PT2079481E - Combinações de péptidos para vacina contra a alergia a gatos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

COMBINAÇÕES DE PÉPTIDOS PARA VACINA CONTRA A ALERGIA A GATOS

Campo da Invenção [0001] A presente invenção diz respeito a composições que compreendem péptidos para a prevenção ou tratamento da alergia a gatos e, em particular, a combinações ideais de péptidos.

Antecedentes da Invenção [0002] O reconhecimento de antigénio pelos linfócitos T requer que as células apresentadoras de antigénio (APCs) apresentem fragmentos de antigénio (péptidos) nas suas superfícies celulares em associação com moléculas do complexo major de histocompatibilidade (MHC). Os linfócitos T utilizam os seus receptores específicos de antigénios (TCRs) para reconhecer os fragmentos de antigénio apresentados pelas APC.

Este reconhecimento actua como um estímulo para o sistema imunitário gerar uma variedade de respostas para erradicar o antigénio que foi reconhecido.

[0003] O reconhecimento de antigénios externos pelo sistema imunitário de um organismo, como um ser humano, pode nalguns casos originar doenças, conhecidas como doenças atópicas. Exemplos disto são as doenças alérgicas, incluindo asma, dermatite atópica e rinite alérgica. Neste grupo de doenças, os linfócitos B geram anticorpos da classe IgE (em humanos) que se liqam a antigénios derivados externamente, que são designados alergénios neste contexto uma vez que estas moléculas desencadeiam uma resposta 1 alérgica. A produção de IgE específica a um alergénio depende dos linfócitos T que também são activados pelo (são específicos ao) alergénio. Os anticorpos IgE específicos ao alergénio ligam-se à superfície das células, como basófilos e mastócitos, em virtude da expressão por estas células de receptores de superfície para IgE.

[0004] A ligaçao cruzada de moléculas de IgE ligadas à superfície por um alergénio resulta na desgranulação destas células efectoras causando a libertação de mediadores inflamatórios como histamina, 5-hidroxitriptamina e mediadores lipídicos, tais como sulfidoleucotrienos. Para além dos eventos dependentes da IgE, algumas doenças alérgicas como a asma são caracterizadas por eventos independentes da IgE.

[0005] As doenças alérgicas mediadas pela IgE são actualmente tratadas com agentes que fornecem alívio ou prevenção dos sintomas. Exemplos destes agentes são anti-histamínicos, agonistas β2 e glucocorticosteróides. Além destes, algumas doenças mediadas pela IgE são tratadas com procedimentos de dessensibilização que envolvem a injecção periódica de componentes ou extractos alergénicos. Os tratamentos de dessensibilização podem induzir uma resposta IgG que compete com IgE por alergénio, ou podem induzir linfócitos T supressores específicos que bloqueiam a síntese de IgE direccionada contra o alergénio. Esta forma de tratamento nem sempre é eficaz e apresenta o risco de provocar efeitos secundários graves, particularmente choque anafiláctico. Este pode ser fatal a menos que seja detectado imediatamente e tratado com adrenalina. Um tratamento terapêutico que reduzisse ou eliminasse a resposta alérgica-imunitária indesejada a um alergénio específico, sem alterar a reactividade imunitária a outros 2 antigénios estranhos nem desencadear uma resposta alérgica, seria de grande benefício para os indivíduos alérgicos.

[0006] Aproximadamente 10% da população humana é alérgica a gatos (Felis domestícus) e até 67% dos doentes asmáticos são sensíveis a alergénios de gatos. O principal alergénio produzido por gatos é a glicoproteína Fel dl, que desencadeia uma resposta em 90-95% dos doentes que sofrem de alergia a gatos. Um tratamento terapêutico ou preventivo seria altamente benéfico para humanos que sofrem ou estão em risco de sofrer de alergia a gatos.

[0007] Na patente WO 99/34826 são revelados métodos terapêuticos envolvendo a administração de composições que compreendem 13 péptidos derivados de Fel dl. A indução de uma população de linfócitos T com actividade regulatória após a administração de uma composição que contém 12 polipéptidos derivados de Fel dl é revelada por Verhoel et al (PloS Medicine, 2005, Vol. 2(3), p253-261). Os efeitos de uma série de péptidos individuais derivados de Fel dl na proliferação e características de libertação de citocinas de células mononucleares de sangue periférico são revelados por Haselden et al (J Allergy Clin Immunol, 2001,Vol.108(3), p349-356).

Resumo da Invenção [0008] Os presentes inventores descobriram que determinadas combinações de fragmentos peptídicos da proteína Fel dl são particularmente úteis na dessensibilização de indivíduos ao alergénio Fel dl. As combinações de polipéptidos da invenção foram seleccionadas pela sua capacidade de se ligarem a muitas moléculas do MHC de Classe II e causam a proliferação de linfócitos T com libertação mínima de histamina. As composições, produtos, 3 vectores e formulações da invenção podem assim ser fornecidas a indivíduos para prevenir ou tratar a alergia a gatos por criação de tolerância.

[0009] Os polipéptidos da invenção foram inicialmente seleccionados como epitopos potenciais do linfócito τ através da utilização de ensaios de ligação do péptido ao MHC. Ver, por exemplo, a Figura 1 que demonstra a capacidade de uma série de péptidos derivados de Fel dl, cadeias 1 e 2, de se ligarem a múltiplos tipos de DR em ensaios de ligação do MHC de classe II. Estes polipéptidos candidatos foram então examinados para utilização potencial na criação de tolerância.

[0010] Uma dificuldade associada a abordagens à dessensibilização com base na imunização com péptidos reside em como seleccionar um tamanho adequado e região do alergénio como base para o péptido ser usado em imunização. O tamanho do péptido seleccionado é crucial. Se o péptido for pequeno demais, a vacina não será eficaz na indução de uma resposta imunológica. Se os péptidos forem grandes demais ou se o antigénio inteiro for introduzido num indivíduo, há o risco de induzir reacções adversas, como anafilaxia, que pode ser fatal.

[0011] Os polipéptidos da invenção foram seleccionados para conservar a especificidade dos linfócitos T ao mesmo tempo que são suficientemente pequenos para não possuir uma estrutura terciária significativa que lhes permitisse manter a conformação de um epítopo de ligação a IgE da molécula inteira. Assim, os polipéptidos da invenção não induzem a ligação cruzada significativa das moléculas IgE adjacentes específicas em células como mastócitos e 4 basófilos e consequentemente não causam uma libertação significativa de histamina.

[0012] Os péptidos da invenção são vantajosos na medida em que aquando da administração de uma amostra de linfócitos T estes ocasionam a proliferação de linfócitos T ao mesmo tempo que desencadeiam uma libertação minima de histamina. Isto é demonstrado no Exemplo 2. Os polipéptidos da invenção são capazes de induzir uma resposta de fase tardia num indivíduo alérgico a gatos. A composição, produtos e formulações da invenção compreendendo estes polipéptidos ou polinucleótidos que são capazes de expressar estes polipéptidos são assim úteis e eficazes na redução da hipersensibilidade ao alergénio Fel dl em indivíduos que foram sensibilizados a este alergénio.

[0013] Outra vantagem da invenção é a capacidade das combinações de péptidos atingirem amplamente as moléculas do complexo major de histocompatibilidade (MHC). Os receptores de linfócitos T (TCRs) são altamente variáveis na sua especificidade. A variabilidade é gerada, como no caso de moléculas de anticorpos, através de eventos de recombinação dos genes dentro da célula. Os TCRs reconhecem o antigénio sob a forma de péptidos curtos ligados a moléculas codificadas pelos genes do complexo major de histocompatibilidade (MHC). Estes produtos de genes são as mesmas moléculas que originam os "tipos de tecidos" usados nos transplantes e também são designados de antigénios leucocitários humanos (HLAs), expressões que podem ser usadas indistintamente. As moléculas individuais do MHC possuem fendas de ligação peptídicas que, devido ao seu formato e carga, só são capazes de se ligar a um grupo limitado de péptidos. Os péptidos ligados por uma molécula 5 do MHC podem não ser necessariamente ligados por outras moléculas do MHC.

[0014] Quando uma molécula de proteína como um antigénio ou um alergénio é capturada por células apresentadoras de antigénio, tais como linfócitos B, células dendríticas, monócitos e macrófagos, a molécula é degradada enzimaticamente dentro da célula. O processo de degradação dá origem a fragmentos peptídicos da molécula que, se tiverem o tamanho, carga e formato adequados, podem então ligar-se dentro da fenda de ligação peptídica de determinadas moléculas do MHC e ser subsequentemente exibidas na superfície de células apresentadoras de antigénio. Se os complexos péptido/MHC estiverem presentes na superfície da célula apresentadora de antigénio em quantidade suficiente podem então activar linfócitos T que comportam os receptores de linfócitos T adequados específicos do péptido/MHC.

[0015] Devido à natureza polimórfica do MHC, os indivíduos numa população não consanguínea como a humana irão expressar combinações diferentes de moléculas MHC nas respectivas superfícies celulares. Uma vez que moléculas MHC diferentes podem ligar-se a diferentes péptidos a partir da mesma molécula com base no tamanho, carga e formato do péptido, indivíduos diferentes irão apresentar um repertório diferente de péptidos ligados às suas moléculas MHC. A identificação de epítopos de péptidos universais de ligação ao MHC numa população não consanguínea como a humana é mais difícil do que no caso de animais de populações consanguíneas (como determinadas estirpes de ratinhos de laboratório). Devido à expressão diferencial do MHC entre indivíduos e às diferenças inerentes na ligação peptídica e na respectiva 6 apresentação, é pouco provável que seja possível identificar um péptido único que seja útil na terapêutica de dessensibilização em humanos.

[0016] A combinação de péptidos da invenção, contudo, oferece uma ampla cobertura de eficácia na população humana ao direccionar-se à maioria dos MHC da população. Não será necessário, por exemplo, tipificar o doente ou indivíduo para determinar que moléculas MHC de Classe II este possui de modo a determinar que péptido ou combinação de péptidos serão eficazes. Deste modo, uma vacina formulada com os péptidos da invenção teria uma ampla utilidade.

[0017] A invenção fornece: • Uma composição para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos num indivíduo por criação de tolerância, que compreende os polipéptidos CPAVKRDVDLFLT (SEQ N.° ID 1); EQVAQYKALPVVLENA (SEQ. N.° ID: 2); KALPVVLENARILKNCV (SEQ. N.° ID 3); RILKNCVDAKMTEEDKE (SEQ. N.° ID 4); KENALSLLDKIYTSPL (SEQ. N.° ID 5); TAMKKIQDCYVENGLI (SEQ. N.° ID 6); SRVLDGLVMTTISSSK (SEQ. N.° ID 7) ; em que um ou mais dos péptidos podem ser substituídos por uma variante ou fragmento do péptido substituído, em que: 7 (a) a variante é um polipéptido que compreende duas ou mais substituições conservadoras de aminoácidos comparativamente ao péptido substituído, ou (b) a variante é um polipéptido com pelo menos 90% de identidade ao polipéptido substituído, ou (c) o fragmento é um polipéptido derivado por deleção de um ou dois aminoácidos da extremidade N-terminal ou da extremidade C-terminal, ou de um aminoácido da extremidade N-terminal ou da extremidade C-terminal do péptido substituído, e em que (i) a referida variante ou fragmento é capaz de causar uma resposta imune que dessensibiliza o indivíduo à proteína Fel dl, e (ii) nenhum outro péptido está presente na composição.

Uma composição para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância que consiste em sequências de polinucleótidos que quando expressos causam a produção de uma composição de polipéptidos, conforme indicado acima.

Um vector de expressão para utilização na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância que consiste em sete sequências de polinucleótidos diferentes, em que cada sequência de polinucleótido codifica um dos polipéptidos das SEQ. N.°s ID 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, em que cada sequência de polinucleótidos está operacionalmente ligada a uma sequência de controlo que permite a expressão da sequência de codificação.

Um produto para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância que consiste nos polipéptidos da composição polipeptídica acima descrita, em que cada polipéptido diferente se destina a utilização simultânea, independente ou sequencial na prevenção ou tratamento da alergia a gatos num humano. • Um produto para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância que consiste em polinucleótidos capazes de expressar os diferentes polipéptidos da composição polipeptídica acima descrita, em que cada polinucleótido se destina a utilização simultânea, independente ou sequencial na prevenção ou tratamento da alergia a gatos num humano. • Uma formulação farmacêutica para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância, que compreende uma composição, vector ou produto, conforme referido acima; e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. • Uma composição ou produto conforme definido acima, que compreende adicionalmente outro antigénio polipeptídico para uso na criação de tolerância num indivíduo a esse antigénio, em que o referido antigénio polipeptídico é diferente de FelDl. • Um método in vitro para determinar se um indivíduo tem ou está em risco de ter uma doença que se caracteriza por sintomas alérgicos em resposta a um alergénio de gato, método esse que compreende testar se o indivíduo tem linfócitos T que respondem a uma composição de acordo com a invenção, determinando assim se o indivíduo tem ou está em risco de ter a doença.

Descrição das figuras [0018] 9

Figura 1 - Péptidos derivados de Fel dl, cadeias 1 e 2, foram testados quanto à capacidade de se ligarem a múltiplos tipos de DR em ensaios de ligação do MHC de classe II. Os péptidos que revelaram caracteristicas de ligação promíscuas foram seleccionados e combinados para gerar misturas de péptidos que se ligam a uma ampla população de tipos de MHC de classe II.

Figura 2 - Representação gráfica de misturas de péptidos mostrando aqueles que se ligam a uma ampla população de tipos de MHC de classe II.

Figura 3 - Proliferação: percentagem de respondedores e qualidade da resposta. A Figura 3 sumaria as respostas proliferativas a péptidos e antigénios. A percentagem de indivíduos que apresentam uma resposta proliferativa detectável é mostrada nas barras a preto. As barras cinzentas (resposta fraca), brancas (resposta moderada) e quadriculadas (resposta forte) fornecem uma análise detalhada da qualidade das respostas. A qualidade é arbitrariamente definida pelo índice de Estimulação (SI: razão das contagens na presença de antigénio/péptido dividido pelas contagens apenas em meio). Assim, para o péptido 1 (MLA01), 12% dos sujeitos apresentaram uma resposta proliferativa e destas, 92% foi fraca, nenhuma foi moderada e 8% foi elevada. As respostas proliferativas aos péptidos/antigénios individuais foram variáveis (barra a preto). 92% dos sujeitos apresentaram respostas proliferativas positivas ao antigénio PPD de controlo positivo. A maioria destas foram respostas fortes (barra a quadriculado). 75% dos sujeitos responderam a extracto de pêlo de gato, 59% destas respostas sendo fracas (ou seja, 59% dos 75%). A resposta à mistura dos 7 péptidos preferidos (SEQ. N.°s ID: 1 A 7) foi quase idêntica à do extracto de pêlo de gato (CAT). 10

Figura 4- Percentagem de respondedores por citocina. A Figura 4 sumaria a percentagem de indivíduos que apresentaram uma resposta detectável a cada um dos péptidos/antigénios por produção das três citocinas medidas. 0 antigénio de controlo positivo PPD obteve produção de citocinas em quase todos os indivíduos (lFN-γ: 91%, IL-13: 97% e IL-10: 96%). 0 alergénio completo de gato e a mistura dos 7 péptidos obteve uma resposta das citocinas em aproximadamente 80% ou mais dos sujeitos. Péptidos individuais obtiveram respostas com frequências diferentes. No geral, a produção de citocinas pareceu ser um método mais sensível de detecção de respostas com percentagens maiores de indivíduos a apresentar respostas positivas às citocinas do que respostas proliferativas. Na maioria dos casos, a secreção de IL-10 foi detectada no maior número de sujeitos e a de IFN-γ foi detectada no menor número.

Figura 5 - Percentagem de indivíduos que produziram IFN-γ e intensidade da resposta após cultura celular com péptido/antigénio. Foram detectadas respostas de IFN-γ em 26-44% dos sujeitos em resposta aos péptidos individuais. Estas respostas foram predominantemente muito baixas, até baixas a moderadas. Antigénios complexos induziram respostas mais frequentes (mistura de péptidos 80%, pêlo de gato 79%, PPD 91 %) . Estas respostas foram de baixas até moderadas a altas. As respostas ao PPD foram particularmente elevadas (89 das respostas ao PPD foram superiores a 100 pg/ml).

Figura 6 - Percentagem de indivíduos que produziram IL-13 e intensidade da resposta após cultura celular com péptido/antigénio. Foram detectadas respostas de IL-13 em 33-68% dos sujeitos em resposta aos péptidos individuais. Estas respostas foram predominantemente muito baixas a 11 baixas, embora tenha sido detectado um número significativo de respostas moderadas. Isto pode reflectir a natureza Th2 da sensibilização alérgica nestes sujeitos. Antigénios complexos induziram respostas mais frequentes (mistura de péptidos 85%, pêlo de gato 93%, PPD 97%) . Estas respostas foram de baixas até moderadas a altas.

Figura 7 - Percentagem de indivíduos que produziram IL-10 e intensidade da resposta após cultura celular com péptido/antigénio. Foram detectadas respostas de IL-10 em 46-75% dos sujeitos em resposta aos péptidos individuais. Estas respostas foram predominantemente muito baixas a baixas. Antigénios complexos induziram respostas mais frequentes (mistura de péptidos 93%, pêlo de gato 96%, PPD 96%). Estas respostas foram de baixas a moderadas. Foram observadas muito poucas respostas "elevadas" de IL-10.

Figura 8 - Um gráfico representativo que mostra a área da LPSR média antes e depois do tratamento para os oito doentes na coorte de 12,0 nmol do ensaio clinico de uma mistura preferida de péptidos da invenção.

Descrição das sequências aqui referidas [0019] As SEQ. N.° ID 1 a 16 fornecem as sequências de polipéptidos da invenção. As SEQ. N.°s ID 1 a 16 correspondem aos péptidos MLA01, MLA03, MLA04, MLA05, MLA07, MLA12, MLA14, MLA02, MLA06, MLAll, MLA15, MLAl6, MLA08, MLA09, MLA10 e MLAl3, respectivamente, conforme representado nos Exemplos e na Fiqura 1. 12

Descrição detalhada da invenção [0020] A invenção fornece uma composição para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos num indivíduo por criação de tolerância, que compreende os polipéptidos 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, em que um ou mais dos péptidos pode ser substituído por uma variante ou fragmento do péptido substituído, e em que (i) a referida variante ou fragmento é capaz de causar uma resposta imune que dessensibiliza o indivíduo à proteína Fel dl, e (ii) nenhum outro péptido está presente na composição.

[0021] A invenção também fornece produtos e formulações que compreendem os polipéptidos da invenção e composições, produtos e vectores que compreendem polinucleótidos capazes de expressar os polipéptidos da invenção para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância.

Fragmentos peptídicos da proteína Fel dl [0022] O principal alergénio produzido pelo gato doméstico

Felis catus {Felis domestics) é a glicoproteína Fel dl. Esta proteína de 39 kDa é formada a partir de duas subunidades de 17 kDa, cada uma consistindo em dois péptidos ligados por ligação dissulfureto (Cadeia 1 e Cadeia 2 de Fel dl). A sequência de aminoácidos do Fel dl é apresentada na patente WO 91/06571. A principal fonte da proteína Fel dl são as glândulas sebáceas, embora a expressão também seja detectada nas glândulas salivares e nas glândulas anais. A função da proteína Fel dl é actualmente desconhecida, embora seja possivelmente uma proteína de ligação a feromonas. 13 [0023] Os péptidos da invenção são derivados de Fel dl. Os termos "péptido" e "polipéptido" são aqui usados indistintamente. Fel dl também é aqui designado como "o alergénio".

[0024] A composição da invenção consiste nos polipéptidos com as SEQ. N.°s ID 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7.

[0025] Por outras palavras, a invenção fornece uma composição para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância que consiste nos polipéptidos com as SEQ. N.°s ID 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 com as seguintes sequências de aminoácidos: CPAVKRDVDLFLT (SEQ. N.° ID 1); EQVAQYKALPVVLENA (SEQ. N.° ID: 2); KALPVVLENARILKNCV (SEQ. N.° ID 3); RILKNCVDAKMTEEDKE (SEQ. N.° ID 4); KENALSLLDKIYTSPL (SEQ. N.° ID 5); TAMKKIQDCYVENGLI (SEQ. N.° ID 6); SRVLDGLVMTTISSSK (SEQ. N.° ID 7); [0026] Outros péptidos de Fel dl são: LFLTGTPDEYVEQVAQY (SEQ N.° ID 8); KMTEEDKENALSLLDK (SEQ N.° ID 9); LTKVNATEPERTAMKK (SEQ N.° ID 10); ISSSKDCMGEAVQNTV (SEQ N.° ID 11); AVQNTVEDLKLNTLGR (SEQ N.° ID 12)

[0027] A invenção revela variantes de qualquer uma das SEQ 14 N.° ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Os fragmentos de péptidos de acordo com a invenção podem ser derivados por truncagem, p. ex. por remoção de um ou mais aminoácidos das extremidades N-terminal ou C-terminal de um polipéptido. Os fragmentos também podem ser gerados por uma ou mais deleções internas, desde que os 9 aminoácidos essenciais que compõem o epitopo do linfócito T não sejam substancialmente alterados.

[0028] Por exemplo, uma variante da SEQ N.° ID 1 pode compreender um fragmento da SEQ N.° ID 1, ou seja uma sequência mais curta. Isto pode incluir uma deleção de um, dois, três ou quatro aminoácidos da extremidade N-terminal da SEQ N.° ID 1 ou da extremidade C-terminal da SEQ N.° ID 1. Estas deleções podem ser efectuadas a partir de ambas as extremidades da SEQ N.° ID 1. Uma variante da SEQ N.° ID 1 pode incluir aminoácidos adicionais (por exemplo da sequência da proteína Fel dl) que se estendem para lá da extremidade (s) da SEQ N.° ID 1. Uma variante pode incluir uma combinação das deleções e adições acima discutidas. Por exemplo, os aminoácidos podem ser eliminados numa extremidade da SEQ N.° ID 1, mas podem ser adicionados aminoácidos adicionais à sequência proteica da Fel dl na outra extremidade da SEQ N.° ID 1. A mesma discussão das variantes acima também se aplica às SEQ N.° ID 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 e 12.

[0029] Um péptido variante pode incluir uma ou mais substituições de aminoácidos da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ N.° ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12, ou um fragmento destas. Um péptido variante pode compreender uma sequência com pelo menos 65% de identidade de sequência a pelo menos 9 ou mais aminoácidos contíguos em qualquer das SEQ N.° ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 11 ou 12. De preferência, uma variante adequada pode compreender pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% de identidade de aminoácidos com pelo menos 9 aminoácidos contíguos de qualquer uma das SEQ N.° ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Este nível de identidade de aminoácidos pode ser observado em qualquer secção do péptido, embora seja de preferência na região essencial. O nível de identidade de aminoácidos é superior a pelo menos 9 aminoácidos contíguos, mas pode ser pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou pelo menos 16 ou 17 aminoácidos, dependendo do tamanho dos péptidos de comparação. Deste modo, qualquer um dos níveis de identidade acima especificado pode ocorrer a todo o comprimento da sequência.

[0030] Em relação às sequências de aminoácidos, "identidade de sequência" refere-se a sequências que têm o valor indicado quando avaliadas usando ClustalW (Thompson et al., 1994, supra) com os seguintes parâmetros:

Parâmetros de alinhamento de emparelhamento - Método: exacto, Matriz: PAM, Penalização por abertura de espaçamentos: 10,00, Penalização por extensão de espaçamentos: 0,10; Parâmetros de alinhamento múltiplo -Matriz: PAM, Penalização por abertura de espaçamentos: 10,00, % identidade para atraso: 30, Penalização por fim de espaçamento: ligada, Distância de separação de espaçamentos: 0, Matriz negativa: não, Penalização por extensão de espaçamentos: 0,20, Penalização por espaçamento específico ao resíduo: ligada, Penalização por espaçamento hidrófilo: ligada, Resíduos hidrófilos: GPSNDQEKR. A identidade de sequência num resíduo particular destina-se a incluir resíduos idênticos que foram simplesmente derivados. 16 [0031] Um péptido variante pode compreender 1, 2, 3, 4, 5 ou mais ou até 10 substituições de aminoácidos de qualquer SEQ N.0 ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. As variantes de substituição envolvem, de preferência, a substituição de um ou mais aminoácidos com o mesmo número de aminoácidos e a realização de substituições conservadoras de aminoácidos. Por exemplo, um aminoácido pode ser substituído por um aminoácido alternativo com propriedades semelhantes, por exemplo, outro aminoácido básico, outro aminoácido ácido, outro aminoácido neutro, outro aminoácido alterado, outro aminoácido hidrófilo, outro aminoácido hidrófobo, outro aminoácido polar, outro aminoácido aromático ou outro aminoácido alifático. Algumas propriedades dos 20 aminoácidos principais que podem ser usados para seleccionar substituintes adequados são as seguintes:

Ala jalifático, hidrófobo, Met jhidrófobo, neutro |neutro Cys jpolar, hidrófobo, neutro Asn jpolar, hidrófilo, I jneutro Asp jpolar, hidrófilo, | (-) carregado Pro jhidrófobo, neutro Glu jpolar, hidrófilo, carregado Gin jpolar, hidrófilo, 1 (_) jneutro Phe jaromático, hidrófobo, Arg jpolar, hidrófilo, ineutro jcarregado ( + ) Gly jalifático, neutro Ser jpolar, hidrófilo, jneutro His iaromático, polar, Thr jpolar, hidrófilo, jhidrófilo, carregado (+) jneutro 17

Ile jalifático, hidrófobo, Vai jalifático, jneutro iihidróf obo, neutro Lys jpolar, hidrófilo, carregado Trp jaromático, 1 ( + ) jhidrófobo, neutro Leu jalifático, hidrófobo, Tyr jaromático, polar, jneutro jhidrófobo [0032] Outras variantes incluem aquelas nas quais em vez do aminoácido natural, o aminoácido que aparece na sequência é um análogo estrutural deste. Os aminoácidos usados nas sequências também podem ser modificados, p. ex. marcados, desde que a função do péptido não seja significativamente afectada de forma adversa. Quando o péptido tem uma sequência diferente da sequência de qualquer uma das SEQ N.° ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou um fragmento destas, as substituições podem ocorrer a todo o comprimento da sequência, dentro da sequência de qualquer uma das SEQ N.° ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 ou fora da sequência de qualquer uma das SEQ N.0 ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Por exemplo, as variações aqui descritas, tais como adições, deleções, substituições e modificações, podem ocorrer dentro da sequência de qualquer uma das SEQ N.° ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Um péptido variante pode compreender ou consistir essencialmente na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ N.° ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12 em que foram efectuadas uma, duas, três, quatro ou mais substituições de aminoácidos. Um péptido variante pode compreender um fragmento de Fel dl que é maior do que qualquer uma das SEQ N.° ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Nesta modalidade, as variações aqui descritas, tais como substituições e modificações, 18 podem ocorrer dentro e/ou fora da sequência de qualquer uma das SEQ N.° ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.

[0033] Os péptidos variantes da invenção têm 9 a 30 aminoácidos de comprimento, inclusive. De preferência, podem ter de 9 a 20 aminoácidos de comprimento ou, mais preferencialmente, de 13 a 17. Os péptidos podem ter o mesmo comprimento do que as sequências de péptidos em qualquer uma das SEQ N.° ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12.

[0034] Os péptidos podem ser quimicamente derivados do alergénio polipeptidico, por exemplo por clivagem proteolítica ou podem ser derivados num sentido intelectual do alergénio polipeptidico, por exemplo utilizando a sequência de aminoácidos do alergénio polipeptidico e sintetizando péptidos com base na sequência. Os péptidos podem ser sintetizados utilizando métodos bem conhecidos na arte.

[0035] O termo "péptido" inclui não apenas moléculas nas quais os residuos de aminoácidos são unidos por ligações peptidicas (-CO-NH-) mas também moléculas nas quais a ligação peptidica é revertida. Estes peptidomiméticos retro-invertidos podem ser produzidos utilizando métodos conhecidos na arte, por exemplo tais como os descritos por Meziere et al. (1997) J. Immunol.159, 3230-3237. Esta abordagem envolve a produção de pseudopéptidos com alterações quem envolvem o cerne e não a orientação das cadeias laterais. Meziere et al (1997) revelam que estes pseudopéptidos são úteis pelo menos para as respostas dos linfócitos T adjuvantes e do MHC de classe II. Péptidos retro-invertidos, que contêm ligações NH-CO em vez de ligações peptidicas CO-NH, são muito mais resistentes à proteólise. 19 [0036] Do mesmo modo, a ligação peptídica pode ser totalmente dispensada desde que uma fracção de ligação adequada que mantenha o espaçamento entre os átomos de carbono dos residuos de aminoácido seja usada; é preferível que a fracção de ligação tenha substancialmente a mesma distribuição de carga e substancialmente a mesma planaridade do que uma ligação peptídica. Também é de referir que o péptido pode ser convenientemente bloqueado na sua extremidade N-terminal ou C-terminal de modo a ajudar a reduzir a susceptibilidade à digestão exoproteolítica. Por exemplo, o grupo amino N-terminal dos péptidos pode ser protegido através da reacção com um ácido carboxílico e o grupo carboxilo C-terminal do péptido pode ser protegido através da reacção com uma amina. Outros exemplos de modificações incluem glicosilação e fosforilação. Outra modificação potencial é os hidrogénios nas aminas da cadeia lateral de R ou K poderem ser substituídos por grupos metileno (-NH2 -> -NH(Me) ou -N (Me) 2) .

[0037] Os análogos de péptidos de acordo com a invenção podem também incluir variantes de péptido que aumentam ou diminuem a semivida do péptido in vivo. Exemplos de análogos capazes de aumentar a semivida dos péptidos usados de acordo com a invenção incluem análogos peptóides dos péptidos, derivados do aminoácido D dos péptidos, e os híbridos péptido-peptóide. Outra modalidade dos polipéptidos variantes usados de acordo com a invenção compreende formas do aminoácido D do polipéptido. A preparação dos polipéptidos usando aminoácidos D em vez de aminoácidos L reduz grandemente qualquer degradação indesejada de um tal agente por processos metabólicos normais, reduzindo as quantidades de agente que é necessário administrar, bem como a frequência da sua administração. 20 [0038] Os péptidos fornecidos pela presente invenção podem ser derivados de variantes de splicing do Fel dl codificadas por mRNA gerado por splicing alternativo da transcrição primária que codifica as cadeias de Fel dl. Os péptidos podem também ser derivados de mutantes de aminoácidos, variantes de glicosilação e outros derivados covalentes de Fel dl que mantêm pelo menos uma propriedade de ligação ao MHC do alergénio. Derivados exemplares incluem moléculas em que os péptidos da invenção são modificados covalentemente por substituição, quimica, enzimática ou por outro meio adequado, com uma fracção que não um aminoácido natural. Também estão incluídas variantes naturais da Fel dl encontradas em diferentes gatos. Estas variantes podem ser codificadas por uma variante alélica ou representar uma variante de splicing alternativa.

[0039] As variantes acima descritas podem ser preparadas durante a síntese do péptido ou por modificação pós-produção ou quando o péptido está sob a forma recombinante usando as técnicas conhecidas da mutagénese dirigida, mutagénese aleatória ou clivagem enzimática e/ou ligação de ácidos nucleicos.

[0040] A invenção também revela péptidos que são de preferência variantes funcionais de qualquer uma das SEQ N.° ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12. Ou seja, os péptidos são de preferência capazes de induzir uma resposta imune. Em particular, são capazes de induzir uma resposta de fase tardia num indivíduo alérgico a gatos. Isto pode ser testado pela capacidade do péptido em induzir a proliferação de linfócitos T numa amostra de linfócitos T. Os métodos para testar a indução da proliferação de linfócitos T são bem conhecidos na arte e um tal método é exemplificado no Exemplo 2. De preferência, o péptido ou péptidos são capazes de causar a proliferação de linfócitos 21 T em pelo menos 20% das amostras de linfócitos T, em que cada amostra é obtida de diferentes indivíduos alérgicos a gatos na população. As composições da invenção são de preferência capazes de induzir a proliferação de linfócitos T em 30% ou mais amostras de linfócitos T obtidas a partir de um painel de indivíduos alérgicos a gatos. Mais preferencialmente, as composições são capazes de induzir a proliferação de linfócitos T em 35% ou mais, 40% ou mais, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% ou 90% ou mais das amostras obtidas de indivíduos sensibilizados num painel. O número de indivíduos num painel de indivíduos alérgicos a gatos pode ser qualquer número superior a um, por exemplo pelo menos 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50, 80 ou 100 indivíduos. É preferível que os péptidos causem a proliferação de linfócitos T, mas não conduzam à libertação de histamina a partir de preparações enriquecidas de mastócitos ou basófilos de um indivíduo sensibilizado. Pode haver alguma libertação de histamina, mas de preferência a composição não causa significativamente mais libertação de histamina do que uma composição que compreenda os 7 polipéptidos diferentes representados na SEQ N.° ID 1 a 7.

[0041] Variantes adequadas capazes de se ligar a TCRs podem ser derivadas empiricamente ou seleccionadas de acordo com critérios conhecidos. Dentro de um único péptido há determinados resíduos que podem contribuir para a ligação dentro da fenda de ligação do antigénio do mhc e outros resíduos que podem interagir com regiões hipervariáveis do receptor de linfócitos T (Allen et al (1987) Nature 327: 713-5).

[0042] De entre os resíduos que contribuem para a interacção do receptor de linfócitos T, foi demonstrada uma hierarquia que se refere à dependência da activação dos linfócitos T mediante substituição de um determinado 22 resíduo peptídico. Utilizando péptidos que tiveram uma ou mais substituições dos resíduos de contacto do receptor de linfócitos T por um aminoácido diferente, vários grupos demonstraram efeitos profundos no processo de activação dos linfócitos T. Evavold & Allen (1991) Nature 252: 1308-10) demonstraram a dissociação da proliferação de linfócitos T e da produção de citocinas. Neste modelo in vitro, um clone de linfócito T específico dos resíduos 64-76 da hemoglobina (no contexto de I-Ek) , foi provocado com um análogo peptídico, tendo sido efectuada uma substituição conservadora de ácido aspártico por ácido glutâmico. Esta substituição não interferiu significativamente com a capacidade do análogo se ligar a I-Ek.

[0043] Após a provocação in vitro de um clone de linfócito T com este análogo, não foi detectada qualquer proliferação, embora a secreção de IL-4 se tenha mantido, assim como a capacidade do clone de ajudar as respostas dos linfócitos B. Num estudo subsequente, o mesmo grupo demonstrou a separação da citólise mediada por linfócitos T em relação à produção de citocinas. Neste caso, a primeira permaneceu inalterada, enquanto a última foi comprometida. A eficácia de ligandos de péptidos alterados in vivo foi inicialmente demonstrada num modelo murino de EAE (encefalomielite alérgica experimental) por McDevitt e colaboradores (Smilek et al (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88: 9633-9637). Neste modelo, a eae é induzida por imunização com o péptido encefalitogénico Acl-11 da MBP (proteína básica da mielina). A substituição na posição quatro (lisina) por um resíduo de alanina gerou um péptido que se ligou bem ao seu elemento limitativo (ΑαυΑβυ), mas que era não-imunogénico na estirpe susceptível PL/JxSJLFl e que, além disso, evitou o aparecimento de EAE quando administrado quer antes quer após a imunização com o péptido encefalitogénico. Assim, podem ser identificados 23 resíduos nos péptidos que afectam a capacidade dos péptidos para induzir várias funções dos linfócitos T.

[0044] Vantajosamente, os péptidos podem ser concebidos de modo a favorecer a proliferação de linfócitos T e a indução de dessensibilização. Metzler and Wraith demonstraram a melhoria da capacidade tolerogénica de péptidos nos quais foram efectuadas as substituições que aumentam a afinidade péptido-MHC (Metzler & Wraith(1993) Int Immunol ~ : 1159-65). Foi demonstrado que um ligando de péptido alterado pode provocar anergia profunda e de longa duração nos linfócitos T clonados - Sloan-Lancaster et al (1993) Nature 363: 156-9.

[0045] As composições da invenção sao capazes de induzir uma resposta de fase tardia num indivíduo sensibilizado ao alergénio Fel dl. 0 termo "resposta de fase tardia" inclui o significado definido em Allergy and Allergic Diseases (1997) A. B. Kay (Ed.), Blackwell Science, pp 1113-1130. A resposta de fase tardia pode ser qualquer resposta de fase tardia (LPR). De preferência, os péptidos são capazes de induzir uma resposta asmática tardia (LAR) ou uma resposta rinítica tardia ou uma resposta cutânea tardia ou uma resposta ocular tardia. É possível determinar se um péptido particular pode ou não originar uma LPR utilizando métodos bem conhecido na arte; um método particularmente preferido é o descrito por Cromwell O, Durham SR, Shaw RJ, Mackay J e Kay AB. Provocation tests and measurements of mediators from mast cells and basophils in asthma and allergic rhinitis. Em: Handbook of Experimental Immunology (4) Chapter 127, Editor: Weir DM, Blackwell Scientific Publications, 1986.

[0046] Assim, de preferência, os péptidos individuais da invenção são capazes de induzir uma LPR num indivíduo que 24 tenha sido sensibilizado ao alergénio Fel dl. É possível determinar se um indivíduo foi sensibilizado ao alergénio através de procedimentos bem conhecidos como o teste de escarificação com soluções de extractos de alergénio, indução de LPRs cutâneas, história clinica, provocação pelo alergénio e prova cutânea RAST (teste radio-alergo-absorvente) para medição da IgE especifica do alergénio. O médico poderá determinar se é ou não expectável que um indivíduo específico beneficie do tratamento com base, por exemplo, nesses testes.

[0047] A dessensibilização ou criação de tolerância de um indivíduo ao alergénio Fel dl significa a inibição ou redução das reacções alérgicas dos tecidos induzida por Fel dl em indivíduos adequadamente sensibilizados. Tem sido demonstrado que os linfócitos T podem ser activados selectivamente e depois modificados para deixar de responder. Além disso, a retirada de energia ou eliminação destes linfócitos T conduz à dessensibilização do doente a um alergénio particular. A dessensibilização manifesta-se pela redução da resposta a um alergénio ou a um péptido derivado do alergénio, ou de preferência pela eliminação de tal resposta, na segunda e posteriores administrações do alergénio ou do péptido derivado do alergénio. A segunda administração pode ser efectuada após um período de tempo adequado para permitir a ocorrência da dessensibilização; ou seja, de preferência qualquer período entre um dia e várias semanas. É preferido um intervalo de cerca de duas semanas.

[0048] Embora as composições da invenção sejam capazes de induzir uma LPR num indivíduo alérgico a gatos, deverá ser referido que quando uma composição é usada para tratar um doente é preferível que seja usada uma concentração suficientemente baixa da composição de forma a que não 25 ocorra qualquer LPR observável e a resposta seja suficiente para dessensibilizar parcialmente os linfócitos T de forma a que a próxima dose (de preferência superior) possa ser administrada e por ai em diante. Deste modo, a dose é acumulada para conferir uma dessensibilização total, mas habitualmente sem chegar a induzir uma LPR no doente. Contudo, a composição ou péptido é capaz de o fazer a uma concentração mais elevada do que a que é administrada.

[0049] As composições da invenção de preferência são capazes de induzir uma resposta de fase tardia em 50 % ou mais de um painel de indivíduos alérgicos a gatos da população. Mais preferencialmente, as composições são capazes de induzir uma LPR em 55% ou mais, 60 % ou mais, 65 % ou mais, 70% ou mais, 75% ou mais, 80% ou mais, 85% ou mais, ou 90 % ou mais de indivíduos sensibilizados num painel. É possivel determinar se as composições são capazes ou não de induzir uma LPR numa determinada percentagem de sujeitos de um painel através de métodos que são bem conhecidos na arte.

Propriedades das combinações de péptidos Ligação do MHC

[0050] Combinações preferidas de péptidos habitualmente ligam-se a um grande número de moléculas diferentes de HLA. Isto é vantajoso na medida em que uma maior proporção de indivíduos numa população irá desenvolver tolerância devido à combinação. Assim, as combinações preferidas compreendem: (iii) pelo menos dois péptidos que exibem uma forte ligação e pelo menos um péptido que exibe uma ligação 26 moderada a cada elemento de um painel de moléculas de HLA; ou (iv) pelo menos um péptido que exibe uma forte ligação e pelo menos dois péptidos que exibem uma ligação moderada a cada elemento do dito painel de moléculas de HLA; em que o painel de moléculas de HLA compreende pelo menos sete moléculas de HLA diferentes codificadas por alelos diferentes que têm uma frequência cumulativa numa população humana não consanguínea de pelo menos 80% ou pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99%.

[0051] A força da ligação do MHC pode ser avaliada através de qualquer método adequado. Os métodos preferidos incluem ensaios de inibição competitiva em que a ligação é medida relativamente a um péptido de referência. O péptido de referência é habitualmente um péptido que é conhecido como um potente ligante para uma determinada molécula de MHC. Neste ensaio, um péptido é um ligante fraco para uma determinada molécula de HLA se tiver uma CI50 mais de 100 vezes inferior à do péptido de referência para uma determinada molécula de HLA. Um péptido é um ligante moderado se tiver uma CI50 mais de 20 vezes inferior mas menos de 100 vezes inferior à do péptido de referência para a molécula de HLA especifica. Um péptido é um ligante forte se tiver uma CI50 menos de 20 vezes inferior à do péptido de referência para a molécula de HLA específica.

[0052] A população humana não consanguínea pode ser qualquer população, habitualmente uma população caucasiana. O painel de moléculas de HLA habitualmente compreende pelo menos HLA-DRl, DR3, DR4, DR7, DR11, DR13 e DR15 e, opcionalmente, também compreende HLA-DRB4 e DRB5. Péptidos de referência adequados para estas moléculas de HLA são: 27 DRl (alelo DRB1*0101): HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT); DR3 (alelo DRBl*0301): MT216 (AKTIAYDEEARRGLE); DR4 (alelo DRB 1*0401): HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT); DR7 (alelo DRB 1 *0701): YKL (AAYAAAKAAALAA); DR 11 (alelo DRB1*1101): HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT); DR13 (alelo DRBl*1301): Bl 21-36 (TERVRLVTRHIYNREE); DR15 (alelo DRB1*1501): A3 152-166 (EAEQLRRAYLDGTGVE); DRB4 (alelo DRB4*0101): E2/E7 (AGDLLAIETDKATI); e DRB5 (alelo DRB5*0101): HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT).

Libertação de histamina [0053] Combinações preferidas de péptidos habitualmente induzem a libertação de histamina numa amostra de indivíduos alérgicos a gatos com basófilos ou mastócitos, que não é superior a 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% à libertação de histamina induzida pelo alergénio Fel dl inteiro numa amostra do mesmo indivíduo ou população de indivíduos.

[0054] Mais preferencialmente, uma combinação induz a libertação de histamina que não é 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% superior à libertação de histamina induzida numa amostra do mesmo indivíduo ou população de indivíduos por uma composição que compreende os 7 polipéptidos diferentes representados nas SEQ N.° ID 1 a 7.

[0055] Uma amostra de um indivíduo alérgico a gatos é habitualmente uma amostra de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) que pode ser preparada como é norma na arte. Um exemplo de um método adequado envolve o isolamento de PBMCs a partir de uma amostra de sangue heparinizado obtido de um sujeito. As PBMCs são 28 habitualmente isoladas dessa amostra por separação por gradiente de densidade.

[0056] A libertação de histamina pode ser avaliada através de qualquer método adequado, por exemplo por ELISA. Vários kits de ensaio adequados estão disponíveis comercialmente para testar os níveis de libertação de histamina das células em resposta a qualquer agente de libertação de histamina. Habitualmente, uma amostra de aproximadamente 5xl05 a 5xl06 PBMCs será incubada com um determinado agente de libertação de histamina numa determinada concentração. A concentração de histamina no meio de incubação ou numa amostra do meio de incubação será medida no final da incubação. A incubação tem habitualmente a duração de 30 minutos a 37°C.

[0057] Quando o agente de libertação da histamina é um péptido ou uma combinação de péptidos, este será habitualmente administrado em várias diluições diferentes dentro de um intervalo de concentração comparável ao que seria expectável que estivesse presente in vivo. Por exemplo, uma dose de 10 mg de um único péptido que entrasse num volume de sangue de 5 litros resultaria numa concentração sérica de 2 ng/ml (2 xl0~6 mg/ml). Assim, um intervalo de concentrações adequado para um péptido ou combinação de péptidos é habitualmente de 10 mg/ml a 1 ng/ml. Pode ser efectuada uma medição única, duplicada ou triplicada em cada diluição testada dentro do referido intervalo. Habitualmente, são necessárias aproximadamente 5xl05 PBMCs para cada medição. Controlos positivos adequados serão também testados a concentrações adequadas que podem ser facilmente determinadas pelos especialistas. Os controlos positivos adequados incluem o alergénio Fel dl inteiro ou uma alternativa adequada, como o extracto de 29 pêlo de gato inteiro disponível comercialmente. A libertação espontânea de histamina por uma amostra de células que não foi tratada com um agente de libertação de histamina pode também ser medida como um controlo negativo/ indicador da libertação de histamina de base. Quando duas ou mais diluições de uma preparação de péptido/alergénio obtêm 10% ou mais de libertação de histamina acima da base, ou quando um único valor de 10% ou mais acima da base é obtido na concentração mais elevada testada, tal será habitualmente considerado uma "libertação de histamina positiva".

[0058] A concentração de histamina no meio de incubação de qualquer amostra será habitualmente medida por ELISA. Ensaios ELISA adequados habitualmente envolvem adicionar um agente de acilação de histamina a uma amostra do meio de incubação em conjunto com um tampão adequado. A histamina acilada é mais estável do que a histamina e as amostras tratadas deste modo podem ser guardadas por um período mais longo antes da análise. A análise habitualmente envolve a adição de reagentes anti-acil-histamina conjugados com fosfatase alcalina, seguida da adição de um substrato cromogénico adequado da fosfatase alcalina. A concentração de histamina é determinada através da medição da absorvância e por comparação com uma curva Standard calibrada contra concentrações de histamina conhecidas.

Libertação de citocinas [0059] As combinações preferidas de péptidos habitualmente induzem um perfil de libertação de citocinas numa amostra de indivíduos alérgicos a gatos contendo linfócitos T, que é equivalente ao perfil de libertação de citocinas induzido 30 numa amostra do mesmo indivíduo ou população de indivíduos pelo alergénio Fel dl inteiro.

[0060] Preferencialmente, a combinação induz um perfil de libertação de citocinas numa amostra de um indivíduo ou população de indivíduos alérgicos a gatos contendo linfócitos T, que é equivalente ao perfil de libertação de citocinas induzido numa amostra do mesmo indivíduo ou população de indivíduos por uma composição que compreende os 7 polipéptidos diferentes representados nas SEQ N.° ID 1 a 7.

[0061] Uma amostra de um indivíduo ou população de indivíduos alérgicos a gatos é habitualmente uma amostra de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) que pode ser preparada como é norma na arte. O perfil de libertação de citocinas pode ser avaliado por qualquer método adequado. Métodos adequados incluem a medição do nível de uma, duas, três ou mais citocinas diferentes libertadas numa amostra em ensaios independentes. Ensaios adequados incluem os testes ELISA e Luminex.

[0062] Um perfil de libertação de citocinas numa amostra é considerado equivalente ao perfil de libertação de citocinas numa amostra diferente quando o nível de determinadas citocinas específicas produzido é semelhante em ambas as amostras. Mais especificamente, os perfis de libertação de citocinas de duas amostras diferentes são considerados equivalentes quando os níveis de IL-10 e IL-13 produzidos numa amostra diferem em não mais de 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ou 10% dos níveis de IL-10 e IL-13 produzidos na segunda amostra.

[0063] Assim, uma combinação de péptidos preferida induz a 31 produção de IL-10 e IL-13 em níveis que diferem em não mais de 10% dos níveis de IL-10 e IL-13 induzidos num amostra do mesmo indivíduo ou população de indivíduos pelo alergénio Fel dl inteiro.

[0064] Um ensaio típico de libertação de citocinas é o seguinte: 250 yl de uma solução de 200 yg/ml da concentração de péptido ou antigénio adequado são distribuídos nos poços adequados de, por exemplo, placas de 48 poços. As placas são então incubadas numa incubadora humidificada com 5% de C02 a 37°C no máximo durante 4 horas. 250 μΐ de uma suspensão de PBMC 5xl06 células/ml são então adicionados a cada poço e as placas são colocadas na incubadora durante 5 dias. Amostras de sobrenadante de cultura são então colhidas como alíquotas múltiplas para uso em ensaios ELISA. As amostras podem ser congeladas e guardadas antes da análise. Uma alíquota é testada quanto à presença de uma citocina.

Habitualmente, a presença de uma citocina é estabelecida usando um ensaio ELISA de acordo com práticas Standard na arte. As concentrações de citocinas numa amostra são habitualmente determinadas por interpolação a partir de curvas Standard geradas no mesmo ensaio. Ácidos nucleicos e vectores [0065] Os péptidos individuais que compõem as composiçoes e produtos da invenção podem ser administrados directamente ou podem ser administrados indirectamente por expressão de uma sequência de codificação. Por exemplo, pode ser 32 fornecido um polinucleótido que codifica um péptido da invenção, tal como qualquer um dos péptidos acima descritos. Um péptido da invenção pode ser, assim, produzido ou fornecido sob a forma de um polinucleótido que o codifica e é capaz de o expressar. Qualquer referência aqui presente ao uso, fornecimento ou administração de um péptido da invenção pretende incluir o uso, fornecimento ou administração indirectos desse péptido através da expressão por um polinucleótido que o codifica.

[0066] Deste modo, a invenção fornece uma composição para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância que consiste em sequências de polinucleótidos que quando expressos causam a produção de uma composição para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância, consistindo nos polipéptidos com as SEQ N.°s ID 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7.

[0067] Os termos "molécula de ácido nucleico" e "polinucleótido" são aqui usados indistintamente e referem-se a uma forma polimérica dos nucleótidos de qualquer comprimento, quer desoxirribonucleótidos, quer ribonucleótidos, ou análogos destes. Exemplos não limitativos de polinucleótidos incluem um gene, um fragmento de gene, RNA mensageiro (mRNA), cDNA, polinucleótidos recombinantes, plasmídeos, vectores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácidos nucleicos e iniciadores (primers). Um polinucleótido da invenção pode ser fornecido sob a forma purificada ou isolado. Uma sequência de ácido nucleico que "codifica" um polipéptido seleccionado é uma molécula de ácido nucleico que é transcrita (no caso do DNA) e traduzida (no caso do mRNA) num polipéptido in vivo quando colocada sob o controlo de sequências reguladoras 33 adequadas. Os limites da sequência de codificação são determinados por um códão de início na extremidade 5' (amino) e um códão de terminação da tradução na extremidade 3' (carboxilo) . Para os fins a que a invenção se destina, estas sequências de ácido nucleico podem incluir, mas não se limitam a, cDNA virai, mRNA procariótico ou eucariótico, sequências genómicas de DNA ou RNA virai ou procariótico, e mesmo sequências de DNA sintético. Uma sequência de terminação da transcrição pode localizar-se a 3' da sequência de codificação.

[0068] Os polinucleótidos da invenção podem ser sintetizados segundo métodos bem conhecidos na arte, por exemplo conforme descrito por Sambrook et al (1989, Molecular Cloning - a laboratory manual; Cold Spring Harbor Press) .

[0069] As moléculas de polinucleótidos da presente invenção podem ser fornecidas sob a forma de uma cassete de expressão que inclui sequências de controlo ligadas operacionalmente à sequência inserida, permitindo assim a expressão do péptido da invenção in vivo num sujeito alvo. Estas cassetes de expressão, por sua vez, são habitualmente fornecidas em vectores (p. ex., plasmídeos ou vectores virais recombinantes) que são adequados para uso como reagentes para a imunização de ácido nucleico. Esta cassete de expressão pode ser administrada directamente a um hospedeiro. Em alternativa, um vector compreendendo um polinucleótido da invenção pode ser administrado a um hospedeiro. De preferência, o polinucleótido é preparado e/ou administrado usando um vector genético. Um vector adequado pode ser qualquer vector capaz de suportar uma quantidade suficiente de informação genética e que permite a expressão de um péptido da invenção. 34 [0070] A presente invenção inclui, assim, vectores de expressão que compreendem essas sequências de polinucleótidos. Assim, a presente invenção fornece um vector para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância que compreende quatro ou mais sequências de polinucleótidos que codificam diferentes polipéptidos da invenção e opcionalmente uma ou mais sequências de polinucleótidos adicionais que codificam diferentes polipéptidos, conforme aqui definido. O vector pode compreender as sequências de polinucleótidos que codificam os diferentes polipéptidos da invenção.

[0071] Além disso, deverá ser referido que as composições e produtos da invenção podem compreender uma mistura de polipéptidos e polinucleótidos. Deste modo, a invenção fornece uma composição ou produto conforme aqui definido, em que no lugar de um dos polipéptidos está um polinucleótido capaz de expressar o referido polipéptido.

[0072] Os vectores de expressão são produzidos por rotina em biologia molecular e podem, por exemplo, envolver o uso de DNA plasmideo e iniciadores, promotores, potenciadores e outros elementos, como por exemplo sinais de poliadenilação que podem ser necessários, e que são posicionados na orientação correcta, de modo a permitir a expressão de um péptido da invenção. Outros vectores adequados serão evidentes para os especialistas na arte. A titulo de exemplo, a este respeito referimo-nos a Sambrook et al.

[0073] Assim, um polipéptido da invenção pode ser fornecido através da administração de um vector a uma célula e permitindo a ocorrência da transcrição do vector. De preferência, um polinucleótido da invenção ou para uso 35 na invenção num vector é operacionalmente ligado a uma sequência de controlo que permite a expressão da sequência de codificação pelas células hospedeiras, ou seja, o vector é um vector de expressão.

[0074] "Operacionalmente ligado" refere-se a uma disposição dos elementos em que os componentes assim descritos são configurados de modo a realizar a sua função habitual. Assim, uma determinada sequência reguladora, como um promotor, operacionalmente ligado a uma sequência de ácido nucleico, é capaz de efectuar a expressão dessa sequência quando estão presentes as enzimas adequadas. O promotor não precisa de estar contíguo à sequência, desde que actue de modo a dirigir a expressão desta. Assim, por exemplo, podem estar presentes sequências intervenientes não traduzidas mas transcritas, entre a sequência promotora e a sequência de ácido nucleico, e a sequência promotora pode ainda assim ser considerada "operacionalmente ligada" à sequência de codificação.

[0075] Vários sistemas de expressão têm sido descritos na arte, cada um habitualmente consistindo num vector com um gene ou sequência de nucleótido de interesse operacionalmente ligados a sequências de controlo da expressão. Estas sequências de controlo incluem sequências promotoras de transcrição e sequências de início e terminação da transcrição. Os vectores da invenção podem ser, por exemplo, plasmídeos, vírus ou bacteriófagos que apresentem uma origem de replicação, opcionalmente um promotor para expressão do referido polinucleótido e opcionalmente um regulador do promotor. Um "plasmídeo" é um vector sob a forma de um elemento genético extracromossómico. Os vectores podem conter um ou mais genes marcadores seleccionáveis, por exemplo um gene 36 resistente à ampicilina no caso de um plasmídeo bacteriano ou um gene de resistência para um vector fúngico. Os vectores podem ser usados in vitro, por exemplo para a produção de DNA ou RNA ou usados para transfectar ou transformar uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira mamífera. Os vectores podem também ser adaptados para serem usados in vivo, por exemplo para permitir a expressão in vivo do polipéptido.

[0076] Um "promotor" é uma seguência de nucleótidos gue inicia e regula a transcrição de um polinucleótido que codifica um polipéptido. Os promotores podem incluir promotores induzíveis (em que a expressão de uma sequência de polinucleótidos operacionalmente ligada ao promotor é induzida por um analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), repressores (em que a expressão de uma sequência de polinucleótidos operacionalmente ligada ao promotor é reprimida por um analito, cofactor, proteína reguladora, etc.) e promotores constitutivos. Pretende-se que o termo "promotor" ou "elemento de controlo" inclua regiões promotoras completas e segmentos funcionais (p. ex., controla a transcrição ou translação) destas regiões.

[0077] Um polinucleótido, cassete de expressão ou vector de acordo com a presente invenção pode adicionalmente compreender uma sequência do péptido sinal. A sequência do péptido sinal é geralmente inserida numa ligação operacional com o promotor de forma a que o péptido sinal seja expresso e facilita a secreção de um polipéptido codificado pela sequência de codificação também em ligação operacional com o promotor.

[0078] Habitualmente, uma sequência de péptidos sinal codifica um péptido de 10 a 30 aminoácidos, por exemplo 15 37 a 20 aminoácidos. Frequentemente, os aminoácidos são predominantemente hidrófobos. Numa situação típica, um péptido sinal tem por alvo uma cadeia de polipéptidos crescente que suporta o péptido sinal para o retículo endoplásmico da célula de expressão. O péptido sinal é clivado no retículo endoplásmico, permitindo a secreção do polipéptido através do aparelho de Golgi. Assim, um péptido da invenção pode ser fornecido a um indivíduo através de expressão a partir de células dentro do indivíduo e secreção dessas células.

[0079] Em alternativa, os polinucleótidos da invenção podem ser expressos de um modo adequado para permitir a apresentação do péptido da invenção por uma molécula do MHC de classe II na superfície de uma célula apresentadora de antigénio. Por exemplo, um polinucleótido, cassete de expressão ou vector da invenção podem ter como alvo as células apresentadoras de antigénio ou a expressão do péptido codificado pode ser de preferência estimulada ou induzida nessas células.

[0080] Os polinucleótidos de interesse podem ser usados in vitro, ex vivo ou in vivo na produção de um péptido da invenção. Tais polinucleótidos podem ser administrados ou usados na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância.

[0081] Métodos para a administração de genes são conhecidos na arte. Ver, p. ex., as norte-americanas n.°s 5.399.346, 5.580.859 e 5.589.466. A molécula de ácido nucleico pode ser introduzida directamente no sujeito, por ex. através de injecção intramuscular ou intradérmica Standard, administração transdérmica de partículas, por inalação, topicamente ou através dos modos de administração 38 oral, intranasal ou pela mucosa. A molécula pode, em alternativa, ser introduzida ex vivo em células que tenham sido removidas de um sujeito. Por exemplo, um polinucleótido, cassete de expressão ou vector da invenção pode ser introduzido nas APCs de um indivíduo ex vivo. As células que contêm a molécula de ácido nucleico de interesse são reintroduzidas no sujeito de forma a produzir uma resposta imune contra o péptido codificado pela molécula de ácido nucleico. As moléculas de ácido nucleico usadas nessa imunização são geralmente designadas aqui "vacinas de ácido nucleico".

[0082] Os polipéptidos, polinucleótidos, vectores ou células da invenção podem estar presentes numa forma substancialmente isolada. Podem ser misturados com veículos ou diluentes que não interfiram com a sua utilização prevista e continuarão a ser considerados como substancialmente isolados. Podem também estar numa forma substancialmente purificada, situação na qual irão geralmente compreender pelo menos 90%, p. ex. pelo menos 95%, 98% ou 99%, das proteínas, polinucleótidos, células ou massa seca da preparação. Células apresentadoras de antigénio (APCs) [0083] A invenção engloba a utilização in vitro de um método de produção de uma população de APCs que apresentam os péptidos da invenção na respectiva superfície, que podem ser subsequentemente usados na terapêutica. Tal método pode ser realizado ex vivo numa amostra de células obtida de um doente. As APCs produzidas deste modo formam, assim, um agente farmacêutico que pode ser usado no tratamento ou prevenção da alergia a gatos por criação de tolerância. As 39 células deverão ser aceites pelo sistema imunitário do indivíduo porque derivam desse indivíduo. A administração de células produzidas deste modo ao indivíduo do qual foram originalmente retiradas, constitui assim uma modalidade terapêutica da invenção.

Formulações e composições [0084] Os péptidos, polinucleótidos, vectores e células da invenção podem ser fornecidos a um indivíduo quer isoladamente, quer em combinação. Cada molécula ou célula da invenção pode ser fornecida a um indivíduo numa forma isolada, substancialmente isolada, purificada ou substancialmente purificada. Por exemplo, um péptido da invenção pode ser fornecido a um indivíduo substancialmente livre de outros péptidos.

[0085] Embora seja possível que os péptidos, polinucleótidos ou composições de acordo com a invenção sejam apresentados em bruto, é preferível apresentá-los como uma formulação farmacêutica. Assim, de acordo com um aspecto adicional da invenção, a presente invenção fornece uma formulação farmacêutica para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância que compreende uma composição, vector ou produto de acordo com a invenção, em conjunto com um ou mais veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis e opcionalmente um ou mais de outros ingredientes terapêuticos. O veículo deve "aceitável" no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não ser prejudicial para o sujeito. Habitualmente, os veículos para injecção e a formulação final são estéreis e apirógenos. A formulação de uma composição que compreende o péptido, polinucleótidos ou células da invenção pode ser produzida utilizando técnicas 40 e metodologias químicas padronizadas de formulação farmacêutica que estão à disposição do especialista.

[0086] Por exemplo, composições que contenham uma ou mais moléculas ou células da invenção podem ser combinadas com um ou mais excipientes ou veiculos farmaceuticamente aceitáveis. Substâncias auxiliares, como agentes humidificadores ou emulsionantes, substâncias de tampão de pH ou similares, podem estar presentes no excipiente ou veiculo. Estes excipientes, veiculos e substâncias auxiliares são geralmente agentes farmacêuticos que não induzem uma resposta imune no indivíduo que recebe a composição, e que podem ser administrados sem toxicidade indevida. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não se limitam a, líquidos como água, solução salina, polietilenoglicol, ácido hialurónico, glicerol e etanol. Sais farmaceuticamente aceitáveis também podem ser aqui incluídos, por exemplo, sais de ácidos minerais como cloridratos, hidrobrometos, fosfatos, sulfatos ou similares; e sais de ácidos orgânicos como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos ou similares. Um discussão completa sobre os excipientes, veículos e substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis está disponível em Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991) .

[0087] Estas composições podem ser preparadas, embaladas ou comercializadas numa forma adequada para a administração em bolus ou para administração contínua. É possível preparar, embalar ou comercializar composições injectáveis em formas farmacêuticas unitárias, por exemplo em ampolas ou em recipientes multidose contendo um conservante. As composições incluem, mas não se limitam a, suspensões, soluções, emulsões em veículos oleosos ou aquosos, pastas, 41 e formulações implantáveis de libertação prolongada ou biodegradáveis. Estas composições podem ainda compreender um ou mais ingredientes adicionais incluindo, mas não se limitando a, agentes de suspensão, estabilizadores ou dispersores. Numa modalidade de uma composição para administração parentérica, o ingrediente activo é fornecido na forma seca (por ex., um pó ou grânulos) para reconstituição com um veículo adequado (p. ex., água estéril e apirógena) antes da administração parentérica da composição reconstituída. As composições farmacêuticas podem ser preparadas, embaladas ou comercializadas sob a forma de uma suspensão ou solução aquosa ou oleosa estéril injectável. Esta suspensão ou solução pode ser formulada de acordo com a arte conhecida e pode compreender, para além do ingrediente activo, ingredientes adicionais tais como os agentes dispersores, agentes humidificadores ou agentes de suspensão aqui descritos. Estas formulações estéreis injectáveis podem ser preparadas usando um diluente ou solvente não tóxico aceitável para administração parentérica, como água ou 1,3-butanodiol, por exemplo. Outros diluentes e solventes aceitáveis incluem, mas não se limitam a, solução de Ringer, solução isotónica de cloreto de sódio e óleos fixos, tais como mono ou di-glicéridos sintéticos. Outras composições passíveis de administração parentérica que são úteis incluem as que compreendem o ingrediente activo numa forma microcristalina, numa preparação lipossomal ou como um componente de um sistema polimérico biodegradável. Composições para libertação prolongada ou implantação podem compreender materiais poliméricos ou hidrófobos farmaceuticamente aceitáveis, tais como uma emulsão, uma resina permutadora de iões, um polímero pouco solúvel ou um sal pouco solúvel. 42 [0088] Em alternativa, os péptidos ou polinucleótidos da presente invenção podem ser encapsulados, adsorvidos a, ou associados a, veículos particulados. Veículos particulados adequados incluem os derivados de polímeros de polimetil metacrilato, bem como micropartículas PLG derivadas de poli (lactidos) e poli (lactido-co-glicólidos) . Ver, p. ex., Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:362-368. Também é possível utilizar outros sistemas particulados e polímeros, por exemplo, polímeros como polilisina, poliarginina, poliomitina, espermina, espermidina, assim como conjugados destas moléculas.

[0089] A formulação de qualquer um dos péptidos, polinucleótidos ou células aqui referidos depende de factores como a natureza da substância e o método de administração. Qualquer uma dessas substâncias pode ser administrada numa variedade de formas farmacêuticas. Pode ser administrada oralmente (p. ex., comprimidos, pílulas, pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, pós ou grânulos dispersíveis), por via parentérica, subcutânea, por inalação, por via intradérmica, intravenosa, intramuscular, transdérmica ou através de técnicas de infusão. A substância também pode ser administrada como supositórios. 0 médico deverá determinar a via de administração adequada para cada indivíduo particular.

[0090] As composições de formulações da invenção compreenderão a concentração adequada de cada péptido/polinucleótido/célula que se revela eficaz sem causar reacções adversas. Habitualmente, a concentração de cada péptido na composição estará no intervalo de 0,03 a 200 nmol/ml. Mais preferencialmente, no intervalo de 0,3 a 200 nmol/ml, 3 a 180 nmol/ml, 5 a 75 nmol/ml ou 10 a 50 43 nmol/ml. A composição ou formulações devem ter uma pureza superior a 95% ou 98% ou uma pureza de pelo menos 99%. Métodos terapêuticos e indivíduo a tratar [0091] A presente invenção refere-se a péptidos, polinucleótidos, vectores e células que são capazes de dessensibilizar ou criar tolerância em indivíduos humanos ao alergénio Fel dl e que são, assim, úteis na prevenção ou tratamento da alergia a gatos. A invenção fornece composições, produtos, vectores e formulações para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância. A invenção também fornece um método de criação de tolerância ou dessensibilização de um indivíduo alérgico a gatos que compreende administrar, isoladamente ou em combinação, os polipéptidos/polinucleótidos/células da invenção, conforme descrito acima.

[0092] 0 indivíduo a tratar ou a receber a composição ou formulação da invenção é de preferência um humano. Deverá ser referido que o indivíduo a tratar pode ter uma alergia confirmada ao Fel dl, pode estar em risco de ser sensibilizado ou haver suspeita de ter sido sensibilizado. O indivíduo pode ser testado quanto à sua sensibilização através de técnicas bem conhecidas na arte e conforme aqui descrito. Em alternativa, o indivíduo pode ter uma história familiar de alergia a gatos. Pode não ser necessário testar um indivíduo quanto à sensibilização a Fel dl porque o indivíduo apresenta sintomas de alergia quando está na proximidade de gatos. Por proximidade entenda-se 10 metros ou menos, 5 metros ou menos, 2 metros ou menos, 1 metro ou menos ou 0 metros do gato. Os sintomas da alergia podem incluir comichão nos olhos, corrimento nasal, dificuldades 44 respiratórias, pele avermelhada e irritada ou erupção cutânea.

[0093] O indivíduo a tratar pode ter qualquer idade.

Contudo, de preferência, o indivíduo pode estar no grupo etário de 1 a 90, 5 a 60, 10 a 40 ou, mais preferencialmente, 18 a 35 anos. Grupos de indivíduos com maior probabilidade de beneficiar do tratamento são, por exemplo, os donos de gatos, veterinários e outras pessoas que contactem com gatos.

[0094] De preferência, o indivíduo a tratar pertence a uma população que tem frequências de alelos do MHC dentro do intervalo de frequências que é representativo da população caucasiana. As frequências de alelos da população de referência para 11 famílias de alelos DRBl comuns são apresentadas na Tabela 3 do Exemplo 2 (dados retirados de HLA Facts Book, Parham and Barber). As frequências de referência foram obtidas por análise de múltiplos estudos que apresentaram frequências e os valores apresentados são valores médios. Assim, de preferência, o indivíduo a ser tratado pertence a uma população que tem frequências de alelos do MHC equivalentes às da população de referência para os alelos indicados na Tabela 3 (p. ex., para pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou todos os alelos), por exemplo, dentro dos intervalos desses valores mais ou menos 1, 2, 3, 5, 10, 15 ou 20%.

[0095] De preferência, o indivíduo pertence a uma população na qual as frequências de alelos dos seguintes alelos DRBl são as que se seguem: 4 - pelo menos 9% 7 - pelo menos 10% 45 11 - pelo menos 8% [0096] O indivíduo pode ter tido alergia a gatos durante pelo menos 2 semanas, 1 mês, 6 meses, 1 ano ou 5 anos. O indivíduo pode apresentar erupção cutânea, congestão nasal, corrimento nasal e/ou tosse causada pela alergia. O indivíduo pode ou não ter recebido outras composições/compostos que tratam a alergia a gatos. O indivíduo pode viver numa população que compreende pelo menos 0,1 gatos por habitante humano. Método de diagnóstico [0097] A invenção também fornece um método para detectar se um indivíduo tem um distúrbio ou está em risco de o desenvolver, distúrbio esse que compreende sintomas alérgicos em resposta a alergénios de gatos.

[0098] O indivíduo é habitualmente um mamífero, de preferência um humano. O indivíduo a testar no método tem de preferência entre 1 e 80 anos de idade, preferencialmente entre 1 e 60, 50, 40, 30 ou 20 anos, e mais preferencialmente entre 1 e 16 anos.

[0099] O indivíduo pode ter sido diagnosticado ou pode haver a suspeita de que sofra de um distúrbio que é classificado como intrínseco ou não alérgico, por exemplo, asma intrínseca ou não alérgica. O indivíduo pode carecer de uma resposta de anticorpos detectável a um alergénio de gato, em particular uma resposta IgE a alergénio de gato. Ensaios adequados para detectar a IgE incluem o sistema Pharmacia™ CAP. Utilizando este sistema, o indivíduo habitualmente obtém uma pontuação 0 ou 0/1. 46 [0100] O indivíduo pode ser um doente que apresenta sintomas que habitualmente são associados a alergia tais como comichão nos olhos, corrimento nasal, dificuldades respiratórias, pele avermelhada e irritada ou erupção cutânea, na ausência de um estímulo identificável. A primeira ocorrência ou diagnóstico destes sintomas pode ocorrer quando o indivíduo tem mais de 15 anos de idade. Por exemplo, o indivíduo pode ter pelo menos 15, 16, 17, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou 30 anos de idade na primeira ocorrência ou diagnóstico dos sintomas de alergia que são habitualmente associados a alergia.

[0101] O método da invenção pretende determinar se um indivíduo apresenta uma resposta dos linfócitos T a um alergénio de gato, em particular ao principal alergénio de gato, Fel dl. Esta resposta dos linfócitos T estará presente em indivíduos alérgicos a gatos. Sem estarem vinculados a qualquer teoria específica, os inventores consideram que os distúrbios intrínsecos ou não alérgicos também são, na realidade, causados por uma resposta imune accionada pelos linfócitos T independente da IgE. Deste modo, estes distúrbios também têm um desencadeador alergénico, mas tal não origina uma resposta IgE específica ao alergénio. Em vez disso, produz uma resposta dos linfócitos T que se caracteriza pela proliferação de linfócitos T ou pela libertação de citocinas. Por exemplo, as citocinas libertadas podem incluir IL-5, que está implicada no recrutamento de eosinófilos. Deste modo, a resposta dos linfócitos T pode originar a indução de reacções eosinofílicas num indivíduo.

[0102] A possibilidade de um indivíduo apresentar uma resposta de linfócitos T a Fel dl é determinada avaliando 47 se o indivíduo tem uma resposta dos linfócitos T a um péptido ou combinação de péptidos de acordo com a invenção. A possibilidade do indivíduo apresentar tal resposta pode ser determinada através de qualquer método adequado, habitualmente um método que pode ser usado para detectar a proliferação de linfócitos T com experiência de contacto com o alergénio ou a presença de citocinas libertadas pelos linfócitos T com experiência de contacto com o alergénio. Um resposta positiva dos linfócitos T do doente ao péptido ou combinação da invenção indica que o doente tem sintomas de alergia ou tem uma maior probabilidade de os desenvolver em resposta ao alergénio. Um resposta negativa indica que o doente tem sintomas de alergia que não são causados pelo alergénio de gato ou tem uma menor probabilidade de desenvolver sintomas de alergia em resposta ao alergénio de gato.

[0103] Os linfócitos T que responderam ao péptido ou à combinação no método são geralmente linfócitos T que foram pré-sensibilizados in vivo ao alergénio. Estes linfócitos T com experiência de contacto com o alergénio estão geralmente presentes no sangue periférico de um indivíduo, ou seja, na população de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) do indivíduo. Os linfócitos T podem ser linfócitos T CD4 e/ou CD8 T.

[0104] No presente método, os linfócitos T podem ser colocados em contacto com o péptido ou combinação da invenção in vitro ou in vivo, de preferência in vitro numa amostra do indivíduo.

[0105] Geralmente, os linfócitos T que são contactados no método são retirados do indivíduo numa amostra de sangue, embora possam ser usados outros tipos de amostras que 48 contenham linfócitos T. A amostra pode ser adicionada directamente ao ensaio ou pode ser processada primeiro. Habitualmente, o processamento pode compreender técnicas Standard tais como a centrifugação por gradiente para separar os linfócitos T, com ressuspensão em qualquer volume adequado. Em alternativa, o processamento pode compreender a diluição da amostra, por exemplo com água, tampão ou meio. A amostra pode ser diluída de 1,5 a 100 vezes, por exemplo 2 a 50 ou 5 a 10 vezes.

[0106] O processamento pode compreender a separação de componentes da amostra. Habitualmente, as células mononucleares (MCs) são separadas das amostras. As MCs compreendem os linfócitos T e as células apresentadoras de antigénio (APCs). Assim, neste método as APCs presentes nas MCs separadas podem apresentar o péptido aos linfócitos T. Noutra modalidade, só é possivel purificar os linfócitos T da amostra, p. ex. linfócitos T CD4. PBMCs, MCs e linfócitos T podem ser separados da amostra usando técnicas conhecidas na arte.

[0107] De preferência, os linfócitos T usados no ensaio estão sob a forma de amostras não processadas ou diluídas, são linfócitos T recém-isolados (p. ex., sob a forma de MCs ou PBMCs recém-isoladas) que são usados directamente ex vivo, ou seja não são cultivados antes de ser usados no método ou são células descongeladas (que foram previamente congeladas). Contudo, os linfócitos T podem ser cultivados antes da utilização, por exemplo na presença do alergénio, e geralmente também de citocinas exógenas promotoras do crescimento. Durante o crescimento da cultura, o alergénio está habitualmente presente na superfície das APCs, como a APC usada no método. Colocar previamente os linfócitos T em cultura pode aumentar a sensibilidade do método. Assim, os 49 linfócitos T podem ser convertidos em linhas celulares, como linhas celulares de curta duração.

[0108] A APC que está habitualmente presente no método pode derivar do mesmo indivíduo do que o linfócito T ou de um indivíduo diferente. A APC pode ser uma APC natural ou uma APC artificial. A APC é uma célula que é capaz de apresentar o antigénio a um linfócito T. É habitualmente um linfócito B, célula dendrítica ou macrófago. É habitualmente separada da mesma amostra do que os linfócitos T e é habitualmente co-purifiçada com os linfócitos T. Assim, a APC pode estar presente nas MCs ou nas PBMCs. A APC é habitualmente uma célula ex vivo recém-isolada ou uma célula cultivada. Pode estar sob a forma de uma linha celular, como uma linha celular de curta duração ou imortalizada. A APC pode expressar na sua superfície moléculas MHC de classe II vazias.

[0109] Numa modalidade, o péptido ou combinação da invenção é adicionado directamente a um ensaio que compreende linfócitos T e APCs. Conforme discutido acima, os linfócitos T e as APCs nesse ensaio poderão estar sob a forma de MCs.

[0110] Numa modalidade, o péptido ou combinação de péptidos é fornecido à APC na ausência do linfócito T. A APC é então fornecida ao linfócito T, habitualmente depois de apresentar o alergénio na sua superfície. O péptido ou combinação de péptidos pode ter sido capturado no interior da APC e apresentado ou simplesmente capturado na superfície sem entrar dentro da APC.

[0111] Habitualmente, 105 a 107, de preferência 2,5xl05 a 106 PBMCs são adicionadas a cada ensaio. No caso do 50 péptido, ou combinação de péptidos, ser adicionado directamente ao ensaio, é habitualmente adicionado como um péptido com uma concentração de 1CT1 a 103pg/ml, de preferência 0,5 a 50 pg/ml ou 1 a 10 pg/ml.

[0112] Habitualmente, a duração da incubação dos linfócitos T com o péptido ou combinação é de 4 a 24 horas (de preferência 5 a 18 horas) para linfócitos T efectores ou superior a 24 horas no caso de células de memória central. Ao utilizar PBMCs ex vivo, descobriu-se que é possivel incubar 5,0 xlO6 PBMCs em 10 pg/ml de péptido durante 5 horas a 37 °C.

[0113] A proliferação dos linfócitos T incubados pode ser medida através de qualquer método adequado. Por exemplo, por citometria de fluxo da incorporação do composto fluorescente CFSE após a incubação com péptido, ou através da medição da incorporação do composto 3H-timidina marcado radioactivamente depois de incubação com péptido. Um exemplo tipico deste método é o que se segue: [0114] 100 μΐ da concentração do péptido adequado sao distribuídos nos poços adequados de placas de 96 poços. As placas são então colocadas numa incubadora humidificada com 5% de C02 a 37°C no máximo durante 4 horas. PBMCs isoladas conforme é Standard na arte são preparadas numa concentração de 2xl06 células/ml em meio completo à temperatura ambiente. 100 μΐ de solução celular são então distribuídos em cada um dos poços das placas de 96 poços que contêm antigénio/péptido. As placas são então incubadas durante 6 a 8 dias. As culturas são pulsadas com solução de timidina tritiada adicionando 10 μΐ de solução stock de timidina tritiada (l,85MBq/ml em meio de RPMI isento de soro) a cada poço. As placas são então devolvidas à 51 incubadora por um período entre 8 e 16 horas. As culturas são então colhidas em filtros e os filtros secos são avaliados usando um contador de cintilação beta adequado. Contagens de poços que contêm péptido são comparadas estatisticamente com poços que contêm apenas meio (12 poços por grupo). Uma diferença estatisticamente significativa entre poços apenas com meio e poços estimulados com péptido é considerada uma estimulação positiva de PBMC pelo péptido ou combinação de péptidos.

[0115] A libertação de citocinas pode ser medida através de qualquer método adequado como um ensaio ELISA, conforme descrito acima. Estes métodos são bem conhecidos na arte.

Imunoterapia de combinação [0116] Uma vez que muitos indivíduos são alérgicos, ou podem requerer dessensibilização, a vários antigénios de polipéptido, a presente invenção também fornece meios de dessensibilização de indivíduos que são alérgicos a múltiplos antigénios. A "tolerância" induzida num indivíduo a um primeiro antigénio ou alergénio de polipéptido pode criar no indivíduo um "ambiente tolerogénico", em que as respostas imunes inadequadas a outros antigénios podem ser moderadas de forma a criar tolerância a outros antigénios.

[0117] Este resultado significa que indivíduos alérgicos a múltiplos alergénios podem ser tratados num período tempo muito reduzido e que indivíduos gravemente alérgicos a alguns alergénios (p. ex., amendoim), mas apenas ligeiramente alérgicos a outros alergénios (p. ex., pêlo de gato) podem beneficiar de uma terapêutica na qual é estabelecida a tolerância ao alergénio mais ligeiro e depois este ambiente tolerogénico é usado para criar 52 tolerância ao outro alergénio mais extremo. Além disso, os indivíduos que sofrem de uma doença auto-imune que são também sensibilizados (ou mesmo imunes) a um antigénio ou alergénio não relacionado podem beneficiar de um regime de tratamento no qual a tolerância ao antigénio ou alergénio não relacionado é primeiro definida e depois este ambiente tolerogénico é usado para fornecer tolerância ao auto-antigénio associado à doença auto-imune.

[0118] Assim, é fornecido um método para dessensibilizar um indivíduo alérgico a gatos ao antigénio Fel dl e a um ou mais outros antigénios de polipéptidos diferentes. O método implica, num primeiro passo, administrar ao indivíduo a composição /produto/formulação (composição primária) de acordo com a invenção, conforme aqui descrito, e em que a administração é efectuada de um modo suficiente para gerar um estado hiporreactivo contra a antigénio Fel dl. Quando tiver sido definido um estado hiporreactivo em relação ao antigénio Fel dl ou pelo menos quando tiver ocorrido uma viragem em direcção à dessensibilização, o método implica a administração de uma composição secundária compreendendo um segundo antigénio de polipéptido diferente ao qual o indivíduo irá ser sensibilizado. A administração da composição secundária é efectuada de modo a tirar partido do ambiente tolerogénico estabelecido pelo uso da composição primária, sendo agora possível criar tolerância ao segundo antigénio de polipéptido diferente. A composição secundária é co-administrada com a primeira composição primária ou com um fragmento maior de Fel dl. O termo "co-administrada" designa a administração simultânea ou concomitante, p. ex., quando os dois estão presentes na mesma composição ou são administrados em composições separadas aproximadamente ao mesmo tempo mas em locais diferentes, assim como a administração dos antigénios do 53 polipéptido em composições separadas em momentos diferentes. Por exemplo, a composição secundária pode ser administrada antes ou depois da administração da primeira composição (ou um fragmento maior de Fel dl) no mesmo local ou num local diferente. 0 tempo entre administrações pode variar de cerca de vários segundos a cerca de vários minutos, várias horas ou mesmo vários dias. Além disso, podem ser empregues diferentes métodos de administração.

[0119] O segundo antigénio de polipéptido é de preferência um alergénio diferente do alergénio Fel dl. Alergénios adequados para uso nos métodos da invenção podem, naturalmente, ser obtidos e/ou produzidos usando métodos conhecidos. Classes de alergénios adequados incluem, mas não se limitam a, pólenes, pêlo de animal que não de gato, ervas, bolores, pós, antibióticos, venenos de picada de insecto e uma variedade de alergénios ambientais (incluindo quimicos e metais), fármacos e alimentos. Alergénios comuns de árvores incluem pólenes de choupo, freixo, vidoeiro, bordo, carvalho, elmo, nogueira amarga e nogueira-pecã; alergénios comuns de plantas incluem os da artemísia, ambrósia, banana-da-terra, azedas e anserina; alergénios de plantas de contacto incluem os do carvalho venenoso, hera venenosa e urtigas; alergénios de erva comuns incluem os do azevém, erva-dos-prados, sorgo bravo, relva das bermudas, festuca e poa; alergénios comuns também podem ser obtidos de bolores ou fungos como a Alternaria, Fusarium, Hormodendrum, Asperglllus, Micropolyspora, mucor e actinomicetos termofílicos; alergénios epidérmicos podem ser obtidos a partir do pó doméstico ou orgânico (habitualmente de origem fúngica), de artrópodes, tais como ácaros do pó doméstico (Dermatophagoides pteronyssinus) ou de origem animal, como penas de aves e pêlo de cão; alergénios alimentares comuns incluem leite e queijo 54 (lacticínios), ovos, trigo, frutos de casca rija (p. ex., amendoim), marisco (p. ex., crustáceos), ervilhas, feijão e glúten; alergénios ambientais comuns incluem metais (níquel e ouro), químicos (formaldeído, trinitrofenol e turpentina), látex, borracha, fibras (algodão ou lã), serapilheira, tinta para o cabelo, cosméticos, detergentes e perfumes; alergénios de fármacos comuns incluem anestésicos local e salicilato; alergénios de antibióticos incluem penicilina, tetraciclinas e sulfonamida; e alergénios comuns de insectos incluem alergénios de veneno de abelha, vespa e formiga e resíduos de barata. Alergénios particularmente bem caracterizados incluem, mas não se limitam a, epítopos crípticos principais do alergénio Der p I (Hoyne et al. (1994) Immunology 83190-195), fosfolipase de veneno de abelha A2 (PLA) (Akdis et al. (1996) J. Clin. Invest. 98:1676-1683), alergénio de pólen de vidoeiro Bet v 1 (Bauer et al. (1997) Clin. Exp. Immunol. 107:536-541), e o alergénio de relva multi-epitópico recombinante rKBG8.3 (Cao et al. (1997) Immunology 90:46-51). Estes e outros alergénios adequados estão comercialmente disponíveis e/ou podem ser facilmente preparados como extractos seguindo técnicas conhecidas.

[0120] De preferência, o segundo alergénio de polipéptido é seleccionado da lista de sequências de alergénio e números de acesso da base de dados (números de acesso ao Entrez do NCBI) abaixo. O NCBI é o National Center for Biotechnology Information e é uma divisão do US National Institutes of Health. O site da Web do NCBI, através do qual se pode aceder à base de dados é www.ncbi.nlm.nih.gov/. Sequências de alergénio e números de acesso da base de dados (números de acesso ao Entrez do NCBI) : 55 Ácaros do pó doméstico

Dermatophagoides pteronyssinus [0121]

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YPYVVTL

Der p 2

MMYKILCLSLLVAAVARDQVDVKDCANHEIKKVLVPGCHGSEPCIIHRGKPF

QLEAVFEANQNTKTAKIEIKASIDGLEVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYD

IKYTWNVPKIAPKSENVWTVKVMGDDGVLACAIATHAKIRD

Der p 3

MHYNILIVLLLAINTLANPILP ASPN ATIV GGEKALAGECPY QISLQSSSHFCGG TILDEYWILTAAHCVAGQTASKLSIRYNSLKHSLGGEKISVAKIFAHEKYDSY QrDNDIALKLKSPMKLNQKNAKAVGLPAKGSDVKVGDQVRVSGWGYLEEG SYSLPSELRRVDIAWSRKEOJELYSKANAEVTDNMICGGDVANGGKDSCQ GDSGGP VVD VKNNQWGIV S WG Y GCARKGYPGVYTRV GNFID WIESKRSQ

Der p 4 KYXNPHFIGXRSVITXLME Der p 5 56

MKFHAFFVATLAVMTVSGEDKKHDYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQ

EQINHFEEKPTKEMKDKIVAEMDTIIAMIDGVRGVLDRLMQRKDLDIFEQYN

LEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV

Der p 6 AIGXQPAAEAEAPFQISLMK Der p 7

MMKLLLIAAAAFVAVSADPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFDPMKVP

DHSDKFERfflGIIDLKGELDMRMQVRGLKQMKRVGDANVKSEDGWKAHL

LVGVHDDWSMEYDLAYKLGDLHPNTHVISDIQDFWELSLEVSEEGNMTLT

SFEVRQFANVVNHIGGLSILDPIFAVLSDVLTAIFQDTVRAEMTKVLAPAFKK

ELERNNQ

Der p9 IVGGSNASPGDAVYQIAL Dermatophagoides farinae

Der f 1

MKFVLAIASLLVLTVY ARP ASDCTFEFKKAFNKNY ATVEEEEV ARKNFLESLK

YVEANKGAINHLSDLSLDEFKNRYLMSAEAFEQLKTQFDLNAETSACRINSV

NVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAYRNTSLDLSEQ

ELVDCASQHGCHGDTIPRGffiYIQQNGWEERSYPYVAREQRCRRPNSQHYG

ISNYCQIYPPDVKQIREALTQTHTAIAVnGIKDLRAFQHYDGRTnQHDNGYQP

NYHAVNIVGYGSTQGDDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQY

PYWIM 57

Derf 2

MISKILCLSLLVAAWADQVDVKDCANNEIKKVMVDGCHGSDPCIIHRGKPF

TLEALFDANQNTKTAKIEIKASLDGLEIDVPGroTNACHFMKCPLVKGQQYDI

KYTWNVPKIAPKSENVWTVKLIGDNGVLACAIATHGKIRD

Der f 3

MMILTIWLLAANILATPILPSSPNATIVGGVKAQAGDCPYQISLQSSSHFCGG

SILDEYWELTAAHCVNGQSAKKLSIRYNTLKHASGGEKIQVAEIYQHENYDS

MTIDNDVALIKLKTPMTLDQTNAKPVPLPAQGSDVKVGDKIRVSGWGYLQE

GSYSLPSELQRVDIDWSRJEQCDQLYSKAGADVSENMICGGDVANGGVDSC

QGDSGGPWDVATKQIVGIVSWGYGCARKGYPGVYTRVGNFVDWIESKRS

Q

Der f 4

AVGGQDADLAEAPFQISLLK

Derf 7

MMKFLLIAAVAFVAVSADPIHYDKITEEINKAIDDAIAAIEQSETIDPMKVPDH ADKEERHV GIVDFKGELAMRN1EARGLKQMKRQGD ANVKGEEGIVKAHLLI GVHDDIVSMEYDLAYKLGDIHPTTHVISDIQDFWALSLEISDEGNITMTSFE VRQFANWNHIGGLSILDPIFGVLSDVLTAIFQDTVRKEMTKVLAPAFKRELE KN

[0122] Sequências adicionais de alergénio de ácaros (acesso ao Entrez do NCBI) : 1170095; 1359436; 2440053; 666007; 487661; 1545803; 84702; 84699; 625532; 404370; 1091577; 1460058; 7413; 9072; 387592. 58

Gato [0123] Sequências de Felis (acesso ao Entrez do NCBI): 539716; 539715; 423193; 423192; 423191; 423190; 1364213; 1364212; 395407; 163827; 163823; 163825; 1169665; 232086; 1169666. Látex [0124] Sequências de hévea:

Hev b 1

MAEDEDNQQGQGEGLKYLGFVQDAATYAVTTFSNVYLFAKDKSGPLQPGV

DIIEGPVKNVAVPLYNRFSYIPNGALKFVDSTWASVTnDRSLPPIVKDASIQV

VSAIRAAPEAARSLASSLPGQTKJLAKVFYGEN

Hev b 3

MAEEVEEERLKYLDFVRAAGVYAVDSFSTLYLYAKDISGPLKPGVDTIENW

KTWTPVYYTPLEAVKFVDKTVDVSVTSLDGWPPVIKQVSAQTYSVAQDAP

RIVLDVASSVFNTGVQEGAKALYANLEPKAEQYAVTTWRALNKLPLVPQVA

NWVPTAVYFSEKYNDWRGTTEQGYRVSSYLPLLPTEKITKVFGDEAS

[0125] Sequências adicionais de hévea (acesso ao Entrez do NCBI) : 3319923; 3319921; 3087805; 1493836; 1480457; 1223884; 3452147; 3451147; 1916805; 232267; 123335; 2501578; 3319662; 3288200; 1942537; 2392631; 2392630; 1421554; 59 1311006; 494093; 3183706; 3172534; 283243; 1170248; 1708278; 1706547 ; 464775; 266892; 231586; 123337; 116359; 123062; 2213877; 542013; 2144920; 1070656; 2129914; 2129913 ; 2129912; 100135; 82026; 1076559; 82028; 82027; 282933; 280399; 100138 ; 1086972; 108697; 1086976; 1086978; 1086978; 1086976; 1086974; 1086972; 913758; 913757; 913756; 234388; 1092500; 228691; 1177405; 18839; 18837; 18835; 18833 ; 18831; 1209317; 1184668; 168217; 168215; 168213; 168211; 168209; 348137. Azevém [0126] Sequências de Lolium: 126385 Lol p 1

MAS SSSVLLVV ALFAVFLGSAHGIAKVPPGPN1TAEYGDKWLDAKSTWYGK

PTGAGPKDNGGACGYKNVDKAPFNGMTGCGNTPIFKDGRGCGSCFEIKCTK

PESCSGEAVTVTITDDNEEPIAPYHFDLSGHAFGSMAKKGEEQNVRSAGELEL

QFRRVKCKYPDDTKPTFHVEKASNPNYLAILVKYVDGDGDVVAVDIKEKGK

DKWIELKESWGAVWRIDTPDKLTGPFTVRYTTEGGTKSEFEDVIPEGWKADT

SYSAK 126386 Lol p 2a

AAPVEFTVEKGSDEKNLALSIKYNKEGDSMAEVELKEHGSNEWLALKKNGD

GVWEIKSDKPLKGPFNFRFVSEKGMRNVFDDWPADFKVGTTYKPE 126387 Lol p 3

TKVDLTVEKGSDAKTLVLNIKYTRPGDTLAEVELRQHGSEEWEPMTKKGNL

WEVKSAKPLTGPMNFRFLSKGGMKNVFDEVIPTAFTVGKTYTPEYN 60 2498581 Lol p 5a

MAVQKYTVALFLRRGPRGGPGRSYAADAGYTPAAAATPATPAATPAGGWR

EGDDRRAEAAGGRQRLASRQPWPPLPTPLRRTSSRSSRPPSPSPPRASSPTSA

AKAPGLIPKLDTAYDVAYKAAEAHPRGQVRRLRHCPHRSLRVIAGALEVHA

VKP ATEEVLAAKIPTGELQIVDKID AAFKLAAT AANAAPTNDKFTVFES AFNK

ALNECTGGAMRPTSSSPPSRPRSSRPTPPPSPAAPEVKYAVFEAALTKAITAM TQAQKAGKPAAAAATAAATVATAAATAAAVLPPPLLWQSLISLLIYY 2498582 Lol p 5b

MAVQKHTVALFLAVALVAGPAASYAADAGYAPATPATPAAPATAATPATP

ATPATPAAVPSGKATTEEQKLIEKINAGFKAAVAAAAWPPADKYKTFVETF

GTATNKAFVEGLASGYADQSKNQLTSKLDAALKLAYEAAQGATPEAKYDA YV ATLT E ALR VIAGTLE VHA VKP AAEE VX V G AIP AAE V QLIDKVD AA YRT A ATAANAAPANDKFTVFENTFNNAIKVSLGAAYDSYKFIPTLVAAVKQAY AA KQ ATAPEVKYTVSETALKICAVT AMSEAEKEATP AAAATATPTP AAAT AT AT PAAAYATATP AAATATATP AAATATP AAAGGYKV 455288 Lol p isoforma 9

MAVQKHTV ALFLAV ALV AGP AAS Y AADAGY AP ATP ATP AAP AT AATPATP ATPATPAAVPSGKATTEEQKLIEKINAGFKAAVAAAAWPPADKYKTFVETF GTATNKAFVEGLASGYADQSKNQLTSKLDAALKLAYEAAQGATPEAKYDA YV ATLTE ALRVIAGTLEVHA VKP AAEEVKV GAIP AAE V QLIDKVD AA YRT A ATAANAAPANDKFTVFENTFNNAIKVSLGAAYDSYKFIPTLVAAVKQAYAA KQ AT APEVKYTV SET ALKKAVTAMSE ΑΕΚΕ ΑΤΡΑΑΑΑΓ ATPTP AAAT AT AT P AAAY AT ATP AAAT AT ATP AAAT ATP AAAGGYKV 1582249 Lol p 11 61

DKGPGFWTGRVYCDPCRAGFETNVSHNVEGATVAVDCRPFDGGESKLKAE

ATTDKDGWYKJEIDQDHQEEICEVVLAKSPDKSCSEIEEFRDRARVPLTSNXG

DCQQGIRYANPIAFFRKEPLKECGGILQAY

[0127] Sequências adicionais de Lolium (acesso ao Entrez do NCBI) : 135480; 417103; 687261; 687259; 1771355; 2388662; 631955; 542131; 542130; 542129; 100636; 626029; 542132; 320616; 320615; 320614; 100638 ; 100634; 82450; 626028; 100639; 283345; 542133; 1771353; 1763163; 1040877; 1040875; 250525; 551047; 515377; 510911 ; 939932 ; 439950 ; 2718; 168316; 168314; 485371; 2388664; 2832717;2828273;548867.

Oliveira

Sequências de oliveira [0128] 416610 Ole e 1

EDIPQPPVSQFPíIQGQVYCDTCRAGFHELSEFIPGASLRLQCKDKENGDVTFT

EVGYTRAEGLYSMLVERDHKNEFCEITLISSGRKDCNEIPTEGWAKPSLKFKL

NTVNGTTRTVNPLGFFKKEALPKCAQVYNKLGMYPPNM

Parietaria [0129] Sequências de Parietaria: 2497750 Par j P2 62

MRTVSMAALWIAAALAWTSSAEPAPAPAPGEEACGKWQDIMPCLHFVKG

EEKEPSKECCSGTKKLSEEVKTTEQKREACKCIVRATKGISG1KNELVAEVPK

KCDIKTTLPPITADFDCSKIQSTIFRGYY 1352506 Par j P5

MVRALMPCLPFV QGKEKEPSKGCCSGAKRLDGETKTGPQRVHACECIQT AM KTYSDIDGKLVSEVPKHCGIVDSKLPPIDVNMDCKT V G WPRQPQLP VSLRH GPVT GPSDP AHKARLERPQIRVPPP APEKA 1532056 Par j P8

MRTVSMAALWIAAALAWTSSAELASAPAPGEGPCGKWHHMPCLKFVKG

EEKEPSKSCCSGTKKLSEEVKTTEQKREACKCIVAATKGISGIKNELVAEVPK

KCGUTTLPPITADFDCSKIESTIFRGYY 1532058 Par j P9

MRTVSAPSAVALWTVAAGLAWTSLASVAPPAPAPGSEETCGTWRALMPC LPFVQGKEKEPSKGCCSGAKRLDGETKTGLQRVHACECIQTAMKTYSDIDGK LVSEVPKHCGIVDSKLPPIDVNMDCKTLGVVPRQPQLPVSLRHGPVTGPSDPA HKARLERPQIRVPPP APEKA 2497749 Par j P9

MRTVSARSSVALWIVAAVLVWTSSASVAPAPAPGSEETCGTWGALMPCL

PFVQGKEKEPSKGCCSGAKRLDGETKTGPQRVHACECIQTAMKTYSDIDGKL

VSEVPKHCGrVDSKLPPIDVNMDCKTLGVLHYKGN 1086003 Par j 1 63

MVRALMPCLPFVQGKEKEPSKGCCSGAKRLDGETKTGPQRVHACECIQTAM

KTYSDE)GKLVSEVPKHCGIVDSKLPPIDVNMDCKTVGWPRQPQLPVSLRH

GPVTGPSRSRPPTKHGWRDPRLEFRPPHRKKPNPAFSTLG

[0130] Sequências adicionais de Parietaria (acesso ao

Entrez do NCBI): 543659; 1836011; 1836010; 1311513; 1311512; 1311511; 1311510; 1311509; 240971.

Erva-dos-prados [0131] Sequências de Phleum:

Phl p 1

MASSSSVLLVWLFAVFLGSAYGIPKVPPGPNITATYGDKWLDAKSTWYGKP

TGAGPKDNGGACGYKDVDKPPFSGMTGCGNTPIFKSGRGCGSCFEIKCTKPE

ACSGEPWVHUDDNEEPIAPYHFDLSGHAFGAMAKKGDEQKLRSAGELELQ

FRRVKCKYPEGTKVTFHVEKGSNPNYLALLVKYVNGDGDVVAVDIKEKGK

DKWIELKESWGAIWRIDTPDKLTGPFTVRYTTEGGTKTEAEDVIPEGWKADT

SYESK

Phl p 1

MASSSSVLLWALFAVFLGSAHGIPKVPPGPNTrATYGDKWLDAKSTWYGKP

TAAGPKDNGGACGYKDVDKPPFSGMTGCGNTPIFKSGRGCGSCFEIKCTKPE

ACSGEPWVHITDDNEEPIAAYHFDLSGIAFGSMAKKGDEQKLRSAGEVEIQF

RRVKCKYPEGTKVTFHVEKGSNPNYLALLVKFSGDGDWAVDIKEKGKDK

WIALKESWGAIWRIDTPEVLKGPFTVRYTTEGGTKARAKDVIPEGWKADTA

YESK

Phlp 2 64

MSMASSSSSSLLAMAVLAALFAGAWCVPKVTFTVEKGSNEKHLAVLVKYE GDTMAEVELREHGSDEWVAMTKGEGGVWTFDSEEPLQGPFNFRFLTEKGM KNVFDDWPEKYTIG ATY APEE

Phl p 5

ADLGYGGPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLIEKINDGFKAALAAAAGVPPA DKYKTFVATFGAASNKAFAEGLSAEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYK TAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIE KVDS AFKV A AT AAN AAP ANDKFTVEE AAFNNAIKAS T GG AYES YKFEP ALE A AVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAFTAMSEAQKAAKPATEATATAT AAV G AAT GAAT AAT GGYK V

Phl p 5

ADLGY GGP ATPAAP AE AAPAGKATTEEQKLIEKINDGFKAALAAAAGVPP A

DKYKTFVATFGAASNKAFAEGLSAEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYK

TAEGATPEAKYDAYVATLSEALRnAGTLEVHAVKPAAEEVKYLPAGELQVIE

KVDSAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNNAIKASTGGAYESYKFIPALEA

AVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPATEATATAT

AAVGAATGAATAATGGYKV

Phl p 5b

AAAAVPRRGPRGGPGRSYTADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDIN VGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAAAAKAPGLVPKLDAAYSVA YKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGE LQJJJDiGD AAFKV AATAAATAJP ADDKFTVfE AAFNXAJKESTGGà YDT YKCÍP SLE AA VKQA Y AATV AAAPQVKYAVFEAALTKAIT AMSEV QKVSQP AT G AA TVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV

Phl p 5a 65

ADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAPAGADAAGKATTEEQKLIEKINAGFKA ALAGAGVQPADKYRTFVATFGPASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSK LDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEV KVTP AGELQVTEKVD AAFKV AATAANAAP ANDKFT VFEAAFNDEIKASTGG A YES YKFIP ALE AA VKQA Y AAT V AT APEVKYTVFET ALKKAITAMSEAQKAA KPAAAATATATAAVGAATGAATAATGGYKV

Phl p 5

MAVQKYTVALFLAVALVAGPAASYAADAGYAPATPAAAGAEAGKATTEEQ KLIEDINV GFKAAV AAAAS VP AADKFKTFE AAFTSS SKAATAKAPGLVPKLD AAYSVSYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGM AKIPAGELQIIDKID AAFKV AATAAATAPADTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTY KdPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPAT G AATV AAG AATT AAG AASG AAT V AAGGYKV

Phl p 5

MAV QKYTVALFLAVALV AGP AAS Y AAD AGY AP ATPAAAGAEAGKATTEEQ KLIEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLD AAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEDPAW PKIPAGELQIIDKID AAFKV AAT AAAT AP ADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAY DTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQ PATGAATVAAGAATTATGAASGAATV AAGG YKV

Phl p 5 66

AD AGYAP ATP AAAGAEAGKATTEEQKL1EDINV GFKAAV AAAAS VPAADKF KTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVAS LTE ALRVIAGALE VHA VKP VTEEP GMAKtP AGELQIIDKID AAFK V AAT AAAT APADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEAAVKQ AY AATV AAAP Q VK YA VFE AALTKAIT AMSE V QKVSQP AT GAAT V AAG AATT AAG AAS G AA TVAAGGYKV

Phl p 5

SVKRSNGSAEVHRGAVPRRGPRGGPGRSYAADAGYAPATPAAAGAEAGKA TTEEQKLEEDINVGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGL VPKLDAAYSVAYKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVT EEPGM AKIP AGELQIIDKID AAFKV AAT AAATAP ADDKPTVFE AAFNKAIKES TGGAYDTYKCIPSLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEV QKVSQP ATGAATVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV

Pulp5

MAVHQYTVALFLAVALVAGPAGSYAADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAP

AGAEPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAAAAGVPPADKYRTFVATFGAAS

NKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAY

VATVSEALRIIAGTLEVHA VKP AAEEVKV1PAGELQVIEKVD AAFKV AATAA

NAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVAT

APEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATA

ATGGYKV

Phl p 5

ADLGYGGPATPAAPAEAAPAGKATTEEQKLEEKINDGFKAALAAAAGVPPA

DKYKTFVATFGAASNKAFAEGLSAEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYK

TAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIE

KVDSAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNNAIKASTGGAYESYKFIPALEA

AVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAFTAMSEAQKAAKPATEATATAT

AAV GAATGAATAATGGYKV 67

Phl p5b

AAAA VPRRGPRGGPGRS YTADAGY AP ATP AAAGAAAGKATTEEQKLIEDIN VGFKAAVAAAASVPAADKFKTFEAAFTSSSKAAAAKAPGLVPKLDAAYSVA YKAAVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGE LQHDKID AAFKV AAT AAATAP ADDKFT VFEAAFNKAIKEST GG AYDT YKCIP SLEAAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAJTAMSEVQKVSQPATGAA

TVAAGAATTAAGAASGAATVAAGGYKV

Phl p5a

ADLGY GP ATP AAP AAG YTP ATP AAP AG AD AAGKATTEEQKLIEKIN AGFKA ALAGAGVQPADKYRTFVATFGPASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSK LDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEV KVIPAGELQVIEKVO AAFKV AAT AAN AAP ANDKFTVFEAAFNDEIKASTGGA YESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAA KP AAAATAT AT AAV GAATGAAT AAT GGYKV

Phl p5

AVPRJRGPRGGPGRSYAADAGYAPATPAAAGAEAGKATTEEQKLffiDINVGF

KAAVAAAASVPAGDKFKTFEAAFTSSSKAATAKAPGLVPKLDAAYSVAYKA AVGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQn

DKID AAFKV AAT AAAT AP ADDKFTVFE AAFNKAIKESTGGAYDT YKCIPSLE

AAVKQAYAATVAAAPQVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVA

AGAATTATGAASGAATVAAGGYKV

Phl p 5b 68

MA VPRRGPRGGPGRS YT AD AG Υ AP ATP AAAGAAAGKATTEEQKLIEDINV G

FKAA V AARQRP AADKFKTFE AASPRHPRPLRQG AGLVPKLD AAYS V A YKAA

VGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQIID

KIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEA

AVKQAYAATVAAAAEVKYAVFEAALTKAITAMSEVQKVSQPATGAATVAA

GAATTAAGAASGAATVAAGGYKV

Phl p5

MAVHQYTVALFLAVALVAGPAASYAADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAP AEAAPAGKATTEEQKLDEKINAGFKAALAAAAGVQPADKYRTFVATFGAAS NKAF AEGLSGEPKGAAES SSKAALTSKLD AAYKLAYKT AEG ATPE AKYD AY VATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVffAGELQVIEKVDAAFKVAATAA

NAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVAT

APEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATA

ATGGYKV

Phl p 5

EAPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALARRLQPADKYRTFVATFGPASNKAFA EGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLS E ALRUAGTLE VHA VKP AAEE VKVIP AAELQ VIEK VD AAFK V AAT AANAAP A NDKFTVFEAAFNDEIKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKY TVFETALKKAITAMSEAQKAAKPPPLPPPPQPPPLAATGAATAATGGYKV

Phl p 5 69

MAVHQYT V ALFLAVALV AGP AAS YAADLGY GP ATP AAP AAGYTP ATP AAP

AE AAP AGKATTEEQKLIEKIN AGFKAALAAAAG V QP ADKYRTF V ATF GAAS

NKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAY

VATLSEALRIIAGTLEVHAVKPAAEEVKVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAA

NAAPANDKFTVFEAAFNDAJKASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVAT

APEVKYTVFET ΑΕΚΚΑΓΓ AMSE AQKAAKP AAAAT AT ATAAV G AAT G AAT A

ATGGYKV

Phl p 5b

MAVPRRGPRGGPGRSYTADAGYAPATPAAAGAAAGKATTEEQKLIEDINVG

FKAAVAARQRPAADKFKTFEAASPRHPRPLRQGAGLVPKLDAAYSVAYKAA

VGATPEAKFDSFVASLTEALRVIAGALEVHAVKPVTEEPGMAKIPAGELQnD

KIDAAFKVAATAAATAPADDKFTVFEAAFNKAIKESTGGAYDTYKCIPSLEA

A VKQ AY AATV AAAAEVKY AVFE AALTKAIT AMSEV QKV SQP AT GAAT V AA

GAATTAAGAASGAATVAAGGYKV

Phl p 5a

ABLGYGPATPAAP AAGYTP ATP AAP AGADAAGKATTEEQKLIEKINAGFKA ALAGAGVQPADKYRTFVATFGPASNKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSK

LDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAYVATLSEALRI1AGTLEVHAVKPAAEEV

KVIPAGELQVIEKVDAAFKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDEIKASTGGA

YESYKFIPALEAAVKQAYAATVATAPEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAA

KPPPLPPPPQPPPLAATGAATAATGGYKV

Phl p 5 70

MAVHQYTVALFLAVALVAGPAASYAADLGYGPATPAAPAAGYTPATPAAP

AEAAPAGKATTEEQKLIEKINAGFKAALAAAAGVQPADKYRTFVATFGAAS

NKAFAEGLSGEPKGAAESSSKAALTSKLDAAYKLAYKTAEGATPEAKYDAY

VATT QFAT ΡΠΔΠΤΤ PVH4WPÍ AFTFWVTPΔΓ.ΡΤ ΠνΤΡΐΓ\ΓΠA AFUTVA ATA A

T i k Λ WWWi 1 tA. I Má ftV* A tm/t * T A AA A T AM 4 M > Mfcrf T T AA A kVJ V Afc^AA T A A4 LA AA f i LA A A A 14 A

NAAPANDKFTVFEAAFNDA1KASTGGAYESYKFIPALEAAVKQAYAATVAT

APEVKYTVFETALKKAITAMSEAQKAAKPAAAATATATAAVGAATGAATA

ATGGYKV

Phl p 6

MAAHKFMVAMFLAVAVVLGLATSPTAEGGKATTEEQKLIEDVNASFRAAM ATT ANVPP ADKYKTFEAAFTVS SKRNLAD A V SKAPQLVPKLDE VYNAAYNA ADHAAPEDKYEAFVLHFSEALRXLAGTPEVHAVKPGA

Phl p 6

SKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALHUAGTPEVHA

VKPGA

Phl p 6

ADKYKTFEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPE DKYEAFVLHFSEALHILAGTPEVHA VKPGA

Phl p 6

TEEQKLIEDVNASFRAAMATT ANVPP ADKYKTLEAAFTVSSKRNLADAVSK

APQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAPEDKYEAFVLHFSEALRI1AGTPEVHAVK

PGA

Phl p 6 71

MAAHKFMV AMFLAV AWLGLATSPTAEGGKATTEEQKLIEDINASFRAAMA TTANVPPADKYKTFEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAA DHAAPEDKYEAFVLHFSEALHI1AGTPEVHAVKPGA

Phl p 6

MVAMFLAVAWLGLATSPTAEGGKATTEEQKLIEDVNASFRAAMATTANVP

PADKYKTFEAAFTVSSKRNLADAVSKAPQLVPKLDEVYNAAYNAADHAAP

EDKYEAFVLHFSEALRDAGTPEVHAVKPGA

Phl p 7

MADDMERIFKRFDTNGDGKISLSELTDALRTLGSTSADEVQRMMAEIDTDGD GFIDFNEFISFCN ANPGLMKD V AKVF

Phl p 11

MSWQTYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITG1M

KDFDEPGHLAPTGMFVAGAKYMVIQGEPGRVIRGKKGAGGITIKKTGQALV

VGIYDEPMTPGQCNMWERLGDYLVEQGM

[0132] Sequências adicionais de Phleum (acesso ao Entrez do NCBI) : 458878; 548863; 2529314; 2529308; 2415702; 2415700; 2415698; 542168; 542167; 626037; 542169; 541814; 542171; 253337; 253336; 453976; 439960.

Vespa (e relacionados)

Sequências de Vespula: [0133] 465054 ALERGÉNIO VES V 5 72

MEISGLVYLmVTUDLP Y GKANNY CKIKCLKGGVHT ACKYGSLKPNCGNKV WS Y GLTKQEKQDILKEHNDFRQKIARGLETRGNPGPQPP AKNMKNLVWND elayvaqvwanqcqyghdtcrdvakyqvgqnvaltgstaakyddpvklv KMWEDEVKDYNPKKKFSGNDFLKTGHYTQMVWANTKEVGCGSIKYIQEK WHKHYLVCNYGPSGNFMNEELYQTK 1709545 ALERGÉNIO VES Μ 1

GPKCPFNSDTVSIUETRENRNRDLYTLQTLQNHPEFKKKTITRPWFITHGFTS

SASEKNFINLAKALVDKDNYMVISIDWQTAACTNEYPGLKYAYYPTAASNT

RLVGQYIATITQKLVKDYKISMANIRLIGHSLGAHVSGFAGKRVQELKLGKYS

EnGLDPARPSFDSNHCSERLCETDAEYVQIIHTSNYLGTEKILGTVDFYMNNG

KNNPGCGRFFSEVCSHTRAVIYMAECIKHECCLIGIPRSKSSQPISRCTKQECV

CVGLNAKKYPSRGSFYVPVESTAPFCNNKGKII 1352699 ALERGÉNIO VES V 1

MEENMNLKYLLLFVYFVQVLNCCYGHGDPLSYELDRGPKCPFNSDTVSniET

RENRNRDLYTLQTLQNHPEFKKKTITRPWFITHGFTSSASETNFINLAKALVD

KDNYMVISEDWQTAACTNEAAGLKYLYYPTAARNTRLVGQYIATITQKLVK

HYKISMANTRLIGHSLGAHASGFAGKKVQELKLGKYSEIIGLDPARPSFDSNH

CSERLCETDAEYVQIIHTSNYLGTEKTLGTVDFYMNNGKNQPGCGRFFSEVC

SHSRAVIYMAECIKHECCLIGIPKSKSSQPISSCTKQECVCVGLNAKKYPSRGS

F YVPVEST APFCNNKGKII 1346323 ALERGÉNIO VES V 2

SERPKRVFWYWNVPTFMCHQYDLYFDEVTNFNIKRNSKDDFQGDKIAIFYD PGEFPALLSLKDGKYKKRNGGVPQEGNmHLQKFIENLDKIYPNRNFSGIGVI DFERWRPIFRQNW GNMKMKNFSIDLVRNEHPT WNKXMIELE ASKRFEK Y A RFFMEETLKLAKKTRKQADWGYYGYPYCFNMSPNNLVPECDVTAMHENDK MSWLFNNQNVLLPSVYVRQELTPDQRIGLVQGRVKEAVRISNNLKHSPKVLS

YWWYVYQDETNTFLTETDVKKTFQEIVINGGDGinWGSSSDVNSLSKCKRL

QDYLLTVLGPIAINVTEAVN 73

549194 ALERGENIO VES VI

5KVNYCKIKCLKGGVHTACKYGTSTKPNCGKMWKAYGLTEAEKQEILKVH NDFRQKVAKGLETRGNPGPQPPAKNMNNLVWNDELANIAQVWASQCNY G HDTCKDTEKYPVGQNIAKRSTTAALFDSPGKLVKMWENEVKDFNPNIEWSK NNLKKTGHYTQMVWAKTKEIGCGSVKYVKDEWYTHYLVCNYGPSGNFRN EKLYEKK

[0134] Sequências adicionais de Vespula (acesso ao Entrez do NCBI) : 549193; 549192; 549191; 549190; 549189; 117414; 126761; 69576; 625255; 627189; 627188; 627187; 482382; 112561; 627186; 627185; 1923233; 897645; 897647; 745570; 225764; 162551.

[0135] Sequências de alergénios de árvores (principalmente de vidoeiro): 114922 Bet v 1

MGVFNYETETTSVIPAARLFKAFILDGDNLFPKVAPQAISSVENffiGNGGPGTI

KKISFPEGFPFKYVKDRVDEVDHTNFKYNYSVIEGGPIGDTLEKISNEIKIVAT

PDGGSILKISNKYHTKGDHEVKAEQVKASKEMGETLLRAVESYLLAHSDAY

N 130975 Bet v 2

MSWQTYVDEHLMCDIDGQASNSLASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGI

MKDFEEPGHLAPTGLHLGGIKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGUIKKTGQALV

FGIYEEPVTPGQCNMWERLGDYL1DQGL 1168696 Bet v 3 74

MPCSTEAMEKAGHGHASTPRKRSLSNSSFRLRSESLNTLRLRRIFDLFDKNSD

GIITVDELSRALNLLGLETDLSELESTVKSFTREGNIGLQFEDFISLHQSLNDSY

FAYGGEDEDDNEEDMRKSILSQEEADSFGGFKVFDEDGDGYISARELQMVL

GKLGFSEGSEIDRVEKMIVSVDSNRDGRVDFFEFKDMMRSVLVRSS 809536 Bet v 4

MADDHPQDKAERERIFKRFDANGDGKISAAELGEALKTLGSUPDEVKHMM

AEIDTDGDGFISFQEFTDFGRANRGLLKDVAKIF 543675 Que a I - Quercus alba = carvalhos (fragmento)

GVFTXESQETSVIAPAXLFKALFL 543509 Car b I - Carpinus betulus = faias-brancas (fragmento)

GVFNYEAETPSVIPAARLFKSYVLDGDKLIPKVAPQAIXK 543491 Aln g I - Alnus glutinosa = amieiros (fragmento) GVFNYEAETPSVIPAARLFKAFILDGDKLLPKVAPEAVSSVENI 1204056 Rubisco

VQCMQVWPPLGLKKFETLSYLPPLSSEQLAKEVDYLLRKNLIPCLEFELEHGF

VYREHNRSPGYYDGRYWTMWKLPMFGCNDSSQVLKELEECKKAYPSAFIRI

IGFDDK

[0136] Sequências adicionais de alergénios de árvores (número de acesso ao Entrez do NCBI): 75 131919; 128193; 585564; 1942360; 2554672; 2392209; 2414158; 1321728; 1321726; 1321724; 1321722; 1321720; 1321718; 1321716; 1321714; 1321712; 3015520; 2935416; 464576; 1705843; 1168701; 1168710; 1168709; 1168708; 1168707; 1168706; 1168705; 1168704; 1168703; 1168702; 1842188; 2564228; 2564226; 2564224; 2564222; 2564220; 2051993; 1813891; 1536889; 534910 ; 534900; 534898; 1340000; 1339998; 2149808; 66207; 2129477; 1076249; 1076247; 629480; 481805; 81443; 1361968; 1361967; 1361966; 1361965; 1361964; 1361963; 1361962; 1361961; 1361960; 1361959; 320546; 629483 ; 629482; 629481; 541804; 320545; 81444; 541814:; 629484; 474911; 452742; 1834387; 298737; 298736; 1584322; 1584321; 584320; 1542873; 1542871; 1542869; 1542867; 1542865; 1542863; 1542861; 1542859; 1542857; 1483232; 1483230; 1483228; 558561; 551640; 488605; 452746; 452744; 452740; 452738; 452736; 452734; 452732; 452730; 452728; 510951; 450885; 17938; 17927; 17925; 17921; 289331; 289329; 166953. 297538;

Amendoim

Sequências de amendoim [0137] 1168391 Ara h 1 76

MRGRVSPLMLLLGILVLASVSATHAKSSPYQKKTENPCAQRCLQSCQQEPDD

LKQKACESRCTKLEYDPRCVYDPRGHTGTTNQRSPPGERTRGRQPGDYDDD

RRQPRREEGGRWGPAGPREREREEDWRQPREDWRRPSHQQPRFCIRPEGREG

EQEWGTPGSHVREETSRNNPFYFPSRRFSTRYGNQNGRIRVLQRFDQRSRQF

QNLQNHRIVQIEAKPNTLVLPKHADADNILVIQQGQATVTVANGNNRKSFNL

DEGHALRIPSGFISYILNRHDNQNLRVAKISMPVNTPGQFEDFFPASSRDQSSY

LQGFSRNTLEAAFNAEFNEIRRVLLEENAGGEQEERGQRRWSTRSSENNEGVI

VK V S KEHVEELTKHARS V SKKGSEEEGDITNPINLREGEPDLSNNF GKLFE VK

PDKKNPQLQDLDMMLT C VEKEG ALMLPHFN SKAMVIYVVNKGT GNLELV

A VRKEQQQRGRREEEEDEDEEEEGSNRE VRRYT ARLKEGD W1MP AAHP V AI

NASSELHLLGFGINAENNHRIFLAGDKDNVIDQIEKQAKDLAFPGSGEQVEKL

KNQKESHFVSARPQSQSQSPSSPEKESPEKEDQEEENQGGKGPLLSILKAFN

Ambrósia

Sequências de ambrósia [0138] 113478 Amb a 1

MG1KHCCYTLYFTLALVTLLQPVRSAEDLQQILPSANETRSLTTCGTYNIIDGC

WRGKADWAENRKALADCAQGFAKGTIGGKDGDIYTVTSELDDDVANPKEG

TLRFGAAQNRPLWUFARDMVIRLDRELAINNDKTIDGRGAKVEnNAGFAIYN

VKNmHNUMHDIWNPGGLIKSHDGPPVPRKGSDGDAIGISGGSQIWIDHCSLS

KAVDGLIDAKHGSTHFTVSNCLFTQHQYLLLFWDFDERGMLCTVAFNKFTD

NVDQRMPNLRHGFVQVVNNNYERWGSYALGGSAGPTILSQGNRFLASDDCK

EWGRYGESAMSESINWNWRSYMDWENGAIFVPSGVDPVLTPEQNAGMIP

AEPGEAVLRLTSSAGVLSCQPGAPC 113479 Amb a 2 77

MGKHCCYILYFTLALVTLVQAGRLGEEVDILPSPNDTRRSLQGCEAHNIIDK

CWRCKPDWAENRQALGNCAQGFGKATHGGKWGDIYMVTSDQDDDWNP

KEGTLRFGATQDRPLWIIFQRDMHYLQQEMWTSDKTE)GRGAKVELVYGGI

TLMNVKNVIIHNIDIHDVRVLPGGRIKSNGGPAIPRHQSDGDAIHVTGSSDIWI

DHCTLSKSFDGLVDVNWGSTGVTISNCKFTHHEKAVLLGASDTHFQDLKMH

VTLAYN1FTNT V HERMPRCREGFF QIVNNFYDRWDKYAIGGS SNPTILS QGNK

FVAPDFIYKKNVCLRTGAQEPEWMTWNWRTQNDVLENGAIFVASGSDPVLT

AEQNAGMMQAEPGDMVPQLTMNAGVLTCSPGAPC 113477 Amb a 1.3

MGDCQCCYILYFTLALVALLQPVRSAEGVGEILPSVNETRSLQACEALNIIDKC

WRGKADWENNRQALADCAQGFAKGTYGGKWGDVYTVTSNLDDDVANPK

EGTLRFAAAQNRPLWIIFKNDMVINLNQELWNSDKTE)GRGVKVEDNGGLT

LMNVKNIIIHNINIHDVKVLPGGMIKSNDGPPILRQASDGDTINVAGSSQIW1D

HCSLSKSFDGLVDVTLGSTHVTISNCKFTQQSKAILLGADDTHVQDKGMLAT

V AFNMFTDNVDQRMPRCRF GFFQ VYNNNYDRW GT Y AIGGSS APTILCQGNR

FLAPDDQKKNVLARTGTGAAESMAWNWRSDKDLLENGAIFVTSGSDPVLT

PVQSAGMIPAEPGEAAIKLTSSAGVFSCHPGAPC 113476 Amb a 1.2

MGIKHCCYILYFTLALVTLLQPVRSAEDVEEFLPSANETRRSLKACEAHNIIDK

CWRCKADWANNRQALADCAQGFAKGTYGGKHGDVYTVTSDKDDDVANP

KEGTLRFAAAQNRPLWIIFKRNMVIHLNQELWNSDKTIDGRGVKVNTVNAG ltlmnvknhihninihdikvcpggmiksndgppilrqqsdgdainvagssqiwi

DHCSLSKASDGLLDITLGSSHVTVSNCKFTQHQFVLLLGADDTHYQDKGML

ATVAFNMFTDHVDQRMPRCRFGFFQWNNNYDRWGTYAIGGSSAPTILSQG

NRFFAPDDIIKKNVLARTGTGNAESMSWNWTRTDRDLLENGAIFLPSGSDPVL

TPEQKAGMIPAEPGEAVLRLTSSAGVLSCHQGAPC 113475 Amb a 1.1 78

MGKHCCYILYFTLALVTLLQPVRSAEDLQEILPVNETRRLTTSGAYNnDGCW

RGKADWAENRKALADCAQGFGKGTVGGKDGDIYTVTSELDDDVANPKEGT

LRFGAAQNRPLWIIFERDMVIRLDKEMVVNSDKTIDGRGAKVEIINAGFTLNG

VKNVIIHNINMHDVKVNPGGLIKSNDGP AAPRAGSDGD AISISGS SQIWIDHCS

LSKSVDGLVDAKLGTTRLTVSNSLFTQHQFVLLFGAGDENIEDRGMLATVAF

NTFTDNVDQRMPRCRHGFFQWNNNYDKWGSYAIGGSASPTILSQGNRFCA

PDERSKKNVLGRHGEAAAESMKWNWRTNKDVLENGAIFVASGVDPVLTPE

QSAGMIPAEPGESALSLTSSAGVLSCQPGAPC

Sequências de cedro [0139]

493634 precursor de Cry j IB

MDSPCLVALLVFSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGS

STMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPPGTLRYGATRDRPLWHFSGNMNIKLKM

PMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLYLYGCSTSVLGNVL

INESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLTSTGVTISN

NLFFNHHKVMSLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARY GLV

HVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCS

NWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPHLTQNA

GVLTCSLSKRC 493632 precursor de Cry j ia

MDSPCLVALLVLSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGS

STMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPAPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMNIKLK

MPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVnHGLHLYGCSTSVLGN 79

VLINESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWTOHNSFSNSSDGLVDVTLSSTGVTI SNNLFFNHHKVMLLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGL VHYANNNYDP WTIY AIGGS SNPTILS EGNSFÍ APNES YKKQ VTIRIGCKTS S S C SNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPQLTKN AGVLTCSLSKRC 1076242 precursor de Cry j II - cedro japonês

MAMKLIAPMAFLAMQLI1MAAAEDQSAQIMLDSWEKYLRSNRSLRKVEHS

RHD AINIFNVEKY G AV GDGKHDCTE AFSTA W QAACKNPS AMLLVPGSKKF V

VNNLFFNGPCQPHFTFKVDGIIAAYQNPASWKNNRIWLQFAKLTGFTLMGKG

VIDGQGKQWWAGQCKWVNGREICNDRDRPTAIKFDFSTGLIIQGLKLMNSPE

FHLVFGNCEGVKnGISHAPRDSPNTDGIDIFASKNFHLQKNTIGTGDDCVAIG

TGSSNIVIEDLICGPGHGISIGSLGRENSRAEVSYVHVNGAKFIDTQNGLRIKT

WQGGSGMASHIIYENVEMINSENPILINQFYCTSASACQNQRSAVQIQDVTYK

NIRGTSATAAAIQLKCSDSMPCKDIKLSDISLKLTSGKIASCLNDNANGYFSGH

VIPACKNLSPSAKRKESKSHKHPKTVMVENMRAYDKGNRTRILLGSRPPNCT

NKCHGCSPCKAKLVTVHRIMPQEYYPQRWICSCHGKIYHP 1076241 proteína de Cry j II - cedro japonês

MAMKFIAPMAFVAMQLIIMAAAEDQSAQlMLDSDffiQYLRSNRSLRKVEHSR HDAINIFNVEKYGAVGDGKHDCTEAFSTAWQAACKKPSAMLLVPGNKKFV VNNLFFNGPCQPHFTFKVDGDAAY QNP AS WKNNRIWLQFAKLTGFTLMGKG VTOGQGKQWWAGQCKWVNGREICNDRDRPTAIKFDFSTGLnQGLKLMNSPE FHLVFGNCEGVKnGISITAPRDSPNTDGIDIFASKNFHLQKNTIGTGDDCVAIG tgssniviedlicgpghgisigslgrensraevsyvhvngakfidtqnglrikt

WQGGSGMASHDYENVEMINSENPILINQFYCTSASACQNQRSAVQIQDVTYK

NIRGTSATAAAIQLKCSDSMPCKDDCLSDISLKLTSGKIASCLNDNANGYFSGH vipacknlspsakrkeskshkhpktvmvknmgaydkgnrtrillgsrppnct nkchgcspckaklvivhrimpqeyypqrwmcsrhgkiyhp 541803 precursor de Cry j I - cedro japonês 80

MDSPCLVALLVLSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGS

STMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPPGTLRYGATRDRPLWIIFSGNMN1KLKM

PMYIAGYKTFDGRG AQ VY1GNGGPC VFIKRV SNVDHGLHLY GCSTS VLGNVL

INESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLSSTGVTISN

NLFFNHHKVMLLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGLV

HVANNNYDPWTIYAIGGSSNPHLSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSCS

NWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPQLTKNA

GVLTCSLSKRC 541802 precursor de Cry j I - cedro japonês

MDSPCLVALLVFSFVIGSCFSDNPIDSCWRGDSNWAQNRMKLADCAVGFGS

STMGGKGGDLYTVTNSDDDPVNPAPGTLRYGATRDRPLWHFSGNMNIKLK

MPMYIAGYKTFDGRGAQVYIGNGGPCVFIKRVSNVIIHGLYLYGCSTSVLGN

VL1NESFGVEPVHPQDGDALTLRTATNIWIDHNSFSNSSDGLVDVTLTSTGVTI

SNNLFFNHHKVMSLGHDDAYSDDKSMKVTVAFNQFGPNCGQRMPRARYGL

VHVANNNYDPWTIYAIGGSSNPTILSEGNSFTAPNESYKKQVTIRIGCKTSSSC

SNWVWQSTQDVFYNGAYFVSSGKYEGGNIYTKKEAFNVENGNATPHLTQN

AGVLTCSLSKRC Cão

Sequências de Canis: [0140]

Can f 1

MKTLLLTIGFSLIAILQAQDTPALGKDTVAVSGKWYLKAMTADQEVPEKPDS

VTPMILKAQKGGNLEAKITMLTNGQCQNITWLHKTSEPGKYTAYEGQRW

FIQPSPVRDHYILYCEGELHGRQIRMAKLLGRDPEQSQEALEDFREFSRAKGL

NQEELELAQSETCSPGGQ

Fragmento de albumina sérica 81

EAYKSEIAHRYNDLGEEHFRGLVL

Fragmento de albumina sérica

LSSAKERFKCASLQKFGDRAFKAWSVARLSQRFPKADFAEISKWTDLTKVH KECCHGDLLECADDRADLAKYMCENQDSISTKLKECCDKPVLEKSQCLAEV ERDELPGDLPSLAADFVEDKEV CKNY QEAKDVFLGTFLYE Y SRRHPE YS V SL LLRLAKEYEATLEKCCATDDPPTCYAKVLDEFKPLVDEPQNLVKTNCELFEK LGEYGFQNALLVRYTKKAPQVSTPTLWEVSRKLGKVGTKCCKKPESERMS CADDFLS

Can f 2

MQLLLLTVGLALICGLQAQEGNHEEPQGGLEELSGRWHSVALASNKSDUKP

WGHFRVFIHSMSAKDGNLHGDILIPQDGQCEKVSLTAFKTATSNKFDLEYWG

HNDLYLAEVDPKSYLILYMINQYNDDTSLVAHLMVRDLSRQQDFLPAFESVC

EDIGLHKDQIWLSDDDRCQGSRD

[0141] Proteína adicional de alergénio de cão (acesso ao Entrez do NCBI): 1731859

Cavalo [0142] Sequências de Equus: 1575778 Equ cl

MKLLLLCLGULVCAQQEENSDVAIRNFDISKISGEWYSIFLASDVKEK1EENG

SMRVFVDVIRALDNSSLYAEYQTKVNGECTEFPMVFDKTEEDGVYSLNYDG

YNVFRISEFENDEHIILYLVNFDKDRPFQLFEFYAREPDVSPEIKEEFVKIVQKR

GIVKENnDLTKIDRCFQLRGNGVAQA 3121755 Equ c 2 82 SQXPQSETDYSQLSGEWNTIYGAASNIXK Euroglyphus (ácaro)

Sequências de Euroglyphus: Eur m 1 (variante)

TYACSINSVSLPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVASTESAYLAYRN MSLDLAEQELVDCASQNGCHGDTIPRGIEYIQQNGWQEHYYPYVAREQSC HRPNAQRYGLKNYCQISPPDSNKIRQALTQTHTAVAVnGIKDLNAFRHYDGR TIMQHDN G Y QPNYHAVNIV G Y GNT QG VD Y WIVRN S WDTTW GDNGY GYFA ANINL

Eur m 1 (variante)

TYACSINSVSLPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVASTESAYLAYRN MSLDLAEQELVDCASQNGCHGDTIPRGIEYIQQNGWQEHYYPYVAREQSC HRPNAQRYGLKNYCQISPPDSNKIRQALTQTHTAVAVnGlKDLNAFRHYDGR TMQHDN GY QPNYHA VNTV G Y GNTQ G VD YWIVRN S WDTTW GDN GY GYFA ANINL

Eur m 1 (variante)

ETNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAY

RNQSLDLAEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQHNGWQESYYRYVAREQS

CRRPNAQRFGISNYCQIYPPNANKIREALAQTHSAIAVnGIKDLDAFRHYDGR

TIIQRDNGYQPNYHAVNIVGYSNAQGVDYWIVRNSWDTNWGDNGYGYFAA

NIDL

Eur m 1 (variante) 83

ETSACR1NSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVAATESAYLAY RNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQQNGWEERSYPYVAREQQ CRRPN SQHY GISNY CQIYPPD VKQIRE ALTQTHT AIAVIIGIKDLRAFQHYD GR TDQHDNGYQPNYHAVNTVGYGSTQGVDYWIVRNSWDTTWGDSGYGYFQA GNNL

Sequências de Poa (relva) [0143] 113562 ALERGÉNIO DE PÓLEN DE POA P 9

MAV QKYTV ALFLVALW GP AAS Y AADLS Y GAP ATP AAPAAGYTP AAPAGA

APKATTDEQKMIEKINVGFKAAVAAAGGVPAANKYKTFVATFGAASNKAFA

EALSTEPKGAAVDSSKAALTSKLDAAYKLAYKSAEGATPEAKYDDYVATLS

EALRJIAGTLEVHGVKP AAEEVKATP AGELQVIDKVDAAFKV AAT AANAAP A

NDKFTVFEAAFNDADCASTGGAYQSYKFIPALEAAVKQSYAATVATAPAVK

YT VFET ALKKAJTAMS Q AQKAAKP AAAATGT ATAAV GA AT G AAT AAAGG Y

KV 113561 POA P 9

MAVHQYTVALFLAVALVAGPAASYAADVGYGAPATLATPATPAAPAAGYT PAAPAGAAPKATTDEQKLIEKINAGFKAAVAAAAGVPAVDKYKTFVATFGT ASNKAFAEALSTEPKGAAAASSNAVLTSKLDAAYKLAYKSAEGATPEAKYD A YV ATLSEALRUAGTLEVHAVKPAGEEVKAIP AGELQVIDKVDAAFKV AAT AANAAP ANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYQSYKFIPALEAAVKQSYAATV ATAPAVKYTVFETALKKAITAMSQAQKAAKPAAAVTATATGAVGAATGAV G AATG AATAAAGGYKTGAATPT AGGYKV 113560 POA P 9 84

MDKANGAYXTALKAASAVAPAEKFPVFQATFDKNLKEGLSGPDAVGFAKK

LDAFIQTSYLSTKAAEPKEKFDLFVLSLTEVLRFMAGAVKAPPASKFPAKPAP

KVAAYTPAAPAGAAPKATTDEQKLIEKINVGFKAAVAAAAGVPAASKYKTF vatfgaasnkafaealstepkgaavasskavltskldaayklayksaegat

PEAKYDAYVATLSEALRIIAGTLEVHGVKPAAEEVKAIPAGELQVIDKVDAA FKVAATAANAAPANDKFTVFEAAFNDAIKASTGGAYQSYKFIPALEAAVKQ SYAATVATAPAVKYTVFETALKKAITAMSQAQKAAKPAAAVTGTATSAVG AATGAAT AAAGGYKV

Sequências de barata [0144] 2833325 Cr pl

MKTALVFAAWAFVAARFPDHKDYKQLADKQFLAKQRDVLRLFHRVHQHN

ILNDQVEVGIPMTSKQTSATTVPPSGEAVHGVLQEGHARPRGEPFSVNYEKH

REQAIMLYDLLYFANDYDTFYKTACWARDRVNEGMFMYSFSIAVFHRDDM

QGVMLPPPYEVYPYLFVDHDVIHMAQKYWMKNAGSGEHHSHVIPVNFTLR

TQDHLLAYFTSD VNLNAFNTYYRYYYPS WYNTTLY GHNIDRRGEQFYYTYK

QIYARYFLERLSNDLPDVYPFYYSKPVKSAYNPNLRYHNGEEMPVRPSNMY

VTNFDLYYIADIKNYEKRVED ADFGY AFDEHMKPHSLYHDVHGMEYLADM

ffiGNMDSPNFYFYGSIYHMYHSMIGHIVDPYHKMGLAPSLEHPETVLRDPVF

Y QLWKRVDHLF QKYKNRLPRYTHDELAFEG VKVENVD V GKLYT YFEQ YD

MSLDMAVYYNNVDQISKV^VQIAVRLNHKPFTYNIEVSSDKAQDVYVAVF

LGPKYDYLGREYDLNDRRHYFVEMDRFPYHVGAGKTVIERNSHDSNIIAPER

DS YRTFYKKV QEA YEGKS QYYVDKGHNY CGYPENLLIPKGKKGGQAYTFY

V1VTPYVKQDEHDFEPYNYKAFSYCGVGSERKYPDNKPLGYPFDRKIYSNDF

YTPNMYFKDVIIFHKKYDEVGVQGH 2231297 Cr p2 85 INEIHSnGLPPFVPPSRRHARRGVGINGLIDDVIAILPVDELKALFQEKLETSPD FKALYDAIRSPEFQSnSTLNAMQRSEHHQNLRDKGVDVDHFIQLIRALFGLSR AARNLQDDLNDFLHSLEPISPRHRHGLPRQRRRSARVSAYLHADDFHKimiE ALPEFANFYNFLKEHGLDWDYINEIHSIIGLPPFVPPSRRHARRGVGINGLIDD VIAILPVDELKALFQEKLETSPDFKALYDAIRSPEFQSnSTLNAMPEYQELLQN LRDKGVDVDHFIRVDQGTLRTLSSGQRNLQDDLNDFLALIPTDQILAIAMDYL ANDAEVQELVAYLQSDDFHKnTTIEALPEFANFYNFLKEHGLDVVDYlNEfflS nGLPPFVPPSQRHARRGVGINGLIDDVIAILPVDELKALFQEKLETSPDFKALY DAIDLRSSRA 1703445 Bla g 2

MIGLKLVTVLFAVATITHAAELQRVPLYKLVHVFINTQYAGITKIGNQNFLTV

FDSTSCNVWASQECVGGACVCPNLQKYEKLKPKYISDGNVQVKFFDTGSA

VGRGDEDSLTISNLTTSQQDIVLADELSQEVCILSADWVGIAAPGCPNALKGK

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KTTTRRICKLDCSKIPSLPDVTFV1NGRNFNISSQYYIQQNGNLCYSGFQPCGH

SDHFFIGDFFVDHYYSEFNWENKTMGFGRSVE

SV 1705483 Bla g 4

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YKLTY CP VKALGEPIRFLLS Y GEKDFED YRFQEGD WPNLKPSMPFGKTP VLEI DGKQTHQSVAISRYLGKQFGLSGKDDWENLEIDMIVDTISDFRAAIANYHYD ADENSKQKKWDPLKKETIPYYTKKFDEWKANGGYLAAGKLTWADFYFVA ELD YLNHM AKEDLV ANQPNLKALREKVLGLP AIKAWV AKRPPTDL

[0145] Sequências de barata adicionais (números de acesso ao Entrez do NCBI): 2580504; 1580797; 1580794; 1362590; 544619; 544618; 1531589; 1580792; 1166573; 1176397; 2897849.

Sequências de alergénio (gerais):

[0146] Números de acesso ao NCBI 2739154; 3719257; 3703107; 3687326; 3643813; 3087805; 1864024; 1493836; 1480457; 2598976; 2598974; 1575778; 763532; 746485; 163827; 163823; 3080761; 163825; 3608493; 3581965; 2253610; 2231297; 2897849; 3409499; 3409498; 3409497; 3409496; 3409495; 3409494; 3409493; 3409492; 3409491; 3409490; 3409489; 3409488; 3409487; 3409486; 3409485; 3409484; 3409483; 3409482; 3409481; 3409480; 3409479; 3409478; 3409477; 3409476; 3409475; 3409474; 3409473; 3409472; 3409471; 3409470; 3409469; 3409468; 3409467; 3409466; 3409465; 3409464; 3409463; 3409462; 3409461; 3409460; 3409459; 3409458; 3409457; 3409456; 3318885; 3396070 ; 3367732; 1916805; 3337403; 2851457; 2851456; 1351295; 549187; 136467; 1173367; 2499810; 2498582; 2498581; 1346478; 1171009; 126608; 114091; 2506771; 1706660; 1169665; 1169531; 232086; 416898; 114922; 2497701; 1703232; 1703233; 1703233; 1703232; 3287877; 3122132; 3182907; 3121758; 3121756; 87 3121755; 3121746; 3121745; 3319925; 3319923; 3319921 3319651; 3318789; 3318779; 3309647; 3309047; 3309045 3309043; 3309041; 3309039; 3288200; 3288068; 2924494 3256212; 3256210; 3243234; 3210053; 3210052; 3210051 3210050; 3210049; 3210048; 3210047; 3210046; 3210045 3210044; 3210043; 3210042; 3210041; 3210040; 3210039 3210038; 3210037; 3210036; 3210035; 3210034; 3210033 3210032; 3210031; 3210030; 3210029; 3210028; 3210027 3210026; 3210025; 3210024; 3210023; 3210022; 3210021 3210020; 3210019; 3210018; 3210017; 3210016; 3210015 3210014; 3210013; 3210012; 3210011; 3210010; 3210009 3210008; 3210007; 3210006; 3210005; 3210004; 3210003 3210002; 3210001; 3210000; 3209999; 3201547; 2781152 2392605; 2392604; 2781014; 1942360; 2554672; 2392209 3114481; 3114480; 2981657; 3183706; 3152922; 3135503 3135501; 3135499; 3135497; 2414158; 1321733; 1321731 1321728; 1321726; 1321724; 1321722; 1321720; 1321718 1321716; 1321714; 1321712; 3095075; 3062795; 3062793 3062791; 2266625; 2266623; 2182106; 3044216; 2154736 3021324; 3004467; 3005841; 3005839; 3004485; 3004473 3004471; 3004469; 3004465; 2440053; 1805730; 2970629 2959898; 2935527 ; 2935416; 809536 ; 730091; 585279 584968; 2498195; 2833325; 2498604; 2498317; 2498299 2493414; 2498586; 2498585; 2498576; 2497749; 2493446 2493445; 1513216 ; 729944 ; 2498099 ; 548449; 465054 465053; 465052; 548671; 548670; 548660; 548658 548657; 2832430; 232084; 2500822; 2498118; 2498119 2498119; 2498118; 1708296 1708793 416607; 416608 416608; 416607; 2499791; 2498580; 2498579; 2498578 2498577; 2497750; 1705483; 1703445; 1709542; 1709545 1710589; 1352699; 1346568; 1346323; 1346322; 2507248 11352240 ; 1352239 ; 1352237; 1352229; 1351935; 1350779 1346806; 1346804; 1346803; 1170095; 1168701; 1352506 1171011; 1171008; 1171005; 1171004; 1171002; 1171001 88 1168710; 1168709; 1168708; 1168707; 1168706; 1168705; 1168704; 1168703; 1168702; 1168696; 1168391; 1168390; 1168348; 1173075; 1173074; 1173071; 1169290; 1168970; 1168402; 729764; 729320; 729979; 729970; 729315; 730050; 730049; 730048; 549194; 549193; 549192; 549191; 549190; 549189; 549188; 549185; 549184; 549183; 549182; 549181; 549180; 549179; 464471; 585290; 416731; 1169666; 113478; 113479; 113477; 113476; 113475; 130975; 119656; 113562; 113561; 113560; 416610; 126387; 126386; 126385; 132270; 416611; 416612; 416612; 416611; 730035; 127205; 1352238; 125887; 549186; 137395; 730036; 133174; 114090; 131112; 126949; 129293; 124757; 129501; 416636; 2801531; 2796177; 2796175; 2677826; 2735118; 2735116; 2735114; 2735112; 2735110; 2735108; 2735106 ; 2735104; 2735102 ; 2735100 ; 2735098 ; 2735096 ; 2707295 ; 2154730; 2154728; 1684720; 2580504 ; 2465137; 2465135; 2465133; 2465131; 2465129; 2465127; 2564228; 2564226; 2564224; 2564222; 2564220; 2051993; 1313972; 1313970; 1313968; 1313966; 2443824 ; 2488684; 2488683; 2488682; 2488681; 2488680; 2488679; 2488678; 2326190 ; 2464905; 2415702; 2415700; 2415698; 2398759; 2398757; 2353266 ; 2338288 ; 1167836 ; 414703 ; 2276458 ; 1684718 ; 2293571 ; 1580797 ; 1580794 ; 2245508 ; 2245060; 1261972; 2190552 ; 1881574 ; 511953 ; 1532058; 1532056; 1532054; 1359436 ; 666007 487661; 217308; 1731859; 217306; 217304; 1545803; 1514943; 577696; 516728; 506858; 493634; 493632; 2154734; 2154732; 543659; 1086046; 1086045; 2147643; 2147642; 1086003; 1086002; 1086001 543675, 543623, 543509; 543491; 1364099; 2147108; 2147107; 1364001; 1085628; 631913; 631912; 631911; 2147092; 477301; 543482; 345521; 542131; 542130; 542129; 100636; 2146809; 480443; 2114497; 2144915 ; 72355; 71728; 319828; 89 1082946; 1082945; 1082944; 539716; 539715; 423193 423192; 423191; 423190; 1079187; 627190; 627189 627188; 627187; 482382; 1362656; 627186; 627185 627182; 482381; 85299; 85298; 2133756; 2133755 1079186; 627181; 321044; 321043; 112559; 112558 1362590; 2133564; 1085122; 1078971; 627144; 627143 627142; 627141; 280576; 102835; 102834; 102833 102832; 84703; 84702; 84700; 84699; 84698; 84696 477888; 477505; 102575; 102572; 478272; 2130094 629813; 629812; 542172; 542168; 542167; 481432 320620; 280414; 626029; 542132; 320615; 320614 100638; 100637; 100635; 82449; 320611; 320610; 280409 320607; 320606; 539051; 539050; 539049; 539048 322803; 280407; 100501; 100498; 100497; 100496 1362137; 1362136; 1362135; 1362134; 1362133; 1362132 1362131; 1362130; 1362129; 1362128; 100478; 2129891 1076531; 1362049; 1076486; 2129817; 2129816; 2129815 2129814; 2129813; 2129812; 2129805; 2129804; 2129802 2129801; 2129800; 2129799; 479902; 479901; 2129477 1076247; 629480; 1076242; 1076241; 541803; 541802 280372; 280371; 1361968; 1361967; 1361966; 1361965 1361964; 1361963; 1361962; 1361961; 1361960; 1361959 320546; 2119763; 543622; 541804; 478825; 478824 478823; 421788; 320545; 81444; 626037; 626028; 539056 483123; 481398; 481397; 100733; 100732; 100639 625532; 1083651; 322674; 322673; 81719; 81718 2118430; 2118429; 2118428; 2118427; 419801; 419800 419799; 419798; 282991; 100691; 322995; 322994 101824; 626077; 414553 ; 398830 ; 1311457; 1916292 1911819; 1911818; 1911659; 1911582; 467629; 467627 467619 ; 467617 ; 915347; 1871507; 1322185; 1322183 897645 ; 897647 ; 1850544 ; 1850542 ; 1850540 288917; 452742; 1842045 ; 1839305; 1836011; 1836010 1829900; 1829899; 1829898; 1829897; 1829896; 1829895 90 1829894; 1825459 ; 1808987 ; 159653 ; 1773369 ; 1769849; 1769847; 608690 ; 1040877 ; 1040875; 1438761; 1311513; 1311512; 1311511; 1311510; 1311509; 1311689; 1246120; 1246119; 1246118; 1246117; 1246116; 1478293; 1478292; 1311642; 1174278; 1174276; 1086972; 1086974; 1086976; 1086978; 1086978; 1086976; 1086974; 1086972; 999009; 999356; 999355; 994866; 994865; 913758; 913757; 913756; 913285; 913283; 926885; 807138; 632782; 601807; 546852; 633938; 544619; 544618; 453094; 451275; 451274; 407610; 407609; 404371; 409328; 299551; 299550; 264742; 261407; 255657; 250902; 250525; 1613674; 1613673; 1613672; 1613671; 1613670; 1613304; 1613303; 1613302; 1613240; 1613239; 1613238; 1612181; 1612180; 1612179; 1612178; 1612177; 1612176; 1612175; 1612174; 1612173; 1612172; 1612171; 1612170; 1612169; 1612168; 1612167; 1612166; 1612165; 1612164; 1612163; 1612162; 1612161; 1612160; 1612159; 1612158; 1612157; 1612156; 1612155; 1612154; 1612153; 1612152; 1612151; 1612150; 1612149; 1612148; 1612147; 1612146; 1612145; 1612144; 1612143; 1612142; 1612141; 1612140; 1612139 1093120 ; 447712; 447711; 447710; 1587177; 158542; 1582223; 1582222; 1531589 ; 1580792 ; 886215; 1545897; 1545895; 1545893; 1545891; 1545889; 1545887; 1545885; 1545883; 1545881; 1545879; 1545877; 1545875; 166486 ; 1498496 ; 1460058; 972513; 1009442 ; 1009440 ; 1009438 ; 1009436 ; 1009434 ; 7413 ; 1421808 ; 551228 ; 452606 ; 32905; 1377859 ; 1364213; 1364212; 395407; 22690 ; 22688 ; 22686; 22684 ; 488605 ; 17680 ; 1052817 ; 1008445 ; 1008443 ; 992612; 706811 ; 886683; 747852 ; 939932 ; 19003 ; 1247377 ; 1247375; 1247373; 862307 ; 312284 ; 999462; 999460 ; 999458 ; 587450 ; 763064 ; 886209 ; 1176397 ; 1173557 ; 902012; 997915; 997914; 997913; 997912; 997911; 997910; 99790; 997908; 997907; 997906; 997905; 997904; 997903; 91 997902; 997901; 997900 ; 997899; 997898; 997897; 997896; 997895; 997894 ; 997893; 997892; 910984; 910983; 910982; 910981; 511604 ; 169631 ; 169629 ; 169627 ; 168316 ; 168314 ; 607633 ; 555616; 293902 ; 485371 ; 455288 ; 166447 ; 166445 ; 166443 ; 166435 ; 162551 ; 160780; 552080 ; 156719 ; 156715 ; 515957 ; 515956 ; 515955 ; 515954 ; 515953 ; 459163; 166953 ; 386678 ; 169865. Métodos de administração [0147] Uma vez formuladas, as composiçoes da invenção podem ser administradas a um sujeito in vivo usando uma variedade de vias e técnicas conhecidas. Por exemplo, um composição pode ser fornecida como uma solução injectável, suspensão ou emulsão e administrada por via parentérica, subcutânea, epidérmica, intradérmica, intramuscular, intra-arterial, intraperitoneal, injecção intravenosa usando uma agulha e seringa convencionais ou usando um sistema de injecção de jacto liquido. As composições também podem ser administradas topicamente à pele ou mucosas, por exemplo por via nasal, endotraqueal, intestinal, rectal ou vaginal ou fornecidas como um spray com partículas muito finas adequado para administração respiratória ou pulmonar. Outros modos de administração incluem a administração oral, supositórios, administração sublingual e técnicas de administração transdérmica activa ou passiva.

[0148] Quando se pretende administrar um péptido da invenção, é preferível administrar o péptido num local no corpo onde aquele tenha a capacidade de entrar em contacto com células apresentadoras de antigénio adequadas, e onde tenha a oportunidade de contactar com os linfócitos T do individuo. Quando se pretende administrar uma APC, é 92 preferível administrar a APC num local do corpo onde esta tenha a possibilidade de entrar em contacto e activar os linfócitos T adequados do indivíduo.

Regimes de administração [0149] A administração dos péptidos/polinucleótidos/células (como a composição que contém uma pluralidade de péptidos) pode efectuar-se através de qualquer método adequado, conforme descrito acima. As quantidades adequadas do péptido podem ser determinadas empiricamente, mas habitualmente estão dentro do intervalo indicado abaixo. Uma única administração de cada péptido pode ser suficiente para ter um efeito benéfico para o doente, mas deve ser referido que poderá ser benéfico se o péptido for administrado mais do que uma vez e, nesse caso, os regimes de administração habituais podem ser, por exemplo, uma ou duas vezes por semana durante 2-4 semanas a cada 6 meses ou uma vez ao dia durante uma semana a cada quatro a seis meses. Cada péptido ou polinucleótido ou combinação de péptidos e/ou polinucleótidos pode ser administrado a um doente isoladamente ou em combinação.

[0150] As dosagens para administração dependem de vários factores incluindo a natureza da composição, a via de administração e o esquema e momento recomendado para a administração. Doses adequadas de uma molécula ou combinação de moléculas da invenção podem estar na ordem dos até 10 pg, até 15 pg, até 20 pg, até 25 pg, até 30pg, até 35 pg, até 50 pg, até 100 pg, até 500 pg ou mais por administração. Doses adequadas podem ser inferiores a 15 pg, mas pelo menos 1 ng, ou pelo menos 2 ng ou pelo menos 5 ng ou pelo menos 50 ng ou pelo menos 100 ng ou pelo menos 93 500 ng ou pelo menos 1 pg ou pelo menos 10 pg. Para algumas moléculas ou combinações da invenção, a dose usada pode ser superior, por exemplo, até 1 mg, até 2 mg, até 3 mg, até 4 mg, até 5 mg ou superior. Estas doses podem ser fornecidas numa formulação liquida, numa concentração adequada para permitir um volume adequado para administração pela via seleccionada. Deverá compreender-se que as doses acima referidas se referem à dose total em caso de uma combinação de moléculas. Por exemplo, "até 35 pg" refere-se à concentração de péptido total de até 35 pg numa composição que compreende uma combinação de mais de um péptido.

Kits [0151] A invenção também diz respeito a uma combinação de componentes aqui descritos adequados para uso num tratamento de acordo com a invenção que são embalados sob a forma de um kit num recipiente. Estes kits podem compreender uma série de componentes para permitir o tratamento de acordo com a invenção. Por exemplo, um kit pode compreender quatro ou mais péptidos, polinucleótidos e/ou células diferentes da invenção ou quatro ou mais péptidos, polinucleótidos ou células da invenção e um ou mais agentes terapêuticos adicionais adequados para administração simultânea, sequencial ou separada. O kit pode, opcionalmente, conter outros reagentes adequados, instruções ou similares.

[0152] A invenção está ilustrada nos exemplos que se seguem.

Exemplo 1: Pesquisa de misturas de péptidos quanto às caracteristicas de ligação do mhc 94

Ensaios de ligação Péptidos [0153] Os seguintes péptidos que incluem as sequências de Fel dl foram investigados quanto à sua capacidade de se ligarem às nove moléculas de HLA-DR: DRl, DR3, DR4, DR7, DRll, DR13, DRl5, B4 e B5. SEQ N.° ID ML AI h2n EICPAVKRDVDLFLTGT COOH Derivado de ^Relacionado Fel dl icom 1 cadeia 1 j ---------- ML A 2 h2n LFLTGTPDEYVEQVAQY COOH Derivado de |8 Fel dl | cadeia 1 j ML A 3 h2n EQVAQYKALPWLENA COOH Derivado de |2 Fel dl | cadeia 1 \ ML A 4 h2n KALPVVLENARILKNCV COOH Derivado de |3 Fel dl i cadeia 1 \ MLA5 h2n RILKNCVDAKMTEEDKE COOH Derivado de ;4 Fel dl ! cadeia 1 j MLA6 h2n KMTEEDKENALSLLDK COOH Derivado de |9 Fel dl i cadeia 1 i MLA7 h2n KENALSVLDKIYTSPL COOH Derivado de |5 Fel dl | cadeia 1 | MLA8* h2n VKMAETCPIFYDVFFA COOH Derivado de\13 Fel dl\ 95

SEQ N.0 ID li cadeia 2 j MLA9* \H2N CPIFYDVFFAVANGNEL COOH \Derivado \Fel icadeia 2 de\14 dl 1 MLA10* \h2n GNELLLKLSLTKVNAT COOH \Derivado ;Fel icadeia 2 de 115 dl | MLA11 h2n LTKVNATEPERTAMKK COOH perivado !Fel icadeia 2 de j 10 dl i MLA12 h2n TAMKKIQDCYVENGLI COOH SDerivado ÍFel ^cadeia 2 de 16 dl | MLA13* \h2n CYVENGLISRVLDGLV COOH \Derivado \Fel Icadeia 2 deli 6 dl 1 MLA14 h2n SRVLDGLVMTTISSSK COOH jDerivado ÍFel padeia 2 de |7 dl | :MLA15 11 IN IS S SKDCMGEAVQNTV COOH jDerivado \Fel jcadeia 2 de jll dl· | MLA16 ÍH2N AVQNTVEDLKLNTLGR COOH jDerivado jFel jcadeia 2 de j 12 di 1 ;* Os péptidos apresentados em itálico foram avaliados quanto à ligação mas não foram tomados em consideração jposteriormente nestas experiências devido à sua fraca solubilidade.

Condições de ligação para ensaios de ligação do MHC 96 [0154] Foram usadas linhas celulares homozigóticas do EBV como fontes de moléculas humanas de HLA classe II (Tab. 4). Moléculas de HLA-DR foram purificadas por cromatografia de afinidade usando o Mab L243 monomórfico (ATCC, Rockville, USA) acoplado a gel de proteína A sepharose CL 4B (Pharmacia, França). Resumidamente, as células foram lisadas em gelo a 5x108 células/ml em NaCl 150 mM, com tampão Tris HC1 10 mM pH=8,3 contendo 1% de Nonidet P40 (NP40), 10 mg/1 de aprotinina, EDTA 5 mM e PMSF 10 mM. Após a centrifugação a 100 000 g durante 1 h, o sobrenadante foi aplicado a colunas de sepharose 4B e sepharose 4B-proteína A e depois à coluna de afinidade específica. As moléculas de HLA-DR foram eluídas com n-dodecil b-D-maltósido (DM) 1,1 mM, NaCl 500 mM e Na2C03 500 mM, pH=ll,5.

As fracções foram imediatamente neutralizadas para pH=7 com tampão Tris HC1 2 M pH=6,8 e exaustivamente dialisadas contra tampão fosfato 10 mM pH=7, DM 1 mM, NaCl 150 mM. Para moléculas de HLA-DR para além do número de lote 40, DM 1 mM no tampão de diálise foi substituído por NOGP 1 mM.

[0155] As moléculas de HLA-DR foram diluídas em tampão fosfato 10 mM, NaCl 150 mM, DM 1 mM, citrato 10 mM, timerosal a 0,003% com um péptido biotinilado adequado e diluições em série de péptidos concorrentes. As condições de ligação de cada molécula estão apresentadas detalhadamente na Tab. 4. Amostras (100 μΐ por poço) foram incubadas em placas de polipropileno de 96 poços (Nunc, Dinamarca) a 37°C durante 24 h a 72 h. Após a neutralização com 50 μΐ de tampão Tris HC1 450 mM pH=7,5, timerosal a 0,003%, BSA a 0,3%, DM 1 mM, as amostras foram aplicadas a placas Maxisorp para ELISA de 96 poços (Nunc, Dinamarca) previamente revestidas com L243 Mab 10 mg/ml e saturadas com tampão Tris HC1 100 mM pH=7,5, BSA 0,3%, timerosal 97 0,003%. Foram deixadas a ligar às placas revestidas com anticorpo durante 2h à temperatura ambiente. O péptido biotinilado ligado foi detectado através da incubação de conjugados com fosfatase alcalina-estreptavidina (Amersham, R.U.) e, após as lavagens, adicionando substrato de fosfato 4-metilumbeliferil (Sigma, França). A fluorescência emitida foi medida a 4 50 nm mediante excitação a 365 nm num fluorimetro Wallac Victor2 1420 (Perkin Elmer). A ligação máxima foi determinada incubando o péptido biotinilado com a molécula de MHC II na ausência de competidor. A especificidade da ligação foi avaliada adicionando mais péptido não biotinilado. O resultado de base não diferiu significativamente do obtido incubando o péptido biotinilado sem moléculas do MHC II. Os dados foram expressos como a concentração de péptido que impediu a ligação de 50% do péptido marcado (CI50) . A capacidade de ligação foi então avaliada relativamente ao péptido de ligação forte conhecido (de referência). Péptidos de referência adequados para os alelos de HLA testados nestas experiências são: DRl (alelo DRB1*0101): HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT); DR3 (alelo DRBl*0301): MT216 (AKTIAYDEEARRGLE); DR4 (alelo DRB1*0401): HA 306-318

(PKYVKQNTLKLAT); DR7 (alelo DRB1*0701) : YKL (AAYAAAKAAALAA); DRBl*1101: HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT); DR13 (alelo DRBl*1301): Bl 21-36 (TERVRLVTRHIYNREE); DR15 (alelo DRBl *1501): A3 152-166 (EAEQLRRAYLDGTGVE); D RB 4 (alelo DRB4*0101) : E2/E7 (AGDLLAIETDKATI); e D RB 5 (alelo DRB5*0101): HA 306-318 (PKYVKQNTLKLAT).

Resultados [0156] Os péptidos de ligação e não ligação foram primeiro discriminados com base num limiar superior de 1000 nM, conforme descrito no geral na literatura (Southwood et al 98 (1998). J Immunol 160:3363; Geluk et al (1998) Proc Natl Acad Sei USA 95:10797), mas são adicionalmente avaliados por comparação com péptidos de referência. Os péptidos de referência são seleccionados de entre os melhores péptidos de ligação de cada molécula de HLA especifica. Relativamente aos péptidos de referência, um péptido é um ligante fraco para uma determinada molécula de HLA se tiver uma CI50 mais de 100 vezes inferior à do péptido de referência para uma determinada molécula de HLA. Um péptido é um ligante moderado se tiver uma CI50 mais de 20 vezes inferior mas menos de 100 vezes inferior à do péptido de referência para a molécula de HLA especifica. Um péptido é um ligante forte se tiver uma CI50 menos de 20 vezes inferior à do péptido de referência para a molécula de HLA especifica.

Análise das misturas do péptido preferido [0157] Os nove alelos de HLA usados para estas experiências englobam uma proporção elevada da população caucasiana. (As frequências de referência de alelos de HLA na população são fornecidas na Tabela 3 do Exemplo 2) . Deste modo, as combinações de péptidos foram avaliadas para determinar quais delas poderão fornecer a cobertura mais ampla de diferentes moléculas de HLA. Os critérios-alvo para uma mistura foram assim definidos conforme se segue: Para uma determinada molécula de HLA, uma mistura pode compreender 2 péptidos de ligação forte e 1 péptido de ligação moderada ou 1 péptido de ligação forte e 3 péptidos de ligação moderada. As misturas preferidas satisfazem estes critérios para os nove tipos de HLA testados. Apenas os péptidos com sequências que correspondem às SEQ N.°s ID 1 a 12 foram tomados em consideração nesta análise, uma vez que os péptidos com sequências que correspondem às SEQ N.°s 99 ID 13 a 16 revelaram ser pouco solúveis. A partir das SEQ. N.°s ID 1 a 12 há mais de 3000 combinações possíveis de péptidos com potencial para satisfazer os critérios-alvo definidos acima.

[0158] Para permitir a visualização destas combinações, foi aplicado um sistema de registo binário de forma que para cada tipo de HLA, em que uma combinação de péptidos satisfaz um dos critérios acima é introduzida uma pontuação de "1" e quando os critérios não são satisfeitos é introduzida uma pontuação de "0". As pontuações para todos os tipos de HLA são então adicionadas, de forma a que uma mistura que não satisfaz os critérios de nenhum dos tipos de HLA irá pontuar 0, enquanto uma mistura que preenche os critérios dos 9 tipos de HLA pontuará 9. As pontuações para cada combinação de péptidos estão representadas nas Figuras 2 A a Q. A pontuação mais elevada de nove foi obtida pelas 10 misturas apresentadas abaixo:

Figura 1 A |ponto 16 íMLA 01, 02, 03, 04, 05, 12, 14 Figura 1 B jponto 272 jMLA oi, 02, 03, 04, 05, 12, 14 Figura 1 C |ponto 472 |mla 02, 03, 04, 05, 06, 12, 14 Figura 1 C jponto 482 jMLA 02, 03, 04, 05, 07, 12, 14 Figura 1 C jponto 488 |mla 02, 03, 04, 05, 11, 12, 14 Figura 1 C jponto 494 jMLA 02, 03, 04, 05, 12, 14, 15 Figura 1 c jponto 495 jMLA 02, 03, 04, 05, 12, 14, 16 Figura 1 D jponto 699 jMLA 03, 04, 05, 07, 12, 14, 15 Figura 1 D jponto 700 |mla 03, 04, 05, 07, 12, 14, 16 Figura 1 G jponto 1271 |hla 02, 03, 04, 05, 12, 14 100 [0159] Assim, estas misturas são as combinações de péptidos preferidas para uso em vacinação.

Exemplo 2: Rastreio transversal de sujeitos alérgicos a gatos quanto às respostas dos linfócitos T e libertação de histamina dos basófilos pelos epitopos de péptido de linfócitos T derivados de Fel dl caracterizados pelo MHC. 1. Introdução 1.1 Ensaio de libertação da histamina [0160] O objectivo deste ensaio foi o de identificar péptidos individuais que são capazes de activar basófilos sanguíneos (como um substituto dos mastócitos teciduais) resultando na libertação de histamina que pode resultar em reacções alérgicas durante a terapêutica. Péptidos ou combinações de péptidos que induzem frequentemente libertação de histamina podem ser considerados inadequados para inclusão na vacina de péptido.

[0161] A libertação de histamina requer a ligaçao cruzada das moléculas de IgE adjacentes específicas na superfície do basófilo. Os péptidos em avaliação eram pequenos (13 a 17 aminoácidos de comprimento) e não deviam, assim, possuir uma estrutura terciária significativa que lhes permitisse manter a conformação de um epítopo de ligação a IgE da molécula inteira. Além disso, monómeros de péptido em solução, mesmo que estejam ligados por IgE, não devem ser capazes de ligação cruzada a moléculas de IgE adjacentes. É de referir, contudo, que alguns dos péptidos contêm resíduos de cisteína que podem resultar na formação de ligação dissulfureto entre péptidos únicos e também entre 101 diferentes péptidos numa mistura. Assim, podem ser gerados dimeros de péptidos que podem ter um potencial de ligação cruzada de igE. Na presente análise, não foram usados excipientes na formulação de péptido para evitar ou reduzir a formação de dimeros através da ligação dissulfureto.

[0162] Foi avaliada a libertação de histamina de sangue periférico total fresco de sujeitos alérgicos a gatos. Os basófilos de sangue periférico foram usados como substitutos dos mastócitos tecidulares que não era prático usar no ensaio. O sangue foi incubado in vitro com 9 péptidos individuais da sequência do principal alergénio de gato Fel dl (SEQ N.°s ID 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 11 e 12).

Estes péptidos foram seleccionados como epítopos potenciais dos linfócitos T após ensaios de ligação péptido-MHC, conforme explicado no Exemplo 1. Adicionalmente, foram analisadas as respostas a misturas preferidas de uma mistura de 7 péptidos identificados no Exemplo 1. A mistura testada preferida de 7 péptidos consistia nos péptidos das SEQ N.°s ID 1 a 7. A libertação de histamina em resposta ao extracto de alergénio completo de pêlo de gato actuou como um controlo positivo. 1.2. Ensaio de proliferação [0163] O objectivo do ensaio de proliferação foi o de determinar a percentagem da população que respondeu a cada péptido individual/péptido auxiliar e a mistura preferida dos 7 péptidos. 1.3 Ensaios de citocinas [0164] O objectivo dos ensaios de citocinas foi duplo: (1) determinar a percentagem da população que respondeu a cada 102 péptido individual e a mistura preferida dos 7 péptidos, e (2) identificar péptidos individuais que possuem caracteristicas Th2 intrínsecas indutoras de (IL-13) que seriam indesejáveis numa vacina de péptido para a doença alérgica, e também identificar péptidos individuais que possuem caracteristicas intrínsecas de indução de il-10 que podem ser benéficas para uma vacina de péptido para a doença alérgica. 2. Materiais e métodos 2.1 Isolamento de células mononucleares de sangue periférico [0165] Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas da amostra de sangue heparinizado obtido do sujeito. As PBMCs foram isoladas através de separação por gradiente de densidade Ficoll-Hypaque. Uma vez isoladas, as células foram usadas no ensaio de proliferação celular, no ensaio de libertação de histamina e no ELISA e no ensaio de libertação de citocinas. 2.2 Ensaio de libertação de histamina e ELISA para histamina [0166] Os ensaios foram realizados em PBMC (que contêm basófilos) . Cada péptido e cada combinação de péptidos foram comparados com moléculas de alergénio inteiro num ensaio de libertação de histamina. As concentrações de histamina foram determinadas por ELISA.

[0167] O ensaio exigiu 3xl06 PBMC por sujeito. O ensaio foi realizado usando o kit Immunotech para imunoensaio de libertação da histamina de acordo com as instruções do 103 fabricante. Após o ensaio de libertação da histamina, amostras aciladas foram testadas por ELISA para histamina. 0 teste ELISA para histamina usou 50 μΐ dos 100 μΐ da amostra acilada gerada pelo ensaio de libertação de histamina. Os restantes 50 μΐ da amostra foram guardados, por congelação a -20°C, até a secção de análise de dados do ELISA ter sido concluída. Depois dos resultados terem sido analisados e do teste ELISA ter sido realizado de modo satisfatório, as amostras foram descartadas.

[0168] Os péptidos foram testados quanto à sua capacidade de induzir a libertação de histamina num intervalo de 5 logio (10 pg/ml a 1 ng/ml). O intervalo de concentração testado foi seleccionado com base em doses teóricas in vivo de péptido que podem ser obtidas durante a terapêutica. Por exemplo, uma dose de 10 pg do péptido que entrasse num volume de sangue de 5 litros resultaria numa concentração sérica de 2 ng/ml (2xlCT6 mg/ml), no intervalo de dose inferior do ensaio de libertação de histamina. Foi usado extracto completo de pêlo de gato (C.B.F. LETI) como um controlo positivo para libertação num intervalo de concentração ligeiramente mais elevado (100 pg a 10 ng/ml). Foram realizadas medições únicas (ou seja, não duplicadas nem triplicadas) para cada diluição. Foi testada uma amostra de sangue duplicada quanto à libertação espontânea de histamina e o valor médio destas amostras foi subtraído de todos os resultados de péptido/alergénio.

[0169] Após a conclusão do ELISA para histamina, os níveis de histamina individuais foram determinados por interpolação para a curva Standard gerada no ensaio ELISA. Os resultados das amostras foram ajustados para permitir qualquer diluição das amostras. Quando duas ou mais 104 diluições de uma preparação de péptido/alergénio obtiveram 10% ou mais de libertação de histamina acima da base, ou quando se obteve um único valor de 10% ou mais em relação à base na concentração mais elevada testada, tal foi considerado uma "libertação de histamina positiva". 2.3 Ensaio de proliferação celular [0170] 0 ensaio de proliferação celular foi realizado em PBMCs (requereu 140xl06 células para testar todos os parâmetros). A proliferação foi medida pela incorporação do composto 3H-timidina marcado radioactivamente.

[0171] Detalhadamente, foram distribuídos 100 μΐ da concentração do antigénio ou péptido adequado nos poços adequados de placas de 96 poços. As placas foram então colocadas numa incubadora humidificada com 5% de CO2 a 37°C no máximo durante 4 horas. PBMCs isoladas conforme descrito acima foram preparadas numa concentração de 2xl06 células/ml em meio completo à temperatura ambiente. 100 μΐ de solução celular foram então distribuídos em cada um dos poços das placas de 96 poços que contêm antigénio/péptido. As placas foram então incubadas durante 6 a 8 dias. As culturas foram pulsadas com solução de timidina tritiada adicionando a cada poço 10 μΐ de solução stock de timidina tritiada (1,85 MBq/ml em meio de RPMI isento de soro). As placas foram então devolvidas à incubadora por um período entre 8 e 16 horas. As culturas foram então colhidas usando um colector de células Canberra Packard FilterMate 196. Os filtros secos foram contados usando um contador de cintilação beta adequado.

[0172] Contagens de poços que contêm péptidos foram comparadas estatisticamente com poços que contêm apenas 105 meio (12 poços por grupo). Foi usado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney. 0 mesmo teste estatístico foi usado em todos os sujeitos. Uma diferença estatisticamente significativa entre poços apenas com meio e poços estimulados com péptido foi considerada uma estimulação positiva das PBMCs pelo péptido. 2. 4 Ensaio de libertação de citocinas [0173] Os perfis de secreção de citocinas das PBMCs foram analisados em resposta à estimulação peptídica. Os sobrenadantes do ensaio de libertação de citocinas foram testados quanto à presença de 3 citocinas - lFN-γ, IL-10 e IL-13 - usando o teste de ELISA.

[0174] O ensaio de libertação de citocinas exigiu 40xl06 PBMCs por sujeito. Detalhadamente, 250 μΐ de uma solução de 200 pg/ml da concentração de péptido ou antigénio adequado foram distribuídos nos poços adequados de placas de 48 poços. As placas foram então incubadas numa incubadora humidificada com 5% de C02 a 37°C no máximo durante 4 horas. 250 μΐ de uma suspensão de PBMC com 5xl06 células/ml foram então adicionados a cada poço e as placas foram colocadas na incubadora durante 5 dias.

[0175] Após a estimulação, amostras de sobrenadante de cultura foram colhidas em 3 alíquotas e congeladas até os testes ELISA poderem ser realizados. Uma alíquota foi testada quanto à presença de uma citocina (ou seja, foi necessário testar as 3 alíquotas para as 3 citocinas). Os níveis de citocina nas amostras foram determinados por interpolação das curvas Standard também geradas no ensaio. 3. Resultados. 106

Resumo dos resultados. 3.1 Libertação de histamina [0176]

Tabela 1- Resumo da libertação de histamina

Controlo (Péptido Mistura de positivo (individual péptidos (libertação 10% | (libertação 10% (libertação 10% superior ao isuperior ao superior ao início do (início do início do estudo) (estudo) estudo) 2 ou (Apenas (2 ou Apenas 2 ou (Apenas mais (conc. (mais cone. mais sconc. diluiçõ (mais (diluiçõ mais diluiçõ (mais es (elevada (es elevada es (elevada 70.4 (7.4 |l7.3 18.5 2.5 (2.5

Sujeito que \ | | | apresentaram j j j \

libertação j j j I

Percentagem 177.8 |30.9* total que( j apresentou | j libertação dej j histamina por( ( grupo ( | * nalguns sujeitos alguns péptidos causaram a libertação em 2 ou mais concentrações e outros apenas na dose mais elevada. Assim, os dois números não podem ser simplesmente adicionados como o são para o extracto de pêlo de gato e para a mistura de péptidos. Do mesmo modo, não é possível adicionar os valores para a libertação do péptido 107 individual a valores para a mistura de péptidos uma vez que 2 dos sujeitos com libertação de histamina para a mistura também apresentaram libertação com péptidos individuais.

[0177] A libertação de histamina dos basófilos de sangue periférico foi observada em resposta tanto ao controlo positivo como a péptidos. A Tabela 1 mostra a percentagem de indivíduos nos quais ocorreu a libertação de histamina (conforme definido pelos critérios de aceitação). A libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais ocorreu frequentemente mas isto raramente se traduziu em libertação de histamina da mistura de 7 péptidos preferidos. Contudo, um total de 5% dos indivíduos apresentaram libertação de histamina em resposta à mistura de péptido. Os detalhes da dose e o número de doses consecutivas da mistura de péptido que desencadearam a libertação de histamina são relevantes para interpretação destes resultados e são discutidos mais detalhadamente abaixo.

Tabela 2- Resumo da libertação de histamina pelo péptido individual MLA01 ML AO 3 MLA04 MLA05 IML AO 7 1 MLAI2 ML AI 4 ÍMLA15 MLA16 | (relacio (SEQ (SEQ (SEQ | (SEQ I (SEQ (SEQ j \ nado com N. 0 N. 0 N. 0 |n. 0 |n. 0 N. 0 ! \ a SEQ ID 2) ID 3) ID 4) jID 5) |ID 6) ID 7) j N.0 D ID | \ \ 4 6 6 1 I6 \6 2 j 7 li | [0178] A Tabela 2 mostra o número de indivíduos nos quais foi detectada a libertação de histamina em resposta a cada 108 péptido individual. MLA15 e MLA16 libertaram mais frequentemente histamina. 3.2 Resumo do ensaio de proliferação [0179] A Figura 3 sumaria as respostas proliferativas a péptidos e antigénios. A percentagem de indivíduos que apresentam uma resposta proliferativa detectável é mostrada nas barras a preto. As barras cinzentas (resposta fraca), brancas (resposta moderada) e quadriculadas (resposta forte) fornecem uma análise detalhada da qualidade das respostas. A qualidade é arbitrariamente definida pelo índice de Estimulação (SI: razão das contagens na presença de antigénio/péptido dividido pelas contagens apenas em meio). Assim, para o péptido 1 (MLA01), 12% dos sujeitos apresentaram uma resposta proliferativa e destas, 92% foi fraca, nenhuma foi moderada e 8% foi elevada. As respostas proliferativas aos péptidos/antigénios individuais foram variáveis (barra a preto). 92% dos sujeitos apresentaram respostas proliferativas positivas ao antigénio PPD de controlo positivo. A maioria destas foram respostas fortes (barra a quadriculado). 75% dos sujeitos responderam a extracto de pêlo de gato, 59% destas respostas sendo fracas (ou seja, 59% dos 75%). A resposta à mistura dos 7 péptidos preferidos (SEQ. N.°s ID 1 A 7) foi quase idêntica à do extracto de pêlo de gato (CAT). Os péptidos MLA15 e MLA16 induziram mais frequentemente respostas do que quatro dos péptidos preferidos. Contudo, MLA15 e MLA16 induziram as respostas mais frequentes de libertação de histamina pelos basófilos (ver secção 3.1). Poucos péptidos individuais induziram respostas proliferativas fortes, conforme esperado (frequência do precursor baixa dos linfócitos T precursores específicos do péptido). 109 3.3 Resumo do ensaio de citocinas [0180] A Figura 4 sumaria a percentagem de indivíduos que apresentaram uma resposta detectável a cada um dos péptidos/antigénios por produção das três citocinas medidas. As barras a preto representam a produção de IFN-γ, as barras cinzentas IL-13 e as barras brancas IL-10. O antigénio de controlo positivo PPD obteve produção de citocinas em quase todos os indivíduos (IFN-γ: 91%, IL-13: 97% e IL-10: 96%). O alergénio completo de gato e a mistura dos 7 péptidos obteve uma resposta das citocinas em aproximadamente 80% ou mais dos sujeitos. Péptidos individuais obtiveram respostas com frequências diferentes. No geral, a produção de citocinas pareceu ser um método mais sensível de detecção de respostas com percentagens maiores de indivíduos a apresentar respostas positivas às citocinas do que respostas proliferativas. Na maioria dos casos, a secreção de IL-10 foi detectada no maior número de sujeitos e a de IFN-γ foi detectada no menor número. 3.4 Tipagem de tecidos [0181]

Tabela 3 DRBl |l |3 4 17 8 11 I12 |13 14 15 116 0. 'O |e. jl4 . 15. CO co 3. 8.3 I3. 114 . 2. 17 . |2 . |4 \l 7 | 4 |9 17 9 6 I5 População de 19. jll. 12. 113 . 3. 13. i2 · j 10. 3. 10 . |3. referência % h jl 8 |2 7 4 13 I2 2 7 I6 [0182] A tipagem de tecido foi realizada de modo a 110 garantir que a população em estudo (predominantemente caucasiana) era representativa da população caucasiana geral na qual a vacina irá ser usada. Estão representadas onze famílias de alelos DRBl comuns. São apresentadas as frequências de alelos em 102 sujeitos tipados do estudo, não a percentagem de indivíduos que expressou um alelo, uma vez que cada indivíduo tem dois alelos DRBl e alguns indivíduos são homozigóticos para determinados alelos. As frequências de alelos da população de referência são também apresentadas para comparação (dados retirados de HLA Facts Book, Parham & Barber). As frequências de referência foram obtidas por análise de múltiplos estudos que apresentaram frequências e os valores apresentados são valores médios.

Todas as frequências detectadas na presente análise estavam dentro dos intervalos indicados nos dados de referência.

Assim, a população examinada no presente estudo é representativa de uma população caucasiana. 4. Figuras 4. Ensaio de libertação de histamina [0183]

Tabela 4 - Perfis de sujeitos individuais. MIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N.°s ID 1 a 7)

Cinzento: libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida.

Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam ;libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito. 111

Sujeito Liberta (Controlo jPéptido Mistura de (Comentários: ção jpositivo (individual péptidos 1 espontâ j (libertação j(libertação 10% (libertação i nea |10% | superior ao 10% 5 (entre (superior aojinicio do superior ao | 10%- jinicio do lestudo) inicio do | 20%) jestudo) estudo) 1 |2 ou Apenaj2 ou Apenas 2 ou(Apena j (mais s (mais conc • mais is ϊ sdiluiç conc.jdiluiçõ mais diluiç (conc. i jões mais jes elevada ões (mais i eleva j |eleva | 1 da | ida \ 002 Iy N |n N N |n |Sem libertação 007 |y N |y N N |n 1 ML AI 6 008 \y N |n N N |n (Sem libertação 009 \y N |n N N |N (Sem libertação 010 \y N |N N N |n (Sem libertação 011 30% | | i | LIBERTAÇÃO REJEIT. Ϊ Iespontânea I í | ELEVADA 012 (Y N (N N N |N (Sem libertação 013 Iy N |N N N |n |Sem libertação 014 |y N |n N N |N (Sem libertação 015 13% |n y \y N N |N jMLAOl, MLA04, \ \ |MLA07, ML AI 5 016 12% |γ N |n N N |N |Sem libertação 017 |y N |n N N |N (Sem libertação 018 |n y |n N N |n jSem libertação 112 MIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N.°s ID 1 a 7)

Cinzento: libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida.

Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito.

Sujeito (Liberta (Controlo jPéptido Mistura de jComentários: jção (positivo jindividual péptidos | (espontâ ( (libertação j(libertação 10% (libertação j jnea |10% | superior ao 10% | | (entre jsuperior ao|inicio do superior aoj |10%— jinício do|estudo) inicio do| |20%) jestudo) | estudo) | | |2 ou Apena|2 ou Apenas 2 ou jApena j | jmais s jmais conc. mais js | 1 jdiluiç conc. jdiluiçõ mais diluiç jconc. | | jões mais jes elevada ões jmais ( s jj eleva j jeleva \ í ^ da ( jda | 019 j47% | | I I LIBERTAÇÃO REJEIT. | | I | Iespontânea | | í ! \ ELEVADA 020 j 77% | 1 1 LIBERTAÇÃO REJEIT. 1 1 \ ! Iespontãnea \ 5 | 1 (ELEVADA 022 | |y N \Y N n |n Imlaoi 023 I |y N (N N N |N jSem libertação 024 | |n N (N N N |n jSem libertação | | í | | (nenhum | | í | (positivo) 026 | \y N |n N N |N jSem libertação 113 MIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N.°s ID 1 a 7)

Cinzento: libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida.

Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito. |Péptido ^individual

Sujeito ^Liberta ^Controlo íção ipositivo iMistura de jComentários: ipéptidos | jespontâ | (libertação j(libertação 10%5(libertação | aoil0% | do; superior aoj iinicio do| iestudo) ! jnea |10% |superior | (entre jsuperior aojiinicio |10%-12 0 %) jinício do|estudo) lestudo) | |2 ou;iApena|2 ou; Apenas 12 oujApenaj jmais lis |mais iconc. limais js j jdiluiç iconc. idiluiçõ imais lidiluiç jconc. i ielevada liões soes jmais |es ieleva \ ida | smais \ ieleva i ida i 027 i \Y ín SN ÍN ÍN ÍN ÍSem libertação 028 i \Y Ín |N ;n ÍN |n ÍSem libertação 029 \ ín ÍN ín |N ÍN In ÍSem libertação i (nenhum ipositivo) 030 \ \Y ÍN ÍN ]N ÍN |n ÍSem libertação 031 i \Y ÍN ÍN lY ÍN |n ÍMLA03, MLA 12 032 REJEIT. j 32% 1 $ | LIBERTAÇÃO Iespontânea Ielevada 033 i |y ÍN |n iN |n |n ÍSem libertação 034 i In ÍN ÍN ÍN ín ín ÍSem libertação 114 MIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N.°s ID 1 a 7) Cinzento : libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida. Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito. Sujeito (Liberta (Controlo jPéptido Mistura de jComentários: jção (positivo jindividual péptidos | (espontâ ( (libertação j (libertação 10% (libertação j jnea |10% | superior ao 10% | | (entre jsuperior ao|inicio do superior aoj |10%— jinicio do |estudo) inicio do| |20%) jestudo) | estudo) | | 2 ou Apena|2 ou Apenas 2 ou jApena j | jmais s jmais conc • mais js | 1 jdiluiç conc. jdiluiçõ mais diluiç jconc. | | |ões mais jes elevada ões jmais ( eleva j jeleva \ I da \ jda | ! | | \ | (nenhum | | ( | (positivo). 035 1 |n γ |n N N jN |Sem libertação 040 ! |n y |n N N (N (Sem libertação 041 1 |N N (N N N (N (Sem libertação \ \ $ ( ( (nenhum $ \ jpositivo) 042 \ \y N |n N N (N (Sem libertação 043 1 |n N |y N N (N (MLA04 (nenhum | | ( ( (positivo) 044 1 !Y N |n N N |y jMIST. 28% 046 | In N |y N N (N (MLA16 (nenhum 115 MIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N.°s ID 1 a 7)

Cinzento: libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida.

Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito. (Mistura de (Comentários: (péptidos |

Sujeito (Liberta (Controlo (Péptido (ção (positivo (individual (espontâ ( (libertação ((libertação 10%i(libertação 1 (nea (10% (superior aoiil0% \ \ (entre isuperior aoiinicio doisuperior ao i |10%- (inicio do(estudo) (inicio doí 520%) (estudo) ( (estudo) i 5 (2 ou|Apena|2 ou s Apenas (2 ouiApenai (mais is (mais iconc. imais is í i (diluiç iconc. (diluiçõ imais idiluiç iconc. i \ (ões (mais jes (elevada iões imais i ieleva \ ieleva i \ | ida ( ida í | \ \ \ \ í \ jpositivo) 047 | \Y ÍN |n ÍN ÍN ÍN ÍSem libertação 049 | |n (N Ín ÍY Ín ÍN Í ML A0 3 MLA16 s i i (nenhum í \ ipositivo) 050 | |y m |n |n ÍN ÍN (Sem libertação 051 | |y ÍN ÍYMLA12 ÍYMLA16 ÍN |n iMLAI2, MLA16 052 | |n íy |n ÍY ÍN |n ÍMLA16 053 | |n |y |n ÍN ÍN |n í 054 REJEIT. (54*

(RESULTADO NAO jlNTERPRETÁVEL, ÍBASE ELEVADA 116 MIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N.°s ID 1 a 7) Cinzento: libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida. Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito. Sujeito jLiberta jControlo |Péptido Mistura de jComentários: jção |positivo jindividual péptidos | jespontâ j (libertação j (libertação 10% (libertação j jnea |10% | superior ao 10% | |(entre jsuperior ao|inicio do superior aoj |10%— jinício do|estudo) inicio do| |20%) jestudo) | estudo) | | 2 ou Apena|2 ou Apenas 2 ou jApena j | jmais s jmais conc. mais js | 1 jdiluiç conc. jdiluiçõ mais diluiç jconc. | | |ões mais jes elevada ões jmais \ eleva j jeleva j I da \ jda | ! | | I jcOM 40-50% DE | | \ | | LIBERTAÇÃO 055 | |y N |N N y In I libertação | | j 1 Imist. a 2 | | j 1 1 CONCENTRAÇÕES \ \ | 1 I CONSECUTIVAS \ \ 1 1 INTERMÉDIAS 056 I |γ N |Y MLA16 YMLA03 Y |n 1 libertação 1 | | I Imist. em 4 | | | 1 jcONC.S CONSEC. 057 I |n N \Y N N |N jMLAl5 1 | í 1 I IMEDIATAMENTE | | % 1 Iacima do 117 MIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N.°s ID 1 a 7) Cinzento: libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida. Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito. Sujeito |Liberta |Controlo jPéptido Mistura deIComentários: Ição Ipositivo jindividual péptidos | lespontâ | (libertação | (libertação 10% (libertação | jnea |10% Isuperior ao 10% j | (entre Isuperior ao|inicio do superior ao\ |10%- jinicio do lestudo) inicio do| |20%) lestudo) \ estudo) | | |2 ou Apena|2 ou Apenas 2 ou ÍApenaj | |mais s smais conc. mais |s | | jdiluiç conc. sdiluiçõ mais diluiçIconc.1 | |ões mais |es elevada ões Imais 1 eleva\ leleva 1 | | da | |da | | | Ilimite de 10% | | s | | (nenhum | | s ! Ipositivo) 058 | |n N |Υ N N |N |MLA04 (nenhum s ! Ipositivo) 059 | |y N |Y N N |n ]MLA12 E MLA16 060 | |n N |N N N |n jSEM LIBERTAÇÃO | | 1 | | (NENHUM | | í | IPOSITIVO) 061 I |y N |n N n In |sem libertação 062 I |γ N |Ymlao3 Ymlaoi,ml N |N |MLA03 MLA01 1 1 | AI 5 1 1 118 MIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N.°s ID 1 a 7) Cinzento : libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida. Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito. Sujeito ^Liberta jControlo jPéptido Mistura de ÍComentários: jção |positivo jindividual péptidos | jespontâ j (libertação j (libertação 10% (libertação j jnea |10% jsuperior ao 10% | (entre jsuperior ao|inicio do superior aoj |10%— jinício do|estudo) inicio do| |20%) jestudo) j estudo) | | |2 ouiApena|2 ou; Apenas 2 ou jApena j | jmais lis jmais conc • mais js | 1 jdiluiçiconc. jdiluiçõ mais diluiç jconc. | | jões imais jes elevada ões jmais \ | | ielevaj jeleva \ | | ida \ jda | 063 \ Iy ín |n N N |n jsEM LIBERTAÇÃO 064 l33% ! i ! | | LIBERTAÇÃO REJEIT. | I i I I Iespontânea I ! i I | | ELEVADA 065 | \y m |n N N |n jSEM LIBERTAÇÃO 066 ! \y m |n N N jN jSEM LIBERTAÇÃO 067 1 |y |n |n N N |n |sem LIBERTAÇÃO 068 1 |n ín |n N N jN jSEM LIBERTAÇÃO 1 1 i 1 1 1 (NENHUM \ \ \ \ | jPOSITIVO) 069 1 lY |n |n Y N |n |MLA03, I |MLA05,MLA07 119 MIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N.°s ID 1 a 7)

Cinzento: libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida.

Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito. (Mistura de jComentários: (péptidos |

Sujeito (Liberta (Controlo (Péptido (ção (positivo (individual (espontâ ( (libertação ((libertação 10%5(libertação j ao(10% | do; superior ao| (inicio do| (estudo) ! jnea |10% (superior | (entre (superior ao(inicio |10%-12 0 %) (início do(estudo) lestudo) | (2 ou(Apena(2 ou(Apenas (2 oujApenaj (mais (s (mais (conc. (mais js j (diluiç(conc. (diluiçõ (mais (diluiç(conc. ( (elevada (Iões loes iimais (es (eleva | (da | smais \ (eleva ( (da \

I | ( j ( ( ( (MLA12 070 | \Y (n ( YmLA04, 14, (15 j YmLA07, 12, |; 6 ;(N In (MLA04,MLA07, |mLA12,MLA14, (MLA15, ML AI 6 071 1 | (Y (N (N ÍN (N |n jSEM LIBERTAÇÃO 072 | \Y (n (N (N ÍN |n (SEM LIBERTAÇÃO 073 | \Y |n In |y ÍN |n |MLA03 076 | |n (N In ]N ÍN |n (SEM LIBERTAÇÃO | (NENHUM (POSITIVO) 080 | |y (n |n (N (N |n (SEM LIBERTAÇÃO 081 | In |n In (N ÍN |n (SEM LIBERTAÇÃO 120 MIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N.°s ID 1 a 7)

Cinzento: libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida.

Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito.

Sujeito jLiberta jControlo |Péptido Mistura de jComentários: jção |positivo jindividual péptidos | jespontâ j (libertação j(libertação 10% (libertação j jnea |10% | superior ao 10% | | (entre jsuperior ao|inicio do superior aoj |10%— jinício do|estudo) inicio do| |20%) jestudo) j estudo) | | 2 ou Apena|2 ou Apenas 2 ou jApena j | jmais s jmais conc. mais js | 1 jdiluiç conc. jdiluiçõ mais diluiç jconc. | | |ões mais jes elevada ões jmais \ s jj eleva j jeleva \ ij $ da \ Ida | j j | I I (NENHUM | | \ | jPOSITIVO) 082 | |y N |N YMLA16 n |n |mlai6 083 [39% ! 1 1 1 ENSAIO NÃO REJEIT. | | \ 1 IINTERPRETÁVEL 084 [37% | 1 | | ENSAIO NÃO REJEIT. | | j I IINTERPRETÁVEL | 1 | | (BASE MUITO | | \ 1 jELEVADA) 085 I |y N |n N n In Isem libertação 086 | |n N |n N N |N ISEM LIBERTAÇÃO | 1 í I I (NENHUM 5 5 \ 1 jPOSITIVO) 121 MIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N. °s ID 1 a 7) Cinzento : libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida. Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito. Sujeito jLiberta jControlo |Péptido Mistura de jComentários: jção jpositivo jindividual péptidos | jespontâ | (libertação j(libertação 10% (libertação j jnea |10% | superior ao 10% | | (entre jsuperior ao|inicio do superior aoj |10%— jinício do |estudo) inicio do| |20%) jestudo) | estudo) | | 2 ou Apena|2 ou Apenas 2 ou jApena j | jmais s jmais conc • mais js | 1 jdiluiç conc. jdiluiçõ mais diluiç jconc. | | jões mais jes elevada ões jmais j s jj eleva \ leleva 1 í ij da \ Ida | 087 1 |n N |n N N |n jsEM LIBERTAÇÃO | | | | (NENHUM | 1 í I jPOSITIVO) 088 | |y N |N N n |n Isem libertação 089 | Iy N |N N n |n |sem libertação 090 \ \Y ^ (YmLA03 Ymlao? N |n jMLA03, MLA07 091 1 |y N |n N n |n Isem libertação 092 jio. 6% |γ N |n N n |n Isem libertação 093 [29% | \ I 1LIBERTAÇÃO REJEIT. | | \ | Iespontânea | | \ 1 | elevada 094 | \y N |n N n In Isem libertação 122 MIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N.°s ID 1 a 7) Cinzento : libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida. Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito. Sujeito jLiberta jControlo jPéptido Mistura de iComentários: jção |positivo jindividual péptidos | jespontâ j (libertação j (libertação 10% (libertação j jnea |10% | superior ao 10% | | (entre jsuperior ao|inicio do superior aoj |10%— jinício do |estudo) inicio do| |20%) jestudo) | estudo) | | 2 ou Apena|2 ouiApenas 2 ou jApena j | jmais s jmais jconc • mais js | 1 jdiluiç conc. jdiluiçõ jmais diluiç jconc. | | |ões mais jes jelevada ões jmais \ s jj elevas \ jeleva | ij $ da \ \ |da | 095 \ Iy N |n )n N |n Isem libertação 096 \ |y N |N jN n |n Isem libertação 097 | 1 | | ENSAIO NÃO REJEIT. ' 5 í i I 1INTERPRETÁVEL | 1 1 1 (PARECE SER | | | 1 | |UMA CONTAGEM ΐ : | |TOTAL ' \ % · 1 1FALSAMENTE \ \ | ; 1 |BAIXA) 099 1 Iy N |n In n |n |sem libertação 100 |ll.5% \y n Iy In N |n |MLA15 101 1 In n In Iy N In IMLA07, MLA14, | 1 ΐ j | |MLA15, MLA16, 123 iMIST.: mistura de 7 péptidos (i.e. SEQ N.°s ID 1 a 7)

Cinzento: libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida.

Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito. jdiluiç Iões mais elevada conc. jdiluiçõ mais jes eleva\ da |

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Cinzento: libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida.

Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito. jPéptido (individual (Mistura de jComentários: (péptidos |

Sujeito (Liberta (Controlo (ção (positivo (espontâ | (libertação j(libertação 10%5(libertação j ao(10% | do ; superior ao | (inicio do| (estudo) ! jnea |10% (superior | (entre (superior ao(inicio |10%— (início do(estudo) 120%) jestudo) | (2 ou)Apena|2 ou(Apenas (2 oujApenaj (mais (s (mais (conc. (mais |s | (diluiç(conc. (diluiçõ (mais (diluiç(conc. I (elevada (Iões loes iimais (es (eleva j Ida |

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Cinzento: libertação de histamina para um ou mais péptidos individuais da mistura preferida ou para a própria mistura preferida.

Comentários: esta coluna enumera os péptidos individuais que originam libertação de histamina/ outros comentários relevantes para cada sujeito.

Sujeito jliberta jControlo jPéptido Mistura dejComentários: jção jpositivo jindividual péptidos \ jespontâ j(libertação j (libertação 10% (libertação j jnea |10% jsuperior ao 10% j 1 (entre jsuperior aojinicio do superior aoi |10%- jinicio do jestudo) inicio doj |20%) jestudo) j estudo) j | 2 ou Apena|2 ou Apenas 2 ou(Apena| | jmais s jmais conc. mais js j | idiluiç conc. sdiluiçõ mais diluiç jconc. j | jões mais jes elevada ões jmais j eleva j jeleva j da j jda j % de ! !7 0.4 7.4 117.3 18.5 2.5 j 2.5 | sujeitos | | j § í que | | i; apresent j j \ j j aram | | \ j j libertaç j j \ j j ão | | | | [0184] Um total de 94 ensaios de libertação de histamina foram concluídos durante o estudo. Destes, foram rejeitados 13 ensaios, principalmente devido a niveis inaceitavelmente elevados de libertação espontânea. Ensaios com libertação espontânea de histamina de 20% ou mais da libertação total 126 de histamina foram rejeitados. Estes ensaios com uma libertação espontânea entre 10% e 20% estão indicados na Tabela 4. Todos os outros ensaios apresentaram valores de libertação espontânea inferiores a 10%.

[0185] Aproximadamente 78% dos sujeitos testados demonstraram uma libertação positiva de histamina para o alergénio sensibilizador. A literatura existente refere que 10-20% dos indivíduos alérgicos são resistentes à libertação de histamina pelos basófilos induzida pelo alergénio.

[0186] A libertação de histamina foi considerada positiva se (a) a concentração mais elevada do péptido isoladamente induzisse uma libertação de 10% ou mais do valor de libertação total ou (b) se dois valores consecutivos fossem 10% ou mais da libertação total. Aproximadamente 31% (25/81) dos sujeitos apresentaram libertação de histamina com um ou mais péptidos individuais. Destes, 6/81 (7,4%) não tiveram libertação de controlo positiva com o extracto de alergénio de gato inteiro.

[0187] Em dois indivíduos, a mistura de 7 péptidos também induziu a libertação de histamina adicionalmente a determinados péptidos individuais. Noutros dois indivíduos, apenas a mistura de 7 péptidos induziu a libertação. Assim, 4/81 indivíduos (~5%) apresentaram libertação de histamina com a mistura de péptidos.

[0188] O sujeito 044 apresentou libertação (28% da libertação total) apenas na concentração mais elevada (10 pg/ml) do péptido. O sujeito 055 apresentou libertação apenas a 0,1 pg/ml (72% do total) e 1 pg/ml (47% do total) . 0 sujeito 056 apresentou libertação a 0,01 pg (11%), 0,1 127 pg/ml (12%), 1,0 pg/ml (17%) e 10 pg/ml. O sujeito 103 apresentou libertação de histamina (33%) apenas na concentração mais elevada (10 pg/ml) do péptido. 4.2 Ensaio de Proliferação [0189] Para o ensaio de proliferação, foram analisados os dados de proliferação individual para todos os sujeito e todas as concentrações de péptido. Os índices de estimulação para cada péptido/antigénio foram resumidos para toda a população de 100 sujeitos.

[0190] Antigénios complexos como o extracto de pêlo de gato e o PPD induzem respostas proliferativas significativas na população como um todo. Os péptidos que induzem respostas significativas são os que desencadeiam respostas proliferativas numa maior percentagem da população.

[0191] Verificam-se índices de estimulação inferiores a 1 quando as contagens em poços que contêm péptidos são inferiores às que contêm apenas meio de cultura. Um tal efeito pode ser atribuível a ligeiras alterações no pH aquando da adição dos péptidos que são preparados em solução ácida. A ausência de uma resposta proliferativa ao péptido resultaria então em contagens ligeiramente menores do que as dos poços apenas de meio. 4.3 Ensaio de libertação de citocinas

[0192] As Figuras 4 a 7 mostram, para cada péptido/antigénio, a percentagem de indivíduos que apresentaram uma resposta de qualquer magnitude detectável (ou seja, produção detectável de IFN-γ, IL-13 ou IL-10). A 128 intensidade destas respostas é então dividida em quatro niveis de produção de citocinas. Por exemplo, 35% da população em estudo pode ter apresentado uma resposta IFN-γ. Desses 35% de indivíduos, metade (50%) apresentou uma resposta muito fraca, 20% uma resposta fraca, 15% uma resposta moderada e 15% uma resposta forte (perfazendo o total de 100% dos respondedores) . Os limites de cada nível de citocinas foram arbitrariamente atribuídos com base no intervalo de detecção do teste ELISA. Os limites são diferentes para IFN-y/IL-10 e IL-13 uma vez que para lFN-γ e IL-10, o intervalo de detecção foi aproximadamente 1-100 pg/ml enquanto o intervalo para o ensaio IL-13 foi aproximadamente 0,5-50 pg/ml. 4.3.1 Produção de interferão-γ [0193] A Figura 5 mostra a percentagem de indivíduos que produziram lFN-γ e a intensidade da resposta após cultura celular com péptido/antigénio. Foram detectadas respostas de IFN-γ em 26-44% dos sujeitos em resposta aos péptidos individuais. Estas respostas foram predominantemente muito baixas, até baixas a moderadas. Antigénios complexos induziram respostas mais frequentes (mistura de péptidos 80%, pêlo de gato 79%, PPD 91%) . Estas respostas foram de baixas até moderadas a altas. As respostas ao ppd foram particularmente elevadas (89 das respostas ao PPD foram superiores a 100 pg/ml). 4.3.2 Produção de IL-13 [0194] A Figura 6 demonstra a percentagem de indivíduos que produziram IL-13 e a intensidade da resposta após cultura celular com péptido/antigénio. Foram detectadas respostas de IL-13 em 33-68% dos sujeitos em resposta a 129 péptidos individuais. Estas respostas foram predominantemente muito baixas a baixas, embora tenha sido detectado um número significativo de respostas moderadas. Isto pode reflectir a natureza Th2 da sensibilização alérgica nestes sujeitos. Antigénios complexos induziram respostas mais frequentes (mistura de péptidos 85%, pêlo de gato 93%, PPD 97%) . Estas respostas foram de baixas até moderadas a altas. 4.3.3 Produção de IL-10 [0195] A Figura 7 demonstra a percentagem de indivíduos que produziram IL-10 e a intensidade da resposta após cultura celular com péptido/antigénio. Foram detectadas respostas de IL-10 em 46-75% dos sujeitos em resposta a péptidos individuais. Estas respostas foram predominantemente muito baixas a baixas. Antigénios complexos induziram respostas mais frequentes (mistura de péptidos 93%, pêlo de gato 96%, PPD 96%) . Estas respostas foram de baixas a moderadas. Foram observadas muito poucas respostas "elevadas" de IL-10. 5. Discussão 5.1 Ensaio de libertação de histamina [0196] Ao interpretar os resultados de libertação de histamina é importante tomar em consideração vários pontos referentes ao design do ensaio: 1) A dose sanguínea estimada dos péptidos que vai ser obtida durante o tratamento situa-se no fundo da curva dose-resposta empregue no ensaio. Por exemplo, uma dose de 10 pg do péptido que entrasse num volume de 130 sangue de 5 litros resultaria numa concentração sérica de 2 ng/ml (2xl0“6 mg/ml), assumindo que nenhum péptido é degradado, o que é improvável). Esta concentração está imediatamente acima do limite da menor dose do ensaio (1 ng/ml). As 2 concentrações mais baixas de péptido usadas no ensaio correspondem aproximadamente às doses injectadas de 5 pg (1 ng/ml) e 50 pg (10 ng/ml). Assim, o ensaio foi concebido de modo a detectar a libertação de histamina em doses com valores iguais ou superiores às doses de péptido usadas para a terapêutica; apenas em 3 casos a libertação de histamina foi associada às duas menores concentrações de péptido (valores consecutivos acima de 10%) . Em dois destes casos, os valores foram inferiores a 11 %. A mistura de 7 péptidos não revelou qualquer libertação nas 2 concentrações mais baixas de péptido. Assim, embora a libertação de histamina em resposta a péptidos individuais ou à mistura seja relativamente comum, não foi geralmente observada nas concentrações de péptido que vão ser atingidas durante a terapêutica. 2) Por motivos de custo e complexidade, só foram testados poços únicos para cada concentração de péptido. Isto aumenta o risco de um valor obtido ser espúrio. Isto é particularmente relevante para a segunda condição definida para um resultado positivo -que a maior concentração isolada de péptido/antigénio apresente uma libertação de 10% ou mais da libertação total, vários casos de libertação de histamina para péptidos individuais associaram-se apenas à concentração mais elevada do péptido e isto também é verdade para 2/4 dos indivíduos com libertação da histamina desencadeada pela mistura de 7 péptidos. 131 3) Nalguns casos, a libertação de histamina dos péptidos não se associou à libertação de histamina a partir do extracto de pêlo de gato (ausência de controlo positivo). 4) Péptidos com resíduos de cisteína (MLA01, MLA04, MLA05, MLAl2 e MLA15) tinham revelado anteriormente ser capazes de diferentes graus de homodimerização. Embora não formalmente quantificados, estes péptidos quando misturados também têm probabilidade de formar heterodímeros (ou seja, na mistura com as SEQ N.°s ID 1 a 7). Os dímeros podem ser suficientes para ligação cruzada com as moléculas de IgE na superfície dos mastócitos e basófilos, originando a libertação de histamina. Não foram usados excipientes para reduzir a formação de ligação dissulfureto entre péptidos homólogos ou heterólogos neste estudo. As preparações clínicas da vacina deverão conter tioglicerol para bloquear a formação de ligação dissulfureto.

[0197] Aproximadamente 78% dos sujeitos testados demonstraram uma libertação positiva de histamina para o alergénio sensibilizador. Isto é ligeiramente inferior aos resultados apresentados na literatura que sugerem que 10-20% dos indivíduos alérgicos são resistentes à libertação de histamina pelos basófilos induzida pelo alergénio.

[0198] Aproximadamente 30,9% dos sujeitos apresentaram libertação de histamina com um ou mais péptidos individuais. A libertação de histamina também foi detectada em 5% dos sujeitos (4/81) para a mistura de 7 péptidos (SEQ N.°s ID 1 A 7; candidatos prováveis à vacina). Dois destes 4 indivíduos apresentaram libertação para péptidos individuais e 2 não. Em vários sujeitos que apresentam libertação de histamina para péptidos individuais (6/81; 132 7,4%), a libertação ocorreu apenas com os péptidos MLA15 e MLAl6, que não estão incluídos na mistura das SEQ N.°s ID 1 a 7. MLAl6 foi o péptido associado mais frequentemente com a libertação de histamina. Ajustando os valores da libertação de péptidos individuais de forma a incluir apenas os péptidos nos 7 candidatos de vacina preferidos, 23,5% dos sujeitos apresentaram libertação de histamina para componentes individuais da vacina. 5.2 Ensaio de Proliferação [0199] A proliferação de PBMC foi testada em resposta a cultura com 3 concentrações de péptidos individuais, uma mistura de 7 péptidos (seleccionada por ensaios de ligação ao MHC) e extracto de alergénio completo de pêlo de gato. As respostas ao PPD numa única concentração também foram determinadas como um marcador de uma resposta positiva de memória.

[0200] Respostas ao PPD: 92% dos sujeitos apresentaram uma resposta proliferativa detectável ao PPD. A resposta é grandemente dependente da vacinação anterior com BCG. Não respondedores podem ser originários de países nos quais a BCG não é obrigatória (p. ex. EUA) ou podem não ter recebido a imunização por outros motivos. A maioria das respostas (92%) resultaram num SI superior a 10. Estas foram arbitrariamente definidas como respostas "fortes".

[0201] Respostas ao extracto de alergénio de pêlo de gato: 75% dos sujeitos apresentaram uma resposta proliferativa detectável ao extracto de alergénio de pêlo de gato. As respostas mais frequentes foram detectadas através da medição das citocinas realçando a importância de testar múltiplos parâmetros de activação para determinar a 133 reactividade. A maioria das respostas foram fracas (SI 2-5; 59%) embora tenham sido observados valores significativos de respostas moderadas (SI 5-10; 24%) e fortes (SI 10+; 17%) .

[0202] Mistura de péptido (Pl-7): 71% dos sujeitos apresentaram uma resposta à mistura de péptido, semelhante à do extracto de alergénio de pêlo de gato. Foram observadas percentagens semelhantes de respostas fracas (52%), moderadas (34%) e fortes (14%). As respostas proliferativas ao extracto de alergénio de pêlo de gato e à mistura de péptido correlacionaram-se fortemente indicando que a maior parte da reactividade dos linfócitos T ao pêlo de gato pode ser atribuída aos epítopos contidos na mistura de péptido.

[0203] Respostas a péptidos individuais : As respostas proliferativas aos péptidos individuais foram geralmente fracas a moderadas. A maioria dos péptidos gerou 70-80% das respectivas respostas na categoria fraca com 20-30% na categoria moderada. Poucos péptidos desencadearam respostas fortes. É expectável que as respostas aos péptidos individuais sejam mais fracas do que as respostas aos antigénios complexos ou misturas de péptidos, o que decorre das menores frequências de precursor dos linfócitos T específicos para epitopos individuais.

[0204] As respostas proliferativas mais fortes a um péptido individual foram ao P12 de Fel dl, cadeia 2, (43%) e as mais fracas ao P4 de cadeia 1 (6%) . Contudo, as respostas de citocinas a todos os péptidos foram detectadas mais frequentemente do que as respostas proliferativas. 5.3 Ensaios de citocinas 134 [0205] A medição de citocinas revelou ser o método mais sensível de medir as respostas aos péptidos. No geral, uma percentagem mais elevada de sujeitos apresentou respostas de citocinas mensuráveis comparativamente a respostas proliferativas mensuráveis. A produção de cada uma das três citocinas variou, sendo a IL-10 geralmente produzida numa proporção maior de sujeitos do que a IL-13 e a IFN-γ. A frequência menor de resposta foi detectada com a IFN-γ. O estado de alergia atópica destes sujeito pode significar que a resposta dos linfócitos T de memória a Fel dl e respectivos epitopos será dominada pelas respostas Th2, o que pode explicar a resposta Thl (IFN-γ) menos frequente. A frequência elevada de respostas IL-10 foi uma surpresa. IL-10 é considerada uma citocina Th2 no sistema murino, mas tal não está bem estabelecido no sistema humano. IL-10 é geralmente considerada uma citocina reguladora/imunossupressora. Relatórios anteriores sugeriram que algumas sequências de péptido podem ter propriedades intrínsecas indutoras de IL-10. Tais péptidos não foram observados neste estudo. A detecção destas respostas noutros sistemas pode simplesmente reflectir a natureza do aparelhamento dos linfócitos T ao alergénio inteiro que é recuperado por cultura de linfócitos T de memória com péptido. Assim, a produção de IL-10 pode ser uma resposta de memória, mais do que o resultado das características intrínsecas de indução de IL-10 do péptido.

[0206] Nenhum péptido único induziu a produção preferencial de uma citocina particular. Assim, nenhum dos péptidos pesquisados induziu uma resposta Th2 (IL-13) particularmente desfavorável que teria sido considerada indesejável para inclusão na vacina de péptido. 135 5.4 Tipagem de tecidos [0207] Os resultados de tipagem de tecidos mostram que neste estudo foi testada uma população representativa. 6. Conclusão 6.1 Ensaio de libertação de histamina [0208] Péptidos individuais induziram a libertação de histamina nalguns indivíduos. A mistura dos péptidos preferidos com as SEQ N.°s ID 1 A 7 induziu a libertação de histamina em 4 indivíduos, embora em 2 destes a libertação tenha sido detectada apenas num único ponto (concentração mais elevada). MLA16 causou a libertação mais frequente, mas está ausente das SEQ N.°s ID 1 a 7.Foi observada alguma libertação positiva com péptidos na ausência de "libertação de controlo positiva" de pêlo de gato completo. O ensaio foi concebido para detectar a libertação de histamina a concentrações de péptido que se aproximam das doses de tratamento e superiores. A libertação de histamina a concentrações de péptido que correspondem a doses de tratamento foi extremamente rara (apenas um exemplo inequívoco) e apenas ocorreu com péptidos individuais, não com as SEQ N.°s id 1 a 7.

[0209] É provável que os resultados do ensaio de libertação de histamina in vitro sobrevalorizem o potencial de libertação da histamina da vacina uma vez que não foram efectuados passos para minimizar a formação de ligação dissulfureto entre péptidos.

[0210] A histamina foi libertada pelos basófilos na 136 maioria dos indivíduos na presença de extracto completo de pêlo de gato. A libertação de histamina ocorreu de um modo dependente da dose em muitos sujeitos, ao contrário da libertação com péptidos que ocorreu frequentemente a concentrações no centro do intervalo de dose. Em indivíduos nos quais a histamina foi libertada pelos péptidos, a sensibilidade ao extracto de pêlo de gato foi habitualmente evidente em doses menores de extracto. 6.2 Ensaio de proliferação [0211] As respostas proliferativas a péptidos foram mais fracas do que às misturas de péptidos ou antigénios proteicos complexos, conforme esperado. A maioria dos péptidos individuais desencadeou respostas proliferativas em menos de 20% dos indivíduos. Foi observada uma variação considerável entre péptidos, mas nenhum péptido único deixou de desencadear respostas proliferativas em pelo menos alguns sujeitos, embora um dos 7 péptidos preferidos, MLA04, tenha sido fraco a induzir a proliferação. Os péptidos MLA15 e MLA16 foram mais potentes na indução de proliferação do que vários dos 7 péptidos preferidos, mas originaram a mais elevada libertação de histamina. 6.3 Ensaios de citocinas [0212] Neste estudo, a produção de citocinas foi um método mais sensível do que a proliferação para detectar respostas a péptidos. Não foram obtidas provas que sustentem a ideia de que determinados péptidos podem ter a capacidade de induzir um padrão específico de produção de citocinas. Nenhum péptido único desencadeou preferencialmente uma resposta Thl, Th2 ou Treg (IL-10) . As respostas IFN-γ tenderam a ser menos comuns do que as IL-13 e IL-10. Os 137 dados do ensaio de citocinas não indicam que qualquer um dos péptidos preferidos da mistura devam ser substituídos nem que qualquer péptido único ou a mistura induz preferencialmente uma resposta Th2 ín vivo.

Exemplo 3: Ensaio clínico da combinação preferida [0213] A mistura preferida de 7 péptidos composta pelos péptidos das SEQ N.°s ID la 7 foi testada num ensaio clínico aleatorizado com ocultação, controlado com placebo. Foi avaliada a eficácia desta mistura na redução dos sintomas alérgicos. 0 design do ensaio clínico satisfez as recomendações de boa prática clínica.

[0214] As respostas cutâneas no início do estudo ao alergénio de gato foram estabelecidas para todos os sujeitos usando uma provocação no início do estudo realizada entre 6 e 8 dias antes da administração da medicação em estudo. Foram administradas duas injecções intradérmicas de 0,010 unidades de HEP (escarificação com equivalente de histamina) de alergénio de gato Standard comercialmente disponível (fornecido pelos Laboratories Leti, Espanha), separadas por um intervalo de 30 minutos, na superfície palmar dos antebraços esquerdo e direito, respectivamente. Os sujeitos foram avaliados para garantir que apresentavam uma resposta cutâneas de fase tardia (LPSR, Late-Phase Skin Response) a alergénio inteiro de gato, e a magnitude desta reacção inicial foi registada do seguinte modo: [0215] Oito horas após cada injecçao, o contorno de qualquer resposta de fase tardia foi desenhado na pele com uma caneta esferográfica. Os diâmetros mais longos e ortogonais foram medidos e registados para cada resposta e 138 foi calculada a área da resposta em cada braço. A área média da resposta em ambos os braços de cada sujeito foi então calculada, constituindo o valor da reacção inicial. Os sujeitos que apresentaram uma reacção adequada no inicio do estudo foram distribuídos aleatoriamente por grupos de dosagem e entraram na Fase de Tratamento.

[0216] A Fase de Tratamento consistiu num período de 21 dias para cada sujeito. Durante este período, um grupo de sujeitos recebeu uma única injecção intradérmica quer da mistura preferida (0,03, 0,3, 3, 12 nmol de cada péptido por dose) ou placebo diluente na Visita 1 da Fase de Tratamento no dia um. Uma coorte de 8 sujeitos recebeu o tratamento em cada nível de dose (6 receberam a mistura preferida e 2 o placebo). A primeira coorte do grupo intradérmico recebeu 0,03 nmol de cada péptido na mistura e cada coorte subsequente no grupo recebeu o nível de dose maior seguinte.

[0217] Foram administradas injecções intradérmica na superfície flexora do antebraço esquerdo. O volume total da injecção foi de 60 pL para todas as injecções. Após o tratamento, foi novamente testada a resposta cutânea dos sujeitos ao alergénio inteiro na Visita 2 da Fase de Tratamento no dia 21 (±3 dias). As respostas cutâneas ao alergénio de gato foram avaliadas através da medição das respostas de fase tardia 8 horas após a administração intradérmica de 0,010 unidades de HEP (escarificação com equivalente de histamina) de alergénio de gato Standard comercialmente disponível (fornecido pelos Laboratories Leti, Espanha), conforme descrito acima. A área média de resposta para ambos os braços de cada sujeito foi então calculada, conforme descrito acima. 139 [0218] Esta área de LPSR média após o tratamento foi comparada com a área de LPSR no início do estudo para cada sujeito. A alteração geral na área da LPSR para os oito doentes em cada coorte foi então avaliada. Os resultados desta análise estão apresentados na tabela abaixo: Esta análise foi realizada sem suspender a ocultação dos dados. DOSE REDUÇÃO NA ÁREA DA LPSR APÓS 0 TRATAMENTO (nmol) 0.03 + 0.3 ++ 3.0 ++ 12.0 ++ [0219] A Figura 8 é uma tabela representativa que apresenta a área da LPSR média antes e depois do tratamento para os oito doentes na coorte de 12,0 nmol. Considerados conjuntamente, estes dados indicam que a mistura de péptidos preferida é eficaz na redução da LPSR a alergénio inteiro em indivíduos alérgicos a gatos. 140

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos num indivíduo por criação de tolerância, que compreende os polipéptidos: CPAVKRDVDLFLT (SEQ. N.° ID 1); EQVAQYKALPVVLENA (SEQ. N.° ID 2); KALPVVLENARILKNCV (SEQ. N.° ID 3); RILKNCVDAKMTEEDKE (SEQ. N.° ID 4); KENALSLLDKIYTSPL (SEQ. N.° ID 5); TAMKKIQDCYVENGLI (SEQ. N.° ID 6); SRVLDGLVMTTISSSK (SEQ. N.° ID 7); em que um ou mais dos péptidos podem ser substituídos por uma variante ou fragmento do péptido substituído, em que: (a) a variante é um polipéptido que compreende duas ou mais substituições conservadoras de aminoácidos comparativamente ao péptido substituído, ou (b) a variante é um polipéptido com pelo menos 90% de identidade ao polipéptido substituído, ou (c) o fragmento é um polipéptido derivado por deleção de um ou dois aminoácidos da extremidade N-terminal ou da extremidade C-terminal, ou de um aminoácido da extremidade N-terminal ou da extremidade C-terminal do péptido substituído, e em que (i) a referida variante ou fragmento é capaz de causar uma resposta imune que dessensibiliza o indivíduo à proteína Fel dl, e (ii) nenhum outro péptido está presente na composição. 1
2. 2. A composição para uso de acordo com a reivindicação 1, em que um ou mais dos polipéptidos têm uma ou mais modificações seleccionadas das seguintes: (i) acetilação N-terminal; (ii) amidação C-terminal; (iii) um ou mais hidrogénios nas aminas da cadeia lateral da Arginina e/ou Lisina substituído por um grupo metileno; (iv) glicosilação; e (v) fosforilação.
3. 3. A composição para uso de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que cada polipéptido tem uma concentração no intervalo de 0,03 a 200 nmol/ml, 0,3 a 200 nmol/ml ou 10 a 50 nmol/ml.
4. 4. Uma composição para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância que consiste em sequências de polinucleótidos que quando expressos causam a produção de uma composição conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. 5. A composição para uso de acordo com a reivindicação 4, em que cada sequência de polinucleótido capaz de expressar um polipéptido diferente está presente nos mesmos vectores de polinucleótido ou em vectores diferentes.
6. 6. A composição para uso de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que é uma composição farmacêutica que contém um ou mais veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.
7. 7. Um vector de expressão para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância que 2 consiste em sete sequências de polinucleótidos diferentes, em que cada sequência de polinucleótido codifica um dos polipéptidos conforme definido na reivindicação 1 e em que cada sequência de polinucleótido está operacionalmente ligada a uma sequência de controlo que permite a expressão da sequência de codificação.
8. 8. Um produto para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância que consiste nos polipéptidos conforme definido na reivindicação 1, em que cada polipéptido diferente se destina a utilização simultânea, independente ou sequencial na prevenção ou tratamento da alergia a gatos num humano.
9. 9. Um produto para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância que consiste em polinucleótidos capazes de expressar os diferentes polipéptidos conforme definido na reivindicação 1, em que cada polinucleótido diferente se destina a utilização simultânea, independente ou sequencial na prevenção ou tratamento da alergia a gatos num humano.
10. 10. Uma formulação farmacêutica para uso na prevenção ou tratamento da alergia a gatos por criação de tolerância, que compreende uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, um vector de acordo com a reivindicação 7, ou um produto de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
11. 11. A formulação para uso de acordo com a reivindicação 10 em que a composição, vector ou produto são formulados para administração intradérmica, oral, nasal, subcutânea, sublingual ou por inalação ou injecção. 3
12. 12. A composição para uso conforme definido em qualquer um das reivindicações 1 a 6, ou produto conforme definido nas reivindicações 8 ou 9, que compreende adicionalmente outro antigénio polipeptídico para uso na criação de tolerância num indivíduo a esse antigénio polipeptídico, em que esse antigénio polipeptídico adicional é diferente de Fel dl.
13. 13. Um método in vitro para determinar se um indivíduo tem ou está em risco de ter uma doença que se caracteriza por sintomas alérgicos em resposta a um alergénio de gato, método esse que compreende testar se o indivíduo tem linfócitos T que respondem a uma composição conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, determinando assim se o indivíduo tem ou está em risco de ter a doença.
14. 14. Um método de acordo com a reivindicação 13 em que a resposta dos linfócitos T à dita composição é medida colocando a composição em contacto com os linfócitos T numa amostra colhida do sujeito, em condições que permitem que a composição e os linfócitos T interajam, e determinando se algum dos linfócitos T é estimulado, determinando assim se está presente uma resposta dos linfócito T. 4