CN1840709B - 筛选与鉴定治疗免疫耐受相关疾病功能基因serpinh1的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了诊断和治疗免疫耐受相关疾病功能基因SERPINH1的筛选与鉴定方法。通过体外培养建立了制备人免疫耐受树突细胞，发现SERPINH1基因在免疫耐受树突细胞中的表达明显升高。当SERPINH1基因或靶向这些基因的siRNA转染单核细胞系，将影响其转录因子的激活，细胞因子的产生和共刺激分子的表达；重要的是转染免疫调节细胞树突细胞后能够发挥特有的免疫调节功能，引导免疫耐受。该基因在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病的治疗方面有着巨大的潜在应用价值。

Description

筛选与鉴定治疗免疫耐受相关疾病功能基因SERPINH1的方法

技术领域

本发明涉及筛选与鉴定治疗免疫耐受相关疾病功能基因SERPINH1的方法，具体讲是已知基因serine proteins inhibitor H1(下文简称SERPINH1基因)新功能的筛选与鉴定方法，免疫耐受相关基因SERPINH1参与免疫耐受并影响免疫应答基因的表达。SERPINH1基因在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病的治疗方面有着潜在的临床应用价值。

背景技术

1975年著名免疫学家Burnet提出克隆选择学说，并以克隆清除(clonal deletion)学说解释免疫耐受现象。处于未成熟阶段的T、B反应细胞系因接触抗原而被清除，则造成免疫耐受。但是，目前对免疫耐受机制的认识已远远超越克隆清除。它的发生涉及到免疫应答过程中任何一个正、负调节系统。克隆不应答可能由于免疫活性细胞缺乏激活信号；免疫活性细胞激活受阻；缺乏辅助细胞和抑制细胞的作用如T抑制细胞的作用，其他抑制免疫细胞如NKT细胞，巨噬细胞的抑制作用。树突细胞作为免疫系统最有效的抗原呈现细胞，在免疫反应的启动和免疫反应的调节过程中起着决定性作用。树突细胞能够表达高水平的抗原呈递分子、刺激分子、产生广泛的细胞因子和化学趋化因子，这些细胞控制着先天性免疫反应和被动免疫反应引导抗病原菌和抗肿瘤免疫反应。

搞清免疫耐受机理对肿瘤免疫，移植排斥反应和自身免疫性疾病有着重要意义。免疫耐受的诱导、维持和破坏影响着许多临床疾病的发生、发展和转归。人们企图诱导和维持免疫耐受性来防治超敏性疾病、自身免疫性疾病，肿瘤以及移植物的排斥反应。某些感染性疾病以及肿瘤生长过程中，设法解除免疫耐受、激发免疫应答将有利于对病原体的清除及肿瘤的控制。近年发现免疫耐受的核心就是树突细胞(Dendritic cell，DC)(Beriou et al.，2005；Coates and Thomson，2002；Cobbold et al.，2003；Fairchild et al.，2004；MacDonaldet al.，2005；Martinez and Rosen，2005；Quezada et al.，2004；Raimondi and Thomson，2005；Taner and Thomson，2004)，这样发现和鉴定控制树突状细胞参于诱导免疫耐受的基因将是关键的。尽管人们通过其它方法发现一些能够调节树突细胞分化和功能的基因，但这远没能揭开控制树突细胞分化和功能尤其是与免疫耐受有关的遗传基础。到目前为止，还没有一个系统方法鉴定树突细胞内控制免疫耐受的基因。

Serine proteases inhibitor(Serpin)，由许多成员组成。现有研究已证实Serpins对重要生理系统的维持起着重要作用(Pike RN.2002，1-7)：Serpins控制血凝系统(Pike RN.4842-4851)；保护T细胞的自身杀伤(Pike RN.2002，1-7)；能够抑制中性细胞和血小板的激活；调节IFN-α的产生与释放(Wachtfogel；1993，1-9)；Serine protease：Aprotinin处理的病人IL-6产生减少(Soeporwata，55-64)，IL-8的水平降低(Soeporwata，55-64)。

发明内容

本发明的目的在于提出一种筛选与鉴定治疗免疫耐受相关疾病功能基因SERPINH1的方法。在体外通过卵巢肿瘤细胞与未成熟树突细胞共同孵育引导和产生免疫耐受树突细胞。利用基因芯片技术，基因库生物信息和现代生物学技术通过比较对照树突细胞和肿瘤相关免疫耐受树突细胞，从肿瘤相关免疫耐受树突细胞筛选免疫耐受基因。筛选的免疫耐受基因再通过一系列分析方法进一步确认。

SERPINH1基因在免疫耐受树突细胞中的表达明显升高。当SERPINH1基因或靶向这个基因的siRNA转染单核细胞系，影响其转录因素的激活，细胞因子的产生和共刺激分子的表达；重要的是转染免疫调节细胞树突细胞后能够发挥特有的免疫调节功能，引导免疫耐受。该基因在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病的治疗方面有着巨大的潜在应用价值。

本发明是通过体外诱导免疫耐受树突细胞的产生，免疫耐受树突细胞具有不成熟树突细胞的形态结构和降低的免疫刺激功能具有相对较低的抗原呈递功能，降低的引导免疫特异反应的能力。利用基因芯片技术，基因库生物信息和现代生物学技术从免疫耐受树突细胞中筛选和鉴定与免疫耐受有关的基因SERPINH1。SERPINH1基因的功能通过五个不同的分析方法进行了进一步评价：1)转染SERPINH1基因对转录因素的影响；2)、转染SERPINH1基因对细胞因子、化学趋化因子和细胞内信号传导系统相关基因表达的影响；3)、转染SERPINH1对共同刺激分子表达的影响；4)、沉寂SERPINH1基因对肿瘤相关免疫耐受树突细胞引导T调节细胞CD4+CD25+细胞的影响；5)、沉寂SERPINH1基因对树突细胞抵抗肿瘤对树突细胞的影响；6)、沉寂SERPINH1基因对树突细胞抗原呈递功能的影响。

本发明提出的筛选与鉴定治疗免疫耐受相关疾病功能基因SERPINH1的方法是包括下述步骤：

(1)免疫耐受树突细胞的制备和鉴定

1)取4-6周健康C57BL/6小鼠的骨髓细胞，用水溶解去除红细胞后，这些骨髓细胞培养在1000单位GM-CSF，10％FCSRPMI1640培养基中，37℃温度下培养4天的骨髓起源的树突细胞作为未成熟的树突细胞。

2)培养4天的未成熟的树突细胞，用生理盐水洗三次，在24孔板分别与鼠卵巢癌肿瘤细胞，已照射卵巢癌细胞或卵巢癌细胞上清液共同培养9天。

3)9天后，用2μl FITC萤光素标记的CD80抗体(BD Pharmingen公司)染鼠卵巢肿瘤细胞与树突细胞，然后通过流式细胞仪从鼠卵巢肿瘤细胞与树突细胞的混和培养(在10％FCSRPMI1640培养基中，时间：9天)分离树突细胞，得免疫耐受树突细胞。

4)首先对免疫耐受树突细胞的形态结构进行了观察，观察肿瘤相关免疫耐受树突细胞的形态与结构。

5)肿瘤相关免疫耐受树突细胞用生理盐水洗三次后，分别加2μl FITC萤光素标记的抗CD40、CD80和CD86抗体染色，流式细胞仪分析，分析免疫耐受树突细胞刺激分子的表达。

6)用类乳头瘤病毒质粒(VLP)(由The Johns Hopkins University School of Medicine提供)免疫鼠引导的特异性T细胞作为靶细胞，肿瘤相关免疫耐受树突细胞与对照树突细胞在装载类乳头瘤病毒质粒(VLP)后作为刺激细胞。在10％FCSRPMI1640培养基中共同培养48小时，取上清液，通过酶联免疫检测试剂盒分析上清液中的IFN-γ(干扰素γ)含量。

(2)免疫耐受树突细胞内免疫耐受基因的筛选

1)首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA；

2)对肿瘤相关性树突细胞总RNA通过基因芯片进行分析，所用基因芯片是AffymetrixMouse U74 GeneChip series(U74A，U74B和U74C)，由美国约翰霍普金斯大学医学院(TheJohne Hopkins University School of Medicine)基因组研究室分析：

1、首先，用寡核苷酸和dT作为引物(Proligo，Boulder，co)以及SuperScript choice(SuperScript TM Choice System，cDNA合成试剂盒)合成单股cDNA。

2、然后合成双股cDNA。双股cDNA通过苯酚-氯仿抽提后，利用BioArray RNA highyield Transcript labeling试剂盒(Inzo Bioche)，通过体外转录产生Biomylated anti-sense cRNA。

3、cRNA在45℃与Affymetrix基因组基因芯片杂交。用Affymetrix Fluidics Staion400洗染芯片除去未杂交的cRNA，然后用streptavidin-PE结合Biotimylated cRNA，再与羊抗-streptavidin Ab孵育。用Hewlett-Packard G2500 GeneArray检测荧光强度。用MicroArray Suite5.0软件(Affymetrix)对每个基因芯片进行图像分析。

4、采用Agilent Bioanalyzer(Palo Alto，CA)与“Lab on a chip”(芯片实验室)技术证实所有样本有着类似的rRNA比率。

5、根据基因库提供生物信息，对在肿瘤相关免疫耐受树突细胞基因芯片分析中明显上调的基因或明显下调的基因结合基因库提供生物信息进行分析。

6)、SERPINH1基因在肿瘤相关的树突细胞的高水平表达通过半定量PCR和定量PCR进一步评价。根据基因库提供生物信息，找出在肿瘤相关免疫耐受树突细胞中明显上调的SERPINH1基因序列。给出基因序列和上调的SERPINH1基因序列：

atgcgctctc tccttctggg caccttatgc ctcttggccg tggccctggc agccgaggtg

aagaaacccc tagaggcggc agcccctggt actgcggaga agctaagttc caaggcgacc

acactggcag agcgcagcac aggcctggcc ttcagcctat atcaggcgat ggccaaagac

caggcggtgg agaacatcct cctgtcaccc ttggtggtgg cctcatccct gggtcttgtg

tcactgggtg gtaaagccac cacagcgtcg caggcgaagg cagtgctgag cgctgagaag

ctgcgcgatg aggaggtgca cacggggctg ggtgagctgc tccgctccct cagcaactcc

actgcgcgca acgtgacctg gaaactgggc agccgcctgt acgggcccag ctccgtgagc

ttcgccgatg acttcgtgcg cagcagcaag caacactaca actgcgaaca ctccaagatc

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gagggcaacc cctttgacca agacatctac gggcgcgagg agctgcgcag ccccaagctg

ttctatgccg accacccctt catcttcctg gtgcgagata atcagagcgg ctccttgctc

ttcattggcc gcctggtccg gcccaaggga gacaagatgc gagatgagtt gtag

设计SERPINH1基因引物：5‘atgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’。用Invitrogen提供的RT-PCR试剂盒进行分析。用SybrGreen I检测模式通过定量PCR，用TAKARA公司提供的SYBR green I萤光染料测定SERPINH1的转录水平。

(3)克隆SERPINH1基因

首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂提取总RNA。用SERPINH1引物：5‘atgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’，通过Invitrogen公司提供的RT-PCR试剂盒，按照该公司提供的实验步骤扩增SERPINH1基因，通过Invitrogen胶提取试剂盒提取扩增的SERPINH1基因片段。然后通过Invitrogen公司提供的pCDNA_3.1 His/V5 ToPo载体，根据该公司提供的实验步骤将SERPINH1基因克隆到pCDNA31 His/V5 ToPo载体。最后，通过测序确定SERPINH1序列(上述列出的序列)。

(4)对筛选的肿瘤相关免疫耐受相关基因功能进一步鉴定

1)、用载有免疫耐受基因SERPINH1载体与pNF-KappaB-Seap报告基因(CloneTech公司)通过lipofectin2000(Invitrogen)共同转染RAW264.7细胞，然后用1μg/mlLPS或25μg/mlPolyI:C刺激，24小时后吸取上清。上清液用clonetech公司提供的“Great Esc Ape SEAPChemilumine Scence”检测试剂盒，通过clonetech公司提供的方法和程序，分析上清液的化学发光强度(Chemilumine Scence)。

2)、肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1转染的RAW264.7，在600μg/ml G418选择条件下，建立稳定转染的细胞系。染色后通过流式细胞仪分析这些稳定转染的细胞表面刺激分子CD40、CD80和CD86及其它共刺激分子的表达。同时，分析这些稳定转染的细胞在不同的Toll-like受体连接键(1μg/ml LPS，25μg/ml Poly I:C 50μg/ml PGN和100nM B.DNA)的刺激后48小时细胞表面CD40、CD80、CD86和其它共刺激分子的表达。

3)、SERPINH1稳定转染的RAW264.7细胞系的总RNA按照Invitrogen公司提供的方法与步骤，用Trizol试剂提取RNA。总RNA用于基因芯片分析SERPINH1对细胞因子、化学趋化因子及细胞内信号系统的表达的影响。

4)、沉寂SERPINH1基因对肿瘤相关免疫耐受树突细胞引导T调节细胞CD4+CD25+细胞的影响。应用AMAXA公司提供的siRNA树突细胞转染试剂盒，按照该公司提供的试剂盒进行转染。靶向免疫耐受基因SERPINH1的siRNA转染的卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞与鼠脾Naive T细胞共同培养10天后，流式细胞仪分析CD4+CD25+T调节细胞的比例。

SERPINH1靶序列1#：AACACTACAACTGCGAACACT；

siRNA序列：sense strand siRNA：CACUACAACUGCGAACACUtt和antisense strandsiRNA：AGUGUUCGCAGUUGUAGUGtt；

SERPINH1靶序列2#：AACTACTATGACGACGAGAAG；

siRNA序列：sense strand siRNA：CUACUAUGACGACGAGAAGtt和antisense strandsiRNA：CUUCUCGUCGUCAUAGUAGtt；

对照siRNA：上述siRNA的人工突变形式(ΔsiRNA)：siRNA序列：sense strand siRNA：CAGUACCACUGCGAACACUtt和antisense strand siRNA：AGUGUUCGCAGUGGUACUGtt；(正义链和反义链)。

用德国生产的Nucleofector核酸转染仪(AMAXA公司)转染树突细胞。评价对树突细胞的影响。

5)、沉寂SERPINH1基因对树突细胞抗原呈递功能的影响。靶向免疫耐受基因SERPINH1的siRNA转染的卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞，装载类乳头瘤病毒质粒后刺激类乳头瘤病毒颗粒特异的T细胞反应。通过ELISA试剂盒测定上清液IFN-γ的浓度。

6)、沉寂SERPINH1基因对树突细胞抵抗肿瘤对树突细胞的影响。用SBI SystemBiosciences公司提供的Double-Promoter pFIV-H₁/U₆ siRNA克隆和表达质粒，按照该公司提供的实验步骤组建了靶向SERPINH1基因的慢病毒感染系统。siRNA模版的设计和插入完全按照SBI System Biosciences公司提供的方法和步骤进行。

SERPINH1 siRNA模版1#：5’cacaagctct ccagcctcat catc-3’和3’gtgttcgagaggtcggagtagtag-5’；SERPINH1 siRNA模版2#：5’-ctgcgcgatgaggaggtgcacacg-3’和3’gacgcgctactcctccacgtgtgc-5’。

对照siRNA模版：上述siRNA模版的突变形式(ΔsiRNA)：cacacgctct ccagcctcat cagc-3’和3’gtgtgcgagaggtcggagtagtcg-5’。

利用携带靶向SERPINH1基因siRNA慢病毒转染树突细胞，同时设靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒对照。用慢病毒转染树突细胞，得到不同转染的树突细胞与卵巢癌细胞在10％FCS1640培养基，37℃下共同培养，一周后，观察树突细胞的形态、结构和抗原刺激分子和抗原呈递功能分析。

本发明提供了一个非常有效的治疗免疫耐受相关疾病功能基因SERPINH1的筛选与鉴定方法，在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病研究有着重要的意义。通过体外培养建立了制备人免疫耐受树突细胞的方法。对肿瘤相关免疫耐受树突细胞遗传背景分析，筛选和鉴定了免疫耐受功能基因。SERPINH1免疫耐受基因参与免疫耐受的引导，在免疫相关性疾病如抗移植排斥反应、肿瘤、炎症、自身免疫性疾病有着潜在的应用价值。

本发明的积极效果具体描述如下：

SERPINH1免疫耐受基因对肿瘤临床免疫治疗有着潜在的应用价值。肿瘤是危害人类身体健康的首要疾病之一，过去十年人们发展了多种抗肿瘤免疫治疗，特别是以树突细胞为基础的免疫治疗方法。但到目前为止，这些方法远没有达到人们的预期效果，一个重要的原因就是肿瘤对干细胞和树突细胞分化和功能的抑制。肿瘤细胞可通过直接接触，细胞因子的释放等因素引导树突细胞的耐受。树突细胞内免疫耐受基因的发现与鉴定，可通过siRNA沉寂或片段缺失等生物学技术，降低树突细胞内免疫耐受基因的表达，抵抗肿瘤细胞对树突细胞的抑制作用。这可成为肿瘤免疫治疗的一种新手段。

SERPINH1免疫耐受基因对移植排斥反应临床治疗有着潜在的应用价值。组织器官移植已成为医学上重要的治疗手段之一。临床上已开展同种肝脏、肾、脾、胰岛、小肠移植，以及肝肾、肝胰、心肺、等联合移植。由于移植物通常取自遗传背景不同的另一个体，移植后常出现排斥反应。建立受者对移植物组织抗原的免疫耐受是移植学家追求的目标。树突细胞控制着免疫反应，免疫耐受基因SERPINH1基因转染的树突细胞具有引导免疫耐受的功能，可通过SERPINH1转染修饰的树突细胞治疗移植排斥反应。

SERPINH1免疫耐受基因对自身免疫性疾病，超敏性疾病和感染性疾病的临床治疗有着潜在的应用价值。树突细胞是最重要的抗原呈递细胞，这些细胞不仅能够引导免疫反应，也能引导免疫耐受，SERPINH1转染或靶向这些基因的siRNA转染的树突细胞可成为这些疾病治疗的一种新手段。

此外，随着现代生物材料的发现如纳米材料，SERPINH1免疫耐受基因以及靶向这些基因siRNA可直接靶向到树突细胞，发挥免疫调节功能，治疗与免疫有关的疾病如自身免疫性疾病、抗排斥反应、肿瘤等。

附图说明

图1、肿瘤相关免疫耐受树突细胞不具备成熟树突细胞的特征。

图2、SERPINH1在肿瘤相关免疫耐受树突细胞高水平表达。

图3、肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1抑制免疫激活因素对转录因素的激活。

图4、肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1抑制刺激分子CD40的表达。

图5、沉寂SERPINH1降低了肿瘤相关树突细胞引导T调节CD4+CD25+细胞产生的能力。

图6、沉寂SERPINH1促进了肿瘤相关树突细胞抗原呈递功能。

图7携带靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒转染促进了树突细胞抵抗肿瘤细胞的抑制作用。

图8、携带靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒转染促进了肿瘤相关免疫耐受树突细胞抗原呈递功能。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。

实施例1

免疫耐受树突细胞的制备。

具体制备方法：

1.1.实验材料：

1)、培养基是含有10％小牛血清(民海生物公司)的PRMI1640培养基(Hyclone公司)，同时加入1％青霉素与1％链霉素。(Sigma公司)(重量)，以下记载中的培养基都是该培养基。

2)、卵巢肿瘤细胞是从鼠卵巢肿瘤组织分离的肿瘤细胞；卵巢肿瘤细胞由Dr.KatherineRoby提供。为了决定肿瘤相关免疫耐受树突细胞的诱导是通过细胞与细胞的直接接触还是肿瘤细胞本身分泌的因素，我们对卵巢癌细胞进行了如下处理：

A、用14000 Rad Co₆₀照射卵巢癌细胞。这类细胞被用于评价细胞与细胞的直接接触的影响。

B、卵巢癌细胞的培养上清液。培养卵巢癌细胞4天上清液被用于调节细胞分泌因素的影响。

C、未经处理的卵巢癌细胞被用于评价细胞与细胞的直接作用与细胞的分泌物对树突细胞的影响。

3)、树突细胞是由骨髓细胞在GM-CSF因子(R&D公司)的作用下，引导产生。4-6周健康C57BL/6(购自解放军军事医学科学院)小鼠，断颈处死后，取骨髓细胞，用消毒蒸馏水溶解去除红细胞后，这些骨髓细胞培养在1000单位GM-CSF，10％FCSRPMI1640培养基中。培养4天的骨髓起源的树突细胞作为未成熟的树突细胞。

1.2.免疫耐受树突细胞的引导。

A.培养4天的未成熟的树突细胞，用生理盐水洗三次，在24孔板分别与鼠卵巢癌肿瘤细胞，已照射卵巢癌细胞或卵巢癌细胞上清液共同培养9天。卵巢肿瘤细胞与树突细胞的比例为1∶10。卵巢癌细胞上清液与新鲜培养基的比例是1∶3。

B.9天后这些处理的树突细胞通过流式细胞仪与卵巢癌细胞分离。用2μl FITC萤光素标记的CD80抗体(BD PharMingen公司)染卵巢肿瘤细胞与树突细胞，然后通过流式细胞仪从卵巢肿瘤细胞与树突细胞的混和培养，分离树突细胞。在这个共同培养系统，9天后，肿瘤细胞多数自动消失，不需要近一步流式细胞仪分离。树突细胞对照。未与肿瘤细胞共同培养的树突细胞作为对照细胞，为了保证对照树突细胞的可比性，用2μl FITC萤光素标记的CD80抗体染色后也通过流式细胞仪分离以排除其他污染的细胞。

1.3、免疫耐受树突细胞的鉴定。

A.首先对免疫耐受树突细胞的形态结构进行了观察，肿瘤相关免疫耐受树突细胞不具备成熟树突细胞的特征。图1、肿瘤相关免疫耐受树突细胞不具备成熟树突细胞的特征。

B.免疫耐受树突细胞表达低水平的刺激分子。为了决定肿瘤相关免疫耐受树突细胞共刺激分子CD40、CD80和CD86的表达，肿瘤相关免疫耐受树突细胞用生理盐水洗三次后，分别加2μl FITC萤光素标记的抗CD40、CD80和CD86抗体，流式细胞仪分析。图1B显示了肿瘤相关免疫耐受树突细胞降低的共刺激分子的表达(a：抗体亚型对照；b：对照组树突细胞；c：肿瘤相关免疫耐受树突细胞)。

C.免疫耐受树突细胞具有相对较低的抗原呈递功能和降低的引导免疫特异反应的能力。

为了观察肿瘤相关的免疫耐受树突细胞的抗原工呈递功能，按照我们以前的方法(J.Virology，2004，11152-11160)，用类乳头瘤病毒质粒(VLP)免疫鼠引导的特异性T细胞被用作靶细胞(2×10⁶)，肿瘤相关免疫耐受树突细胞与对照树突细胞在装载类乳头瘤病毒质粒(VLP)后作为刺激细胞。共同培养48小时，取上清，通过酶联试剂盒(R&D Co.)分析上清液中的IFN-γ含量。结果显示了免疫耐受树突细胞具有相对较低的抗原呈递功能和降低的引导免疫特异反应的能力(图1C)。

图1、肿瘤相关免疫耐受树突细胞不具备成熟树突细胞的特征。A、光镜下的肿瘤相关免疫耐受树突细胞，A1：对照组树突细胞；A2：肿瘤相关免疫耐受树突细胞。B、肿瘤相关免疫耐受树突细胞共刺激分子的表达，a：抗体亚型对照；b：对照组树突细胞；c：肿瘤相关免疫耐受树突细胞。C、肿瘤相关免疫耐受树突细胞降低的抗原呈递能力，DC：对照树突细胞；T.DC肿瘤相关的免疫耐受树突细胞；Contr.：仅树突细胞。DC∶T：树突细胞与T细胞的比率。

2.免疫耐受树突细胞内免疫耐受基因的鉴定。

本发明为了决定或鉴定肿瘤相关的免疫耐受基因，对肿瘤相关性树突细胞总RNA通过基因芯片进行了分析。首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂(购自Invitrogen公司)提取总RNA。

2.1.基因芯片分析方法：

A、5μg总RNA用于合成单股cDNA。用寡核苷酸和dT作为引物(Proligo，Boulder，co)以及SuperScript choice合成单股cDNA，然后合成双股cDNA。

B、双股cDNA通过苯酚-氯仿(两种液体等体积)抽提后，利用BioArray RNA high yieldTranscript labeling试剂盒(Inzo Bioche)。通过体外转录产生Biomylated anti-sense cRNA。15mg的Biotimylated cRNA在94℃处理35分钟(100mM Trix-acetate，PH8.2，500mM KoAc，150mMMgOAc)，随后10ug总的处理过的cRNA在45℃下与Affymetrix(Affymetrix，Inc.)人基因组基因芯片杂交，轻轻摇动(60rpm)16小时。用Affymetrix Fluidics Station400洗染芯片除去未杂交的cRNA，然后用streptavidin-PE结合Biotimylated cRNA，再与羊抗-streptavidin Ab孵育。用Hewlett-Packard G2500 GeneArray检测荧光强度。用MicroArray Suite 5.0软件(Affymetrix)对每个基因芯片进行图像分析。为了比较不同的芯片，使用全球尺度，确定150作为荧光强度值。

C、为了确保来自不同样本的可比性，我们采用芯片分析系统Agilent Bioanalyzer(PaloAlto，CA)Agilent 2100 Bioanalyzer与“Lab on a chip”(芯片实验室，这项技术)技术证实了所有样本有着类似的rRNA比率，18S和28S比率为1∶2和清晰的“run pattern”(电泳条带)。同样的，这个技术也被用于确认cRNA和已片段化的cRNA(fragmented cRNA)。为了确保杂交的质量，Genechip影像，不同芯片之间的比较，我们也研究了以下参数：等级参数(scaling factor)；背景；保留基因。为了评估质量控制，我们也比较了每个组不同上调与下调的百分比。起始表达结果是基于不同实验条件下的比较，试验组与对照组的表达水平至少显示2倍的变化，才被认为有意义。

2.2.通过对鼠肿瘤相关免疫耐受树突细胞与对照树突细胞相比较，正如图2显示的，一部分基因被上调，而另一部分基因下调。在这些卵巢肿瘤相关的免疫耐受基因(卵巢肿瘤上调或下调的基因)中，SERPINH1明显上调(图2A)。明显上调的SERPINH1基因在卵巢肿瘤相关的树突细胞的高水平表达由半定量PCR(图2B)和定量PCR(图2C)得到进一步证实。SERPINH1引物：5‘atgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’。

图2、SERPINH1在肿瘤相关免疫耐受树突细胞高水平表达。A、肿瘤相关免疫耐受树突细胞基因芯片分析。T.DC：肿瘤相关树突细胞；DC：对照树突细胞。B1和C1：SERPINH1在对照树突细胞的表达；B2和C2：SERPINH1在肿瘤相关树突细胞的表达。B、半定量PCR，C、定量PCR；R.E：相对强度；GAPDH：阳性保留基因对照。

3、SERPINH1免疫相关耐受基因的克隆。首先按照Invitrogen公司提供的步骤，从肿瘤相关性树突细胞用Trizol试剂提取总RNA。用SERPINH1引物：5‘atgcgctctctccttctgggcacc3’和3’caactcatctcgcatcttgtctcc5’。用Invitrogen提供的RT-PCR试剂盒进行分析，按照该公司提供的实验步骤扩增SERPINH1基因，通过Invitrogen胶提取试剂盒提取扩增的SERPINH1基因片段。然后通过Invitrogen公司提供的pCDNA_3.1 His/V5 ToPo载体，根据该公司提供的实验步骤将SERPINH1基因克隆到pCDNA_3.1 His/V5 ToPo载体。最后，通过测序确定SERPINH1序列。

4、对筛选肿瘤相关免疫耐受基因功能的确定。

4.1、肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1对转录因素的影响。

为了决定SERPINH1基因对免疫调节功能的影响。用载有免疫耐受基因SERPINH1的载体与pNF-KappaB-Seap报告基因(CloneTech公司)通过lipofectin2000(Invitrogen)共同转染RAW264.7细胞，然后用1μg/mlLPS或25μg/ml PolyI:C刺激，24小时后吸取上清。上清液用clonetech公司提供的“Great Esc Ape SEAP Chemilumine Scence”检测试剂盒，通过clonetech公司提供的方法和程序，分析上清液的化学发光强度(Chemilumine Scence)。正如图3中所示的，SERPINH1明显抑制了LPS和PolyI:C对转录因素NF-kappaB的激活。

图3、肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1抑制免疫激活因素对转录因素的激活。RAW264.7：单核吞噬细胞系对照；TRAW264.7：SERPINH1转染的单核吞噬细胞。Contr：仅RAW264.7或TRAW264.7上清液；LPS：用1μg/ml LPS刺激RAW264.7或TRAW264.7上清液；Poly I:C：用25μg/ml Poly I:C刺激RAW264.7或TRAW264.7上清液。化学发光强度由克隆公司提供的试剂盒检测。

4.2、肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1对共刺激分子表达的影响。

肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1转染的RAW264.7，在600μg/ml G418选择条件下，建立稳定转染的细胞系。染色后通过流式细胞仪分析这些稳定转染的细胞表面刺激分子CD40、CD80和CD86及其它共刺激分子的表达。同时，分析这些稳定转染的细胞在不同的Toll-like受体连接键(1μg/ml LPS，25μg/ml Poly I:C 50μg/ml PGN和100nM B.DNA)的刺激后48小时。细胞表面CD40、CD80、CD86和其它共刺激分子的表达。如图4所示。SERPINH1转染明显降低了RAW264.7对Toll-like受体连接键刺激的反应能力，降低了CD40的表达。图4、肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1抑制刺激分子CD40的表达。a：抗体亚型对照；b：肿瘤相关免疫耐受基因转染的单核吞噬细胞；c：未转染的单核吞噬细胞对照。SERPINH1基因转染与未转染的Raw264.7在给予100nM B.DNA，1μg/ml LPS，25μg/ml PGN，25μg/ml PolyI:C刺激48小时后，CD40的表达。

4.3、肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1对细胞因子、化学趋化因子、细胞内信号系统分子表达的影响。SERPINH1稳定转染的RAW264.7细胞系的总RNA按照invitrogen公司提供的方法与步骤，用Trizol试剂提取。总RNA用于基因芯片分析。与对照未转染的RAW264.7细胞相比，SERPINH1明显影响了一些细胞因子、化学趋化因子及细胞内信号系统的表达(表1-3)。

表1、肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1对细胞因子及相关基因表达的影响。

表2、肿瘤相关免疫抑制基因SERPINH1对化学趋化因子及其相关基因表达的影响。

表3、肿瘤相关免疫抑制基因SERPINH1对细胞内信号系统相关分子表达的影响。

表1-3：转染SERPINH1基因的Raw264.7的基因芯片分析：Contr：未转染SERPINH1基因的Raw264.7细胞。SERPINH1：转染SERPINH1基因的Raw264.7细胞。

4.4、沉寂肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1的siRNA抑制肿瘤相关免疫耐受细胞引导CD4+CD25+T调节细胞的产生。应用AMAXA公司提供的siRNA树突细胞转染试剂盒，按照该公司提供的试剂盒进行转染。靶向免疫耐受基因SERPINH1的siRNA转染的卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞与鼠脾Native T细胞共同培养10天后，流式细胞仪分析CD4+CD25+T调节细胞的比例，结果显示了免疫耐受基因siRNA沉寂树突细胞免疫抑制基因的表达，明显抑制了CD4+CD25+T调节细胞的产生(图5)。SERPINH1靶序列1#：AACACTACAACTGCGAACACT；siRNA序列：sense strand siRNA：CACUACAACUGCGAACACUtt和antisense strand siRNA：AGUGUUCGCAGUUGUAGUGtt；SERPINH1靶序列2#：AACTACTATGACGACGAGAAG；siRNA序列：sense strand siRNA：CUACUAUGACGACGAGAAGtt和antisense strand siRNA：CUUCUCGUCGUCAUAGUAGtt；对照siRNA：上述siRNA的人工突变形式(ΔsiRNA)：siRNA序列：sense strand siRNA：CAGUACCACUGCGAACACUtt和antisense strand siRNA：AGUGUUCGCAGUGGUACUGtt：用德国生产的AMAXAsiRNA转染仪转染树突细胞。图5、沉寂SERPINH1降低了肿瘤相关树突细胞引导T调节CD4+CD25+细胞产生的能力。T.siRNADC：靶向SERPINH1基因siRNA转染的肿瘤相关树突细胞；T.MsiRNA：对照siRNA转染的肿瘤相关树突细胞。

4.5、沉寂SERPINH1促进了肿瘤相关树突细胞抗原呈递功能。靶向免疫耐受基因的SERPINH1siRNA转染的卵巢肿瘤相关免疫耐受树突细胞装载类乳头瘤病毒质粒能够刺激类乳头瘤病毒颗粒特异的T细胞反应，引导IFN-γ的产生。如图6所示的，IFN-γ水平明显高于对照siRNA(ΔsiRNA)感染的树突细胞。图6、沉寂SERPINH1促进了肿瘤相关树突细胞抗原呈递功能。

4.6、携带靶向SERPINH1基因siRNA慢病毒转染促进了树突细胞抵抗肿瘤细胞的抑制作用。为了进一步决SERPINH1免疫耐受基因对树突细胞功能的影响，建立了携带靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒感染系统。SBI System Biosciences公司提供的Double-Promoter pFIV-H₁/U₆ siRNA克隆和表达了质粒。siRNA模版的设计和插入完全按照SBI System Biosciences公司提供的方法和步骤进行。SERPINH1siRNA模版1#：5’cacaagctctccagcctcat catc-3’和3’gtgttcgagaggtcggagtagtag-5’；SERPINH1siRNA模版2#：5’-ctgcgcgatgaggaggtgcacacg-3’和3’gacgcgctactcctccacgtgtgc-5’。对照siRNA模版：上述siRNA模版的突变形式(ΔsiRNA)：cacacgctct ccagcctcat cagc-3’和3’gtgtgcgagaggtcggagtagtcg-5’。转染率可通过自身GFP的表达检测。利用携带靶向SERPINH1基因siRNA慢病毒转染树突细胞，同时设靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒对照。用慢病毒转染树突细胞，如图7，90％的树突细胞转染。得到不同转染的树突细胞与卵巢癌细胞共同培养，一周后，观察了树突细胞的形态、结构和抗原刺激分子。结果清楚地展示了，携带靶向肿瘤免疫耐受基因siRNA的慢病毒，明显抵抗卵巢癌细胞对树突细胞的影响，而携带对照siRNA的慢病毒则不能抵抗卵巢癌肿瘤细胞对树突细胞的抑制效果，导致耐受性树突细胞的产生(图7)。图7携带靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒转染促进了树突细胞抵抗肿瘤细胞的抑制作用。A：整合靶向肿瘤相关免疫耐受基因SERPINH1siRNA的慢病毒转染树突细胞。A1、光镜下树突细胞；A2、GFP在慢病毒转染的树突细胞的表达。ΔsiRNA：对照siRNA慢病毒转染的树突细胞；siRNA：SERPINH1siRNA慢病毒转染的树突细胞。

4.7、靶向免疫耐受基因siRNA促进了树突细胞的抗原呈递功能。

靶向SERPINH1基因siRNA慢病毒转染的树突细胞具有较强的抗原呈递功能，装载类乳头瘤病毒质粒的不同siRNA慢病毒转染的树突细胞能够刺激类乳头瘤病毒颗粒刺激的T细胞反应。如图8所示的，IFN-γ水平明显高于携带对照siRNA慢病毒感染的树突细胞。图8、携带靶向SERPINH1基因siRNA的慢病毒转染促进了树突细胞抵抗肿瘤细胞的抑制作用。DC：对照组树突细胞；T.DC：肿瘤相关免疫耐受树突细胞；T.siRNADC：靶向SERPINH1基因siRNA慢病毒转染的肿瘤相关树突细胞；T.ΔsiRNA：对照siRNA慢病毒转染的肿瘤相关树突细胞；仅树突细胞：仅对照树突细胞和转染树突细胞。DC∶T：树突细胞与T细胞的比率。

4.8、肿瘤免疫耐受基因抑制免疫刺激因素引导的树突细胞成熟。免疫刺激因素如Toll-like受体连接键(LPS、Poly I:C、CPG和PGN)能够激活NF-KappaB信号途径，引导树突细胞的成熟。肿瘤免疫耐受基因SERPINH1转染的单核细胞RAW264.7能够抵抗这些Toll-like受体连接键对转录因素NF-KappaB的激活作用，阻止共刺激分子的表达(图3、图4)。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>筛选与鉴定治疗免疫耐受相关疾病功能基因SERPINH1的方法

<130>2006023

<160>1

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1254

<212>DNA

<213>小鼠mouse

<400>1

atgcgctctc tccttctggg caccttatgc ctcttggccg tggccctggc agccgaggtg    60

aagaaacccc tagaggcggc agcccctggt actgcggaga agctaagttc caaggcgacc    120

acactggcag agcgcagcac aggcctggcc ttcagcctat atcaggcgat ggccaaagac    180

caggcggtgg agaacatcct cctgtcaccc ttggtggtgg cctcatccct gggtcttgtg    240

tcactgggtg gtaaagccac cacagcgtcg caggcgaagg cagtgctgag cgctgagaag    300

ctgcgcgatg aggaggtgca cacggggctg ggtgagctgc tccgctccct cagcaactcc    360

actgcgcgca acgtgacctg gaaactgggc agccgcctgt acgggcccag ctccgtgagc    420

ttcgccgatg acttcgtgcg cagcagcaag caacactaca actgcgaaca ctccaagatc    480

aacttccgag acaagcgcag cgccctgcag tccatcaacg agtgggcctc gcagaccacg    540

gacggcaagc tgcctgaggt caccaaggat gtggagcgca cggatggggc actgcttgtg    600

aacgccatgt tctttaagcc acactgggat gagaggtttc accacaggat ggtggacaac    660

cgtggcttca tggtgacccg ctcctatact gtgggtgtta cgatgatgca ccggacaggc    720

ctgtacaact actatgacga cgagaaggag aagctgcaga tggtggagat gcccctggct    780

cacaagctct ccagcctcat catcctcatg ccccaccatg tggagccgct cgagcgcttg    840

gagaagctgc tgaccaagga gcagctgaag gcctggatgg gaaagatgca gaagaaggct    900

gtcgccatct ccctgcccaa gggcgtggtg gaggtgaccc atgacctgca gaaacatctg    960

gcaggactgg gcctgaccga agccatcgac aagaacaagg cagacctatc gcgcatgtct    1020

ggcaagaagg acctgtacct ggccagtgtg ttccacgcca ctgccttcga gtgggacacc    1080

gagggcaacc cctttgacca agacatctac gggcgcgagg agctgcgcag ccccaagctg    1140

ttctatgccg accacccctt catcttcctg gtgcgagata atcagagcgg ctccttgctc    1200

ttcattggcc gcctggtccg gcccaaggga gacaagatgc gagatgagtt gtag          1254

Claims (1)

1.一种免疫耐受相关疾病基因SERPINH1的用途，应用于制备治疗肿瘤的药物。

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