 (figur 12) og 125-148 (figur 13) eller i serum alene. T-celler ble tilsatt og etter 72 timer (figur 12) eller etter 48 timer (figur 13) ble den T-celle-proliferative respons målt ved<3>H-thymidin-opptak. For MBP 77-100 er T-cellene isolert fra en DR2:MBP 82-100 transgen mus, mens for MBP 130-144 anvendes T-celle-klonen MS17:A3.

For MBP-region 77-100 er de følgende peptider definert som apitoper:

Minimum MBP-sekvensen som gjenkjennes av T-celler fra DR2 MBP 82-100 transgen mus er region 85-94.

For MBP-region 125-148 er de følgende peptider definert som apitoper:

Minimum MBP-sekvensen som gjenkjennes av T-celle-klon MS17:A3 er region 133-144.

Eksempel 2C-undersøkelse av region 89-101 av MBP

De foreliggende oppfinnere har tidligere vist at i motsetning til andre myelin T-celle-epitoper, så hindrer ikke administrering av peptid 89-101 i oppløselig form murin eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) indusert med enten helt myelin eller selve 89-101 peptidet (Anderton og Wraith (1998) Eur. J. Immunol. 28:1251).

MBP 89- 101 omfatter tre T- celle- epitoper

For å undersøke T-celle-reaktivitet overfor 81-111 regionen av MBP, blir lymfekjertelceller fra mus primet med 81-111 stimulert med 81-111 in vitro og disse cellene testes med et panel av overlappende 10-mer peptider med to rest-forskyvninger som dekker 81-111 regionen (nemlig: 81-90, 83-92, 85-94, 87-96, 89-98, 91-100, 93-102, 95-104, 97-106, 99-108 og 101-111). Responsmønstre på peptider som dekker 89-101 utviser stimulerende kapasitet for 5 nabo-peptider (N-terminal 87-96 til og med 95-104) som gjenspeiler tilstedeværelse av minst to (og kanskje tre) distinkte epitoper.

For å undersøke denne regionen ytterligere, frembringes tre under-linjer fra den opp-rinnelige 81-111-responderende T-celle-linje, og disse testes på ny med et panel av overlappende 10-mer peptider med en rest-forskyvning som dekker 84-106 regionen. Resultatene åpenbarer forekomsten av tre distinkte men overlappende T-celle-epitoper innenfor 89-101 sekvensen: 89-94, 92-98 og 95-101 (se figur 14).

MBP- peptid 92- 98 er en kryptisk epitop

De tre epitop-spesifikke T-celle-linjer (TCL) utviser interessante forskjeller når de testes med hensyn på reaktivitet overfor 89-101 peptidet og hele det rekombinante MBP. Alle tre TCL responderer på peptidet (89-101) men kun 89-94- og 95-101-spesifikt TCT responderer på hele MBP. Dette indikerer at antigenbehandling av intakt MBP fortrinnsvis frembringer ligander for T-celler som gjenkjenner 89-94 og 95-101 men ikke dem som gjenkjenner 92-98. Dette antyder at 92-98 epitopen er kryptisk (dvs. ikke kan frembringes ved behandling av nativt antigen). Det synes som om MBP 89-101 peptidet tar del i tre distinkte interaksjoner med MHC-molekylet hvilket resulterer i peptid/MHC-ligander som gjenkjennes av tre separate T-celle-populasjoner. Behandling av MBP frembringer imidlertid ligander for to av disse T-celle-populasjoner (se fig. 14).

Indusering av EAE krever T-celle-gjenkjennelse av autoantigene epitoper uttrykt i CNS som et resultat av nedbrytning av intakt MBP. Immunisering av mus med peptider omfattende kun en av de tre tidligere identifiserte T-celle-epitoper viser at kun dem inneholdende en naturlig behandlet epitop (89-94 eller 95-101) er i stand til å indusere EAE. Dette understøtter ytterligere det funn at 92-98 er en kryptisk epitop.

MBP- peptid 92- 98 er den dominante epitop for MBP- region 89- 101

Som nevnt ovenfor, inneholder regionen 89-101 tre distinkte men overlappende peptider. Av disse viser peptid 92-98 seg å være dominant for denne regionen. Når for eksempel T-celle-kloner frembringes fra mus primet med 89-101 peptidet, responderer alle seks kloner som ble frembragt på 92-98. Ved anvendelse av 89-101 analogpeptider inneholdende individuelle alanin-substitusjoner ved hver posisjon, er det blitt funnet at substitusjon av hvilken eller hvilke som helst av posisjonene 92-98 fører til en mangel på responderbarhet, hvilket viser at endring av hvilken eller hvilke som helst rester innenfor 92-98 kjernen har store effekter på gjenkjennelse av denne epitopen.

MBP- peptid 89- 101 klarer ikke å tolerisere EAE- relevante T- celler som gjenkjenner en naturlig behandlet MBP- epitop

For å oppsummere funnene ovenfor, har de foreliggende oppfinnere funnet at a) 89-101 sekvensen har et potensial til å frembringe 3 distinkte T-celle-epitoper; b) kun to av disse epitopene (89-94 og 95-101) frembringes ved antigenbehandling av intakt MBP (begge in vitro og in vivo); c) kun peptider inneholdende de naturlig behandlede epitoper og ikke dem inneholdende en kryptisk epitop er effektive med hensyn til å indusere EAE; d) 89-101 peptidet klarer ikke å beskytte mot EAE i peptidterapiforsøk.

Denne informasjonen tilveiebringer et grunnlag for undersøkelse av hypotesen om at peptid 89-101 ikke klarer å tolerisere mot EAE gjennom en svikt med hensyn til å

direkte ligere de sykdomsrelevante T-celler. For å underbygge hypotesen bør peptidet (89-101) ikke klare å indusere toleranse overfor den større encefalittogene epitop (89-94) siden den ikke vil binde direkte til MHC restriksjonselementet (I-A<s>) i den passende konformasjon. Med andre ord vil ikke 89-101 virke som en apitop for T-celler som

responderer på 89-94.

For å teste denne muligheten utføres toleranseforsøk med 89-101 og 87-96 peptider (fig. 15 A & B). 87-96 peptidet inneholder epitopen (89-94) som er mest effektiv med hensyn til å indusere EAE.

Metoder

Mus mottok 200 ug peptid i PBS eller PBS alene intraperitonealt på dager -8, -6 og -4 forut for 100 ug peptid i Freunds komplette adjuvans på dag 0. Etter 10 dager ble drenerende lymfekjertelceller (6 x IO<5>pr. brønn) dyrket i X-Vivo 15 medium supplert med 5 x 10"<5>M 2-merkaptoetanol og 2M L-glutamin med eller uten antigen i 72 timer. Kulturer ble pulsert i de siste 16 timene med 0,5 uCi<3>H-thymidin og innlemmelse ble målt ved anvendelse av en væskescintillasjonsteller. Resultater uttrykkes som gjennomsnittstellinger pr. minutt for triplikate kulturer.

Resultater

Priming med 87-96 induserte en sterk recall-respons på seg selv og en svakere respons på 89-101 (for henholdsvis fig. 15 A og B □ og O). Dette er overensstem-mende med behovet for antigenbehandling for å frembringe 89-94 fra 89-101. Anvendelsen av 87-96 som et tolerogen forut for priming med 87-96 undertrykket recall-responser på både 87-96 og 89-101 (fig. 15 A ■ og •). Dette passer med 89-94 reaktive T-celler, så snart de er gjort ikke-responderende in vivo, som ikke klarer å respondere in vitro på 89-94 enten de er frembragt fra 89-96 eller 89-101. Det er imidlertid avgjørende at anvendelsen av 89-101 som tolerogenet forut for priming med 87-96 ikke klarte å inhibere recall-responser på hverken 87-96 eller 89-101 (fig. 15 B A ■ og •). Disse dataene viser at administrering av peptid 89-101 i tolerogen form ikke klarer å tolerisere til den naturlig behandlede encefalittogene epitop basert på 89-94 sekvensen: 89-101 peptidet klarer ikke å oppføre seg som en apitop for 89-94 epitopen.

Uten ønske om å bindes av noen teori, mener de foreliggende oppfinnere at observasjonene kan forklares ved posisjonen av peptid 89-101 i MHC peptid-bindingssetet. Hvis peptidet fortrinnsvis binder slik at regionen 92-98 er i peptid-bindingslommen, da vil det gjenkjennes av MB92-98-spesifikke T-celler. Dette ville forklare hvorfor, når mus er primet med MBP89-101 peptidet, alle de frembragte T-celle-kloner gjenkjenner MBP92-98 epitopen. Likeledes, når 89-101 anvendes til å tolerisere T-celler, vil det hovedsakelig tolerisere celler som gjenkjenner MBP92-98 epitopen. Hvis MPB92-98 er en kryptisk epitop, frembringes den ikke ved naturlig behandling av hele antigenet og T-celler som gjenkjenner denne epitopen vil sannsynligvis ikke foreligge in vivo. Selv hvis en MBP92-98-spesifikk T-celle ikke forelå in vivo, ville den ikke være relevant for sykdommen. 89-101 klarer således ikke å hindre EAE indusert med helt MBP.

EKSEMPEL 3 - peptidterapi for en musemodell av MS

De foreliggende oppfinnere har tidligere vist at en enkelt dose av peptidantigen administrert systemisk enten ved den intraperitoneale (Liu og Wraith (1995) Int Immunol 8:1255-1263) eller intranasale (Metzler og Wraith (1993) 5:1159-1165) rute vil effektivt beskytte mus mot eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE) i opp til tre måneder (Metzler og Wraith (1999) Immunology 97:257-263). Minst 5 doser peptid var nødvendig for å indusere toleranse i den Tg4-transgene mus (Burkhart et al

(1999) 11:1625-1634) som uttrykker en EAE-spesifikk T-celle-reseptor (Liu et al

(1995) Immunity 3:407-415). Nyere arbeider har vist at den intranasale (IN) rute er sikrere enn den intraperitoneale (IP) rute i Tg4 musen, selv om begge fremgangsmåter er like sikre i den ikke-transgene musen.

Peptid 83-99 av MBP testes i den Fug/D6 transgene mus som uttrykker både det passende HLA-DR2 klasse II MHC-molekyl og en TCR fra en human T-celle-klon som er spesifikk for dette peptidet. Musene behandles med peptid etter enten standarddosen anvendt for behandling av den Tg4 transgene mus (Tg4 protokoll) eller desensitivise-ringsprotokollen for peptiddose-eskalering som er blitt anvendt i behandling av pasienter som lider av allergi (desensitiviseringsprotokoll).

Tg4 protokoll: Grupper av mus behandles ved intranasal administrering av peptid 83-99 (4 mg/ml i fosfatbufret saltoppløsning (PBS)) eller PBS alene i et totalt volum på 25 pl. Musene behandles hver 1. og 5. dag i uken i 5 uker hvilket gir totalt 10 doser. Ved begynnelsen av uke 6 injiseres hver mus med peptid 83-99 i Freunds komplette adjuvans (CFA) og mottar også en IP-injeksjon av Pertussis Toxin (200 ng) på dag 1 og 3. Progresjonen av EAE overvåkes i minst 30 døgn.

Desensitiviseringsprotokoll: Grupper av mus behandles ved intranasal administrering av en eskalerende dose av peptid 83-99 eller PBS alene i et totalt volum på 25 pl. Doseeskaleringen begynner ved 0,1 pg og fortsetter gjennom 1, 3, 6, 12, 50 og deretter tre ganger 100 pg. Musene behandles hver 1. og 5. dag i uken i 5 uker hvilket gir totalt 10 doser. Ved begynnelsen av uke 6 injiseres hver mus med peptid 83-99 i Freunds komplette adjuvans (CFA) og mottar også en IP-injeksjon av Pertussis Toxin (200 ng) på dag 1 og 3. Progresjonen av EAE overvåkes i minst 30 døgn.

EKSEMPEL 4 -nasal administrering av en apitop-cocktail til MS-pasienter

Det lages en vaksine som omfatter MBP-peptidene 30-44, 83-99, 110-124 og 130-144 (dvs. noen av de epitoper av MBP som er blitt identifisert som apitoper). Vaksinen gis til trettifem pasienter i et fase Ia/Ib-forsøk. Forsøket er en enkelt krysstudie hvori pasientene forblir ubehandlet i tre måneder etterfulgt av en enkelt dose av peptid (Ia). Pasientene overvåkes deretter i tre måneder etter den enkle dosen av vaksine for å vurdere sikkerhet. Behandlingen består deretter av to ukentlige administreringer ved intranasal avlevering. For hver pasient: klinisk aktivitet analyseres månedlig ved magnetisk resonansavbildning, immunologisk aktivitet overvåkes ved anvendelse av en kinetisk responsanalyse for proliferasjon, og cytokinproduksjon overvåkes ved anvendelse av en celle-basert ELISA.

Forsøket innbefatter initialt behandling av 5 pasienter som lider av kronisk progressiv (CP, chronic progressive) sykdom. Disse pasientene er valgt på grunnlag av lav MRI-aktivitet og behandles først med den høyeste dosen av peptidet. Behandlingen startes

i CP-pasientgruppen fordi det er mest sannsynlig å fremvise mulige skadelige effekter som vises ved en økning i MRI-aktivitet. Behandling av remitterende pasienter som får tilbakefall begynner så snart det er klart at både enkeltdose- og multippeldose-behandling er sikker i CP-gruppen. En større gruppe av 30 remitterende pasienter som får tilbakefall på grunnlag av at de lider av økende MRI-lesjoner under en overvåk-ningsperiode på 3 måneder. Disse inndeles i tre grupper som skal behandles med en høy, middels eller lav dose av peptid.

Forkortelser: APC = antigen-presenterende celler, MHC = major histocompatability complex, TCR = T-celle-reseptor, EAE = eksperimentell autoimmun encefalomyelitt, APITOP = antigenbehandlingsuavhengig epitop, APIPS = antigenbehandlingsuavhengig presenteringssystem, aa = aminosyre, MS = multippel sklerose, MBP = myelin-basisprotein, PLP = proteolipid-protein, TCL = T-celle-linje, TCC = T-celle-klon, PBMC = perifert blod-mononukleære celler, PPD = renset proteinderivat av Mycobacterium tuberculosis, PHA = fytohemagglutinin.

Claims (8)

1. Tolerogent peptid som er i stand til å binde til et MHC klasse I eller II molekyl uten ytterligere antigen behandling, som er selektert fra de følgende myelin-basisprotein (MBP) peptider: 30-44, 80-94, 83-99, 81-95, 84-98, 110-124, 130-144, 131-145, 132-146 og 133-147, for anvendelse i behandling og/eller forebygging av multippel sklerose.

2. Farmasøytisk preparat for behandling og/eller forebygging av multippel sklerose, hvor preparatet omfatter et peptid som angitt i krav 1.

3. Farmasøytisk preparat ifølge krav 2, som omfatter et flertall av tolerogene MBP peptider som angitt i krav 1.

4. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 3, som omfatter mellom 2 og 15 tolerogene MBP peptider.

5. Farmasøytisk preparat som angitt i krav 4, som omfatter 4 tolerogene MBP peptider.

6. Farmasøytisk preparat som angitt i ett eller flere av kravene 3 til 5, som er i form av et kit hvori noen eller hvert av peptidene er tilveiebragt separat for samtidig, separat eller påfølgende administrering.

7. Peptid eller farmasøytisk preparat som angitt i ett eller flere av de foregående krav for intranasal administrering.

8. Anvendelse av et peptid som angitt i krav 1 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for anvendelse i behandling og/eller forebygging av multippel sklerose.