CN1840708A - 用于治疗免疫耐受相关疾病的基因的筛选和鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗免疫耐受相关疾病的基因的筛选和鉴定方法。通过体外培养建立了制备人免疫耐受树突细胞的方法。对肿瘤相关免疫耐受树突细胞遗传背景分析，筛选和鉴定了树突细胞内与免疫耐受功能有关的基因：FLJ20151、FLJ23306、FLJ20151、FLJ21080、FLJ10055、FLJ20967、FLJ12287、FLJ11565、MGC45806或DKFZp434K1210。，这些基因参与免疫耐受的引导，在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病有着潜在的应用价值。

Description

用于治疗免疫耐受相关疾病的基因的筛选和鉴定方法

技术领域

本发明涉及用于治疗免疫耐受相关疾病的基因的筛选和鉴定方法。在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病的治疗方面这些基因有着潜在的临床应用价值。

背景技术

1975年著名免疫学家Burnet提出克隆选择学说，并以克隆清除(clonal deletion)学说解释免疫耐受现象。处于未成熟阶段的T、B反应细胞系因接触抗原而被清除，则造成免疫耐受。但是，当前对免疫耐受机制的认识已远远超越克隆清除。它的发生涉及到免疫应答过程中任何一个正、负调节系统。克隆不应答可能由于免疫活性细胞缺乏激活信号；免疫活性细胞激活受阻；缺乏辅助细胞和抑制细胞的作用如T抑制细胞的作用，其他抑制免疫细胞如NKT细胞，巨噬细胞的抑制作用。树突细胞作为免疫系统最有效的抗原呈现细胞，在免疫反应的启动和免疫反应的调节过程中起着决定性作用。树突细胞能够表达高水平的抗原呈现分子、刺激分子、产生广泛的细胞因子和化学趋化因子，这些细胞控制着先天性免疫反应和被动免疫反应引导抗病原菌和抗肿瘤免疫反应。

近年发现免疫耐受的核心就是树突细胞(Dendritic cell，DC)(Beriou et al.，2005；Coates and Thomson，2002；Cobbold et al.，2003；Fairchild et al.，2004；MacDonald et al.，2005；Martinez and Rosen，2005；Quezada et al.，2004；Raimondi and Thomson，2005；Tanerand Thomson，2004)。尽管树突细胞引导免疫耐受的机理并不很清楚，但与CD4+CD25+T调节细胞的引导和免疫抑制因子IL-10的产生(Maluhnke K，2005，133-150；Chen W，2006，1360-1370；VerginisP，7433-7439；Li G，2005，4706-4717；KleindienstP，3941-3947)和共刺激分子的表达改变，如CD40、CD80、CD86的表达降低和抑制分子PD1、CTLA-4分子表达升高有关。(Probst HC，2005，280-286；Tan PH，2005，2936-2943)。树突细胞控制着CD4+CD25+免疫调节性T细胞的产生，发育和功能的维持(Mahnke K，，133-150)，确实最近发现CD4+CD25+免疫调节性T细胞在维持免疫耐受过程中起重要作用(Akl et al.，2005；Chai et al.，2005；Sakaguchi，2005；Takahashi T，693-706，2003)。肿瘤免疫耐受是肿瘤病人常见的免疫无应答现象，是肿瘤周围环境不平衡的结果，包括抗原呈现细胞群的改变，刺激分子与抑制分子的改变及CD4+CD25+T调节细胞的改变[Zou.W.2005，263-274]。当树突细胞被招募到肿瘤环境，这些树突细胞经历变化，抑制免疫反应，使肿瘤能够生长。呈现在肿瘤环境中的树突细胞如未成熟或部分成熟的骨髓样树突细胞(myeloid树突细胞)、B7-H1+骨髓样树突细胞(myeloid树突细胞)、Indoleamine-2，3-Deoxygenase(IDO)+髓样树突细胞、肿瘤相关性浆树突细胞(plasmacytoid DCS)和CD11c+CD45+树突细胞。这些肿瘤相关的树突细胞拥有免疫调节功能。Toll-like受体在免疫细胞，特别是在树突细胞的发现进一步加深了对树突细胞如何控制免疫反应的理解，当Toll-like受体与它们的连接键结合后，通过MyD88依靠和非依靠的途径激活NF-κB、AP-1和MAPK等转录因素，促进抗原呈现分子和刺激分子的表达和引导一系列抗炎症因子的产生。几个与Toll-like受体信号系统有关的基因PI3K(phosphoinositide 3-kinase)，SOCS-1(suppressor of cytokine signaling-1)，IRAK-2(IL-1receptor-associated kinase-2)，IRAK-M，IRAK1 and IRAK4，SIGIRR(single immunoglobulinIL-1R-related molecule)and Tollip(Toll-interacting protein)等能够影响树突细胞的分化和功能，这些基因在一定程度上决定了免疫反应的倾向，如Tollip能够抑制树突细胞Toll-like受体信号系统从而影响免疫反应的产生，树突细胞也表达其他抗原识别受体C-type lectins，C-type lectins如mannose receptors、DC-SIGN and Langerin能够识别不同的mannose containing carbohydrates，这些受体与他们的连接键结合后通过信号系统也对树突细胞的分化与功能产生重要的影响。

总之，发现和鉴定控制树突状细胞参于诱导免疫耐受的所有基因对于搞清免疫耐受的遗传基础和对于肿瘤免疫，移植排斥反应和自身免疫性疾病等的治疗方面有着重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提出一种用于治疗免疫耐受相关疾病的基因的筛选和鉴定方法。首先通过体外诱导免疫耐受树突细胞的产生，免疫耐受树突细胞具有不成熟树突细胞的形态结构和降低的免疫刺激功能；具有相对较低的抗原呈递功能，降低的引导免疫特异反应的能力；肿瘤相关的免疫耐受树突细胞能够引导CD4+CD25+T调节细胞的产生；产生高水平的免疫抑制因子IL-10。利用基因芯片技术，基因库生物信息和现代生物学技术从免疫耐受树突细胞中筛选与免疫耐受有关的基因。这些免疫耐受有关的功能基因在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病有着潜在的广泛应用。

在体外通过卵巢肿瘤细胞与未成熟树突细胞共同孵育引导和产生了免疫耐受树突细胞。对于免疫耐受树突细胞可通过下例分析方法进行鉴定：A)、具有不成熟树突细胞的形态结构和降低的免疫刺激功能；B)、具有相对较低的抗原呈递功能，降低的引导免疫特异反应的能力；C)、肿瘤相关的免疫耐受树突细胞能够引导CD4+CD25+T调节细胞的产生；D)、产生高水平的免疫抑制因子IL-10，而IL-12的表达水平较低。

为了筛选免疫耐受基因，利用基因芯片技术，基因库生物信息和现代生物学技术通过比较对照树突细胞和肿瘤相关免疫耐受树突细胞，从肿瘤相关免疫耐受树突细胞筛选免疫耐受基因。

本发明提出的用于治疗免疫耐受相关疾病的基因的筛选和鉴定方法包括下述步骤：

本发明所述的免疫耐受有关的功能基因在美国NIH基因库的代号为：FLJ20151、FLJ23306、FLJ20151、FLJ21080、FLJ10055、FLJ20967、FLJ12287、FLJ11565、MGC45806和DKFZp434K1210。

1、免疫耐受树突细胞的制备和鉴定

1)从卵巢癌患者的全血用Ficoll分离出白细胞(白膜，buffy coat)，用生理盐水洗三次放入装有培养基的培养瓶中培养1小时，保留粘附在培养瓶上的单核细胞，反复用生理盐水冲洗去除非粘附的细胞，然后加入6ml含有1000U的人GM-CSF(R&D公司)和1000U IL-4(R&D公司)，继续培养4天，得到的树突细胞作为未成熟的树突细胞；培养基含有10％小牛血清(民海生物公司)的PRMI1640培养基(Hyclone公司)，同时加入1％的青霉素和1％的链霉素(Sigma公司)。

2)、将培养4天的未成熟的树突细胞，用生理盐水洗三次，分别与来自同一病人的卵巢癌肿瘤细胞、用Co60照射后的卵巢癌细胞或卵巢癌细胞上清液在24孔板中共同培养9天；卵巢肿瘤细胞与树突细胞的比例为1∶10；所述的卵巢癌肿瘤细胞是从卵巢癌患者新鲜的腹水中分离的肿瘤细胞，采用磁力珠分离方法去除潜在污染的淋巴细胞。

3)使用流式细胞仪将培养9天后的树突细胞与卵巢癌细胞分离，得到树突细胞；

4)鉴定免疫耐受树突细胞：免疫耐受树突细胞用生理盐水洗三次后，分别加PharminGen公司提供的2μl FITC萤光素标记的抗CD40、CD80和CD86抗体染色，用流式细胞仪(B.D.FAScanBur)分析，分析免疫耐受树突细胞刺激分子的表达；

5)用同一病人外周血引导流感病毒多肽“Mp58-66 peptide(GILGFVFTL，GIL；designated as A2-GIL)”特异性的HLA-0201限制性T细胞系，分离的人T细胞与装载流感病毒多肽的树突细胞共同培养，每周刺激一次，共刺激三次。肿瘤相关免疫耐受树突细胞与对照树突细胞在装载流感病毒多肽“Mp58-66 peptide后作为刺激细胞，共同培养48小时，取上清液，通过酶联试剂盒(R&D Co.)分析上清液中的IFN-γ(干扰素γ)含量。

6)、分析免疫耐受树突细胞引导CD4+CD25+T调节细胞的能力，当肿瘤相关的免疫耐受树突细胞或对照树突细胞与来自同一病人T细胞在一定比例(树突细胞∶T细胞＝1∶10)共同培养9天，通过FITC标记的抗CD4抗体和PE标记的抗CD25抗体染色和流式细胞仪分析肿瘤相关的免疫耐受树突细胞引导CD4+CD25+T调节细胞产生。

7)、分析免疫耐受树突细胞产生细胞因子的能力。用半定量PCR测定免疫耐受树突细胞IL-10和IL-12的转录水平，用Invitrogen公司提供的RT-PCR试剂盒测定IL-10和IL-12的转录水平，IL-10引物：5’atgcacagctcagcactgctctgttgc 3’和3’gtttcgtatcttcattgtcatg5’；IL-12p40引物：5’atgtgtcaccagcagttggtcatctc3’和3’actgcagggcacagatgcccattc5’。

2、免疫耐受树突细胞内免疫耐受基因的筛选

1)首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂提取总RNA；

2)对肿瘤相关性树突细胞总RNA通过基因芯片进行分析，所用基因芯片是Affymetrix human genechip platforms，由美国约翰霍普金斯大学医学院(The JohneHopkins University School of Medicine)基因组研究室分析；

3、筛选和鉴定免疫耐受相关基因

1)、首先，用寡核苷酸和dT作为引物(Proligo，Boulder，co)以及SuperScript choice合成单股cDNA。

2)、然后合成双股cDNA，双股cDNA通过苯酚-氯仿抽提后(抽提条件体积比1∶1)，利用BioArray RNA high yield Transcript labeling试剂盒(Inzo Bioche)，通过体外转录产生Biomylated anti-sense cRNA。

3)、随后处理过的cRNA与在45℃与Affymetrix基因组基因芯片杂交，用Affymetrix Fluidics Station400洗染芯片除去未杂交的cRNA，然后用streptavidin-PE结合Biotimylated cRNA，再与羊抗-streptavidin Ab孵育，用Hewlett-Packard G2500 GeneArray检测荧光强度，用MicroArray Suite 5.0软件(Affymetrix)对每个基因芯片进行图像分析；

4)、采用Agilent Bioanalyzer(Palo Alto，.CA)与“Lab on a chip”(芯片实验室)证实所有样本有着类似的rRNA比率；

5)、根据美国NIH基因库提供的生物信息，对在肿瘤相关免疫耐受树突细胞基因芯片分析中明显上调的基因或明显下调的基因，结合基因库提供生物信息进行分析。

本发明提供了一个非常有效的用于治疗免疫耐受相关疾病基因的筛选和鉴定方法，在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病研究有着重要的意义。通过体外培养建立了制备人免疫耐受树突细胞的方法。对肿瘤相关免疫耐受树突细胞遗传背景分析，筛选和鉴定了树突细胞内与免疫耐受功能有关的新基因，一些基因在这些免疫耐受树突细胞的表达明显升高，而其它一些基因的表达则明显降低。这些基因参与免疫耐受的引导，在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病有着潜在的应用价值。

本发明的积极效果描述如下：

本发明涉及的免疫耐受相关基因FLJ20151、FLJ23306、FLJ20151、FLJ21080、FLJ10055、FLJ20967、FLJ12287、FLJ11565、MGC45806和DKFZp434K1210等对肿瘤临床免疫治疗有着潜在的应用价值。肿瘤是危害人类身体健康的首要疾病之一，过去十年人们发展了多种抗肿瘤免疫治疗，特别是以树突细胞为基础的免疫治疗方法。但到目前为止，这些方法远没有达到人们的预期效果，一个重要的原因就是肿瘤对干细胞和树突细胞分化和功能的抑制。肿瘤细胞可通过直接接触，细胞因子的释放等因素引导树突细胞的耐受。树突细胞内免疫耐受相关基因的发现与鉴定，可通过直接转染免疫耐受相关基因或利用siRNA沉寂或片段缺失等生物学技术，降低树突细胞内免疫耐受基因的表达，抵抗肿瘤细胞对树突细胞的抑制作用。这可成为肿瘤免疫治疗的一种新手段。

本发明涉及的免疫耐受相关基因FLJ20151、FLJ23306、FLJ20151、FLJ21080、FLJ10055、FLJ20967、FLJ12287、FLJ11565、MGC45806和DKFZp434K1210等对移植排斥反应临床治疗有着潜在的应用价值。组织器官移植已成为医学上重要的治疗手段之一。临床上已开展同种肝脏、肾、脾、胰岛、小肠移植，以及肝肾、肝胰、心肺、等联合移植。由于移植物通常取自遗传背景不同的另一个体，移植后常出现排斥反应。建立受者对移植物组织抗原的免疫耐受是移植学家追求的目标。树突细胞控制着免疫反应，免疫耐受基因或靶向免疫耐受基因的siRNA转染的树突细胞具有引导免疫耐受的功能，可通过转染修饰的树突细胞治疗移植排斥反应。

本发明涉及的免疫耐受相关基因FLJ20151、FLJ23306、FLJ20151、FLJ21080、FLJ10055、FLJ20967、FLJ12287、FLJ11565、MGC45806和DKFZp434K1210等对自身免疫性疾病，超敏性疾病和感染性疾病的临床治疗有着潜在的应用价值。树突细胞是最重要的抗原呈递细胞，这些细胞不仅能够引导免疫反应，也能引导免疫耐受，免疫耐受相关基因转染或靶向这些基因的siRNA转染的树突细胞可成为这些疾病治疗的一种新手段。

此外，随着现代生物材料的发现如纳米材料，免疫耐受相关基因以及靶向这些基因siRNA可直接转染到树突细胞，发挥免疫调节功能，治疗与免疫有关的疾病如自身免疫性疾病、抗排斥反应、肿瘤等。

附图说明

图1、人卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞的不具备成熟树突细胞形态结构特征。

图2、人卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞的功能特征。

图3、人卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞上调的卵巢肿瘤相关免疫耐受的基因。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。

实施例1

1、人肿瘤相关免疫耐受树突细胞的制备。

1.1、实验材料

1)、培养基：含有10％小牛血清(民海生物公司)的PRMI1640培养基(Hyclone公司)，同时加入1％青霉素和1％链霉素，重量。以下记载中的培养基都是该培养基。

2)、卵巢肿瘤细胞：卵巢肿瘤细胞是从卵巢癌患者新鲜的腹水中分离的肿瘤细胞，采用磁力珠分离方法去除潜在污染的淋巴细胞。

3)、树突细胞：从HLA-0201病人分离卵巢癌患者外周血单核细胞，通过培养瓶粘附法，即从患者全血用Ficoll(Amershan，Bioscience)分离白细胞(白膜，buffy coat)，洗三次后，放入培养瓶中培养，一小时后，保留粘附的单核细胞，反复冲洗去除非粘附的细胞，然后加入6ml含有1000U的人GM-CSF(R&D公司)和1000U IL-4(R&D公司)。培养4天的树突细胞作为未成熟的树突细胞。

4)、为了决定肿瘤相关免疫耐受树突细胞的诱导是通过细胞与细胞的直接接触还是肿瘤细胞本身分泌的因素，对卵巢癌细胞进行了如下处理：

A、用14000Rad Co60照射卵巢癌细胞，这类细胞被用于评价细胞与细胞的直接接触的影响。

B、卵巢癌细胞的培养(条件：10％FCSRPMI1640培养基，37℃)上清液。培养卵巢癌细胞4天上清液被用于调节细胞分泌因素的影响。

C、未经处理的卵巢癌细胞被用于评价细胞与细胞的直接作用与细胞的分泌物对树突细胞的影响。

1.2.免疫耐受树突细胞的引导。

1)、培养4天的未成熟的树突细胞，用生理盐水洗三次，在24孔板分别与来自同一病人的卵巢癌肿瘤细胞，Co60已照射卵巢癌细胞或卵巢癌细胞上清液共同培养9天。卵巢肿瘤细胞与树突细胞的比例为1∶10。卵巢癌细胞上清液与新鲜培养基的比例是1∶3。

2)、9天后这些处理的树突细胞通过流式细胞仪与卵巢癌细胞分离。卵巢肿瘤细胞不表达CD80，肿瘤相关的树突细胞表达CD80。用2μl FITC萤光素标记的CD80抗体染卵巢肿瘤细胞与树突细胞，然后通过流式细胞仪从卵巢肿瘤细胞与树突细胞的混和培养分离树突细胞，这些树突细胞作为免疫耐受树突细胞。在这个共同培养系统，9天后，肿瘤细胞多数自动消失，不需要近一步流式细胞仪分离。树突细胞对照，未与肿瘤细胞共同培养的树突细胞被作为对照细胞，为了保证对照树突细胞的可比性，用2μl FITC萤光素标记的CD80抗体染色后也通过流式细胞仪分离以排除其他污染的细胞。

1.3、免疫耐受树突细胞的鉴定。

1)、首先对免疫耐受树突细胞的形态结构进行了观察。图1显示了光镜下的肿瘤相关免疫耐受树突细胞不具备成熟树突细胞的特点(A：未成熟树突细胞；B：对照组树突细胞；C：肿瘤相关免疫耐受树突细胞)。图1、人卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞的不具备成熟树突细胞形态结构特征。A、未成熟的树突细胞(培养4天的树突细胞)；B、成熟的树突细胞；C、人卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞

2)、免疫耐受树突细胞表达低水平的刺激分子。为了决定肿瘤相关免疫耐受树突细胞共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达，肿瘤相关免疫耐受树突细胞用生理盐水洗三次后，分别加2μl FITC萤光素标记的PharminGen公司提供的抗CD40、CD80和CD86抗体，流式细胞仪(B.D FASCanBur)分析。图2A显示了肿瘤相关免疫耐受树突细胞降低的共刺激分子的表达(A：抗体亚型对照；B：肿瘤相关免疫耐受树突细胞；C：对照组树突细胞)。

3)、免疫耐受树突细胞具有相对较低的抗原呈递功能和降低的引导免疫特异反应的能力。

为了决定肿瘤相关耐受树突细胞抗原呈现功能，首先用同一病人外周血引导流感病毒多肽“Mp58-66 peptide(GILGFVFTL，GIL；designated as A2-GIL)”特异性的HLA-0201限制性T细胞系。流感病毒多肽特异性T细胞的引导进行。即：分离的人T细胞与装载流感病毒多肽的树突细胞共同培养，每周刺激一次，共刺激三次。肿瘤相关免疫耐受树突细胞与对照树突细胞在装载流感病毒多肽“Mp58-66 peptide后作为刺激细胞。共同培养48小时，取上清液，通过酶联试剂盒分析上清液中的IFN-γ含量。结果显示了免疫耐受树突细胞与对照组树突细胞相比仅引导低水平的IFN-γ(图2B)。

4)、肿瘤相关的免疫耐受树突细胞能够引导CD4+CD25+T调节细胞的产生。当肿瘤相关的免疫耐受树突细胞或对照树突细胞与来自同一病人T细胞在一定比例(树突细胞∶T细胞＝1∶10)共同培养9天，通过PharminGen公司提供的FITC标记的抗CD4抗体和PE标记的抗CD25抗体染色和流式细胞仪分析发现肿瘤相关的免疫耐受树突细胞能够引导CD4+CD25+T调节细胞的产生(图2C)

5)、免疫耐受树突细胞产生高水平的免疫抑制因子IL-10，而IL-12的表达水平较低。用半定量PCR测定免疫耐受树突细胞IL-10和IL-12的转录水平。IL-10引物：

5’atgeacagetcagcaetgctctgttgc 3’和3’gtttcgtatcttcattgtcatg5’；IL-12p40引物：

5’atgtgtcaccagcagttggtcatctc3’和3’actgcagggcacagatgcccattc5’。免疫耐受树突细胞表达高水平的免疫抑制因子IL-10，而IL-12的表达水平较低(图2D)。

图2、人卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞的功能特征。A、人卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞共刺激分子的表达，a：抗体亚型对照；b：人卵巢肿瘤相关的免疫耐受树突细胞；c：对照树突细胞。B、人卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞功能的评价，不同比率的对照树突细胞与肿瘤相关免疫耐受的树突细胞装载流感病毒多肽后，刺激流感病毒多肽特异的T细胞反应的能力。C、人卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞引导CD4+CD25+T调节细胞的产生。D、人卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞细胞因子的产生。DC:T：树突细胞与T细胞的比率；DC：对照树突细胞；T.DC：人卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞；Contr：仅树突细胞。

2.免疫耐受树突细胞内免疫耐受基因的筛选。

本发明为了决定或鉴定肿瘤相关的免疫耐受基因，对肿瘤相关性树突细胞总RNA通过基因芯片进行了分析。首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂提取总RNA。

基因芯片分析方法：

2.1、首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂提取总RNA。

2.2、对肿瘤相关性树突细胞总RNA通过基因芯片进行分析。所用基因芯片是Affymetrix human genechip platforms，由美国约翰霍普金斯大学医学院(The JohneHopkins University School of Medicine)基因组研究室分析。

1)、5μg总RNA用于合成单股cDNA。用寡核苷酸和dT作为引物(Proligo，Boulder，co)以及SuperScript choice合成单股cDNA，然后合成双股cDNA。

2)、双股cDNA通过苯酚-氯仿抽提后，利用BioArray RNA high yield Transcriptlabeling试剂盒(Inzo Bioche)。通过体外转录产生Biomylated anti-sense cRNA。15mg的Biotimylated cRNA在94℃通过35分钟处理(100mM Trix-acetate，PH8.2，500mM KoAc，150mM MgOAc)，随后10μg总的处理过的cRNA与在45℃ Affymetrix人基因组基因芯片杂交，轻轻摇动(60rpm)16小时。Affymetrix Fluidics Station400用于洗和染芯片除去未杂交的cRNA，然后用streptavidin-PE结合Biotimylated cRNA，再与羊抗-streptavidin Ab孵育。用Hewlett-Packard G2500 GeneArray检测荧光强度。用MicroArray Suite 5.0软件(Affymetrix)对每个基因芯片进行图像分析。为了比较不同的芯片，使用全球尺度，确定150作为把荧光强度值。

3)、为了确保来自不同样本的可比性，我们采用Agilent Bioanalyzer(Palo Alto，CA)，“Lab on a chip”技术证实了所有样本有着类似的rRNA比率，18S和28S比率为1∶2和清晰的“run pattern”。同样的，这个技术也被用于确认cRNA和已片段化的cRNA(fragmented cRNA)。为了确保杂交的质量，Genechip影像，不同芯片之间的比较，我们也研究了以下参数；等级参数(scaling factor)；背景；保留基因。为了评估质量控制，我们也比较了每个组不同上调与下调的百分比。起始表达结果是基于不同实验条件下的比较，试验组与对照组的表达水平至少显示2倍的变化，才被认为有意义。

通过对病人卵巢肿瘤相关的树突细胞与对照树突细胞相比较，与肿瘤相关的基因有1734个。有1072的基因被上调，基因转录超过2倍的有779个基因，662个基因转录被下调，基因转录下调超过2倍的有315个：

总基因       1734

上调         1072           ≥2倍        779

下调         662            ≥倍         315

在这些卵巢肿瘤相关基因(卵巢肿瘤上调或下调的基因)中，根据美国NIH基因库提供的信息，已被证实与免疫反应有关的基因有98个，其中65个肿瘤相关的免疫基因上调，33个与免疫反应有关的卵巢相关基因被下调。

2.1.通过对卵巢癌基因芯片分析结合美国NIH基因库信息(NCBI，Pubmed，Nucleotide)，发现一些未知功能的基因被上调，而另一些未知功能的基因被下调。卵巢肿瘤细胞能够影响84个未知功能基因的表达，其中38个未知功能基因被上调，46个未知功能基因下调。卵巢肿瘤明显上调的10个基因FLJ20151、FLJ23306、FLJ20151、FLJ21080、FLJ10055、FLJ20967、FLJ12287、FIJ11565、MGC45806、DKFZp434K1210(图3)作为肿瘤免疫耐受相关基因。

实施例2

1、人肿瘤相关免疫耐受树突细胞的制备。

1.1、实验材料.

1)、培养基：含有10％小牛血清(民海生物公司)的PRMI1640培养基(Hyclone公司)，同时加入1％青/链霉素；

2)、卵巢肿瘤细胞：卵巢肿瘤细胞是从卵巢癌患者新鲜的腹水中分离的肿瘤细胞，采用磁力珠分离方法去除潜在污染的淋巴细胞，生理盐水洗三次备用。

3)、为了决定肿瘤相关免疫耐受树突细胞的诱导是通过细胞与细胞的直接接触还是肿瘤细胞本身分泌的因素，对卵巢癌细胞进行了如下处理：

A、用14000Rad Co60照射卵巢癌细胞。这类细胞被用于评价细胞与细胞的直接接触的影响。

B、卵巢癌细胞的培养上清液。培养卵巢癌细胞4天上清液被用于调节细胞分泌因素的影响。

C、未经处理的卵巢癌细胞被用于评价细胞与细胞的直接作用与细胞的分泌物对树突细胞的影响。

4)、树突细胞：从HLA-0201病人分离卵巢癌患者外周血单核细胞，通过培养瓶粘附法，即从患者全血分离白细胞(白膜，buffy coat)，洗三次后，放入培养瓶中培养，一小时后，保留粘附的单核细胞，反复冲洗去除非粘附的细胞，然后加入6ml含有1000U的人GM-CSF(R&D公司)和1000U IL-4(R&D公司)。培养4天的树突细胞作为未成熟的树突细胞。

1.2.免疫耐受树突细胞的引导。

1)、培养4天的未成熟的树突细胞，用生理盐水洗三次，在24孔板分别与来自同一病人的卵巢癌肿瘤细胞，已照射卵巢癌细胞或卵巢癌细胞上清液共同培养9天。卵巢肿瘤细胞与树突细胞的比例为1∶10。卵巢癌细胞上清液与新鲜培养基的比例是1∶3。

2)、9天后这些处理的树突细胞通过流式细胞仪与卵巢癌细胞分离。卵巢肿瘤细胞不表达CD80，肿瘤相关的树突细胞表达CD80。用2μl FITC萤光素标记的CD80抗体染卵巢肿瘤细胞与树突细胞，然后通过流式细胞仪从卵巢肿瘤细胞与树突细胞的混和培养分离树突细胞，这些树突细胞作为免疫耐受树突细胞。在这个共同培养系统，9天后，肿瘤细胞多数自动消失，不需要近一步流式细胞仪分离。树突细胞对照，未与肿瘤细胞共同培养的树突细胞被作为对照细胞，为了保证对照树突细胞的可比性，用2μl FITC萤光素标记的CD80抗体染色后也通过流式细胞仪分离以排除其他污染的细胞。

1.3、免疫耐受树突细胞的鉴定。通过对免疫耐受树突细胞的观察和分析，取得类似

实施例1的结果：

1)、肿瘤相关免疫耐受树突细胞不具备成熟树突细胞的特点；2)、免疫耐受树突细胞表达低水平的刺激分子；3)、免疫耐受树突细胞具有相对较低的抗原呈递功能和降低的引导免疫特异反应的能力。4)、肿瘤相关的免疫耐受树突细胞能够引导CD4+CD25+T调节细胞的产生。5)、免疫耐受树突细胞产生高水平的免疫抑制因子IL-10，而IL-12的表达水平较低。

2.免疫耐受树突细胞内免疫耐受基因的筛选。

本发明为了决定或鉴定肿瘤相关的免疫耐受基因，首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，对肿瘤相关性树突细胞总RNA通过基因芯片进行了分析。

基因芯片分析方法：

2.1、首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA。

2.2、对肿瘤相关性树突细胞总RNA通过基因芯片进行分析。所用基因芯片是Affymetrix human genechip platforms，由美国约翰霍普金斯大学医学院(The JohneHopkins University School of Medicine)基因组研究室分析。

1)、5μg总RNA用于合成单股cDNA。用寡核苷酸和dT作为引物(Proligo，Boulder，co)以及SuperScript choice合成单股cDNA，然后合成双股cDNA。

2)、双股cDNA通过苯酚-氯仿抽提后，利用BioArray RNA high yield Transcriptlabeling试剂盒(Inzo Bioche)。通过体外转录产生Biomylated anti-sense cRNA。15mg的Biotimylated cRNA在94℃通过35分钟处理(100mM Trix-acetate，PH8.2，500mM KoAc，150mM MgOAc)，随后10μg总的处理过的cRNA与在45℃Affymetrix人基因组基因芯片杂交，轻轻摇动(60rpm)16小时。Affymetrix Fluidics Station400用于洗和染芯片除去未杂交的cRNA，然后用streptavidin-PE结合Biotimylated cRNA，再与羊抗-streptavidin Ab孵育。用Hewlett-Packard G2500 GeneArray检测荧光强度。用MicroArray Suite 5.0软件(Affymetrix)对每个基因芯片进行图像分析。为了比较不同的芯片，使用全球尺度，确定150作为把荧光强度值。

3)、为了确保来自不同样本的可比性，我们采用Agilent Bioanalyzer(Palo Alto，CA)，“Lab on a chip”(芯片实验室)技术证实了所有样本有着类似的rRNA比率，18S和28S比率为1∶2和清晰的“run pattern”。同样的，这个技术也被用于确认cRNA和已片段化的cRNA(fragmented cRNA)。为了确保杂交的质量，Genechip影像，不同芯片之间的比较，我们也研究了以下参数：等级参数(scaling factor)；背景；保留基因。为了评估质量控制，我们也比较了每个组不同上调与下调的百分比。起始表达结果是基于不同实验条件下的比较，试验组与对照组的表达水平至少显示2倍的变化，才被认为有意义。

通过对病人卵巢肿瘤相关的树突细胞与对照树突细胞相比较，取得类似实施例1的结果：卵巢肿瘤明显上调的10个基因FLJ20151、FLJ23306、FLJ20151、FLJ21080、FLJ10055、FLJ20967、FLJ12287、FLJ11565、MGC45806、DKFZp434K1210(图3)这些基因作为肿瘤免疫耐受相关基因。

实施例3

1、人肿瘤相关免疫耐受树突细胞的制备。

1.1、实验材料.

1)、培养基：含有10％小牛血清(民海生物公司)的PRMI1640培养基(Hyclone公司)，同时加入1％青霉素1％链霉素，重量；

2)、卵巢肿瘤细胞：卵巢肿瘤细胞是从卵巢癌患者新鲜的腹水中分离的肿瘤细胞，采用磁力珠分离方法去除潜在污染的淋巴细胞，生理盐水洗三次备用。

3)、为了决定肿瘤相关免疫耐受树突细胞的诱导是通过细胞与细胞的直接接触还是肿瘤细胞本身分泌的因素，对卵巢癌细胞进行了如下处理：

A、用14000Rad Co60照射卵巢癌细胞。这类细胞被用于评价细胞与细胞的直接接触的影响。

B、卵巢癌细胞的培养上清液。培养卵巢癌细胞4天上清液被用于调节细胞分泌因素的影响。

C、未经处理的卵巢癌细胞被用于评价细胞与细胞的直接作用与细胞的分泌物对树突细胞的影响。

4)、树突细胞：从HLA-0201病人分离卵巢癌患者外周血单核细胞，通过培养瓶粘附法，即从患者全血用Ficoll(Amersham，Biosciences)分离白细胞(白膜，buffy coat)，洗三次后，放入培养瓶中培养，一小时后，保留粘附的单核细胞，反复冲洗去除非粘附的细胞，然后加入6ml含有1000U的人GM-CSF(R&D公司)和1000U IL-4(R&D公司)。培养4天的树突细胞作为未成熟的树突细胞。

1.2.免疫耐受树突细胞的引导。

1)、培养4天的未成熟的树突细胞，用生理盐水洗三次，在24孔板分别与来自同一病人的卵巢癌肿瘤细胞，已照射卵巢癌细胞或卵巢癌细胞上清液共同培养9天。卵巢肿瘤细胞与树突细胞的比例为1∶10。卵巢癌细胞上清液与新鲜培养基的比例是1∶3。

2)、9天后这些处理的树突细胞通过流式细胞仪与卵巢癌细胞分离。卵巢肿瘤细胞不表达CD80，肿瘤相关的树突细胞表达CD80。用2μl FITC萤光素标记的CD80抗体(PharminGen公司)染卵巢肿瘤细胞与树突细胞，然后通过流式细胞仪(B.D FAScanBur)从卵巢肿瘤细胞与树突细胞的混和培养分离树突细胞，这些树突细胞作为免疫耐受树突细胞。在这个共同培养系统，9天后，肿瘤细胞多数自动消失，不需要近一步流式细胞仪分离。树突细胞对照，未与肿瘤细胞共同培养的树突细胞被作为对照细胞，为了保证对照树突细胞的可比性，用2μl FITC萤光素标记的CD80抗体染色后也通过流式细胞仪分离以排除其他污染的细胞。

1.3、免疫耐受树突细胞的鉴定。通过对免疫耐受树突细胞的观察和分析，取得类似实施例1的结果：

1)、肿瘤相关免疫耐受树突细胞不具备成熟树突细胞的特点；2)、免疫耐受树突细胞表达低水平的刺激分子；3)、免疫耐受树突细胞具有相对较低的抗原呈递功能和降低的引导免疫特异反应的能力。4)、肿瘤相关的免疫耐受树突细胞能够引导CD4+CD25+T调节细胞的产生。5)、免疫耐受树突细胞产生高水平的免疫抑制因子IL-10，而IL-12的表达水平较低。

2.免疫耐受树突细胞内免疫耐受基因的筛选。

本发明为了决定或鉴定肿瘤相关的免疫耐受基因，首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取总RNA，对肿瘤相关性树突细胞总RNA通过基因芯片进行了分析。

基因芯片分析方法：

2.1、首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂提取总RNA。

2.2、对肿瘤相关性树突细胞总RNA通过基因芯片进行分析。所用基因芯片是Affymetrix human genechip platforms，由美国约翰霍普金斯大学医学院(The JohneHopkins University School of Medicine)基因组研究室分析。

1)、5μg总RNA用于合成单股cDNA。用寡核苷酸和dT作为引物(Proligo，Boulder，co)以及SuperScript choice合成单股cDNA，然后合成双股cDNA。

2)、双股cDNA通过苯酚-氯仿抽提后，利用BioArray RNA high yield Transcriptlabeling试剂盒(Inzo Bioche)。通过体外转录产生Biomylated anti-sense cRNA。15mg的Biotimylated cRNA在94℃通过35分钟处理(100mM Trix-acetate，PH8.2，500mM KoAc，150mM MgOAc)，随后10μg总的处理过的cRNA与在45℃Affymetrix人基因组基因芯片杂交，轻轻摇动(60rpm)16小时。Affymetrix Fluidics Station400用于洗和染芯片除去未杂交的cRNA，然后用streptavidin-PE结合Biotimylated cRNA，再与羊抗-streptavidin Ab孵育。用Hewlett-Packard G2500 GeneArray检测荧光强度。用MicroArray Suite 5.0软件(Affymetrix)对每个基因芯片进行图像分析。为了比较不同的芯片，使用全球尺度，确定150作为把荧光强度值。

3)、为了确保来自不同样本的可比性，我们采用Agilent Bioanalyzer(Palo Alto，CA)，“Lab on a chip”技术证实了所有样本有着类似的rRNA比率，18S和28S比率为1∶2和清晰的“run pattern”。同样的，这个技术也被用于确认cRNA和已片段化的cRNA(fragmented cRNA)。为了确保杂交的质量，Genechip影像，不同芯片之间的比较，我们也研究了以下参数：等级参数(scaling factor)；背景；保留基因。为了评估质量控制，我们也比较了每个组不同上调与下调的百分比。起始表达结果是基于不同实验条件下的比较，试验组与对照组的表达水平至少显示2倍的变化，才被认为有意义。

通过对病人卵巢肿瘤相关的树突细胞与对照树突细胞相比较，取得类似实施例1的结果：卵巢肿瘤明显上调的10个基因FLJ20151、FLJ23306、FLJ20151、FLJ21080、FLJ10055、FLJ20967、FLJ12287、FLJ11565、MGC45806、DKFZp434K1210(图3)，这些基因作为肿瘤免疫耐受相关基因。

Claims (3)

1、一种用于治疗免疫耐受相关疾病的基因的筛选和鉴定方法，其特征在于包括下述步骤：

(1)免疫耐受树突细胞的制备和鉴定

1)从卵巢癌患者的全血用Ficoll分离出白细胞，用生理盐水洗三次放入装有培养基的培养瓶中培养1小时，保留粘附在培养瓶上的单核细胞，反复用生理盐水冲洗去除非粘附的细胞，然后加入6ml含有1000U的人GM-CSF和1000UIL-4，继续培养4天，得到的树突细胞作为未成熟的树突细胞；培养基含有10％小牛血清的PRMI1640培养基，同时加入1％的青和1％链霉素。

2)将培养4天的未成熟的树突细胞，用生理盐水洗三次，在24孔板分别与来自同一病人的卵巢癌肿瘤细胞、用Co60已照射卵巢癌细胞或卵巢癌细胞上清液共同培养9天；卵巢肿瘤细胞与树突细胞的比例为1∶10(数量比)；所述的卵巢癌肿瘤细胞是从卵巢癌患者新鲜的腹水中分离的肿瘤细胞，采用磁力珠分离方法去除潜在污染的淋巴细胞。

3)使用流式细胞仪将培养9天后的树突细胞与卵巢癌细胞分离，得到树突细胞；

4)鉴定免疫耐受树突细胞：免疫耐受树突细胞用生理盐水洗三次后，分别加PharminGen公司提供的2μl FITC萤光素标记的抗CD40、CD80和CD86抗体染色，用流式细胞仪分析，分析免疫耐受树突细胞刺激分子的表达；

5)用同一病人外周血引导流感病毒多肽“Mp58-66 peptide(GILGFVFTL，GIL；designated as A2-GIL)”特异性的HLA-0201限制性T细胞系，分离的人T细胞与装载流感病毒多肽的树突细胞共同培养，每周刺激一次，共刺激三次。肿瘤相关免疫耐受树突细胞与对照树突细胞在装载流感病毒多肽“Mp58-66peptide后作为刺激细胞，共同培养48小时，取上清液，通过酶联试剂盒分析上清液中的IFN-γ(干扰素γ)含量。

6)分析免疫耐受树突细胞引导CD4+CD25+T调节细胞的能力，当肿瘤相关的免疫耐受树突细胞或对照树突细胞与来自同一病人T细胞在一定比例(树突细胞∶T细胞＝1∶10)共同培养9天，通过FITC标记的抗CD4抗体和PE标记的抗CD25抗体染色和流式细胞仪分析肿瘤相关的免疫耐受树突细胞引导CD4+CD25+T调节细胞产生。

7)分析免疫耐受树突细胞产生细胞因子的能力。用半定量PCR测定免疫耐受树突细胞IL-10和IL-12的转录水平，用Invitrogen公司提供的RT-PCR试剂盒测定IL-10和IL-12的转录水平，IL-10引物：5’atgcacagctcagcactgctctgttgc3’和3’gtttcgtatcttcattgtcatg5’；IL-12p40引物：5’atgtgtcaccagcagttggtcatctc3’3’actgcagggcacagatgcccattc5’。

(2)免疫耐受树突细胞内免疫耐受基因的筛选

1)首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂提取总RNA；

2)对肿瘤相关性树突细胞总RNA通过基因芯片进行分析，所用基因芯片是Affymetrix human genechip platforms，由美国约翰霍普金斯大学医学院(TheJohne Hopkins University School of Medicine)基因组研究室分析；

(3)筛选和鉴定免疫耐受相关基因

1)、首先，用寡核苷酸和dT作为引物(Proligo，Boulder，co)以及SuperScriptchoice合成单股cDNA。

2)、然后合成双股cDNA，双股cDNA通过苯酚-氯仿抽提后(等体积，1∶1)，利用BioArray RNA high yield Transcript labeling试剂盒(Inzo Bioche)，通过体外转录产生Biomylated anti-sense cRNA。

3)随后处理过的cRNA与在45℃与Affymetrix基因组基因芯片杂交，用Affymetrix Fluidics Station400洗染芯片除去未杂交的cRNA，然后用streptavidin-PE结合Biotimylated cRNA，再与羊抗-streptavidin Ab孵育，用Hewlett-Packard G2500 GeneArray检测荧光强度，用MicroArray Suite 5.0软件(Affymetrix公司)对每个基因芯片进行图像分析；

4)采用Agilent Bioanalyzer(Palo Alto，CA)，“Lab on a chip”(芯片实验室)技术证实所有样本有着类似的rRNA比率；

5)根据美国NIH基因库提供的生物信息，对在肿瘤相关免疫耐受树突细胞基因芯片分析中明显上调的基因或明显下调的基因，结合基因库提供生物信息进行分析。

2、根据权利要求1所述的筛选和鉴定方法，其特征在于步骤(1)卵巢肿瘤细胞与树突细胞的比例为1∶10；卵巢癌细胞上清液与新鲜培养基的比例是1∶3，体积。

3、根据权利要求1所述的筛选和鉴定方法，其特征在于所述的免疫耐受有关的功能基因在美国NIH基因库的代号为：FLJ20151、FLJ23306、FLJ20151、FLJ21080、FLJ10055、FLJ20967、FLJ12287、FLJ11565、MGC45806或DKFZp434K1210。

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